ANDRADE, A., PINTO, SC., and OLIVEIRA, RS., orgs. Animais de Laboratrio: criao e experimentao [online]. Rio de J aneiro: Editora FIOCRUZ, 2002. 388 p. ISBN: 85-7541-015-6. Available from SciELO Books <http://books.scielo.org>.
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No se sabe, porm, o perodo exato que esse roedor foi levado para a Europa e para todo o continente americano. Wagner & Manning (1976) descreveram e deram algumas referncias sobre a transformao desse roedor nativo em animal de laboratrio. De forma sucinta, tais animais foram vistos pela primeira vez pelos espanhis no Peru, no incio do sculo XVII, e levados por marinheiros para a Europa com o propsito de domesticao e exposio. Anos depois, sendo aproveitados como animais de laboratrio, foram os primeiros a ser utilizados na tentativa de obter animais livres de germes, por meio de cesrias asspticas, por Nuttal e Thierfelder (1895) na Alemanha. A escolha se deu em virtude da maturidade de seus filhotes ao nascer. Com o auxlio de um complicado isolador, conseguiram manter cobaias por mais de 10 dias livres de microorganismos, porm, no se desenvolveram. Reyniers (1946) obteve com sucesso a produo desses animais livres de germes em isoladores mais adequados. Cepas consangneas de cobaias foram obtidas a partir de 1906 e contriburam grandemente para a compreenso da gentica e da reproduo. IMPORTNCIA NA EXPERIMENTAO BIOLGICA A cobaia conhecida, por muitos, como smbolo representativo dos animais de laboratrio. As primeiras utilizaes, com fins experimentais, foram realizadas por Lavoiser, em 1790, em investigaes relacionadas ao calor. Atualmente, as cobaias so muito utilizadas em experimentaes ligadas nutrio, farmacologia, imunologia, alergia, radiologia etc. o animal de eleio para obter complemento necessrio em muitas reaes imunolgicas denominadas, em geral, de fixao do complemento, entre as quais se destaca a clssica reao de Wassermann, empregada para o diagnstico clnico e para isolar Mycobacterium tuberculosis, variedade hominis, e na demonstrao de carncia por vitamina C. Esses animais so bastante utilizados nos testes de reativos biolgicos. 10 72 ANIMAIS DE LABORATRIO POSIO TAXONMICA Classe: Mamfera Ordem: Rodentia Famlia: Cavidae Gnero: Cavia Espcie: Porcellus Cavia porcellus. Variedade inglesa. Fonte: Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz. Wagner & Manning (1976) descreveram as diferentes espcies do gnero Cavia que so encontrados predominantemente em determinadas regies da Amrica do Sul. Na Argentina, no Uruguai e no Brasil so encontrados Cavia aperea, enquanto no Peru encontrada Cavia cutleri. Festing (1976) considerou que Cavia porcellus derivada de Cavia aperea, e Cavia cutleri e Cavia rufescens so, na realidade, formas de Cavia aperea. As variedades de Cavia porcellus so identificadas pelo tamanho e pela direo dos plos. A variedade inglesa (Dunkin Hartley) apresenta plo curto (short hair), liso e macio. a variedade mais comum e aparentemente a mais bem adaptada e utilizada em pesquisas. A variedade abissnia, que apareceu na Inglaterra, uma mutante de plos curtos e speros que crescem em redemoinho ou rosetas, enquanto a variedade peruana uma mutante de plos longos e sedosos. Raramente so utilizadas em pesquisa e se mantiveram, quase exclusivamente, para fins de domesticao e de exposio. A cepa iniciada por Dunkin e Hartley, em 1926, a estirpe progenitora de muitas cobaias; deu grande contribuio para a compreenso da gentica e para a reproduo da espcie. COMPORTAMENTO As cobaias so animais sociais, tmidos, dceis e raramente mordem ou arranham. Assustam-se facilmente, defecam e urinam nos comedouros e derramam sua alimentao pelo piso da gaiola. Gritam de prazer antes de situaes gratificantes (alimentao) e ficam muito juntas ou em cima umas das outras durante o manejo da colnia pelo tcnico. Os animais adultos, freqentemente, mordem as orelhas dos jovens e os machos podem brigar violentamente, principalmente durante disputas por uma fmea em estro, at que se estabelea a hierarquia do grupo. 