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DETERMINACION DE
HIDROXIMETILFURAL EN MIELES.
Mtodo por HPLC con deteccin UV Fecha revisin:
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Laboratorio
de Nutrientes, Aditivos
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1. OBJETIVO
La determinacin del contenido de Hidroximetilfurfural (HMF) en miel de abejas.

2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

El mtodo permite determinar HMF, el cual es un producto de deshidratacin de monosacridos
presentes en la miel, que sirve como indicador de la longevidad de la miel o bien para juzgar las
condiciones de procesado y almacenamiento de este producto. Este mtodo permite cuantificar
HMF en mieles de diverso origen (mieladas, mono o multiflorales).

3. FUNDAMENTO

La presente metodologa tiene como principio realizar un cribado de la muestra, donde la
muestra es sometida a una extraccin en fase slida, para obtener una fraccin limpia. La
muestra es determinada por HPLC, utilizando fase estacionaria reversa y detectada a 284 nm.

4. REFERENCIAS
4.1 Drieffield M., Chan D., Macarthur R., Macdonald S. and Brereton P. Single laboratory
validation of a Method for the determination of Hydroxymethylfurfural in honey by using
solid-phase extraction cleanup and liquid chromatography. Journal of AOAC International,
vol. 88, 1, p. 121-127, 2005.

5. TERMINOLOGA
5.1 DAD: Detector de arreglo de diodos.
5.2 HMF: Hidroximetilfurfural.
5.3 HPLC: Cromatografa Lquida de Alta Resolucin.
5.4 SPE: Extraccin en Fase Slida.
5.5 UV: Espectro Ultravioleta.

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1 Equipos
6.1.1 Balanza de precisin, con resolucin de 0,001g.

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6.1.2 Estacin de cromatografa lquida con al menos deteccin UV.
6.1.3 Agitador orbital.
6.1.4 Sistema de extraccin en fase slida con manifold.
6.1.5 Bomba de vaco de 1 hp.
6.1.6 Elementos de seguridad (guantes y antiparras).

6.2 Materiales y Reactivos
6.2.1 Agua redestilada o desionizada conductividad < 0,055 S/cm (resistividad 18
M*cm).
6.2.2 Acetonitrilo para cromatografa.
6.2.3 Agua para cromatografa.
6.2.4 Metanol para cromatografa.
6.2.5 Solucin de elusin: mezclar acetonitrilo para cromatografa y agua para
cromatografa en relacin 1 : 9. Desgasifique antes de uso.
6.2.6 Fase mvil: mezclar acetonitrilo para cromatografa y agua para cromatografa en
relacin 8 : 92. Desgasifique antes de uso.
6.2.7 Hidroximetilfurfural grado reagente.
6.2.8 Esptulas, toalla absorbente, plumn permanente, gradillas.
6.2.9 Micropipetas de 200 L ,1000 L y de 5000 L.
6.2.10 Piseta.
6.2.11 Tubos con tapa de 15 y 50 mL.
6.2.12 Viales para automuestreador.
6.2.13 Cartuchos de extraccin en fase slida con resina C18 de 500 mg.
6.2.14 Columna HPLC: RP-18 250 x 4,6 mm, 5 m o equivalente.


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7. DESARROLLO
El ingreso de la muestra para su anlisis debe cumplir con el Instructivo de Aceptacin o
Rechazo de muestras IT-711-02-065.
Profesional del laboratorio es el encargado de realizar el anlisis cromatogrfico, realizar los
clculos e informar resultados.
Tcnico de laboratorio efecta el resto del procedimiento.

7.1 Preparacin de la Muestra
7.1.1 Si la muestra presenta partculas retrelas con una esptula, y de ser posible,
homogeneizar la muestra previamente antes de su obtencin, para que esta sea
representativa Bajo ninguna circunstancia caliente la miel en ninguna etapa del
procedimiento, ya que invalidara el mtodo.
7.1.2 Pesar alrededor de 5 0,3 g de muestra, en duplicado y con precisin de 0,01 g, en
tubos con tapa de 50 mL.
7.1.3 Aadir agua desionizada llevando a 25 mL cada tubo.
7.1.4 Tomar una alcuota de 1mL de la disolucin y diluirla con 9 mL de agua desionizada.
7.1.5 Monte el sistema de SPE y acondicione los cartuchos con 1 mL de metanol, seguido
de 3 mL de agua desionizada.
7.1.6 Cargar 2 mL de la disolucin de muestra al cartucho.
7.1.7 Lavar el cartucho con 2 mL de agua desionizada.
7.1.8 Secar el cartucho con un volumen aproximado de 25 mL de aire.
7.1.9 Elur la muestra con 4 mL de la solucin de elusin y luego pase un volumen
aproximado de 25 mL de aire por el cartucho, para asegurar que todo el volumen del
cartucho ha eludo. Tapar el vial y agitar en vortex por 10 segundos.
7.1.10 Diluir 1,5 mL del eluato con 0,5 mL de agua desionizada. Tapar el vial y agitar en
vortex por 10 segundos. Transfiera a un vial de autosampler mbar para su anlisis.

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7.2 Determinacin por cromatografa lquida y deteccin UV.

7.2.1 Para la determinacin de HMF, puede utilizar un detector UV para la cuantificacin
de HMF y/o bien utilizar DAD. Utilice las siguientes condiciones cromatogrficas
para el anlisis.

Columna: RP-18 250 x 4,6 mm, 5 m (o equivalente).
Fase mvil: Acetonitrilo: Agua = 8 : 92
Flujo: 1 mL/min
Temperatura: 20 C
Tiempo de retencin de HMF: 5,8 0,02 minutos
Volumen de inyeccin: 50 L.
Longitud de onda: 284 nm

7.2.2 Para la curva de calibrado tome valores de dilucin de 0,05 a 1 ppm. La linealidad de
la metodologa representa hasta 133 mg/kg de HMF en una muestra.

7.3 Clculo e informe de resultados
7.3.1 Clculo de resultados

A x 0,0075 x 5
HMF (mg/Kg) = --------------------------------------------
Porcin ensayada (g)

Donde:
A = Concentracin obtenida por la curva de calibrado.
0,0075 = Factor de dilucin.
5 = Porcin de ensayo nominal.

Debe informarse la concentracin de HMF en la muestra como mg/Kg de producto.

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7.3.2 Control de Calidad

Se efectuarn controles sistemticos y peridicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el mtodo analtico recogido en este procedimiento, segn disponibilidad.

a) Nivel I: Ensayos de intercomparacin utilizacin de materiales de referencia certificados
patrones de referencia certificados, segn disponibilidad.

b) Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye:
- Ajuste del cero del equipo.
- Control de blanco al inicio de las lecturas (para estndar de referencia).
- Control de estndar de concentracin conocida.
- Lectura del estndar como control por cada diez muestras ledas.

8. REGISTROS
8.1 registro de anlisis hidratos de carbono


9. ANEXOS
Anexo N 1 registro de anlisis hidratos de carbono