Sunteți pe pagina 1din 76

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

1

CAPITOLUL I. INTRODUCERE. GENERLITĂŢI

Plantele medicinale şi aromatice au utilizări multiple, cu grade foarte diferite de prelucrare. Cu produsele obţinute din ele se asigură în principal satisfacerea necesarului industriei chimico-farmaceutice autohtone, ca şi solicitărilor populaţiei pentru o gamă variată de sortimente (plante medicinale în stare uscată şi amestecuri de plante pentru ceaiuri, produse cosmetice cu extracte din plante, siropuri, ş.a.). Produsele brute medicamentoase de origine vegetală, sau „drogurile” vegetale se întrebuinţează în scopul punerii în valoare a substanţelor pe care le conţin cu deosebite calităţi terapeutice. Utilizarea produselor vegetale poate fi legată de proprietăţile lor fizice, cum este cazul sporilor de cornişor (Lycopodium sp.) sau a perilor seminţelor de bumbac (Gossypidium sp.). Majoritatea produselor sunt folosite însă pentru acţiunea lor terapeutică, atribuită unor principii active. Din punct de vedere farmacodinamic, respectiv terapeutic, rolul principiilor activi poate fi jucat de o singură substanţă sau de un complex de substanţe. Principiul sau principii activi pot fi extraşi, respectiv izolaţi din produsul vegetal şi întrebuinţaţi ca şi substanţe chimice pure. Prin sinteza organică s-a ajuns la obţinerea pe cale industrială a unui număr însemnat de principii activi. În unele cazuri., aceşti produşi de sinteză au înlocuit într-o măsură mai mică sau mai mare produsul vegetal, de exemplu majoritatea vitaminelor. În alte cazuri întrebuinţarea produsului natural continuă să fie mai rentabilă din punct de vedere economic decât obţinerea pe cale sintetică a principilor activi, de exemplu majoritatea alcaloizilor. Utilizarea produsului vegetal poate fi preferată faţă de substanţa chimică pură şi din punct de vedere terapeutic. În acest caz produsele vegetale se preferă pentru complexitatea acţiunii, asigurată de sinergismul diferiţilor compuşi. Astfel, de exemplu, morfina sau atropina obţinute din plantele respective prezintă o altă acţiune decât extractul de opiu sau beladonă.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

2

Din momentul în care s-a ajuns la cunoaşterea structurii chimice a principiilor activi s-au lărgit posibilităţile de valorificare a acestora prin:

-întrebuinţarea unor preparate farmaceutice, numite şi galenice, obţinute dintr-un drog vegetal, de preferinţă cu un conţinut prevăzut de principii activi;

-întrebuinţarea unui complex de principii activi obţinut prin îndepărtarea substanţelor inactive numite substanţe balast; -întrebuinţarea unui singur component considerat ca cel mai important dintre principii activi ai produsului respectiv; - întrebuinţarea unui principiu activ obţinut prin sinteză. Procentul la care ajung principii activi în diferitele organe ale aceleaşi plante variază în limite largi. Unii compuşi se găsesc practic în toate ţesuturile plantei respective, alţii sunt localizaţi aproape în întregime în anumite organe sau ţesuturi.

Valorificarea raţională a plantelor medicinale necesită cunoaşterea localizării precise a principiilor activi. Prezenţa diferiţilor compuşi sau a ţesuturilor (metode citochimice şi histochimice). Studiul structurii microscopice şi a localizării principiilor activi intră în domeniul cercetărilor de farmacognozie. Locul în care un principiu activ apare în cadrul organismului vegetal depinde în primul rând de rolul pe care acesta îl joacă în metabolismul plantei. Pentru a putea ajunge la mărirea conţinutului de principii activi este necesar să se cunoască toţi factorii care influenţează biogeneza principiilor activi. Metode de analize fotochimice, absolut necesare pentru studiul plantelor medicinale şi aromatice sunt cuprinse în tratatul lui Paech şi Tracey. O mare parte a principiilor activi sunt consideraţi ca „substanţe secundare”, care se formează în cursul proceselor de desimilaţie. Principal, fiecare celulă vie poate să elaboreze diferite substanţe de acest gen. În multe cazuri, însă producerea masivă a acestora are loc în celulele diferenţiate în acest scop, care se cunosc sub numele de ţesuturi de secreţie.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

3

Clasificarea principiilor activi poate fi făcută după natura lor chimică, după proprietăţile lor fizico-chimice şi după însuşirile lor biologice. Unele grupe de principii activi sunt mai multe sau mai puţin unitare din punct de vedere chimic, în privinţa unei grupe funcţionale sau în privinţa nucleului care stă la baza formulei structurale. Alte categorii de compuşi naturali heterogeni din punct de vedere chimic, dar mai mult sau mai puţin unitare în privinţa proprietăţilor fizico- chimice. Alte grupe de principii activi se stabilesc pe baza proprietăţilor biologice pe care le prezintă, ca de exemplu antibioticele sau vitaminele. În anumite cazuri criteriul unităţii de structura şi al acţiunii biologice se suprapun. Clasificările actuale ale principiilor activi se bazează pe trei criterii:

natura chimică, proprietăţile fizico-chimice şi acţiunea biologică. Cele mai importante grupe de principii activi sunt: glucidele, pectinele, mucilagiile şi gumele, uleiurile grase, uleiurile esenţiale, rezinele, acizii organici, glicozidele, saponinele, materiile tanante, principiile amare, vitaminele, alcaloizii, coloranţii vegetali, antibioticele şi fitoncidele, substanţe minerale. Cercetările de laborator efectuate au stabilit că: -în imensa majoritate a cazurilor, cantitatea de principii activi nu este aceeaşi în toate organele unei plante medicinale, într-un organ acumulându-se în concentraţia cea mai mare, în altul mai mică, şi în altul chiar poate lipsi sau exista în cantitate neglijabilă. De aici rezultă că trebuie să se cunoască cu suficientă precizie organul sau organele cele mai bogate în principii activi, deoarece numai aşa se va obţine un produs vegetal cu eficienţă terapeutică nu numai certă, dar şi constantă. -cantitatea de principii activi din organul plantei cel mai bogat în ele nu este aceeaşi în tot timpul anului şi variază în funcţie de etapele sezoniere de vegetaţie ale plantei, găsindu-se în concentraţie maximă numai într-o anumită perioadă a anului, care trebuie să fie şi timpul de recoltare al acestui organ, alegerea momentului optim de recoltare fiind deosebit de important pentru obţinerea produselor de calitate superioară;

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

4

-stabilitatea în timp cantitativă şi calitativă a principiilor activi dintr-un organ de plantă recoltat la timpul potrivit depinde pe de o parte de modul de uscare al lui, iar pe de altă parte, de condiţiile în care este păstrat. Fitoterapia şi fitochimia reprezintă azi o valoroasă sursă de inspiraţie pentru cercetările fundamentale din domeniul medicamentelor. După ce s-a izolat un principiu activ din plantă şi i s-a stabilit structura, se poate realiza nu numai molecula iniţială prin sinteza chimică, ci se poate obţine şi derivaţi cu o structură asemănătoare pentru a găsi alte medicamente valoroase. Plantele şi respectiv drogurile aromatice, cât şi uleiurile volatile obţinute din acestea sunt folosite pe scară industrială numai în scopuri farmaceutice, dar şi în următoarele domenii: parfumerie, cosmetică, industria săpunurilor, pentru aromatizare, industria alimentară, la aromatizarea unor dulciuri, băuturi alcoolice şi în cantitate de condiment la obţinerea diferitelor produse de carne, etc. În prezentul proiect de diplomă se va face un studiu fitochimic asupra plantelor de gălbenele, Calendula Officinalis, prezentându-se principii activi, importanţa şi utilizarea lor.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

5

CAPITOLUL II. PREZENTAREA PROBLEMEI

În flora ţării noastre, care numără aproximativ 3600 de specii de plante superioare, se întâlnesc reprezentanţi ai plantelor medicinale şi aromatice. Numărul lor se ridică la aproximativ 400, ceea ce înseamnă că din 9 specii care cresc pe teritoriul ţării noastre, una îşi găseşte utilizări în medicină. Primele mărturii scrise asupra teritoriului şi oamenilor pământului românesc atestă, că încă de pe timpul dacilor plantele medicinale erau cunoscute şi folosite. Îmbogăţită ulterior cu noi cunoştinţe, tradiţia medicinii populare s-a perpetuat din generaţie în generaţie, iar în ultimul secol aceasta se împleteşte cu studiul aprofundat al plantelor medicinale şi aromatice. Din această mare varietate de specii de plante medicinale şi aromatice, ca material de studiu s-a ales Calendula officinalis (gălbenele). Originară din Sudul Europei, la noi se cultivă de mult timp ca plantă ornamentală. Prin cultură s-a produs o serie de varietăţi decorative. În scopuri medicinale se folosesc numai varietăţile caracterizate prin flori duble de culoare galben-portocalie.

2.1. Descriere botanică

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 5 CAPITOLUL II. PREZENTAREA PROBLEMEI În flora ţării noastre, care numără aproximativ

Specie anuală (rarbienală), cu rădăcina pivotantă; tulpina înaltă până la 75 cm, puternică, ramificată şi păroasă, are frunzele oblonglanceolate alterne, sesile. Florile sunt grupate în capitule terminale mari, prezintă flori ligulate, tridintate pe margini, de culoare galbenă-portocalie şi flori centrale tubuloase de culoare galbenă. Înfloreşte din mai până în septembrie.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

6

Se utilizează ca produs vegetal fie numai florile marginale (Flores Calendulae sine receptaculis), fie întregul capitul (Flores Calendulae cumreceptaculis). Ambele produse au miros slab aromat, gust amărui sărat.

2.2. Tehnologia de cultură

  • 2.2.1. Soiul cultivat

În prezent în ţara noastră se cultivă soiul „Plamen” cu inflorescenţe mari, involte, portocalii.

  • 2.2.2. Amplasarea culturii

Gălbenelele nu sunt pretenţioase faţă de temperatură şi umiditate. Se dezvoltă mulţumitor pe toate tipurile de sol, preferând soluri adânci, bogate, afânate, cu umiditate suficientă, care se încălzesc uşor. În asolament pot urma după orice cultură prăşitoare anuală. Nu se recomandă monocultura pentru a preveni atacul bolilor şi dăunătorilor. Nu vor reveni pe acelaşi teren mai devreme de 4 sau 5 ani.

  • 2.2.3. Fertilizarea

Administrarea îngrăşămintelor fosfatice contribuie la sporirea numărului de inflorescenţe pe plantă şi la prelungirea duratei de înflorire, dacă se aplică în doze de 60-80 kg/ha fosfor ş.a. împreună cu îngrăşămintele cu azot. Îngrăşămintele cu azot se recomandă a se aplica în doză de 40-45

kg/ha.

Îngrăşămintele cu potasiu se aplică în doză de 40-45 kg/ha ş.a. Îngrăşămintele cu fosfor şi potasiu se aplică toamna sub arătura de bază, iar îngrăşămintele cu azot, primăvara devreme. Se va acorda atenţie deosebită mărunţirii, împrăştierii uniforme a îngrăşămintelor pe suprafaţa solului.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

7

  • 2.2.4. Lucrările solului

După recoltarea plantei premergătoare se execută arătura adâncă la 20- 25 cm după care terenul se grapează. Până toamna solul se va menţine curat de buruieni prin lucrări repetate cu discul. Terenul în care se vor semăna gălbenelele se va pregăti folosind combinatorul sau discul în agregat cu grapa cu colţi reglabili, pentru afânare, mărunţire, nivelarea solului.

  • 2.2.5. Semănatul

Se utilizează semănătoarea SUP-29, la care distribuitorul se reglează astfel încât să nu spargă seminţele. Semănatul se efectuează primăvara devreme în epoca I (martie), norma de sămânţă fiind de 6 kg/ha, distanţa între rânduri fiind de 50 cm, adâncimea de semănat de 2-3 cm asigurându-se la răsărire o densitate de 40-50 plante/m 2 . După semănat se tăvălugeşte pe rând. Pe suprafeţe mai mici semănatul se poate face manual, în cuiburi, la distanţe de 50 cm. La fiecare cuib se introduc 2-3 seminţe.

  • 2.2.6. Lucrările de întreţinere

Imediat după ce au răsărit se execută manual plivitul pe rând şi prăsila între rânduri spărgând crusta şi distrugând buruienile. Prăsilele mecanice între rânduri şi manuale se vor executa ori de câte ori este necesar în cursul perioadei de vegetaţie. Se va acorda atenţie loturilor semincere, din care se vor distruge vetrele de cuscută, iar după recoltarea seminţelor, resturile se vor arde.