73 Criao e manejo de cobaias Outra caracterstica marcante das cobaias a de que so extremamente susceptveis a estmulos estressantes, sobretudo a alteraes ambientais. Simples modificaes na rao, no comedouro, na gua e no bebedouro podem levar os animais a recusar o alimento. Alm disso, estmulos como barulho intenso ou movimentos bruscos assustam os animais, que passam a correr de um lado para o outro, provocando ferimentos entre eles. Ocasionalmente, durante a conteno para a troca de gaiolas, podemos observar paralisao do animal por vrios minutos e at mesmo a morte. Isso implica dizer que o trabalho com essa espcie deve ser realizado com muito cuidado, principalmente no que se refere s fmeas grvidas ou aos recm-nascidos, os quais podem ser pisoteados pelos outros animais do grupo. As cobaias so muito sensveis toxicidade por vrios antibiticos, tais como tetraciclina, penicilina e cloranfenicol. PRINCIPAIS CARACTERSTICAS ANATMICAS E FISIOLGICAS A cobaia um roedor de estatura baixa e com o corpo arredondado e sem cauda. So animais de olhos salientes, vivos, brilhantes, pretos ou transparentes (albinos) e de orelhas pequenas, largas e dobradas. Os machos so mais corpulentos que as fmeas, exceto durante a gravidez. Tanto os machos como as fmeas possuem um par de glndulas mamrias abdominais. A frmula dentria para animais adultos a seguinte: incisivos 1/1, caninos 0/0, pr-molares 1/1 e molares 3/3. Tm um total de 20 dentes permanentes sem raiz e com crescimento contnuo. Possuem quatro dedos nas patas anteriores e trs nas posteriores. Os eritrcitos das cobaias so menos frgeis em solues eletrolticas. A protrombina apresenta um longo tempo para sua converso em comparao com a maioria das espcies. Tem escassa produo de tromboplastina no pulmo. As fmeas de idade avanada so excelentes fontes de complemento, usado freqentemente para os ensaios sorolgicos. O sistema linftico bem desenvolvido e os gnglios da regio ventral da cabea e do pescoo so facilmente acessveis para fins exploratrios e tambm mais afetados por abscessos bacterianos. A temperatura retal situa-se, em mdia, em torno de 38,5 C. NUTRIO As cobaias so fundamentalmente herbvoras e comem a maioria dos tipos de gros, verduras e pasto. As raes comerciais so peletizadas, com dimetro recomendvel de no mximo de 50 mm, e devem ser administradas em comedouros adequados para minimizar o desperdcio, contaminao fecal e urinria. O consumo mdio dirio de rao comercial peletizada pelos animais adultos de 40 g. As cobaias, do mesmo modo que primatas no-humanos e o prprio homem, so dependentes de fontes exgenas de cido ascrbico. A deficincia de cido ascrbico na alimentao das cobaias responsvel pelo aparecimento de sinais e sintomas caractersticos que comeam com a reduo no consumo de alimento e perda de peso, seguidas por anemia e hemorragia generalizada. Em razo dessas alteraes, ou de infeces bacterianas secundrias, a morte sobrevm em 3 a 4 semanas (National Research Council, 1978). A incapacidade para sintetizar o cido ascrbico atribuda a uma deficincia, de origem gentica, da enzima heptica gluconolactona oxidase necessria para produzir cido L-ascrbico que, em outros animais, procede da D-glucosa. O contedo de vitamina C nos alimentos, em forma de pellets, reduz-se com o perodo de fabricao e armazenamento. As raes com mais de 90 dias de fabricao podem no conter quantidade suficiente de vitamina C para manter os animais em bom estado de sade. A suplementao de vitamina C, atravs de vegetais verdes, na 74 ANIMAIS DE LABORATRIO quantidade de 50 a 100 g/dia/animal, tem sido bastante utilizada. Porm, essa suplementao deve ser vista com restries, em virtude de fatores desconhecidos que podem favorecer a contaminao dos animais pela dificuldade do controle da fonte produtora e da eliminao de agentes patognicos. Tem sido difcil determinar a quantidade de vitamina C exata por animal, pois dependem da sua condio fisiolgica. sugerida a quantidade diria de 10 mg/kg para manuteno de animais e de 30 mg/kg para fmeas grvidas. Recomendamos a suplementao de vitamina C