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PRCTICA 8: ELECTROFORESIS EN GELES DE POLlACRILAMIDA EN

CONDICIONES DESNATURALlZANTES (SDS-PAGE).
1. OBJETIVO
Separar las protenas obtenidas en los extractos celulares y en el
fraccionamiento las prcticas anteriores mediante una electroforesis
en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes

2. FUNDAMENTO
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos
ms utilizados para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas.
La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en
movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. La
electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre
geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-
PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes
de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos (p.e.
urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin
de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms
habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del
tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las
protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la
protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia
de peso molecular conocido.
En el apartado de conclusiones realizaremos una descripcin ms
detallada de la electroforesis desnaturalizante.

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3. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
A continuacin se detalla el material e instrumental necesarios para la
realizacin de la prctica.
3.1. EQUIPAMIENTO
pH-metro.
Agitador magntico.
Balanzas de precisin.
Centrfuga de mesa.
Equipo de electroforesis para mini-geles con accesorios (sistema
de montaje y preparacin de geles, espaciadores para geles de
0,75 mm de espesor, peines para formar 10 pocillos, placas de
cristal).
Fuente de electroforesis.
Bloque seco.
Agitador orbital.
Transiluminador.
Sistema de documentacin.

3.2. MATERIAL
Agua destilada.
Rotulador indeleble.
Etiquetas adhesivas de papel.
Esptulas.
Tijeras.
Botellas de vidrio o plstico para almacenar soluciones.
Papel de filtro.
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Matraz.
Vasos de precipitado y probetas (25, 50 y 100 ml).
Imn para agitacin magntica.
Guantes de goma.
Pipetas automticas y puntas.
Pipetas Pasteur.
Tubos eppendorf de 1,5 ml.
Gradillas.
Frasco lavador con agua destilada.
Bandejas de plstico para el teido de geles.

2.3. REACTIVOS
Extractos proteicos
Solucin de acrilamida/bis-acrilamida 30/0,8% (p/v)
Tris-HCl 1 M, pH 6,8
Tris-HCl 1 M, pH 8,8
SDS 10% (p/v)
Persulfato amnico (APS) 10% (p/v)
TEMED (preparado comercial).
Tampn de electroforesis: SDS 0,1 %, Tris 0,025M/glicina
0,192M, pH 8,3
Tampn de carga 4X: SDS 16% (p/v), glicerol 40% (v/v), 2-
mercaptoetanol 20% (v/v), EDTA 30 mM, azul de bromofenol
0,016% (p/v), Tris-HCl 0,25 M, pH 6,8.
Marcadores de peso molecular de protenas.
Solucin de tincin: 0,1% de azul de Coomassie en 40% de etanol,
10% de cido actico.
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Solucin desteidora: Metanol, 40% (v/v), actico 10% (v/v).

4. PROCEDIMIENTO
4.1. PREPARACIN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA
En la presente prctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de
espesor. Las cantidades indicadas para la preparacin de las soluciones en
la siguiente tabla corresponden a la preparacin de dos geles. Cada uno de
ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud
que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de
aproximadamente 6 cm.


GEL DE
EMPAQUETAMIENTO
(STACKING) AL 4%
GEL SEPARADOR
(RUNNING) AL 12%
Sol. Acrilamida/bis al
30/0,8 %

0,65 ml 4 ml
Tris-HCl 1 M

0,625 ml (pH 6,8) 3 ml (pH 8,8)
SDS 10%

50 l 0,08 ml
TEMED

5 l 8 l
APS 10%

50 l 0,08 ml
Agua destilada

3,62 ml 0,8 ml
Volumen

5 ml 8 ml



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Clculos para el gel de empaquetamiento:
Solucin acrilamida/bis al 30/0.8 %

APS 10%


0,005 g de APS

Clculos para el gel separador:
Solucin acrilamida/bis al 30/0.8 %

APS 10%


0,01 g de APS

A. Preparacin del gel separador al 12%
Se mezcla en una probeta los componentes en el siguiente orden: agua
destilada, Tris-HCl, SDS, acrilamida/bis, APS y TEMED
Con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se aade la mezcla en el
interior del molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior
de la placa mayor, de forma que quede suficiente espacio para el gel
concentrador (se debe calcular 1 cm ms de la longitud de los pocillos del
peine).
A continuacin, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel
con isobutanol, isopropanol o agua destilada. Esto previene el contacto del
oxgeno con el gel que inhibe la reaccin de polimerizacin.
La polimerizacin del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.