  • 2.2.7. Boli, dăunători şi combaterea acestora

În culturile de gălbenele, pagubele provocate de boli şi dăunători sunt neînsemnate. Totuşi, în ultimul timp au fost semnalate boli ca: făinarea (Sphaerathea fuliginea) şi Sclerotinia sclerotinorum. Se recomandă respectarea măsurilor agrofitotehnice şi a măsurilor de igienă fitosanitară. Cuscuta este un parazit foarte păgubitor care se întâlneşte pe plantele de gălbenele.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

8

2.2.8. Recoltarea

Recoltarea se face eşalonat când s-au deschis primele 2-3 rânduri de flori ligulate, începând cu luna iunie şi continuând până în octombrie. Se recoltează florile ligulate de la capitulele deschise sau capitulele întregi pe timp însorit, de îndată ce s-a ridicat roua până seara. Florile ligulate sau capitulele întregi se culeg numai în coşuri, la început numai la intervale de 3-4 zile, apoi mai rar. Cu cât se recoltează mai regulat, cu atât plantele formează mai multe inflorescenţe. Producţia de flori ligulate, uscate este de 2 la 3 q/ha, iar la capitulele întregi de 10-20 q/ha.

2.2.9. Uscarea şi condiţionarea

După cel mult 3-4 ore de la recoltare, florile ligulate şi capitulele se usucă, la umbră, în încăperi curate şi uscate, în straturi subţiri, care se introduc des. Uscarea se poate realiza şi în uscătorii cu aer cald la temperaturi de 40-45 o C, după ce în prealabil florile au fost uscate la umbră 2-3 zile. Florile uscate în condiţii bune trebuie să-şi, menţină culoarea naturală. Materialul uscat se ambalează în lăzi căptuşite cu hârtie şi se păstrează până la livrare la întuneric, în încăperi curate şi uscate. Raportul de uscare la capitule este de 7-8/1./3/.

2.3. Principii activi izolaţi şi importanţa lor

Principii terapeutic activi fac parte din compoziţia chimică a plantei. Cele două noţiuni, principiu activ şi compoziţia chimică, nu se suprapun însă. În compoziţia fiecărei plante găsim un număr foarte mare de compuşi chimici, dintre care numai unii prezintă interes terapeutic. Multe grupe de substanţe intră în mod obligatoriu în compoziţia materiei vii, implicit ele se găsesc în plantă. Aceste substanţe ne interesează în calitate de principii activi numai atunci când se

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

9

formează într-un procent ridicat, respectiv dacă prin prezenţa lor se explică utilizarea medicinală. /4/ Conţinutul general de principii activi din florile de gălbenele este reprezentat de lipide, glucide, flavonoide, saponine. Despre conţinutul lor sunt semnalate o serie de date de literatură. Valorile se diferenţiază mult între ele şi se raportează cu precădere la materialul uscat. Dequeker dă următoarele valori: saponine 10%, grăsimi 5,5%, albumină 6%, celuloză 2%, zaharuri reducătoare 5,5%, cenuşă 1,3%. Conţinutul în apă îl apreciază Schindler la 10%. Principii activi conţinuţi de florile de gălbenele sunt: saponozidele triterpenice, carotinoidele (licopina, alfa şi beta caroten, neneolicopina A, rubixantina, luteina, xantofila, violaxantina, flavoxantina), flavonoizi şi glicozizi flavonici, rutinozizii şi derivaţi ai quercetolului; ulei volatil, substanţe amare, gumirezine, mucilagii şi esteri colesterinici ai acizilor lauric, mastitic, palmitic şi margaric; acid malic, substanţe proteice, calendulina, etc /5/.

2.3.1. Saponinele

Complexul de saponine reprezintă un amestec de glicozide triterpenice acetilate de tipul beta-amirinei, a cărei parte uşor cristalizabilă este denumită beta-escină şi în trecut s-a crezut că ar fi unitar glicozidul de bază. S-a dovedit însă a fi un amestec de glicozide a căror agliconi sunt diesteri ai protoesciginei şi ai boringtogenolului C. Ca şi componenţă acidă se amintesc acizii acetic, alfa metilbutilic, izobutilic, tioglicol, anghelic; şi drept componentă zaharică, acizii gluconici, glucoza, xiloza şi galactoza. Escina, s-a dovedit a avea o acţiune edeminhibitoare şi de scădere a fragilităţii vasculare. /6/ W. Boguslav a efectuat separarea cromatografică în strat subţire şi gaz- lichid a alcoolilor triterpenici trihidroxipentaciclici din florile de gălbenele. Compuşii titlu au fost extraşi din flori prin fierbere cu Et 2 O urmată de acetilare şi de cromatografia gazoasă. /7/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

10

  • 2.3.2. Carotinoidele

Carotinoidele se găsesc în toate ţesuturile verzi alături de clorofilă, în cantităţi variabile, în funcţie de faza de vegetaţie a plantei. Carotinoidele se găsesc şi în unele flori (petale, polen), precum şi în fructe, seminţe şi rădăcini. Au o răspândire universală găsindu-se atât în plante inferioare, alge, ciuperci, bacterii, cât şi în organismele animale. În organismele animalelor superioare carotinoidele au un rol esenţial datorită legăturii biochimice cu vitamina A şi cu retinenul, substanţă importantă în procesul biochimic al vederii. Carotinoidele constituie un component indispensabil al hranei animalelor. Fiind pigmenţi liposolubili, se găsesc în ţesuturi solvite în lipide sau sub formă cristalină. Conţinutul în aceşti pigmenţi depinde de faza de vegetaţie şi de o serie de factori cum sunt: condiţiile de lumină, temperatură şi sol. Atât sub formă cristalină cât şi sub formă de soluţie, carotinoidele se transformă prin autooxidare, mai repede sau mai încet în produşi incolori rezultaţi în urma ruperii catenei. Datorită fixării oxigenului sub formă de compuşi oxigenaţi puţin sensibili, carotinoidele intervin în procesele de oxido-reducere. Unele carotinoide îndeplinesc funcţia de provitamine, iar altele participă la procesul biochimic al vederii. Preparatele de beta-caroten se întrebuinţează în farmacie ca provitamină A. Datorită puterii de colorare şi a solubilităţii în grăsimi carotinoidele sunt folosite ca şi coloranţi alimentari, îndeosebi pentru colorarea margarinei. /6/

  • 2.3.3. Flavonoidele

Flavonoidele sunt larg răspândite în natură, ele găsindu-se şi în florile de gălbenele. Lor li se atribuie o acţiune terapeutică în tratamentul insuficienţei venoase. Efectul farmacologic se explică printr-o creştere a acţiunii adrenalinei şi o activare enzimatică, respectiv inhibitoare. Mai au ca indicaţii: efect protector la radiaţii, scăderea permeabilităţii vaselor şi creşterea rezistenţei capilarelor,

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

11

stimularea

diurezei,

efect

moderat

cardio-

schimbului calciului.

şi

vaso-stimulator,

influenţarea

  • 2.3.4. Vitamina C

Este cunoscută şi sub denumirea de acid ascorbic sau vitamina antiscorbutică. Se formează în toate plantele, ajungând însă la procente mai ridicate numai în anumite organe vegetale, care se utilizează ca surse naturale de vitamina C. Această substanţă este uşor distrusă la uscarea organelor vegetale şi la prepararea extractelor. Descompunerea enzimatică decurge rapid dacă părţile vegetale sunt ţinute la temperaturi mai ridicate. Descompunerea rapidă are loc şi în prezenţa unor urme de metale grele. /1/

  • 2.3.5. Uleiurile esenţiale (uleiuri volatile, uleiuri eterice)

Sunt amestecuri de diferiţi compuşi chimici care în totalitatea lor prezintă anumite caractere fizico-chimice comune: sunt volatile, au miros aromatic caracteristic şi sunt de regulă solubile în alcool etilic. Spre deosebire de uleiurile grase (uleiuri fixe), pata translucidă pe care o prezintă o picătură de ulei esenţial pe hârtie dispare în scurt timp. În componenţa uleiurilor esenţiale intră diferite hidrocarburi alifatice şi ciclice, saturate şi nesaturate, precum şi derivaţii lor oxidaţi. Pe lângă hidrocarburi şi derivaţii lor, în compoziţia uleiurilor esenţiale pot intra şi compuşi aromatici, respectiv fenolici.

  • 2.3.6. Acizii organici (acizii carbonici)

Sunt compuşi alifatici, ciclici sau aromatici, care conţin una sau mai multe grupări carboxilice. Sunt larg răspândiţi în regnul vegetal, atât în stare liberă, cât şi sub formă de săruri şi esteri. Foarte frecvent întâlniţi sunt acizii:

malic, citric, oxalic etc.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

12

Produsele bogate în acizi organici sunt întrebuinţate pentru corectarea gustului neplăcut al unor medicamente. Acizii organici contribuie la stabilizarea vitaminei C în produsele vegetale. /1/

2.3.7. Substanţele minerale Se găsesc în organismul vegetal pe de o parte sub formă de săruri, respectiv ioni, iar pe de altă parte sub formă de combinaţii organice. După îndepărtarea totală a conţinutului în apă dintr-un anumit organ vegetal, se obţine „substanţa uscată” formată în cea mai mare parte din substanţe organice şi dintr- un procent mic de substanţe minerale. Prin arderea substanţelor organice apar produşi de descompunere, iar substanţele minerale se oxidează. O parte din produşii de descompunere se volatilizează, iar cealaltă parte nevolatilă formează cenuşa. Cantitatea maximă de cenuşă care se obţine dintr-un anumit organ vegetal este caracteristica Unele substanţe organice care se găsesc în produsele brute medicamentoase de origine vegetală pot juca rolul de substanţe de acţiune. /1/ Ca urmare a principiilor activi pe care îl conţin gălbenelele, florile acestora prezintă multe utilizări, atât în medicină, cât şi în cosmetică şi în ramura alimentară. T. Boyadzhin, Tr. Nauchi experimentează efectul sedativ şi hipotensiv al preparatelor de plante de Calendula Officinalis. Studiul a pus în evidenţă proprietăţile farmaceutice al extractului apos (1:1 şi 0,5:1 cu EtOH 30%) în alcool, din inflorescenţa de gălbenele. Testele pe şobolani şi pisici au arătat efectul inhibitor asupra SNC, cu acţiune sedativă generală marcantă, la fel şi un efect hipotensiv datorat acţiunii sale miotropice. L.D. 50 a fost de 45 mg subcutanat la şoareci şi 526 mg la 100 kg intravenos la şobolani. /8/ M.G. Chaplinska şi V.O. Golovkin în urma experienţelor efectuate pun în evidenţă acţiunea antimicrobiană a câtorva extracte din florile de Calendula Officinalis. Din florile proaspete de Calendula , sau din flori proaspăt uscate s-a

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

13

realizat un extract la temperatura camerei, cu apă saturată cu CHCl 3 (fracţiunea 1) cu 70% EtOH (fracţiunea 2) şi cu apă fierbinte (fracţiunea 3). Un extract de ulei s-a preparat prin amestecarea florilor cu EtOH şi un extract, cu ulei de floarea soarelui sau de peşte, timp de 3 zile . Investigarea bacteriologică a arătat că florile de gălbenele conţin componenţi cu proprietăţi antimicrobiene care sunt solubili în EtOH şi insolubili în apă. /9/ Acţiunea farmacodinamică a principiilor activi se poate rezuma astfel:

-intern, au efect diaforeic, sedativ, antiinflamator, gastrointestinal, colagog şi coleretic (datorită principiului amar, florile de gălbenele măresc secreţia biliară), cicatrizant (prin stimularea circulaţiei sângelui la nivelul ţesuturilor). -extern, acţionează ca antiinflamator hemoroidal şi cicatrizant. Utilizările terapeutice a preparatelor cu principii activi extraşi din gălbenele, sunt atât interne cât şi externe. Intern se administrează în diskinezii biliare, ulcer gastric şi duodenal, dismenoree, anterocolite, aritmii cardiace, afecţiuni hipertonice, stomatite, neoplasm gastric. Extern, se folosesc în tratarea plăgilor greu vindecabile, hemoroizi, degerături, arsuri, eczeme, acnee, tenuri uscate.