em gua na proporo de 300 mg/litro. Deve ser preparada diariamente, por ser tratar de uma de vitamina termolbil. Os bebedouros, em geral, so fabricados de material plstico com capacidade de 1 litro, equipados com bicos de ao inox e colocados do lado de fora das gaiolas, evitando, assim, o derramamento de gua em seu interior. Tabela 1 Necessidades nutricionais para cobaias (concentrao na dieta) NUTRIENTE UNIDADE NECESSIDADE Protena (cresc.) % 18 cido linoleico % 1 Energia Total Kcal/g 3 Fibra % 10 MINERAIS Clcio % 0.9 Magnsio % 0.2 Fsforo % 0.6 Potssio % 1.0 Cobre % 6.0 Iodo % 1.0 Ferro % 50.0 Mangans % 40.0 Zinco % 20.0 Cromo % 0.6 Selnio % 0.1 VITAMINAS A Mg/kg 7.0 D UI/kg 1000.0 E Mg/kg 50.0 K Mg/kg 5.0 C Mg/kg 200.0 Biotina Mg/kg 0.3 Colina Mg/kg 1000.0 Acido Flico Mg/kg 4.0 Niacina Mg/kg 10.0 Pantotnico Mg/kg 20.0 Riboflavina Mg/kg 3.0 Tiamina Mg/kg 2.0 Piridoxina Mg/kg 3.0 Cianocobalamina Ug/kg 10.0 Fonte: Nutrient Requirements of Laboratory Animals (1978). 75 Criao e manejo de cobaias SISTEMA DE REPRODUO A cobaia um animal polistrico. O estro dura menos da metade de um dia e o ciclo estral completo tem a durao de 13 a 25 dias (em mdia 16 dias). O nmero mdio de filhotes por ninhada 2, variando de 1 a 8. Perodo de gestao: cerca de 59 a 72 dias ou mdia de 63 dias, ou seja, longo para um animal to pequeno. A ovulao espontnea e o corpo lteo funcional, em contraste com a condio encontrada em todos os outros roedores que foram investigados. A poca da puberdade situa-se aproximadamente entre 55 e 70 dias de idade, ,, ,, em condies normais de manejo. Se alimentados com raes mais ricas do que a usual, h maior desenvolvimento do animal e a puberdade pode ocorrer entre 45 a 60 dias. Uma srie de trabalhos enuncia como idade mdia do aparecimento do primeiro cio aproximadamente 67,8 dias de idade, mais ou menos dois dias, com desvio-padro de 21,5 dias, com variao de 33 a 134 dias. A idade mdia da ruptura da membrana que fecha a vagina se d em torno de 58,2 dias. O intervalo entre a primeira ruptura e o primeiro cio vai de 0 a 4 dias. O cio comea freqentemente ao anoitecer. O proestro, onde se nota congesto e tumefao dos genitais externos e uma ligeira descarga serosa da vagina, usualmente dura 24 a 36 horas. O cio onde h receptividade sexual dura de 6 a 11 horas em 90% dos casos. A ovulao ocorre usualmente 10 horas aps o comeo do cio ou da receptividade sexual. Cerca de 64% de todos os perodos de cio comeam entre 18 horas a 6 horas. O cio ocorre imediatamente depois do parto em cerca 64% das fmeas. Usualmente, ele comea duas horas aps o fim do parto. Algumas fmeas apresentam ovulao aps o parto, sem sinais de cio. Uma fecundao bem-sucedida indicada pela expulso do tampo vaginal, uma substncia branca e serosa, com cerca de 2,5 cm de comprimento proveniente da coagulao do lquido seminal que aparece 24- 48 horas aps o acasalamento. O tampo escurece rapidamente e, ento, muitas vezes no possvel distingui- lo no meio das fezes no fundo da gaiola. Ele pode nos indicar com preciso o tempo da gestao ou o momento prximo do parto, pois sua presena garante 80% da fecundao da fmea. Os filhotes j nascem recobertos de plos, com os olhos abertos e a dentio completa, o que lhes confere precocidade e auto-suficincia, uma vez que j podem consumir alimentos slidos (3-5 dias de idade). O leite materno ainda fundamental aos neonatos para a proteo contra doenas infecciosas. Desse modo, o desmame pode ser feito aos 14 dias, mas a melhor indicao de que ocorra quando os animais apresentem 21 dias de idade. O reconhecimento dos filhotes pela me pode ser feito a distncia, porm no deixam de amamentar os filhotes de outras fmeas, desde que sejam do mesmo grupo de convivncia. O peso dos filhotes ao nascer fica entre 80 a 100 gramas. SISTEMA DE ACASALAMENTO A escolha dos animais para acasalamento deve ser cuidadosa. Alm de selecionar machos e fmeas jovens, fortes e saudveis, devemos ter o cuidado de escolher criteriosamente pelos seus valores genticos (ver controle da consanginidade da colnia). O acasalamento pode ser realizado quando as fmeas tiverem aproximadamente trs meses de idade (400 g - 500 g) e os machos quatro meses (500 g - 600 g), mas acasalamentos frteis so observados entre animais de 8 a 10 semanas. O primeiro parto deve ocorrer antes dos 6 meses de idade. Depois desse tempo, a snfise pbica (articulaes da plvis-anel plvico) tende a se soldar mais firmemente por um processo de calcificao, produzindo estreitamento mecnico do canal de nascimento que resultar em partos distrcicos. 