CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS GRUPOS MICROBIANOS
Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biolgicos. El crecimiento microbiano requiere la formacin de estructuras complejas como protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos a partir de elementos preformados en el medio de crecimiento o ser sintetizados por la propia clula, a su vez, este crecimiento necesita de una fuente de energa para ser llevado a efecto, todo este proceso se designa con el nombre de metabolismo, que se define como todas las transformaciones qumicas que ocurren en una clula. Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a transformar las molculas nutritivas en elementos que posteriormente sern utilizados para la sntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las protenas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energa que est contenida en una reaccin qumica en algn proceso que requiera de energa como puede ser el trabajo o el movimiento. Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en ningn caso el alimento contiene todas las molculas que una clula requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que slo contena glucosa como nica fuente de energa. As pues, se pens que la sntesis de todos los componentes celulares se llevaba acabo en el interior de las levaduras. Hoy se conoce que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una funcin especfica a no ser la de formar parte delo que se conoce como va metablica. La transformacin de los nutrientes en compuestos tiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones qumicas que realizan unas protenas conocidas como enzimas. El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones qumicas que tiene lugar en la clula, y tiene tres funciones especficas a saber: - Obtener energa qumica del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones celulares, - Convertir los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la clula bacteriana, - Formar y degradar molculas necesarias para funciones celulares especficas, como por ejemplo, movilidad y captacin de nutrientes.
La energa liberada en las reacciones catablicas se usa para fosforilar ADP,generando ATP. La energa almacenada en el ATP se utiliza en la mayora de los trabajos celulares. Por lo tanto, el ATP acopla los procesos productores de energa de la clula a los consumidores de energa. Figura N 1.2. Todos los procesos que ocurren en la clula o bacteria requieren de energa. Esta energa est almacenada como molculas de ATP, que se forma a partir de ADP y fosfato inorgnico.
El metabolismo tiene lugar a travs de secuencias de reacciones catalizadas enzimticamente, y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la clula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en la produccin de nuevo material celular, tambin se denomina biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones de gradativas de los nutrientes para obtener energa o para convertirlos en unidades. Figura N 1.3.
TIPOS DE METABOLISMO MICROBIANO Los distintos tipos de metabolismo microbiano se pueden clasificar segn tres criterios distintos: 1. La forma la que el organismo obtiene el carbono para la construccin de la masa celular: Auttrofo. El carbono se obtiene del dixido de carbono (CO 2 ). Hetertrofo. El carbono se obtiene de compuestos orgnicos (glucosa, por ejemplo). Mixtrofo. El carbono se obtiene tanto de compuestos orgnicos como fijando el dixido de carbono. 2. La forma en la que el organismo obtiene los equivalentes reductores para la conservacin de la energa o en las reacciones biosintticas: Litotrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos inorgnicos. Organotrofo. Los equivalentes reductores se obtienen de compuestos orgnicos. 3. La forma en la que el organismo obtiene la energa para vivir y crecer: Quimiotrofo. La energa se obtiene de compuestos qumicos externos. Fototrofo. La energa se obtiene de la luz.
En la prctica, estos trminos se combinan casi libremente. Los ejemplos tpicos son como sigue: Los quimiolitoauttrofos obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos y el carbono de la fijacin del dixido de carbono. Ejemplos: bacterias nitrificantes, bacterias oxidantes del azufre, bacterias oxidantes del hierro, bacterias oxidantes del hidrgeno. Los fotolitoauttrofos obtienen energa de la luz y el carbono de la fijacin del dixido de carbono, usando compuestos inorgnicos como equivalentes reductores. Ejemplos: Cyanobacteria (agua como equivalente reductor), Chlorobiaceae,Chromaticaceae (sulfuro de hidrgeno), Chloroflexus (hidrgeno). Los quimiolitohetertrofos obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos, pero no pueden fijar el dixido de carbono. Ejemplos: algunos Nitrobacter spp., Wolinella (con hidrgeno como equivalente reductor), algunas bacterias oxidantes del hidrgeno. Los quimioorganohetertrofos obtienen energa, carbono y equivalentes reductores para las reacciones biosintticas de compuestos orgnicos. Ejemplos: La mayora de las bacterias, como Escherichiacoli, Bacillus spp., Actinobacteria. Los fotoorganotrofos obtienen energa de la luz y el carbono y los equivalentes reductores para las reacciones biosintticas de compuestos orgnicos.
COMPETENCIAS Manipula e identifica los microorganismos en funcin a su comportamiento bioqumico.
MATERIALES Y EQUIPOS
Placas con agar nutritivo con 1% de almidn Tubos con: gelatina, caldo peptonado, caldo MR VP (Rojo de Metilo VogesProskauer), caldo lactosado con indicador de Andrade. Tubos con medio de: Citrato de Simmons en plano inclinado, Urea, TSI en plano inclinado y con TSA. Cultivos de: E. coli,B. subtilis,Ps. aeruginosa, Enterobacter,Proteusvulgaris,Staphylococcus. aureus,Streptococcusviridans. Lugol. Reactivos de: kovacs, rojo de metilo, Voges Praoskauer: alfa-naftol al 5%, en alcohol amlico, KOH creatina al 40% Tiras de papel de filtro impregnadas con solucin saturada de acetato de plomo. Perxido de hidrgeno al 3%. Campanas de Durham y pipetas Pasteur.
PROCEDIMIENTO 1. UTILIZACION DE CARBOHIDRATOS A.) CALDO LACTOSADO
Inocule en el tubo de caldo lactosado con Shigella. Incubar a 37 C por 24 horas.