Produsul vegetal prelucrat prin extracţii este utilizat pentru obţinerea unor dermoplaste: loţiuni, emulsii, unguente şi pudre; pentru acţiunea antiinflamatoare, decongestionantă, cicatrizantă şi antimicrobiană. Datorită mirosului se utilizează ca insectifug în încăperi. /5/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

14

CAPITOLUL III. STUDII DE LITERATURĂ

În urma perfecţionării metodelor de identificare şi extragere a produşilor naturali şi a introducerii unor metode noi în studiul acestor substanţe, apare astăzi şi mai evidentă complexitatea construcţiei chimice a organismelor vegetale. Numărul substanţelor, îndeosebi organice, întâlnite în plante este uimitor de mare. Numeroase din ele, cunoscute mai demult sau descoperite mai recent, constituie produşi de remarcabilă importanţă biologică, farmaceutică sau tehnică.

Scopul prezentului proiect de diplomă este studiul principiilor activi din florile de gălbenele.

3.1. Saponinele

3.1.1. Nomenclatură. Structură.

Saponina din florile de gălbenele face parte din grupa saponinelor de tip triterpenic. S-a dovedit că saponinele considerate pure până în prezent, erau de fapt amestecuri de astfel de substanţe. La fel şi escina, pe care Tschesche şi

Wolff au descoperit-o pentru prima dată prin C.S.S. în mai multe componente, după ce în prealabil Wagner şi Bosse au izolat două componente izomere pe care le-au denumit alfa şi beta-escină şi mai târziu alte două saponine, criptoescina A şi B.

Criptoescina A a fost recunoscută de Tschesche şi Axen ca un amestec de cel puţin şapte componente. Există şi o lucrare a lui Winkler care descrie separarea C.S.S. a escinei într-un glicosid principal şi mai multe glicozide secundare. Mulţi autori s-au străduit să clarifice structura escinei. Abia recent le-a reuşit lui Hoppe, Gieren şi Brodnerr ca şi Tschesche şi Wolff izolarea unui aglicon cu grupa esterică nemodificată şi decelarea structurii sale prin analiză Rx. Complexul de saponine prezintă un amesctec de glicozide triterpenice acetilate de tipul beta-amirinei, a cărei parte uşor cristalizabilă este denumită

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

15

beta-escină şi în trecut s-a crezut că ar fi unitar glicozidul de bază. S-a dovedit însă a fi un amestec de glicozide a căror agliconi sunt diesteri ai protoescigeninei şi a boringtogenolului C. ca şi componenţă acidă se amintesc acizii acetic, alfa- metilbutilic izobutilic, tioglicol, anghelic; şi drept componentă zaharică acizii gluconici, glucoza, xiloza şi galactoza. Acidul glucuronic este legat de scheletul triterpenic printr-o grupă OH de C 3 beta-blicozidic şi este în continuare legat de 2 moli de zaharoză. Agliconi de bază sunt protoescigenin-21-anghelat-22acetat, respectiv protoescigluin-21-tiglat-22-acetat. Încercările farmacologice relevate până în prezent s-au efectuat cu saponina-escina şi cu extractul total de seminţe. De aceea nu este surprinzător că s-au publicat cele mai contradictorii rezultate şi divergenţa asupra principiului activ din florile de Calendula nu a contenit.

3.1.2. Metode de recunoaştere şi determinare

La agitarea unei soluţii de E se formează spumă intensă (efect general sapo0ninic). Pentru identificare este nevoie de compararea valorilor R F obţinute prin C.H. sau C.S.S. cu etaloane. Pentru recunoaşterea acţiunii hemolitice se pun cromatografele developate între plăci de gelatină sanguină sau se stropesc cu un amestec de 1 parte sânge defibrinat sau citrat sanguin şi 8 părţi soluţie fiziologică de NaCl. Sensibilitatea este în domeniul 40 ug/pată. La stropirea C.S.S. cu acid sulfuric 50% şi ulterioară uscare, E dă la lumina zilei o coloraţie brun-roşcată şi în ultra- violet o fluorescenţă galbenă care după un tip trece în albastru. La concentraţii mari E prezintă iniţial o fluorescenţă roşu-portocalie. O metodă gravimetrică după Romisch se fundamentează pe trecerea saponinei extractelor escinice în alcaliescinol hidrosolubil. Prin adaos de HCl diluat se obţine pp escinolul hidrosolubil, care se determină gravimetric sau alcalimetric. Conţinutul extractelor cercetate se raportează la escină. Melnitschuk determină separat I.A. şi I.S. în seminţele de castan după o prealabilă degresare.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

16

Din valorile găsite se stabileşte prin transformarea conţinutului în escigenina din care în continuare se poate concluziona conţinutul de saponină brută. În determinarea forometrică după Overlach, reacţionează E cu o soluţie p-dimetilaminobenzaldehida: acid sulfuric. Se formează o soluţie violetă a cărei extincţie se măsoară la 570 nm. La identificarea fotometrică după Schlemmer se reiau extractele de seminţe cu 0,1 n HCl şi se extrag cu Pn-OH/CHCl 3 . După concentrare se reia amestecul saponinic cu acid acetic gl. Formarea complexului colorat se obţine cu reactivul FeCl 3 x H 2 HO 4 . Abaterea relativă standard l a540 nm este de 2,8%. În locul acestui reactiv Panich foloseşte clorura de cobalt. Înainte de determinarea colorimetrică se face o separare prin C.S.S. a saponinei pe plăci de silicagel.

3.1.3. Rol fiziologic

Escina este o substanţă cu înaltă activitate farmaco-dinamică. Doza letală este apreciată de Moller pentru şoareci, după administrare intra venos la 0,9 mg/kg. Lorens şi Malek au stabilit doza letală intra venos pentru şoareci la 2,5 mg/kg, pentru şobolani la 12,3 mg/kg şi pentru cobai la 9,1 mg/kg corp. Referitor la resorbţia escinei, în literatură există concepţii divergente. După Hausschild, nu se poate dovedi o resorbţie din tractul digestiv, iar după Orzechowschi, ea este minimă şi insuficientă. La Corena şi Malek, care la escină sau extract nu au văzut efecte asupra edemului, nu se găsesc date referitoare la doza aplicată. Schweitzwr relatează despre trei cazuri de intoxicaţii cu flori de Candula la copii, cu un caz de deznodământ letal, după un consum repetat de material. Preziosi şi Mawka au furnizat până în prezent, prin experienţe pe animale, singurele dovezi pentru o resorbţie suficientă a escinei din canalul digestiv. Ei au obţinut în experiment rezultate identice, când au aplicat p.o. 5 mg/kg şi i.v. 1 mg escină/kg corp. E. a. O. a dus, referitor la întârzierea operaţiei morţii la solicitare la frig a şobolanilor fără rinichi auxiliar, la rezultate deosebit

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

17

de bune. După administrarea i.v. de doze acut letale de escină la animale se ajunge nemijlocit prin hemoliză la anoxie, respectiv hipoxie a parenchimurilor vitale (ficat, rinichi), la deces. La administrarea cronică zilnică i.v. de 1/5 D.L. 50 (=1,1 mg/kg) până la

  • 30 d. nu apar la iepure nici schimbări chimice, nici patolego-anatomice.

Hemoliza intravitală care apare la om după o injecţie i.v. de 2 mg E este de 1 minut de la administrare şi cu cea mai sensibilă metodă nedecelată. Escina se leagă foarte rapid, complex de albumină serică, încât se inhibă puternic hemoliza. Mecanismul de hemoliză decurge după Vogel în primul rând printr-un atac al proteinei membranei eritrocitei. Experimental. S-a dovedit o acţiune edeminnhibitoare şi de scădere a fragilităţii vaselor din partea escinei. Ea se instalează la 8 ore după amplificare, este maximă după 16 ore şi se menţine câteva zile. Efectele hemolitice şi antiextrudative decurg paralel. Un efect asupra tenosului venos nu se poate atribui. Se pare însă, că la doze mai mici de 1 mg/kg corp, după o scădere, apare o creştere a tensiunii sanguine.

În clarificarea mecanismului de acţiune s-au străduit Vogel şi Ubel. După aceştia, acţiunea este legată de o fracţiune auxiliară renală intactă. Aceste constatări coincid cu cercetările cu Jacubicowa ca şi Vadek şi Kozlik referitoare la efectul general al saponinei asupra cortexului suprarenal. Deoarece în încercările chimice s-a instalat foarte repede evitarea edemică, în centrul atenţiei stau două acţiuni ale escinei:

1) nemijlocit, după aplicare se ajunge la formare de edeme localizate, care se pare a fi condiţionate de o obturare a capilarelor. 2) după un timp mai lung de latenţă se ajunge la un efect secundar maximal asupra suprarenalei. Acest efect se bazează pe un atac direct al saponinei asupra cortexului suprarenal, care duce la o secreţie suplimentară de

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

18

Pe baza mecanismului de acţiune a escinei se obţin indicaţii sub influenţa compuşilor activ ai cortexului suprarenal, asupra metabolismului celular. Acestea sunt edeme traumatice, distorsiuni grele, inflamaţii trombotice şi traume cerebrale (commotio cerebri).

3.2. Flavonoidele

Flavonoidele reprezintă o clasă de substanţe fenolice larg răspândite, mai ales sub formă de glicozizi. Multe flavonoide sunt colorate, constituind unii din principalii pigmenţi vegetali, cum sunt antocianinele şi flavonele. Diferitele flavonoide se aseamănă prin scheletul comun format din două inele benzenice legate printr-un lenţ de trei atomi de carbon (C 6 -C 3 -C 6 ). Cu excepţia chalconelor, fragmentul C 3 se găseşte într-un heterociclu cu oxigen, piranic sau furanic, condensat cu unul din nucleele benzenice. Diferitele grupe de flavonoide se deosebesc prin gradul de oxidare al fragmentului C 3 . Se disting 6 tipuri de flavonoide: flavani, antocianidine, flavone, flavonone, chalcone, aurone. Acestea derivă de la utmăroarel esubstanţe: flavan, flaven-3, flaven-2-on-4, flavonon-4, benziliden-aceto-fenona şi 2-benziliden-cumarona.

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 18 Pe baza mecanismului de acţiune a escinei se obţin indicaţii sub

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

19

Diferiţii reprezentanţi ai fiecărei grupe de flavonoide se caracterizează prin grupări hidroxilice şi metoxilice fixate în anumite poziţii pe ciclurile A şi B, uneori şi pe heterociclu. Mai rar se întâlnesc reprezentanţi cu alte grupări funcţionale sau având catene laterale. /8/ prin reacţii de hidroxilare, dehidroxilare, metilare sau demetilare, unii reprezentanţi aparţinând aceleiaşi grupe de flavonoide. Aceste transformări au o mare importanţă practică, deoarece unele flavonoide larg răspândite în natură, pot fi transformate în altele mai valoroase din punct de vedere practic, dar mai puţin răspândite, cum este cazul rutinei şi quercetinei, cu rol bine stabilit în terapeutică, fiind produse farmaceutice de mare circulaţie.

3.2.1. Flavone şi glicozizi flavonici

Flavonele sunt pigmenţi galbeni, care se găsesc în flori, fructe şi frunze, sub formă de glicozizi, iar în lemn şi scoarţă, atât libere, cât şi ca glicozizi.

La cunoaşterea constituţiei compuşilor flavonici au contribuit în primul rând cercetările lui A.G. Perhin şi St. Kostanecki. Au fost sintetizate numeroase flavone, dar nu toate au corespondent natural. În natură s-au găsit peste o mie de compuşi flavonici. Numărul grupărilor hidroxilice şi metoxilice variază de la 2 până la 6. grupările metoxilice se găsesc mai ales pe inelul B. Un număr mai mic de compuşi flavonici conţin grupe metil, dioximetil sau catene mai lungi, de tipul:

CH 3 -CH 2 -CH 2 -C- CH 3 , sau sunt condensaţi cu unele cicluri. OH Glucidele care participă la construcţia glicozizilor flavonici sunt în primul rând: D-glucoza, L-ramnoza, L_arabinoza, D-xiloza şi acidul D- glucuronic. Aceste glucide pot participa şi sub formă de biglucide sau triglucide cum sunt: rutinoza, apioza, robinoza, soforoza şi altele

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 19 Diferiţii reprezentanţi ai fiecărei grupe de flavonoide se caracterizează prin grupări

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

20

Resturile glucidice se găsesc hidroxilice ale compusului flavonic.

fixate

la

una

sau două din grupările

Proprietăţi fizice

Flavonele sunt substanţe cristalizate, colorate în galben. Glicozizii flavonici cristalizează bine, fiind solubili în apă, metanol şi etanol. Solubilitatea flavonelor este variată. Gruparea –CO - C = C- are putere cromoforă mică, dar datorită conjugării cu nucleele aromatice precum şi datorită grupărilor hidroxilice, culoarea se intensifică. Un efect deosebit asupra închiderii culorii galbene au grupările hidroxilice din 3 şi 4 datorită posibilităţii de formare a unei structuri chinoide. Flavonoidele prezintă în U.V. două sau trei benzi de absorbţie. Grupările hidroxilice din anumite poziţii au efect batocrom caracteristic, iar transformarea acestora în grupări metoxilice are un efect hipocrom. Determinarea poziţiei benzilor de absorbţie în U.V. permite caracterizarea compuşilor flavonici. Flavonele prezintă o serie de proprietăţi chimice ce se datoresc agliconului.