76 ANIMAIS DE LABORATRIO Os acasalamentos podem ser monogmicos e poligmicos permanentes. O acasalamento monogmico um sistema que compreende um macho e uma fmea acasalados durante toda a vida reprodutiva. Tem a vantagem da fcil identificao dos filhotes e a manuteno de registro fidedigno, elevada porcentagem de cio frteis ps- partos, de filhotes desmamados, maior controle das enfermidades, boa seleo dos reprodutores e amplamente utilizado em colnias consangneas onde empregam acasalamento entre irmos. As desvantagens so o aumento de mo-de-obra, necessidade de grande nmero de machos reprodutores, de espaos maiores e de mais pessoal. O acasalamento poligmico um sistema que compreende 1 macho para um grupo de 5 a 12 fmeas respeitando o espao mnimo por animal (1200 cm 2 ). Recomendamos 1 macho para cada 5 fmeas com gaiolas de 100 cm de comprimento, 70 cm de largura e 30 cm de altura, fabricada em plstico e autoclavvel. Esse sistema o mais utilizado na maioria das colnias de grande produo. A vantagem dele consiste em ter o maior nmero de animais produzidos em menos espao. Tem como desvantagem a dificuldade para o registro dos animais e a identificao da fmea e do macho no-frteis. Os reprodutores so mantidos na colnia at a idade de 24 a 30 meses. DESMAME E SEXAGEM Independente do sistema de produo, os filhotes devem ser desmamados com trs semanas de idade. O melhor critrio quando no existe registro, provavelmente quando alcanam mais 180 g de peso. Os animais devem ser separados por sexo e tamanho. Tanto os machos quanto as fmeas apresentam o orifcio genital em igual distncia do nus. Nos machos, esta rea ligeiramente arredondada com sulco nico e contnuo entre a abertura da uretra e o nus, enquanto nas fmeas esse sulco interrompido pela membrana vaginal, exceto durante o estro ou no trmino da gravidez. Nos machos, os testculos podem ser palpados e o pnis pode ser exteriorizado facilmente mediante uma presso na regio inguinal. CONTROLE DA CONSANGINIDADE NA COLNIA ANIMAIS CONSANGNEOS INBRED so obtidos pelo acasalamento entre irmos, e/ou pais e filhos, durante 20 ou mais geraes consecutivas. Os estudos genticos em relao as cobaias foi iniciado em 1906 pela Animal Husbandry Division of the U.S. Bureau of Animal Industry. Este estudo foi complementado por Wright a partir de 1915. Desde ento, consta de 35 cepas inbred destinadas principalmente ao estudo do cncer. ANIMAIS NO-CONSANGNEOS OUTBRED so animais que apresentam constituio gentica variada, em estado de heterozigose, a qual deve ser conhecida e mantida. O emprego do sistema de acasalamento rotacional visa a manter animais heterozigotos, evitando o acasalamento de parentes prximos e assegurando que a gerao seguinte venha de um maior nmero de pais do que o que ocorreria se fosse ao acaso. Ao empregar esse sistema, a colnia se desenvolve em vrios grupos de igual nmero, de modo que a quantidade de fmeas e machos em todos os grupos sempre igual. O nmero de grupos de uma colnia est relacionado a seu tamanho (nmero de reprodutores). Quanto menor a colnia, maior o nmero de grupos. Em colnia de criao e produo de cobaias, utilizamos um sistema de acasalamento similar ao rotacional (Mtodo Poiley). Por exemplo: Suponhamos que a colnia consista de 510 fmeas e 102 machos, com gaiolas para cada unidade reprodutiva (5 fmeas x 1 macho), numeradas de forma que identifique os grupos e as unidades reprodutivas. E que essa colnia esteja dividida em 6 grupos, onde cada grupo constitudo de 85 fmeas e 17 machos. Recomendamos 77 Criao e manejo de cobaias ainda, para cada grupo, reserva