UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SADE PBLICA

GRADUAO EM BIOTECNOLOGIA BACHARELADO


CRITA DE SOUZA RIBEIRO E SILVA
CAROLINE GUSMO DE SOUZA
DEBORAH CAROLINA CARVALHO DOS ANJOS
KAUAN MILHOMEM




PRODUO DE TAC POLIMERASE PARA PCR A PARTIR DE HYPSIBI US
DUJ ARDI NI .






GOIANIA
2014
CRITA DE SOUZA RIBEIRO E SILVA
CAROLINE GUSMO DE SOUZA
DEBORAH CAROLINA CARVALHO DOS ANJOS
KAUAN MILHOMEM






PRODUO DE TAC POLIMERASE PARA PCR A PARTIR DE HYPSIBI US
DUJ ARDI NI .



Trabalho de Concluso de Disciplina
apresentado ao Prof. Dr. Clayton Luiz
Borges como requisito parcial para
obteno de nota em Genmica e
Protemica do curso de Biotecnologia
UFG.


GOIANIA
2014
1. INTRODUO
Cada enzima codificada por um determinado gene que est presente no genoma do
organismo que a produz, aps ser identificado, o gene pode ser isolado e transferido
para um microrganismo conhecido.
Tardigrada um filo de animais microscpicos conhecidos por sua alta capacidade de
sobrevivncia em lugares extremos em estado criptobiotico, condies estas que so
cerca de 1000 vezes a mais do que um humano poderia suportar, depois so capazes de
se reidratar e voltar a viver, rastejam com o auxilio de garras localizadas em suas
pernas (RAMAZZOTTI E MAUCCI, 1983; KINCHIN, 1994). Tem o formato
cilndrico e no possuem rgos respiratrios, popularmente so chamados de ursos
dagua.
O desenvolvimento dos tartigrados rpido, e acontece no momento da muda, podem
ocorrer at 12 mudas durante a vida do animal, a maioria deles alimenta-se do contedo
das clulas vegetais perfurando-as com o aparelho bucal em forma de estilete, em geral
as fmeas so predominantes, so dioicos com uma nica gnada sacular (RUPPERT et
al., 2003).
Em nosso trabalho utilizaremos a espcie hypsibius dujardini, que possui um genoma
compacto que pode ser cultivado indefinidamente, por ser um extremfilo o seu gene
que expressa a TAQ polymerase no desnatura em altas temperaturas, assim os
extremfilos so a oportunidade do desenvolvimento de extremo-enzimas.
Extremfilos so organismos que vivem, e em muitos casos necessitam, de condies
extremas, que diferem vrios aspectos e para a maioria dos organismos da terra seriam
prejudiciais a vida, o organismos de um extremfilo altamente adaptvel, assim como
seu metabolismo, so de muito interesse na rea astrobiologia nos estudos de evoluo.
As enzimas so amplamente utilizadas em diversos ramos da indstria, onde
frequentemente substituem processos qumicos ou compostos, so capazes de decompor
molculas complexas, e especificas, cada vez mais so produzidas por microrganismos
geneticamente modificados, e devido ao seu enorme potencial, existe uma busca
constante por novas enzimas.
A Escherichia coli uma bactria bacilar gram negativa, encontrada de forma ampla,
pois simbionte no homem, e encontrada no TGI de quase todo animal de sangue
quente, so aerbicas, e anaerbias facultativas, se reproduzem rapidamente e passam as
caractersticas adiante, sendo muito utilizada na tcnica de DNA recombinante.
A ideia central do trabalho encontrar o gene responsvel pela expresso da TAQ
polymerase, e produzi-la em E. Coli,que por sua vez possui todo seu genoma
decodificado, considerada um organismo modelo em estudos cientficos, resistente ao
manuseio e fcil de ser trabalhada in vitro, assim iremos produzir essas enzimas pela
tcnica de DNA recombinante eliminando a necessidade de cultivar os prprios
extremfilos , devido ao fato de que o cultivo requere condies especiais e um tanto
quanto trabalhosas que pode ser difceis de ser conseguidas em laboratrio.
2. OBJETIVOS DO TRABALHO
2.1 Objetivo geral
Produo da enzima TAQ polimerase a partir de um extremfilo do filo tardigrada,
utilizando a tcnica de DNA recombinante.
2.2 Objetivos especficos
Identificar o gene responsvel pela expresso da TAQ polmera no Hypsibius
dujardini
Amplificar o gene
Inserir o gene em um plasmdeo e posteriormente fazer a insero da E.coli
Purificao da protena
Testes em PCR.