Acţiunea alcalilor şi acizilor

Sub acţiunea alcalilor inelul pironic se deschide, stabilindu-se un

echilibru între flavonă şi dicetona rezultată.

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 20 Resturile glucidice se găsesc hidroxilice ale compusului flavonic. fixate la una

Reacţia de deschidere a ciclului pironic fiind reversibilă, alcalii şi acizii pot avea acţiune izomerizantă asupra flavonelor. Astfel de reacţii de izomerizare sub acţiunea acizilor au fost folosite în scopuri preparative. /9/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

21

  • 3.2.2. Flavonoli ai florilor de Calendula

Flavonoli

Fracţiunea lipofilă

% în extract s.u.

-cvercetin – 3 – glucozid (soquercitin)

-

-chempferol – 3 - glocozidoramnozid

0,075

  • - chempferol – 3 - xilozidoglucozid

-

-cvercetin – 3 - glucozidoramnozid

-

  • - chempferol – 3 - diglicozid

0,100

-cvercetin – 3 - xilozidoglicozid

0,200

Fracţiune hidrofilă

  • - cvercetin – 3 - diglicozid

-

  • - chempferol – 3 - glucozidoxilozidoglucozid

1,250

  • - cvercetin – 3, 3 - diglucozid

0,500

  • - cvercetin – 3 – xilozidoglucozid – 3 - glucozid

0,500

Fracţiunea lipofilă reprezintă 13,4% şi cea hidrofilă 61% din ansamblul fracţiei flavonolice

  • 3.2.3. Nomenclatură. Structură

Fiind polifenoli, flavonele şi flavonolii pot trece în anumite condiţii dintr-o structură chinonică şi să acţioneze drept catalizator redox, pe care fapt se şi bazează activitatea lor biochimică. Structura determinată pentru efectul flavonic după Schills şi Goodhart este: grupa chinonică la C – 4, dubla legătură între C –2 şi C –3 şi grupe OH la C – 3 şi C – 4, în timp ce la flavonoli grupa chinonică ce se formează la nucleul 2- fenillic este activată în plus de OH de la C – 3. Loth şi Dietrich au pus în evidenţă uşurinţa de oxidare a derivaţilor flavonolici cu o grupă o-dihidroxi în 3, 4. Pentru a concretiza comportarea diferită a hidroxi-flavonolilor, ei au stabilit între altele şi potenţialele redox ale rutinei şi cvercetinei. Rezultatele relevă influenţa determinantă a grupei 3-OH libere. Astfel cvercetina a avut faţă de rutină un potenţial cu 100 mV mai negativ. În comparaţie cu sistemul benzocatechina/o-benzochinona, a cărui rest este atrăgător de electroni, restul 3- OH este donor de electroni. De asemenea s-a putut dovedi tendinţa mai slabă de a

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

22

da reacţii secundare în cazul derivaţilor o-chinonici ai flavonolilor faţă de compuşii fără grupe 3-OH libere prin titrare discontinuă.

3.2.4. Metode de recunoaştere şi determinare

La tratarea extractelor escinice cu zinc sau magneziu în soluţie de acid clorhidric, soluţia iniţială galbenă se colorează în roşu. Se formează prin reducere şi cu recuperarea unui rest zaharic, anticianidin clorurile, respectiv derivaţi de chempferol clorură de pelargonidin, iar din derivaţii cvercetinei, clorura de cianidin.

După Kussner, această reacţie se poate aplica în determinări colorimetrice. Flavonele dau cu săruri incolore de Al, Pb, Cd, Cu, Fe, B, Sb ;i Bi în urma burocromiei, combinţii puternice colorate în galben(glicozida chempferilică) sau portocaliu (glicozida cvercetinică). Alte proprietăţi se utilizează frecvent la recunoaşterea cromatografică şi la determinări colorimetrice cantitative. Determinarea cantitativă după Overlach se face cu Flovobnost R , un complex aminoestiester al acidului difenilboric. Se pretează pentru determinarea conţinutului extractelor de flori de Calendula, deoarece conţinutul de flavonoide se pateu raporta direct la cvercetină. O substanţă de referinţă pentru extractele de seminţe nu se cunoaşte la această metodă. Overlach a considerat nejustă alegerea unei flavonoide la întâmplare, ca referinţă, dacă proprietăţile ei ca absorbţie a luminii după efectuarea reacţiei de culoare nu au coincis cu cele ale extractelor escinei, sau dacă lipsesc date exacte referitoare la flavonoidele de determinat. Deoarece extractele de seminţe cercetate de autor au dat în condiţiile reacţiei descrise un maxim de absorbţie la aceeaşi lungime de undă, pare acum după cunoaşterea exactă a structurii majorităţii flavonoidelor din seminţe, întemeiată raportarea la cvervetină. La determinarea colorimetrică după Romisch cu AlCl 3 în tampon CH 3 COOH g.l./Py se calculează conţinutul de flavoniode cu echivalent de rutină. Metoda se pretează la determinarea substanţei pure şi a extractelor

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

23

deoarece se măsoară numai intensificarea culorii prin formarea complexului de aluminiu şi soluţia de compensare este aceeaşi soluţie tampon flavonolică, ca cea de măsurat, însă fără adaos de sare de Al. Dificultatea apare la determinarea asupra extractelor de seminţe necojite, deoarece pigmentul cojii chiar în diluţia aferentă determinării, intensifică culoarea ducând la dificultatea recunoaşterii extincţiei. De fapt, nici nu este întocmită raportarea la echivalent de rutin deoarece nu este prezent rutin în seminţe. Determinarea colorimetrică după Horhammer a fost propusă pentru determinarea conţinutului extractelor escinei, pentru noua carte de homeoterapie a medicamentelor în Germania. După hidroliza flavonelor care conţin drept aglicon comun cvercetina, urmează colorarea cu o soluţie 5% ZrOCl 2 şi măsurarea extincţiei la 435 nm. Conţinutul de flavonoli se citeşte de pe o curbă de eşalonare ridicată în aceleaşi condiţii ca şi cvercetina pură. Deoarece extractul hidrolizat conţine pe lângă cvercetină cantitate apropiată de chempferol, pare problematică obţinerea unui etalon adevărat. De aceea se pot numai compara conţinuturile flavonoidice ale fiecărui extract între ele. /9/

3.2.5. Rol fiziologic

O metodă biologică o constituie testul Petechien după Muschaweck în formă modificată de Auster. Pe burţi depilate de şobolani se determină valoarea Sog-ului la care ½ din câmpurile examinate reacţionează în Petechien (mici hemoragii cutanate). Apoi se aplică animalului soluţia de determinat. După 24 de ore, zonele din imediata vecinătate a câmpurilor investigate trebuie să reziste la o solicitare Sog cu c.p. 30%. O altă cale modificată după Kovaks şi Foldi care efectuează testul pe partea dorsală depilată a şobolanilor de ambele părţi a coloanei vertebrale constă în ţinerea în prealabil a şobolanilor 2-3 săptămâni la un regim scorbutigen. Tot un efect tenacizant al capilarelor se atribuie după Paris şi compuşilor D-catechină şi catechină de argasit. Aceasta nu este surprinzătoare, în măsura în care catechinele

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

24

pot fi asimilate drept flavonoli hidrogenaţi sau antocianuri hidrogenate. Catechinele pure nu s-au impus în terapie datorită instabilităţii lor.

3.3. Pigmenţii carotenoidici

3.3.1. Sursele şi factorii care influenţează conţinutul de pigmenţi carotenoidici

Carotenoidele sunt pigmenţi naturali, neazotaţi, larg răspândiţi în natură, care datorită dublelor legături conjugate din molecula lor, imprimă ţesuturilor în care apar o culoare galbenă, portocalie, roşie, sau chiar albastră, de diferite nuanţe. Spre deosebire de restul pigmenţilor naturali (flavone, calcone, aurone, antociani, chinone, pigmenţi indolici, pigmenţi porfirinici, etc) carotenoidele sunt cei mai răspândiţi pigmenţi care se găsesc atât în regnul vegetal cât şi în cel animal. Plantele superioare (angiosperme şi gimnosperme) conţin un număr relativ mare şi variat de carotenoide, atât în ţesuturile fotosintetizante (frunze, tulpini, muguri, sepale,etc) cât şi în cele nefotosintetizante (fructe, flori, seminţe, rădăcini, polen, plantule etiolate). După T.W. Goodwin carotenoidele se găsesc localizate predominant în cloroplastele şi cromoplastele organismelor vegetale. În anumite condiţii ele pot să apară şi în sucul citoplasmatic, extraplasmatic, mai cu seamă toamna, când se produce degradarea plastidelor, precum şi la unele alge, fapt ce imprimă toamna ţesuturilor şi mediului acvatic culoarea carotenoidelor. În cloroplastele din celulele şi ţesuturile fotosintetizante, carotenoidele se găsesc predominant sub formă de complexe caroteno-proteice, carotenolipoproteice, carotenolipidice incorporate în grânele cloroplastelor. Aceste complexe ale carotenoidelor intră în alcătuirea fotosistemelor I şi II, care înfăptuiesc procesul de fotosinteză. Felul şi conţinutul carotenoidelor diferă în cele două fotosisteme. În fotosistemul I predomină conţinutul beta-carotinei faţă de cel al luteinei (sau a altor xantofile) fiind într-un raport de 1,4:1. În fotosistemul II, conţinutul

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

25

carotenoidelor hidrocarburice (beta-carotina, alfa-carotina) este cu mult mai mic decât cel al xantofilelor. Pe baza a numeroase analize efectuate cu plante din diferite regiuni ale globului pământesc, s-a ajuns la constatarea că în ţesuturile verzi fotosintetizante se găsesc în mod constant 4 carotenoide principale, în următoarele proporţii: beta-carotina 25%, luteina 40%, violaxantina 18% şi aloxantina 12%. Alături de aceste carotenoide principale în ţesuturile verzi apar frecvent, dar nu constant şi alte carotenoide în cantităţi mici cum sunt: alfa- carotina, beta-carotina, zeaxantina, anteraxantina, fitoemul şi fitofluemul. Conţinutul carotenoidelor din ţesuturile fotosintetizante depinde de natura speciei, pigmenţii fiind determinaţi genetic, precum şi de influenţa condiţiilor de mediu.

După E.I. Mercer, B.N. Davies şi T.W.Goodwin, în frunzele de Vicia sativa, conţinutul fitoemului şi al fitofluemului este de aproximativ 100 de ori mai mare decât al beta-carotinei. După G. Britton şi T.W. Goodwin, în frunzele de Syngonium conţinutul neoxantinei este mai mare decât al violaxantinei, iar în frunzele de Fremontia, conţinutul zeaxantinei este la fel de ridicat ca şi cel al luteinei. Z.W. Ierkowski a arătat că conţinutul carotenoidelor hidrocarburice este cuprins între 5 şi 36% din totalul carotenoidelor, iar conţinutul alfa-carotinei este cuprind între 0 şi 40% din totalul carotenoidelor hidrocarburice. În ţesuturile fotosintetizante, xantofilele se găsesc în stare liberă, neesterificate sau esterificate, încorporate în grânele cloroplastelor. T.W. Goodwin a arătat că în urma îmbătrânirii cloroplastelor (predominant toamna), când acestea încep să se dezintegreze, xantofilele sunt eliberate în citoplasmă, unde se produce esterificarea sau eterificarea acestora. Conţinutul beta-carotinei în frunze variază între 200 şi 700 μg/g material uscat, în funcţie de natura speciei. După L.R.G. Valadon şi R.S. Mummery la unele plante dionice, frunzele plantelor femele au un conţinut mai mare de carotenoide decât frunzele plantelor mascule. Frunzele tinere au în general un conţinut de carotenoide mai mare decât frunzele bătrâne. În natură, alături de plantele autotrofe, există şi