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B. Preparacin del gel concentrador al 4%
Se elimina el alcohol que cubre el gel separador, y se lava la parte
superior del gel 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier residuo
de acrilamida no polimerizada. Se seca el lquido restante en la parte de
superior del gel con papel de filtro con cuidado de no daar el gel.
Se mezclan en una probeta los componentes en el orden indicado
anteriormente.
Utilizando una pipeta Pasteur, se introduce la solucin directamente
sobre la superficie del gel separador. Inmediatamente se inserta el peine en
la solucin concentradora con cuidado para evitar que se formen burbujas
de aire
Se espera hasta que el gel haya polimerizado (aproximadamente 30
minutos). Se retira el peine cuidadosamente con un movimiento vertical.
ATENCIN: La acrilamida y bisacrilamida son agentes neurotxicos que
se absorben a travs de la piel. Es necesario llevar guantes durante todo el
proceso, incluso despus de polimerizar el gel, ya que puede contener
cantidades de material no polimerizado.

NOTA: La polimerizacin comienza en el momento en que se aade el
TEMED, por lo tanto se debe trabajar con rapidez a partir de este
momento.

4.2. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS
1. Aadir el tampn de carga 4x a las muestras a desarrollar en la
electroforesis.

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2. Calentar las muestras en bao de agua a ebullicin durante 3 min.
3. Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta (hasta 20 l)
en los pocillos, en un orden predeterminado y previamente anotado. No
se olvide aadir, en un carril, la solucin de protenas estndar, de
peso molecular conocido.

Las muestras que se van a cargar son:
Clulas enteras de los cultivos o/n. al pellet de los 100 l de
cultivo o/n se le aade 20 l de tampn de carga 6X.
20 l del extracto proteico y 4 l del tampn de carga 4X.

4.3. ELECTROFORESIS
1. Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de
electroforesis.
2. Se prepara el tampn de electroforesis a partir de la solucin
concentrada y se aade en los reservorios interior y exterior. Se
retiran, si las hubiera, las burbujas de aire y restos de acrilamida
del interior de los pocillos, introduciendo tampn de electroforesis
en los mismos.
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3. Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la
fuente de alimentacin y se aplica corriente elctrica. La corriente
elctrica recomendada para geles de 0,75 mm de grosor es un
voltaje constante de 100-200V.
4. La duracin aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez
acabada la electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol
alcanza la parte inferior del gel, se desconecta la fuente de
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alimentacin, retirndose los electrodos y sacando los geles de la
cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de
trabajo.
5. Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando
cuidadosamente con ayuda de una esptula ambos cristales. Se
elimina el gel concentrador y se hace una muesca al gel en una de
las esquinas para orientar la posicin de las muestras (por ejemplo
en la esquina inferior contraria al patrn de protenas).

4.4. TINCIN DEL GEL CON AZUL DE COOMASSIE
Las bandas de protenas, una vez terminada la electroforesis, se
visualizan tiendo los geles con una solucin de azul de coomasie. La tincin
se realiza con agitacin suave durante, al menos, 30 min.
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1. Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que
contiene la solucin de tincin de coomassie. Se deja el gel en
agitacin suave con suficiente volumen de esta solucin a
temperatura ambiente durante 1 hora.
2. Se elimina la solucin de tincin con una pipeta y se conserva para
futuras tinciones.
3. Se aade solucin decolorante