de animais jovens para substituio anual de 50% dos reprodutores da colnia, retirados de cada unidade reprodutiva trs meses antes, para crescimento e observao dos futuros reprodutores. Sabendo-se que o ciclo de acasalamento (perodo reprodutivo dos reprodutores) varia entre 2 a 3 anos de idade. Quadro 1 Esquema sobre como os acasalamentos sero efetuados Formao do grupo = Macho do grupo x Fmea do grupo 1 = 3 6 2 = 6 1 3 = 5 2 4 = 1 3 5 = 2 4 6 = 4 5 PRODUO MENSAL ESTIMADA EM UMA COLNIA COM 510 FMEAS E 102 MACHOS REPRODUTORES Sabendo-se: Perodo mdio de gestao = 63 dias Nmero mdio de filhotes/parto = 2,75 Taxa de mortalidade de lactente = 10% Nmero de filhotes desmamados/parto = 2,5 Desmame = 21 dias de idade Acasalamento = mdia de 90 dias de idade Intervalo entre partos = 63 dias de gestao 16 dias de ciclo estral 79 dias 365 dias (ano): 79 dias (intervalo) = 4,6 partos/ano. OBS.: aproximadamente 5 partos, devido a um nmero significativo de fmeas fecundadas imediatamente aps o parto. 5 partos x 2,5 filhotes = 12,5 filhotes desmamados/ano/fmea 12,5 desmamados/ano x 510 fmeas = 6.375 desmamados/ano ou seja, 531,25 desmamados/ms. Para fins de clculo de produo, consideramos o ndice reprodutivo igual a 1 filhote/fmea/ms. Dos filhotes nascidos e/ou desmamados, 50% so fmeas e 50% machos. Sabendo-se que em cada perodo de 24 meses o nmero de reprodutores (machos e fmeas) so substitudos em 100%. Mensalmente, so substitudos 1:24 fmeas = 21,25 e 1:24 machos = 4,25. Considerando que a taxa de mortalidade dos reprodutores e animais em crescimento seja 3%, necessitamos de reserva mensal de 22 fmeas e 5 machos de filhotes desmamados para futuros reprodutores. 78 ANIMAIS DE LABORATRIO IDENTIFICAO DOS ANIMAIS E REGISTRO DA COLNIA DE COBAIA necessrio contar com um bom mtodo de identificao dos animais para garantir um registro fidedigno da colnia. O mtodo mais satisfatrio mediante a tatuagem individual nas orelhas, usando uma pina de tamanho apropriado. E em cada orelha se pode ter trs letras ou nmeros. Aplicao de corantes tais como a soluo de cido pcrico (amarelo), embora eficiente, de curta durao e deve ser periodicamente renovada. Os registros dos eventos ocorridos com os animais, nas respectivas fichas de identificao da unidade reprodutiva ou em livro, devem conter informaes suficientes para que se tenha, a cada momento, uma posio exata de tudo o que acontece na colnia, como: data do acasalamento, nascimento, quantidade de filhotes nascidos, mortos, desmame, variaes ambientais etc. CONTENO O mtodo mais seguro para conter uma cobaia colocar uma mo sob o trax e com a outra apoiar a parte posterior, para suportar o peso do animal, permitindo que ele fique sentado sobre a palma da mo. Deve-se evitar apertar o trax pela sua fragilidade. Os anestsicos devem ser utilizados sempre que necessrio, obtendo-se maior facilidade e tempo de manipulao do animal. Quadro 2 Medicao pr-anestsica para cobaias DROGA DOSAGEM VIA EFEITO Atropina 0,03 0,05 mg/kg S.C. tranqilizante por 30 min. Diazepan 5,0 mg/kg I.P. tranqilizante, mas no produz analgesia Diazepan + 0,1 mg I.M. rpida imobilizao e bom relaxamento muscular Ketamina 44 mg/kg Ketamina 25 a 44 mg/kg I.M Tranqilizante Fonte: Guide to the Care and Use of Experimental Animals (1984). Quadro 3 Anestsicos injetveis para cobaias (hipntico/sedativo) DROGA DOSAGEM VIA EFEITO Fentanyl/droperidol (innovar vet) 22-88 ml / kg I.M. Tranqilizante anestesia Ketamina HCl + 100 mg / ml Promazine HCl + 7,5 mg / ml I.M. Anestesia Aminopentamide Sulphate 0,0625 mg / ml (Ketaset Plus-Bristol) 125 mg / kg Pentobarbital 30 a 40 mg / kg I.P. ou I.V. Anestesia Thiopental 55 mg / kg I.P. ou I.V. Anestesia Fonte: Guide to the Care and Use of Experimental Animals (1984). 79 Criao e manejo de cobaias Os anestsicos por inalao, em particular o metoxiflurano, so agentes de escolha para anestesia em cobaia. O ter , ainda, freqentemente usado como relaxante muscular e analgsico, sempre associado atropina para conter a excessiva salivao. 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