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

26

plante semiparazite, în frunzele cărora se găsesc aceleaşi carotenoide de bază ca şi în frunzele plantelor autotrofe. Ca un aspect caracteristic apare faptul că pigmentul principal îl constituie beta-carotina. După T.W. Goodwin, carotenoidele au o largă răspândire nu numai în organismele autotrofe ci şi în organismele şi ţesuturile nefotosintetizante. Fructele alături de glucide, aminoacizi, vitamine, acizi organici, taninuri, etc., conţin un număr însemnat de carotenoide. Aici majoritatea carotenoidelor se găsesc alături de pigmenţii flavonoidici, fiind localizate predominant în coajă. Principalele carotenoide ale speciei Calendula officinalis sunt: licopina, alfa şi beta-caroten, neolicopina A, rubixntina, luteina, xantofila, violaxantina şi flavoxantina. /10/

3.3.2. Nomenclatură. Structură. Proprietăţi fizico-chimice.

Primul pigment carotenoidic izolat sub formă cristalină a fost din morcov, căruia Wackenroder în 1831 i-a atribuit denumirea de caroten. Ulterior s- a constatat că această hidrocarbură este alcătuită din 3 izomeri şi anume: alfa-, beta- şi gama-carotina. Denumirea carotenoidelor provine în cea mai mare parte de la denumirea sursei naturale din care s-a extras. Primele propuneri cu privire la nomenclatura raţională au fost făcute în 1947 de către P. Karer, fiind îmbunătăţite în 1960. În această nomenclatură se folosesc litere greceşti pentru fiecare moleculă care este considerată o entitate distinctă. Numerotarea atomilor de carbon din molecule se face cu cifre arabe, pentru prima jumătate a moleculei C 40 , de la stânga la dreapta, în ordine crescândă, iar pentru cea de-a doua jumătate, de la dreapta la stânga. Ca proprietăţi fizice, majoritatea carotenoidelor sunt substanţe colorate şi colorante întrucât posedă un cromofor alcătuit din cel puţin 8-9 duble legături conjugate. Cele care conţin mai puţin de 8-9 duble legături C=C conjugate sunt incolore, cele cu 10 duble legături au o culoare galbenă, cele cu 11 duble legături au culoare portocalie, iar cele cu peste 11 duble legături sunt roşii.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

27

Pigmenţii carotenoidici se dizolvă bine în solvenţi organici şi în lipide. Carotenoidele oxigenate se solvă numai în solvenţi organici polari. Carotenoidele prezintă un miros caracteristic slab aromat. Nu sunt toxice, nici iritante. Punctele de topire sunt în general situate sub 25 o C, marea majoritate fiind cuprinse între 170-200 o C. /10/

3.3.3. Metode de extracţie, separare, dozare şi identificare

Alegerea metodei de extracţie este determinată în principal de natura materialului vegetal, de uşurinţa extracţiei cu solvenţi, de proprietăţile şi cantitatea pigmenţilor prezenţi. T.W. Goodwin şi G. Britten, în scopul eliminării lipidelor au aplicat

următorul procedeu de saponificare: la extractul carotenoidic s-ai adăugat 1 ml etanol sau metanol 10% şi soluţie de hidroxid de potasiu 15%. În cazul în care extractul carotenoidic nu s-a dizolvat bine în etanol sau metanol i s-a adăugat un volum mic de eter sau benzen şi apoi soluţia alcoolică de hidroxid de potasiu, solventul iniţial fiind eliminat prin antrenare cu vapori de apă. D.L. Flether a utilizat două variante ale procedeului de saponificare:

  • a) – amestecul alcalin a fost încălzit timp de 5-10 minute,

ferit de lumină, pe baia de apă, sub atmosferă de azot şi apoi răcit;

  • b) – amestecul alcalin, ferit de lumină a fost lăsat la

temperatura camerei sub atmosferă de azot timp de 12-16 ore; S-a constatat că prima variantă este economică, iar a doua variantă prezintă avantajul că pigmenţii carotenoidici, cum sunt xantofilele, care sunt deosebit de termolabili, nu sunt expuşi operaţiei de încălzire. S. Liaaen-Jensen, după realizarea saponificării a extras pigmenţii carotenoidici astfel: soluţia saponificată şi răcită a fost amestecată cu eter etilic (1:1) într-o pâlnie de separare, după care s-a adăugat apă până la apariţia celor două faze, carotenoidele aflându-se în stratul eteric superior. Faza inferioară a fost eliminată, extracţia repetându-se până la extracţia completă a pigmenţilor.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

28

Pentru a evita emulsionarea săpunurilor, au fost adăugaţi câţiva mililitri de alcool sau de soluţie concentrată de sare (NaCl, MgSO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 ). Soluţiile eterice reunite s-au spălat cu apă într-o pâlnie de separare până la îndepărtarea completă a alcaliilor, s-au uscat peste sulfat de sodiu anhidru, s-au filtrat şi evaporat secundar. N. Arpin, J.L. Fiasson au constatat că separarea carotenoidelor dintr-un amestec este strâns legată de caracterul hidrofil datprat grupărilor funcţionale din moleculă şi de polaritatea moleculei, caracteristici care fac posibilă existenţa a două tipuri de metode de separare: una de repartiţie între două faze lichide nemiscibile între ele şi a doua, de separare prin proprietatea de absorbţie pe absorbant. R. Bonnett şi A.K. Mallams au separat carotinele de xantofile prin repartiţia extractului în faza lichid-lichid între eter de petrol şi metanol apos (95- 90%). Aceşti autori au constatat că separarea prin repartiţie între lichid-lichid poate fi o alternativă a saponificării în vederea eliminării clorofilelor din extracte care conţin carotenoide sensibile la alcali, procedeul fiind însoţit fie de repartiţia unei soluţii în eter de petrool cu metanol 84%, când xantofilele trec în hipofaza metanolică, clorofilele în epifază sau de extracţia unei soluţii metanolice a unui pigment cu eteri de petrol, până când toate clorofilele sunt terminate. În ambele cazuri xantofilele din hipofază au fost trecute în eter etilic şi apoi spălate cu apă. B.H. Davies a efectuat se pararea pigmenţilor carotenoidici nesaponificabili din extract în eter de petrol prin agitarea într-o pâlnie de separare, conţinând metanol 90% când toate xantofilele conţinute în extract cu 2 sau mai multe grupe OH sau grupe carbonil au trecut în faza metanolică. În epifază au rămas carotenele, cetocarotenoidele, epoxizii, eterii şi esterii carotenoidici. Din hipofază, fracţiunea metanolică, carotenoidele s-au trecut în eter etilic apoi au fost spălate cu apă şi uscate. S-a constatat că cea mai importantă tehnică de izolare a carotenoidelor în stare pură este cromatografia pe coloană.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

29

S. Liaaen-Jensen şi A. Jensen au utilizat ca procedeu pentru separarea carotenoidelor cromatografia inzone, când amestecul de carotenoide aflat într-un solvent nepolar a fost aplicat în partea superioară a coloanei, pentru developare fiind utilizat un solvent potrivit până la separarea zonelor pe coloană. Coloana a fost demontată, absorbantul selecţionat pe zone şi fiecare zonă eluată individual cu un solvent polar. G. Britton a aplicat ca procedeu de separare pe coloană cromatografia eluţiei în trepte, când proba de amestec a pigmenţilor este aplicată în partea superioară a coloanei în solvent nepolar (eterul de petrol), iar coloana este spălată prin developare cu solvent, în care solventul polar este mărit treptat. Pigmenţii sunt eluaţi în mod succesiv, în ordinea creşterii activităţii lor de absorbţie, de la zona de jos spre cea de sus a coloanei şi colectaţi sub formă de eluat. Fiecare zonă eluată a fost evaporată la sec, redizolvate într-un volum mic de solvent, în vederea examinării prin recromatografierea pe coloană, spectofotometrice. E. Stahel a efectuat separarea pigmenţilor carotenoizi prin metoda cromatografiei pe strat subţire. Probele individuale care au fost separate preliminar prin cromatografia pe coloană au fost în continuare cromatografiate pe strat subţire utilizând ca absorbant silicagel G, la care s-a adăugat o soluţie de 3% hidroxid de potasiu. Eluarea a fost efectuată cu eter etilic, sau eter etilic ce conţine 5-10% etanol, în cazul carotenoidelor polare. C. Subbarayan a efectuat identificarea carotenoidelor în tratarea cu triclorura de stibiu, acid sulfuric concentrat, când a apărut o coloraţie albastră. H.H. Strain tratând o soluţie eterică de pigment carotenoidic cu o soluţie de acid clorhidric 20%, a observat apariţia unei coloraţii albastre, pe această cale reuşind identificarea 5,8-epoxi carotenoidelor. /9/ Anna Kurowska, D. Kalemba şi I. Gola au comparat calitativ şi cantitativ componentele izo-p.myreistat (IMP), propilen-glicol (PG), şi aq.propilen glicol (AG) din extractul inflorescenţelor de gălbenele. Extractul IPM trebuie să conţină setul complet al carotenoizilor plantei. De aceea cele mai bune

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

30

rezultate au fost obţinute cu un extract galben IMP şi cu un PG. În toate extractele au fost prezente flavonoidele, inclusiv în extractul AG. au fost prezenţi acizii fenolici cu excepţ Ia acidului o-hidroxifenilacetic. Extractul AG conţine puţini carotenoizi. Conţinutul de tanin şi oleanozide a fost crescut în extractul AG. după o perioadă de stocare de 6-24 ore, componentele extractului s-au schimbat, extractul având proprietăţi organoleptice bune. /11/.

3.3.4. Rol fiziologic

Rolul şi funcţiile pigmenţilor carotenoidici constituie cea mai importantă latură a lor, fapt pentru cate li se şi justifică prezenţa în organismele vii.

Carotenoidele în organismul uman constituie sursa de retinol. Iau parter la colorarea pielii, ceea ce a dus la utilizarea lor ca agenţi fotoprotectori în boli fotoreceptoare şi chiar ca agenţi anticancerigeni. Beta-carotina este cea mai importantă, predominând în legume, fructe şi zarzavaturi, care sunt consumate de om şi din această cauză, fiind provitamina A, are cea mai mare activitate biologică.

s-a făcut o corelaţie între carotenodermie cu valori scăzute şi diferite boli infecţioase, cum sunt malaria, pneumonia, gripa, etc., s-a sugerat ca nivelurile crescute ale carotenemiei pot preveni infecţiile. Există de asemenea o corelaţie între carotenemie şi bolile de ficat. Pacienţii cu astfel de afecţiuni au o carotenemiei scăzută, datorită capacităţii reduse de absorbţie a carotenelor cauzate de leziuni al eficatului. Pigmenţii carotenoidici au proprietatea de a proteja hematiile împotriva fotohemolizei induse de un pigment porfirinic exogen sau endogen. Carotenoidele sunt utilizate în industria farmaceutică, cu precădere pentru colorarea unor preparate farmaceutice, cât şi pentru deţinerea unor preparate tonice şi dietetice regenerative.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

31

3.4. Acidul ascorbic (vitamina C)

3.4.1. Surse, factori ce influenţează conţinutul de acid ascorbic

Este foarte răspândit în regnul vegetal, unde se găseşte în toate plantele superioare şi în unele plante inferioare. Foarte bogate în vitamina C sunt fructele multor plante (Myrciaria glomerata: 2,4-2,7%), dar şi unele frunze (Vicia amoenas). În cantităţi mari se mai găseşte în fructele de ardei, coacăze negre, măceş, nuci necoapte, lămâi, mandarine etc. În urma studiilor efectuate de J.G. Wood şi D.H. Cruickshank în 1944, de Takeuchi în 1956, de S. Bose şi B.C. Guha în 1959. s-a ajuns la concluzia că în frunzele plantelor, acidul ascorbic s-ar găsi asociat cu proteine formând un complex numit ascorbigen frunzele tinere sunt mai bogate decât cele bătrâne. Cantitatea maximă de vitamina C se găseşte în petinol şi la suprafaţa frunzelor.