y se incuba en agitacin para
eliminar el exceso de coloracin hasta que slo queden teidas de
azul las protenas, cambiando la solucin decolorante tantas veces
como sea necesario. El gel puede estar en esta solucin toda la
noche pero se pueden empezar a observar las protenas en 20
minutos.
4. Se elimina la solucin de desteido y se aade agua destilada (o
actico al 10%).
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5. CONCLUSIONES
En este apartado describiremos ms detalladamente la tcnica de
electroforesis desnaturalizante.
Los soportes de eleccin para la electroforesis de protenas son los
geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido
a su buena resolucin y gran versatilidad. Adems, poseen una serie de
ventajas tales como: ser qumicamente inertes, estables en un amplio rango
de pH, temperatura y fuerza inica y fciles de generar mediante la
polimerizacin de acrilamida. En la mayora de los casos, el gel se dispone
entre dos receptculos independientes y separados que contienen tampn
de electroforesis y los electrodos positivo y negativo, de forma que la
conexin elctrica entre ambos receptculos slo es posible a travs del
gel. Una vez que la electroforesis ha tenido lugar, el gel de poliacrilamida se
puede teir, documentar o incluso se puede purificar la molcula de inters
cortando literalmente el fragmento del gel.
Los geles de poliacrilamida actan a modo de tamiz molecular
retardando el movimiento de macromolculas grandes mientras que
permiten a molculas ms pequeas moverse libremente, potenciando de
esta forma la separacin. El entramado de los geles de poliacrilamida se
genera mediante la polimerizacin, a travs de radicales libres, de
monmeros de acrilamida en presencia de pequeas cantidades de bis-
acrilamida. Se forman enlaces cruzados entre los polmeros de acrilamida,
de manera que se generan geles con tamao de poro determinado tanto por
la concentracin total (%T) como por la concentracin relativa de acrilamida
y de bisacrilamida.
La reaccin de polimerizacin se inicia por un sistema redox de
catlisis. El TEMED cataliza la formacin de radicales libres que dirigen la
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reaccin a partir del in persulfato que se aade en forma de APS y que
acta como iniciador.
La electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida puede
llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes
(SDS-PAGE). Las diferencias entre uno y otro tipo radican en los
componentes de los geles y del tampn de electroforesis, as como el
tratamiento de las muestras. Como su propio nombre indica, en el segundo
tipo, y no en el primero, se incluyen agentes desnaturalizantes: reductores,
detergentes y catropos. En el primer caso, las protenas mantienen su
estructura tridimensional y las diferentes cadenas polipeptdicas pueden
permanecer unidas, separndose no slo en funcin de su carga elctrica,
sino tambin segn su tamao y forma. Por el contrario, cuando las protenas
se solubilizan en presencia del detergente aninico SDS, ste se une a las
protenas, rompiendo interacciones hidrofbicas y desnaturalizndolas. Las
protenas desnaturalizadas de la muestra adoptarn una estructura en
forma de bastoncillo con una serie de molculas de SDS cargadas
negativamente a lo largo de la cadena polipeptdica. Como media, se une una
molcula de SDS por cada dos residuos de aminocidos. La carga nativa
original de la molcula est completamente enmascarada por la carga
negativa del SDS. Debido a que la cantidad de SDS que se une a las
protenas es prcticamente proporcional a su tamao, los complejos SDS-
protenas presentan un valor carga/masa constante y por lo tanto se
separan de acuerdo a su tamao cuando migran desde el ctodo al nodo a
una velocidad relacionada con su peso molecular. Adems del SDS, se
emplean otros agentes desnaturalizantes como son un agente reductor,
generalmente el 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro.
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Para asegurar la disociacin de las protenas en sus subunidades y la
prdida de la estructura secundaria de las protenas se suele calentar la
muestra antes de ser cargada en el gel. A diferencia de la electroforesis en
condiciones nativas, en la SDS-PAGE las protenas se separan nicamente en
funcin de su tamao.
Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de
cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de pesos
moleculares conocidos.
Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son
funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

Actualmente existen dos sistemas de electroforesis de protenas en
geles de poliacrilamida en base a los tampones empleados:
El sistema continuo de Weber y Osborn. En este sistema existe un
nico gel separador que emplea el mismo tampn en los tanques y en el
gel.
El sistema discontinuo o de Laemmli que se llevar a cabo en la
presente prctica. Consta de dos tipos de geles: un gel, llamado
concentrador con un tamao de poro no restrictivo (grande) que se
forma sobre un segundo gel llamado separador. En este sistema cada
uno de los geles se prepara con tampones de diferente pH y fuerza
inica, y el tampn de electroforesis es un tercer tipo de tampn.
El gel de empaquetamiento (con un tamao grande de poro) sirve para
concentrar todas las protenas en la interfase entre los dos geles. Despus
de entrar en el gel de separacin (con menor tamao de poro) las protenas
se separan por su masa molecular.
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Esta estructura hace que las muestras se concentren en estrechas
bandas antes de que empiece la migracin de las protenas en el gel
separador, y por tanto permite la separacin de volmenes relativamente
grandes de muestra sin prdida de resolucin