3. METODOLOGIA
3.1 Extrao do DNA de clulas do Hypsibius dujardini
Aps a coleta de clulas provenientes de Hypsibius dujardini, ser realizada
a extrao de material gentico, proveniente deste. Para tal evento ser
utilizado o kit de extrao de DNA, obtido comercialmente: AccuPrep
Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)
3.2 Sequenciamento do Genoma de Hypsibius dujardini
A partir do DNA extrado ser realizado o sequenciamento do genoma do
organismo de interesse a fim de desvendar o gene responsvel pela
expresso da TAQ polimerase. O DNA extrado, ser fragmentado e
sequenciado em uma das plataformas de alta performance: a SOLiD System,
Solexa e a plataforma 454 FLX.
3.3 Identificao do gene de interesse
Tendo por base o genoma sequenciado, o prximo passo ser identificar o
gene responsvel pela expresso da TAQ polimerase no Hypsibius dujardini.
Sero comparados o genoma em questo com outros j conhecidos, com a
finalidade de reconhecer alguns genes.
Os genes que tiverem sua expresso desconhecida sero inseridos em
plasmdeos e enxertados em E.coli para anlise das protenas produzidas a
partir deles. Por um mtodo de Tentativa, estima-se encontrar, entre essas
colnias de E.coli recombinantes, uma que produza a TAQ Polimerase. A
partir deste evento, o gene ser descoberto.
3.4 Amplificao do gene de interesse
O gene identificado ser ento amplificado por tcnicas de PCR. A
amplificao ser realizada com a finalidade de possibilitar a produo da
enzima de interesse, em maior quantidade.
3.5 Produo da enzima TAQ polimerase, atravs de E. coli
A partir da amplificao do gene, este ser inserido em um plasmdeo e
atravs da tecnologia do DNA recombinante, ser enxertado em E.coli, para
que a enzima seja produzida em grande quantidade.
3.6 Purificao da enzima obtida
O extrato de protenas totais, obtido pela E. coli, ser purificado atravs da
tcnica de cromatografia de afinidade sem colunas de Ni-NTA (Qiagen).

4. ANALISE

5. RESULTADOS ESPERADOS
Espera-se que o desenvolvimento da tcnica de produo da TAQ polimerase
nos permita obter uma enzima com capacidade para ser utilizada tanto em
processos envolvendo PCR convencional como o PCR em tempo real,
capacidade essa, adquirida a partir de suas caractersticas peculiares que seria o
seu alto poder de resistncia em etapas de amplificao resistindo a altas
temperaturas sem que ocorra a sua desnaturao, na qual poderamos
comercializar essa enzima de extremfilo com qualidade superior da mesma
forma ou at mesmo se sobressaindo em relao s enzimas envolvidas em
processos de PCR existentes no mercado atual.
6. CRONOGRAMA


ATIVIDADE

PERIODO
IDENTIFICAO DO GENE AGOSTO/NOVEMBRO
AMPLIFICAO NOVEMBRO/DEZEMBRO
PRODUO DA ENZIMA
ATRAVEZ DA E. COLI COM
O DNA RECOMBINANTE
DEZEMBRO/FEVEREIRO
PURIFICAO FEVEREIRO/MAIO


PCR


MAIO/AGOSTO

7. CONCLUSO
8. REFERNCIAS
BERTOLANI, R.; BISEROV, V.I.. 1996. Leg and claw adaptations in soil tardigrades,
with erection of two new genera of Eutardigrada, Macrobiotidae: Pseudohexapodibius
and Xerobiotus. Invertebrate Biology, 115: 299-304.
http://www.webartigos.com/artigos/filo-tardigrada-descricao-e-sistematica/9200/m.
http://www.brasilescola.com/biologia/escherichia-coli.htm
Wilson, Z. E. and Brimble, M. A.. (January 2009).
http://www.cib.org.br/pdf/fbci12port.pdf
http://www.labome.com.br/method/DNA-Extraction-and-Purification.html
http://www.genome.gov/Pages/Research/Sequencing/SeqProposals/EcdysozoaProposal
FinalPDF.pdf
http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a505cr1820.pdf
http://www.scielo.br/pdf/fb/v29n2/19569.pdf