3.4.2. Nomenclatură. Structură şi proprietăţi fizico-chimice.

Acidul L (±) – ascorbic (vitamina C) are formula moleculară C 6 H 8 O 6 şi se prezintă ca o pulbere cristalină albă, fără miros, cu gust acru. Structura a fost dedusă de E.L. Hirst şi colaboratorii săi şi de F. Michael şi K. Craft în 1933. Acidul ascorbic poate fi privit ca lactona acidului 2-ceto-L-gluconic (forma enolică). Cele două grupări enolice din moleculă determină caracterul acid şi reducător al vitaminei C. În apă aceasta este solubilă. Din etanol-eter cristalizează sub formă de foiţe cu p.t. 190-192 o C. Rotaţia specifică în apă (alfa) D + 23 o creşte în decurs de trei zile la + 31 o , pentru a scădea încet până la 0 o C, în metanol (alfa) D + 48 o . În apă acidul ascorbic se titrează în prezenţa fenolftaleinei ca un acid monobazic. Acest caracter se datorează grupării enolice de la C 3 a cărei constantă de disociere este K = 4,17 faţă de K = 11,57 a grupării enolice de la C 2 . în soluţie acidă, acidul ascorbic este destul de stabil, în soluţii alcaline, îndeosebi în

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

32

prezenţa luminii şi de cantităţi catalitice de metale, este oxidat de oxigenul atmosferic în acid dehidro-L-ascorbic, datorită pierderii celor doi atomi de hidrogen de la grupările enolice. Oxidarea are loc repede sub acţiunea unor oxidanţi slabi. Agenţii reducători, chiar slabi reoxidează acidul dehidroascorbic, în acid ascorbic. Oxidanţii mai puternici determină o scindare a moleculei acidului dehidroascorbic prin ruperea legăturii între C 2 şi C 3 , cu formarea de acid oxalic şi acid L-treonic. În plante oxidarea acidului ascorbic este catalizată de ascorbinoxidaza şi reducerea acidului dehidroascorbic este catalizată de către ascorbin-reductaza. Prin intervenţia ascorbinreductazei, după M. Yamaguchi şi M.A. Jocelyn, 1952, acidul dehidroascorbic poate fi redus în acid ascorbic de către glutation. În ţesuturile vegetale transformarea acidului ascorbic în acid dehidroascorbic se realizează prin reacţii de oxidare enzimatică şi neenzimatică. Oxidarea enzimatică are loc sub acţiunea ascorbinoxidazei, identificată în diferite plante şi dovedită a fi o Cu-proteidă. Oxidarea neenzimatică a acidului ascorbic este catalizată în ţesuturile vegetale de săruri ale metalelor grele. /9/

3.4.3. Metode de separare, dozare şi identificare

L.A. Schinjanski şi L.S. Kasarnowski au efectuat extracţia sub influenţa ultrasunetelor cu frecvenţa de 480-500 KHz, intensitatea de 20W/cm 2 şi un timp de expunere de 15 secunde. Comparându-se acest extract cu un extract normal s-a observat că prin tratare cu ultrasunete se micşorează timpul de extracţie, iar cerinţele acestui extract corespund farmacopeei. /12/ Stanislaw Krauzer şi Zbigniew Bozyk recomandă metoda de extracţie a lui Fellemberg. Cercetările asupra vitezei de catabolizare a vitaminei C arată că pierderile care apar sunt determinate de punerea în libertate de SO 2 care nu este legat de (CH 3 )CO. La metoda lui Pijanowski, în fierbere se pierde mai mult de 10% din vitamina C; la extracţiile tehnice pierderile fiind mai mari. /13/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

33

Conform patentului francez numărul 1033046 din 23/02/1951, autorul Michel Cormar a efectuat extracţia selectivă pentru separarea vitaminei C prin utilizarea unui sistem format din 2 lichide miscibile şi o substanţă solidă solubilă în unul din lichide. Metoda foloseşte ca solvenţi miscibili cu apa, acetona, etil- cetona, iar ca substanţă solidă utilizată pentru separarea amestecului lichid în două faze, zaharoza, clorura de calciu, sulfatul de amoniu, sulfatul de zinc şi iodura de sodiu. Un amestec de acetonă şi apă se separă prin adaos de clorură de calciu în două faze, faza superioară formată, conţinând 96,20% acetonă, 4,80% apă; 59,30% apă şi 35,50% clorură de calciu. /14/ Letzig E. şi Fuecker K. au propus o metodă de determinare prin electroforeză la curent înalt a vitaminei C. În cadrul metodei, probele au fost pregătite făcându-se amestecul cu soluţie 2% acid oxalic. Soluţia filtrată a fost utilizată pentru electroforeza pe o sticlă plată de 20 x 20 cm, cu un strat subţire de pudră de celuloză la 600 V şi 20 mA pentru 60-90 minute. Bandele de acid ascorbic au fost marcate în lumină ultravioletă, îndepărtate şi developate cu alaun fericşi o-fenentrolină-HCl. Măsurătoarea spectrofotometrică a fost făcută la 510 nm. Acidul dehidroascorbic a fost determinat ca osazonă. /15/.

3.4.4. Rol fiziologic

Acidul ascorbic şi dehidroascorbic formează în celule un sistem de oxido-reducere foarte important, care ia parte în numeroase procese metabolice din organism. Acest sistem reglează potenţialul de oxido-reducere celular şi contribuie la transportul hidrogenului pe cale neenzimatică, imprimând ţesăturilor vegetale ale fanerogramelor un caracter reducător. Acidul ascorbic stimulează metabolismul glucidelor, lipidelor, glico-proteidelor şi a numeroşi aminoacizi. Au o acţiune antioxidantă, de apărare a vitaminelor liposolubile şi a glutationului. Vitamina C îndeplineşte rolul de activator general al metabolismului celular. Acidul ascorbic are o activitate vitaminică mai mare decât a acidului dehidroascorbic. În avitaminoza accentuată se produce la om boala numită

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

34

scorbut, caracterizată prin hemoragii la nivelul gingiilor (gingivite), apariţia de hematoame, tulburări digestive, anemie, stări de subfebrilitate, etc. Transformarea reversibilă a acidului ascorbic în acid dehidroascorbic se face mai uşor prin intermediul glutationului şi respectiv a diglutationului. /16/

3.5. Uleiurile grase (lipide vegetale)

  • 3.5.1. Structură şi proprietăţi fizico-chimice

Lipidele sunt substanţe de rezervă formate din esteri ai glicerinei cu diferiţi acizi graşi. Acizii graşi sunt alifatici şi pot fi saturaţi (acidul butiric, capronic, lauric, palmitic şi stearic) sau nesaturaţi (acidul oleic, linoleic etc.). Prin saponificarea acestora trigliceridele se pun în libertate compusul alcoolic, glicerina.

Uleiurile grase prezintă o serie de proprietăţi fizico-chimice comune. Sunt lichide nevolatile (uleiuri fixe), grase la pipăit, care nu se amestecă cu apa, dar sunt solubile în benzen, cloroform, eter, sulfură de carbon, eter de petrol, benzină, etc. Cu excepţia unor uleiuri grase (ulei de ricin) sunt greu solubile sau insolubile în alcool etilic. Culoarea gălbuie a unor uleiuri vegetale se datorează conţinutului lor în carotenoizi. Unele uleiuri grase întinse într-un strat subţire rămân lichide (uleiuri nesicative). Alte uleiuri se transformă cu timpul într-o masă elastică (uleiuri sicative), proprietate pentru care sunt utilizate în diferite scopuri tehnice.

  • 3.5.2. Surse. Factori de influenţă. Rol fiziologic.

Uleiurile grase se găsesc în cantităţi mari (30-50%) în diferite seminţe, care servesc la obţinerea lor pe cale industrială. Unele uleiuri sunt folosite în scopuri farmaceutice, respectiv terapeutice, în calitate de solvenţi ai unor medicamente liposolubile, precum şi pentru prepararea unor unguente, emulsii

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

35

etc. Uleiurile grase în componenţa cărora intră acizii graşi nesaturaţi într-un procent mai mare, joacă rolul vitaminei F. În ultimii ani se consideră că lor le revine un rol important în metabolismul colesterolului, fiind apreciată în prevenirea şi tratamentul A.T.S. Unele uleiuri vegetale sunt utilizate ca şi medicamente coleretice sau purgative. Alături de trigliceride în plante se găsesc în cantitate mai mică steride, compuşi în care componentul alcoolic este fitosterolul sau alt alcool steroidic. Steridele se deosebesc de uleiurile grase prin lipsa proprietăţilor de saponificare în împrejurările în care se saponifică trigliceridele. Ele formează fracţiunea insaponificabilă din diferite uleiuri grase. J. Turowska urmăreşte variaţiile sterolilor liberi şi obligaţi în Calendula officinalis în timpul creşterii. Studiul distribuţiei sterolilor în timpul creşterii plantelor arată că perioada germinaţiei a fost caracterizată prin hidroliza esterilor sterolici, a sterolilor liberi. Perioada înfloririi este caracterizată prin acumularea esterilor sterolici, sterol-glicozidelor şi sterolilor liberi în toate organele plantei, particular în flori. Perioada senescenţei este caracterizată prin hidroliza esterilor sterolici în lăstari şi prin esterificarea sterolilor în rădăcini şi seminţe. /17/ W. Saniszowska expune rezultatul cercetării localizării intracelulare a biosintezei tocoferolului în Calendula officinalis. ( 3 H) fitol a fost administrat protoplaştilor din frunze şi din fracţiile subcelulare, etichetând dinamica 7- monometiltocolului, 8-monometiltocolului, 7,8-dimetiltocolului şi 5,7,8,- trimetiltocolului şi relaţia fitilchinonelor la fel de bune ca a vitaminei K 1 . Prin condensarea cu acid homogentisic au fost formulaţi doi izomeri metilfitilchinone(2-metil-5-fitobenzochinone) şi (2-metil-6- fitobenzochinone). Mai târziu a fost adăugată ciclizarea gama-tocoferolului care poate fi metilat la alfa-tocoferol. Reacţia slabă a fost localizată în cloroplaste şi microzomi. Câţiva monometiltocoli şi metilfitilbenzochinone au fost decelaţi la fel de buni ca vitamina K 1 putând fi transportaţi la cloroplaste şi mitocondrii. /18/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

36

Conform studiului realizat de R.C. Badami, uleiul din seminţele de gălbenele conţine monohidroxiacid în proporţie de aproximativ 5% din acidul gras. /19/ Z. Wojcieckowski a investigat efectul acidului oleanolic sintetizat individual în frunzele plantelor de gălbenele. A fost probat ca raportul şi direcţia transportului depinde de etapa de vegetaţie şi de poziţia frunzei pe plantă. Cel mai mare raport al transportului a fost observat din nivelul superior al frunzelor către inflorescenţă, în perioada înfloritului. Perioada de după explozie a fost caracterizată de încetinirea migraţiei acidului oleanolic din frunză. Migraţia a fost direcţionată din partea de jos a frunzelor în special către rădăcini. /20/ W. Saniszowska şi J. Rygir studiind schimburile în nivelul prenilchinonelor şi tocoferolilor în Calendula officinalis în timpul vegetaţiei, afirmă că plastochinonele, ubichinonele, gama-metiltocolul şi alfa- tocoferolchinonele, alfa şi gama-tocoferolii cresc continuu de la faza de sămânţă la cea de înflorire. În timpul senescenţei nivele lor au scăzut cu excepţia ubichinonelor. Investigarea s-a efectuat în seminţe, lăstari şi flori. În rădăcini s-au găsit doar ubichinone şi puţini alfa-tocoferoli. /21/ K. Szasz menţionează că de la 14 componente izolate din uleiuri de Calendula officinalis, numai 4 sunt identificate: gama-murolon, deltacadinon, guaiol şi terreiol. Conţinutul uleiului este diferit în diferitele părţi ale florilor. Acest fapt, explică contradicţiile din literatură date de conţinutul uleiului din inflorescenţă. Conţinutul în ulei a organelor varietăţii cu flori galbene, cu excepţia mugurilor şi a florilor ligulate, a fost mai mare decât a varietăţii cu flori portocalii. Totuşi, compoziţia uleiului nu a fost diferită în cele două variante. /22/

3.6. Materialele tanante (Taninuri)

3.6.1. Structură şi proprietăţi fizico-chimice

Taninurile alcătuiesc o grupă de principii activi unitari, mai mult din punct de vedere al proprietăţilor tehnologice decât din punct de vedere chimic.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

37

Sunt substanţe care pot fi utilizate la tăbăcirea pielii. Ele prezintă proprietatea comună de a precipita proteinele, alcaloizii şi acetatul de plumb. Gustul lor este astringent. Din punct de vedere chimic materialele tanante aparţin grupei polifenolilor şi pot fi de două tipuri: compuşi formaţi din fenoli prin esterificare, în unele cazuri în combinaţii cu glucidele şi compuşi cu nucleu condensat. Substanţele din prima categorie pot fi hidrolizate prin fierbere cu acizi minerali. Substanţele din categoria a doua conţin nuclee flavonoide, sunt înrudite cu catechinele şi antocianinele şi spre deosebire de substanţele din grupa precedentă, nu pot fi hidrolizate cu acizi. În urma încălzirii uscate primele dau pirogalol, le conţin, materialele tanante produc reacţii de culoare cu sărurile de metale grele. În prezenţa clorurii ferice, materiile tanante hidrolizabile dau o coloraţie sau un precipitat albastru până la negru, iar cele cu nucleu condensat, o coloraţie în verde. Materiile tanante acţionează asupra mucoaselor, coagulează proteinele şi în consecinţă prezintă o acţiune hemostatică. /1/