B.) TSA CON ALMIDON 5%
Siembre en la placa petri que contiene TSA con almidn al 5 % el m.o Shigella, incube a 37 C por 24 horas.
C.) TSI: TRIPLE SUGAR IRON
Con el asa de siembra, inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la superficie del pico de flauta. Rotular e incubar a 37C por 24 horas.
D.) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL-METIL-CARBINOL (ACEOTINA)
1. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER Por la tcnica de inoculacin sembrar el m.o Shigella, incubar a 37C por 24 horas.
2. PRUEBA DE ROJO DE METILO Por la tcnica de inoculacin sembrar el m.o Shigella, incubar a 37C por 48-72horas.
2. PROTEINAS A.) HIDRLISIS DE LA GELATINA Inocule el m.o Shigella en el tubo que contiene gelatina haciendo uso de un asa en punto introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.
B.) PRODUCCION DEL INDOL
Inocule el m.o Shigella en el tubo que contiene caldo peptonado haciendo uso de un asa en punto por el mtodo de inoculacin. Inocule a 37 C por 24 horas. Al segundo dia agregue 4 gotas del reactivo de Kovac dejando resbalar por la pared interna que presenta el desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.
C.) PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO Por una tcnica de puntura y estria, sembrar el m.o en el medio de TSA. Luego coloque una tira de papel de filtro impregnada con acetao de plomo, finalmente incube a 37C por 24 horas.
E.) SIM
Sembrar el m.o Shigella en el medio de cultivo SIM, incubar a 37C por 48-72horas
3. PRUEBAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES A.) UTILIZACION DEL CITRATO
Sembrar por la tcnica de estria con la sepa de Shigella. Incubar a 37C por 24 horas.
B.) HIDRLISIS DE LA UREA Por la tcnica de estra sembrar en el medio de urea el m.o Shigella Incubar a 37C por 24 horas.
C.) PRUEBA DE LA CATALASA Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubo con el cultivo de Shigella y transferir el inoculo a un portaobjeto limpio. Aadir 2 gotas de H 2 O 2 3% Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
RESULTADOS: A) CARBOHIDRATOS 1.- CALDO LACTOSADO
La prueba resulto positiva porque se observo el desprendimiento de gases, es decir burbujas (CO2) en el tubo de Dunhan.
2.- TSI
4.- PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL METIL CARBINOL ROJO DE METILO
VOGES PROSKAWER El tubo de ensayo que contena TSI cambio de coloracin (rojo-amarillo), siendo esto un resultado positivo y significando que la bacteria Shigella ferment 3 azucares (glucosa, lactosa y sacarosa).No hubo produccin de gas. El rojo de metilo es un indicador de pH, que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable, esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta, pero en este caso con la bacteria Shigella nos dio NEGATIVO.
PROTEINAS 1.- CALDO PEPTONADO
Se realizo para determinar la presencia de INDOL que es uno de los productos de degradacin metablica del triptfano, y da positivo para las bacterias que poseen triptofanasa porque estas son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, acido piruvico y amoniaco. Esta prueba est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p- dimetilaminobenzaldehido, en este caso para Shigella nos dio un resultado NEGATIVO porque no existe la formacin del anillo rojo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva, pero en este caso con Shigella nos dio un resultado NEGATIVO.
2.- SIM
3.- PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO TSA
Nos dio un resultado negativo, el cual indica que Shigella no presenta movilidad ya que solo creci en el rea de la puntura. Los bacilos productores de este gas hacen que el medio tome un color enengrecido cas siempre en la profundidad. Como producto final metablico se obtiene sulfuro del hidrgeno (H 2 S). El hidrgeno producido durante la fermentacin es realmente quin conduce la respiracin durante la reduccin del sulfato. Eventualmente, los electrones pasan de la enzima hidrogenasa a la APS reductasa, que junto con la sulfito reductasa termina la reduccin del sulfato a sulfuro del hidrgeno, pero en este caso obtuvimos un resultado NEGATIVO.
4.- GELATINA
USO DEL CITRATO
Se usa para valorar la licuefaccin o licuacin de la gelatina por accin de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas Enterobacterias. La reaccin positiva hace que el medio permanezca lquido despus de la incubacin an despus de dejarse en refrigeracin durante media hora. La reaccin negativa permite nuevamente la solidificacin.
Mide la capacidad de un organismo para utilizar el citrao como nica fuente de carbono, las bacterias al usar citrato extraen nitrgeno de la sal de amonio con produccin de amoniaco (alcalinizacin del medio) que hace que vire el indicador de verde a azul, en este caso nos dio un resultado POSITIVO porque la muestra final viro a color azul. REACCION DE CITOCROMO OXIDASA
PRUEBA DE CATALASA
Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura, en este caso nos dio un resultado NEGATIVO, lo cual indica que la bacteria no presenta la citrocromo oxidasa.
Esta prueba detecta la presencia de citocromooxidasas. La produccin inmediata y abndante de burbujas indica la conversin del H2O2 en agua y oxigeno gaseoso, pero en este caso nos dio un resultado POSITIVO. 4.- HIDRLISIS DE LA UREA
CONCLUSIONES Todos los organismos tienen una temperatura optima de crecimiento, crecimiento pero algunos tienen la capacidad para resistir cambios moderados de temperatura. Estos realizan pequeas alteraciones en su metabolismo para poder tolerar el cambio y as poder sobrevivir. sobrevivir Ej. E. coli en la sntesis de cidos grasos saturados e insaturados
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Se utiliza para la valoracin de la produccin de ureasa por algunas enterobacterias. Este medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el indicador se vuelve rojo prpura, en este caso se observo una ligera formacin rojiza en la base del tubo.