3.6.2. Metode de extracţie, separare, dozare şi identificare

Taninurile din produsele vegetale au o constituţie foarte variată şi prezintă tendinţa de a se condensa şi de a se oxida, structura lor atât în produsul vegetal cât şi în soluţiile extractive se modifică în timp, iar activitatea astringentă a preparatelor nu este legată de cantitatea de taninuri. Taninurile sunt solubile în apă, alcool, glicerol, acetonă, puţin solubile sau insolubile în eter, cloroform, benzen, în soluţii alcaline sau acide, sub acţiunea luminii şi a oxigenului se descompun repede. W. Lang în studiile sale a arătat că un reactiv general pentru taninuri este acidul fosfowolframic. Pentru a mări specificitatea acestei reacţii, autorul procedează în prealabil la o precipitare a taninurilor cu acetat de zinc în mediu amoniacal, apoi separă precipitatul, pune taninurile în libertate cu acid sulfuric diluat şi tratează în mediu slab alcalin cu acid fosfowolframic, când s eobţine o coloraţie albastră, datorită acţiunii

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

38

reducătoare a acestora. Prin acest procedeu sunt eliminate substanţele străine care pot falsifica rezultatele: glicozidele polifenolice nu sunt precipitate cu acetatul de zinc, flobafenele deşi sunt precipitate nu se dizolvă în acid sulfuric diluat. Un procedeu analog care foloseşte pentru identificare reactivul arsen wolframic a fost propus de G. Grieger. Taninurile au fost precipitate cu acetat de plumb şi gelatină, separate prin centrifugare şi aduse din nou în soluţie cu ajutorul acidului fosforic. Soluţia limpede, sau clarificară prin filtrare a fost tratată cu reactiv arsen wolframic până la apariţia unei coloraţii albastre. Reactivul a fost preparat prin încălzirea în reflux timp de 2 ore a amestecului format din 100g wolframat de sodiu, 30 g acid arsenic, 50 ml acid sulfuric şi 300 ml apă. Soluţia s-a filtrat şi s-a adus la 1000 ml cu apă.

3.6.3. Rol fiziologic şi utilizări practice

Rolul fiziologic al taninurilor este puţin cunoscut. Cercetările recente par să indice că taninurile se acumulează în ţesuturi care nu mai constituie sediul unui metabolism activ şi că ar îndeplini rolul de substanţe ce protejează planta împotriva atacului din partea viruşilor şi a microorganismelor. A.L. Cursanow a arătat că, catechinele libere fac parte din sistemele redox ale plantei, putând constitui transmiţători între enzime oxidante şi substraturi oxidabile. Taninurile se utilizează pe scară largă în procesul de tăbăcire a pielii. În acest scop se folosesc extractele apoase obţinute din organe vegetale bogate în tanin. Taninurile se mai utilizează la fabricarea unor cerneluri, în alte ramuri ale industriei chimice, în farmacie, în industria textilă, la limpezirea vinurilor şi la laboratoarele de chimie.

3.7. Proteidele

Proteidele sunt cele mai importante poliprotide, ele fiind substanţe de bază în manifestările sub orice formă a vieţii. În locul denumirii de proteide se foloseşte adeseori numele de substanţe sau materii proteice, sau cel de proteine.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

39

3.7.1. Răspândire

Proteidele sunt componente nelipsite ale oricărei celule vegetale sau animale. Ele se găsesc în cantitate mare în nucleul celular şi formează mare masă a protoplasmei celulare. Proteidele se găsesc şi în sucurile care circulă în

organismele vegetale, în general în toate organele plantei, în cantitate mai mare aflându-se în seminţe. În organismele vii proteidele prezintă caractere coloidale. Frunzele plantelor tinere conţin 30-40% proteide din substanţa uscată, dar conţinutul lor scade la îmbătrânire.

3.7.2. Metode de izolare, purificare şi dozare

Proteidele solubile se extrag din ţesuturile fin divizate, cu apă sau soluţii de săruri sau de alcali, corespunzător solubilităţii diferitelor proteide. Proteidele greu solubile se extrag cu acid formic sau cu soluţie de uree, guanidină, proidină, etc., câteodată cu acizi minerali tari. Extragerea se face în toate cazurile la temperatură joasă şi repede. Din soluţii proteidele por fi precipitate prin coagularea soluţiei concentrate sau prin precipitarea cu alcooli sau acetonă. Pentru a separa proteidele între ele şi totodată de substanţe străine, se foloseşte mai frecvent metoda precipitării fracţionate cu sulfat de amoniu sau sulfat de magneziu de diferite concentraţii, sau precipitarea fracţionată cu alcool sau acetonă. Obţinerea proteidelor în stare perfect pură este de cele mai multe ori o operaţie dificilă, care necesită aplicarea succesivă a mai multor metode. O serie de proteide se pot separa în stare cristalină, dar cristalele au de multe ori o structură neunitară, datorită faptului că proteide diferite pot cristaliza împreună. Identificarea proteidelor se face prin reacţii caracteristice de culoare şi de precipitare. Dozarea proteidelor din materiile vegetale se face de obicei pe baza determinării conţinutului în azot după metoda Kjeldahl. Rezultatele care se obţin în urma degradării materiilor vegetale, după Kjeldahl, prezintă proteide numite

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

40

brute, pentru că azotul determinat nu provine exclusiv de la proteide, ci de la alte substanţe azotate. Pentru determinarea proteidelor pure, ele trebuie separate de celelalte substanţe prin precipitare cu reactivi specifici, ca de exemplu cu hidroxid de cupru, acetat de plumb, alcool 78% etc. Proteidele digestibile se determină în condiţii de digestie experimentală, prin hidroliza cu pepsină în mediu acid.

3.7.3. Rol fiziologic

Proteidele sunt substanţe indispensabile pentru orice organism viu. Unele proteide constituie elemente structurale ale tuturor celulelor, altele sunt substanţe de rezervă şi substanţe cu activitate biologică ridicată. La unele plante s-a constatat că substanţele proteice din frunze pot fi folosite ca substrat respirator.

CAPITOLUL IV. CONCLUZIILE STUDIULUI DE LITERATURĂ

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

41

În urma studiului efectuat se poate constata că utilizarea florilor de gălbenele este relativ veche, ele reprezentând o sursă inepuizabilă de principii activi, cu deosebită importanţă în practica farmaceutică, cosmetică şi chimică. Fiind o plantă existentă în flora spontană şi cultivată a ţării noastre, puţin pretenţioasă la condiţiile de mediu, cultivată şi în câmpia de vest, prezenta lucrare de diplomă şi-a propus să:

-efectueze studii fitochimice referitoare la principii activi ai florilor de gălbenele: saponozide triterpenice, carotenoide (licopina, alfa şi beta caroten, noelicotina A, rubixantina, luteina, xantofila, violaxantina, flovoxantina), flavonoizi şi glicozizi flavonici, rutinozizi, mucilagii, esteri colesterinici ai acizilor lautic, miristic, palmitic şi margaric; vitamina C, acid malic, substanţe proteice, calendulina şi altele. -stabilească condiţiile optime de extracţie integrală a principiilor activi.

CAPITOLUL V. REZULTATE. DISCUŢII. CONTRIBUŢII ORIGINALE

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

42

5.1. Obţinerea extractelor

În acest scop s-au folosit flori de categoria a II-a (pierderi de umiditate 50%). Conţinutul în E a fost de 5,7%, de flavonoide 0,28% şi de uleiuri 5,23%.

5.1.1. Macerarea

Macerarea s-a făcut după metoda clasică.

5.1.1.1. Macerarea metanolică

S-au preparat macerate cu concentraţii metanolice în raport decimal 1:5. Proba s-a umflat puternic în solvent metanolic de 0-50% volum. În concentraţie metanolică mare, umflarea a fost minoră. Intensitatea culorii extractelor a crescut în sens invers. Culoarea extractului metanolic a fost galben deschis. La MeOH 80% (vol) s-a putut observa o culoare intensă galben deschis, care la scăderea conţinutului de MeOH a trecut în galben-brun. Maximul intensităţii de culoare a fost la MeOH 10% (vol.). Macerarea cu MeOH este optimă numai pentru determinarea flavonoidelor. La scăderea concentraţiei de MeOH până la zero nu s-au înregistrat diferenţe considerabile în eficacitatea la extracţie. Deci MeOH este mai bun solvent pentru izolarea extracţiei flavonoidelor. Surprinzător de mare este conţinutul de E (calculat ca beta-E) în extractul apos. Creşte până la MeOH 40% (vol.) pentru a rămâne relativ constant până la MeOH 90% (vol.), înregistrându- se un optim de 60%. Foarte ciudată este scăderea conţinutului de E în extract de MeOH pur când nu ajunge nici la 2x din valoarea extractului apos (Tabel 1)

Tabelul 1

MeOH % vol

E %

Flavonoide mg%

Conţinutul extractelor

%

0

0,284

15,16

2,61

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

43

  • 10 0,605

17,17

3,30

  • 20 0,706

17,76

3,83

  • 30 0,890

17,80

3,94

  • 40 1,010

17,73

4,04

  • 50 1,072

18,54

4,03

  • 60 1,140

19,13

4,03

  • 70 1,110

19,26

3,96

  • 80 1,046

19,58

3,92

  • 90 1,017

20,14

3,23

100

0,460

41,80

3,12

5.1.1.2. Macerarea etanolică

S-au abordat macerate cu un raport de extracţii 1:5 până la 1:10 în concentraţii decalare de EtOH. Un randament optim s-a atins la 1:5 cu EtOH 50- 80% vol. Dacă în cazul maceratului metanolic am văzut că pentru MeOH 90% faţă de MeOH 10% conţinutul de M este de 2x, în cazul celor etanolice relaţia este inversă. Schimbarea raportului de extracţie este 1:10 duce la îmbunătăţiri

nesemnificative ale randamentului care nu justifică efortul depus (Tabel 2).

Tabelul 2

EtOH % vol

E %

Flavonoide mg%

Conţinutul extractului

%

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

44

 

Raport de extracţie 1:5

0

0,220

15,30

2,61

  • 10 0,956

40,74

3,57

  • 20 1,020

42,46

3,77

  • 30 1,070

44,75

4,01

  • 40 1,120

45,80

4,06

  • 50 1,180

46,20

4,11

  • 60 1,160

46,40

4,20

  • 70 1,180

47,60

4,22

  • 80 1,180

46,00

4,05

  • 90 0,549

36,90

2,05

100

0,198

11,20

1,21

 

Raport de extracţie 1:10

0

0,120

18,04

1,09

  • 10 0,557

25,04

1,91

  • 20 0,614

31,85

2,23

  • 30 0,605

33,58

2,56

  • 40 0,623

36,81

2,58

  • 50 0,633

36,48

2,68

  • 60 0,650

36,30

2,63

  • 70 0,685

35,81

2,75

  • 80 0,710

35,69

2,61

  • 90 0,712

22,88

1,75

100

0,160

12,19

1,35

5.1.1.3. Dubla macerare

Utilizarea cloroformului pentru extracţia carotenilor este ilustrată de randamentele obţinute (0,0845 g% la prima macerare şi 0,0607 g% la o doua macerare). Poate fi evidenţiat propilenglicolul, care extrage atât carotenii, cât şi flavonele, dar cu randament mai mic decât ceilalţi solvenţi. Prin reunirea maceratelor alcoolice, cu cele de ulei de floarea soarelui şi respectiv, maceratelor cloroformice cu maceratul în propilenglicol, urmată de îndepărtarea solvenţilor volatili din amestecurile nemacerate, rezultă soluţii extractive bogate în principii activi cu caracter hidrofil şi lipofil. Această metodă realizează preparate extractive îmbogăţite în ambele fracţiuni. /23/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

45

5.1.2. Turboextracţia

Ca durată optimă a extracţiei cu EtOH 96% s-a găsit 10 minute (Tabel 3)

Tabelul 3

Timp extract

E %

Punct de extracţie

5

0,374

0,328

10

0,423

0,371

15

0,423

0,371

20

0,424

0,372

Nici în EtOH apos nu s-a înregistrat o umflare puternică a materialului mărunţit ca la macerat, însă totuşi prezentă. Din reziduul extracţiei aproape că nu s-a putut recupera prin presare solvent încât este suficientă o clătire a florilor mărunţite. Culoarea extractelor a virat de la galben-deschis până la galben intens. La EtOH 10%, extractul apos galben deschis a fost tulbure şi nu s-a putut filtra. Optimul randament în flavonoide s-a obţinut cu EtOH 50-60% vol. Şi coincide cu randamentul de E, a cărui maxim este la EtOH 40-70% vol. Cantitatea cea mai mare în extract uscat s-a atins la 40 vol. Nici în acest caz nu există un paralelism între conţinutul optim de substanţă activă, intensitate de culoare şi conţinut de extract uscat (Tabel 4).

Tabelul 4

EtOH % vol

E %

Flavonoide mg%

Conţinutul extractului %

0

0,17

14,40

0,98

  • 10 0,67

22,30

2,00

  • 20 0,90

33,40

3,72

  • 30 1,13

41,08

5,07

  • 40 1,13

48,26

4,71

  • 50 1,14

53,30

5,30

  • 60 1,18

50,75

4,69

  • 70 1,18

44,02

3,98

  • 80 0,99

36,00

3,22

  • 90 0,81

26,30

2,21

100

0,45

17,60

1,57

5.1.3. Percolarea

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

46

Prepararea percolatelor s-a făcut după o modificare a prescripţiei clasice, deoarece aceasta nu este economică pentru o producţie de mare tonaj. S-a urmărit reproducerea condiţiilor industriale la scară mică. Referitor la culoare şi intensitate, percolatele s-au comportat ca şi maceratele şi turboextractele. Deosebit de mare este conţinutul de escină în percolatul apos, care cu valoarea de 0,78% reprezintă aproximativ 52% din randamentul maxim. Cea mai bună extracţie de escină s-a obţinut cu EtOH 50- 70% vol; EtOH 96% a dat randamentul cel mai slab. Un rezultat surprinzător s-a obţinut, referitor la randamentul în flavonoide, pentru care a rezultat un maxim de extracţie apoasă. Similar pentru conţinutul de extract uscat (Tabel 5).

Tabelul 5

EtOH % vol

E %

Flavonoide mg%

Conţinutul în extract %

0

0,78

54,01

5,88

  • 10 0,92

53,04

5,73

  • 20 1,06

54,20

5,63

  • 30 1,20

51,42

5,52

  • 40 1,38

50,80

5,40

  • 50 1,51

50,20

5,26

  • 60 1,51

47,30

5,15

  • 70 1,51

40,02

4,92

  • 80 1,40

30,01

4,60

  • 90 0,80

20,48

2,74

100

0,44

15,44

1,36

5.1.4. Interpretarea rezultatelor

Randamentul cel mai bun în escină (Tabel 6) s-a obţinut cu EtOH 50- 70% vol. Valoarea de 132,50 μg/g se datorează încercărilor analitice la care escina s-a izolat material cu EtOH 96%. Pentru date mai exacte în privinţa conţinutului de escină, trebuie extrase cu EtOH 70% vol., în loc de 90% vol. Pentru flavonoide se înregistrează o creştere a randamentului în funcţie

de solventul utilizat. Nu s-au înregistrat valori peste 100%.

Tabelul 6

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

47

Metoda

Escină μg/g

 

Macerare cu MeOH 1:5

40-60

40-60

Macerare cu EtOH 1:5

50-80

103,50

70,00

85,00

Turboextracţie cu EtOH 1:5

50-70

103,50

50-55

98,7

Percolare cu EtOH 1:5

50-70

132,50

0-55

96,40

Pe baza raportului de extracţie este neapărat necesară o umflare a produsului pentru o extracţie exhaustivă a escinei. Dacă este suficientă escina trece foarte repede în soluţie şi de exemplu în cazurile percolării se găsesc aproape integral în primele părţi de percolat similar şi flavonoidele. Solubilitatea mei bună în medii apoase s-a recunoscut optic prin intensificarea culorii brun- roşcate a extractelor. Percolarea este metoda cea mai adecvată pentru escină. Pentru flavonoide este în egală măsură atât percolarea cât şi turboextracţia.

5.2. Identificarea şi determinarea componentelor

5.2.1. Complexul saponinic

Identificarea E (escină), respectiv a complexului saponinic, s-a efectuat prin C.S.S. pe silicagel Co. Deoarece în literatură nu prea există referiri la solubilitatea escinei E, sau ele sunt contradictorii, s-a stabilit solubilitatea E în câţiva solvenţi (Tabel 7).

Tabelul 7

Solvent

E % /lit/

/reg/

EtOEt

În vol

0,0076

CHCl 3

În vol.

0,0077

H 2 O

0,007-0,01

0,0250

EtOH

Uşor solubil

21,700

MeOH

Uşor solubil

25,880

În elaborarea unei metode adecvate de determinare a E în extracte escinice sau preparate, şi a verificării conţinutului de E a florilor de Calendula de diferite provenienţe, s-au verificat metoda escinică după Romich şi determinarea fotometrică după Schlemmer. Determinările după prima metodă au dat cu escina

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

48

pură (luând în considerare conţinutul de apă al substanţei) date insuficient reproductibile pentru o determinare exactă. Marja de eroare apreciată la ±5% este de fapt mai mare şi atinsă numai de un operator rutinat. În rare cazuri s- a regăsit cantitatea de escină introdusă. Deosebit de dificilă s-a dovedit aducerea la sec a probelor datorită fierberii explozive, încercarea se compromite. Evaporarea a dus la un consum mare de timp apropiat mai avantajos. S-a regăsit substanţa luată în lucru 100%. Valorile au fost între 97 şi 104%. La reproducerea metodei s-a găsit ca o spălare ulterioară a reziduului de la evaporarea extractelor cu eter, în scopul îndepărtării sterinelor sau grăsimilor coantrenate în ciuda recomandărilor autorului, duc la pierderi de escină şi la variaţii de reproductibilitate a rezultatelor. Cu toate că escina deţine aceeaşi solubilitate în EtOH ca în CHCl 3 aceasta din urmă influenţează reproductibilitatea în mod favorabil. Unul din motive este faptul că CHCl 3 faţă de EtOH, solubilizează complet grăsimile. O prelucrare a fracţiunilor de spălare eterică a dus în toate cazurile la regăsirea diferenţei de până la 100%. În determinarea conţinutului de escină în florile de Calendula extractul s-a făcut după metoda Melwitschuk. Mărunţirea în moara cu ciocane (Pironette) a dus însă la rezultate reproductibile.

5.2.2. Flavonoidele

Pentru determinarea conţinutului de flavoniode în extractele de seminţe s-a aplicat metoda după Horckmmer. Ea reprezintă premizele unei investigaţii de rutină şi este aplicabilă în cazul florilor de Calendula . soluţii cu un conţinut diferit de cvercetină au fost determinate după această metodă, iar valorile au fost citite pe o curbă de etalonare a unei soluţii standard de cvercetină. În toate cazurile s-a regăsit cantitatea de cvercetină introdusă. La izolarea flavonoidelor din florile de Calendula s-a găsit cea mia avantajoasă metodă de fierbere, cu MeOH (Tabel 8).

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

49

Tabelul 8

Sursa

E %

Flavonoide %

U.S.A.B.

8,76

0,27

BUZIAŞ

4,25

0,21

DOMASNEA

8,46

0,27

MOŞNIŢA

8,07

0,26

BOCŞA

6,21

0,23

BERZOVIA

6,17

0,24

FIBIŞ

5,82

0,21

FĂGET

5,20

0,18

LUGOJ

6,01

0,19

SACU

5,43

0,21

IABLANIŢA

4,63

0,17

În completarea tabelului 8, se va lua în considerare următorul tabel

adiacent:

Metoda de izolare

Flavonoide (%)

Extracţie cu Soxhlet (10 ore)

0,238-0,245

Fierbere cu EtOH

0,220-0,215

Fierbere cu MeOH

0,217-0,276

Ne-a suscitat interesul dacă, conţinutul de escină, respectiv flavonoide prezintă pe lângă variaţii sezoniere şi variaţii teritoriale. În acest scop s-au ales flori de Calendula în diferite zone ale Banatului, după mărunţire, uscare şi măcinare, rezultă clar că influenţarea conţinutului nu este geografică, ci de mediu ambiant.

5.2.3. Carotenoidele

Eliza Gafiteanu, Ioana Matei, Iuliana Popovici şi Dorina Lazăr, în cercetările efectuate asupra florilor de Calendula au urmărit realizarea unor soluţii extractive bogate în principii active, în condiţii de extracţie avantajoase. Conţinutul în flavone şi caroteni la extracţia selectivă şi succesivă a produsului „Calendula flos” cu diferiţi solvenţi, începând cu cel mai lipofil, a fost următorul (Tabel 9):

Tabelul 9

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

50

Solvent

Raport

Metode

Durata

Conţinut în g% în:

drog/solvent

de

de

Flavonoide

Caroteni (beta

extracţie

extracţie

(în rutozid)

caroteni)

Eter

de

100/q.s.

Extracţie

Până

la

 
  • - 0,1047

petrol

în

epuizare

Soxhlet

cloroform

100/q.s.

Extracţie

Până

la

 
  • - 0,0169

în

epuizare

Soxhlet

Alcool

100/100

refluxare

-

0,35

-

În scopul realizării unor randamente superioare s-a ales raportul drog/solvent de 5/100 şi au fost respectate condiţiile prevăzute la „macerarea repetată”. Pe baza rezultatelor obţinute în prima serie de extracţie s-a ales ca solvent cloroformul şi alcoolul, urmând ca în faza viitoare, acelaşi produs vegetal să fie extras prin macerare simplă cu propilenglicol şi respectiv cu ulei de floarea soarelui.

Conţinutul în flavone şi caroteni obţinut la extracţia prin macerarea produsului „Calendula flos” a fost cel redat în tabelul 10.

Tabelul 10

Solvent

Raport

Conţinutul în g% în:

 

drog/solvent

Flavone (în

Caroteni

(în

beta

rutozid)

caroteni)

Alcool

10/100

0,2916

-

alcool

10/100

0,2563

-

Cloroform

10/100

-

0,0845

Cloroform

10/100

-

0,0607

Ulei de floarea soarelui

10/100

-

 

0,0209

Propilenglicol

10/100

0,02071

0,0363

Se constată că randamentul în flavone este asemănător la cele 2 soluţii alcoolice, de unde rezultă utilitatea macerării dublă şi capacitate mare de extracţie a alcoolului (0,2961 g%; 0,2563 g% faţă de 0,02071 g% cât extrage propilenglicolul). /23/

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

51

La extracţia produsului „Calendula flos” prin digestie, conţinutul în flavone şi caroten este cel redat în tabelul 11.

Tabelul 11

Solvent

 

Raport

Conţinutul în g% în:

 

drog/solvent

Flavone (în

Caroteni (în beta

rutozid)

caroteni)

Propilenglicol

10/100

0,0150

0,0403

Propilenglicol alcool benzilic

şi

10/100

0,0194

0,0472

Ulei

de

floarea

10/100

 
  • - 0,0116

soarelui

Ulei

de

floarea

10/100

 
  • - 0,0124

soarelui

Parafină lichidă şi alcool benzilic 1%

10/100

 
  • - 0,0108

Adausul de alcool benzilic la propilenglicol şi ulei de floarea soarelui este în favoarea conservării şi măreşte randamentul de extracţie pentru flavone şi pentru caroten. Uleiul de parafină utilizat într-o singură variantă de extracţie cu alcool benzilic, realizează un conţinut scăzut de caroteni (0,0108 g%). În cazul digestiilor cu propilenglicol se observă o creştere a conţinutului în caroteni (0,0472 g%), faţă de procedeul prin macerare (0,0363 g%), dar nu şi a conţinutului în flavone (0,02071 g%) la macerat şi 0,0194 g% la digestie).

  • 5.2.4. Acidul ascorbic

Soluţia apoasă a acizilor carboxilici s-a tratat cu exces de apă. În urma filtrării a avut loc identificarea prin C.H. ascendent. S-a putut pune în evidenţă acid ascorbic în comparaţie cu etalonul.

  • 5.2.5. Metionina

Punerea în evidenţă a aminoacizilor în „soluţia mamă” s-a făcut cu ninhidrină 0,3%. S-a obţinut o coloraţie slab purpurie. Recunoaşterea metioninei

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

52

după separarea flavonoiodelor s-a făcut cu soluţie pentacianonitrosil ferat (III) de sodiu 1% printr-o coloraţie în roşu.

  • 5.2.6. Colina

S-a izolat din extractul pur şi s-a identificat ca picrat (p.t. 237-239 o C).

  • 5.2.7. Aneurin-HCl

Identificarea s-a făcut după separarea colinei cu soluţie proaspătă de K 2 /Fe(CN) 6 / prin formarea unei fluorescenţe albastru-violetă care a reapărut la adăugarea a două picături KOH 1n.

  • 5.2.8. Aminopurinele

În ultraviolet s-au pus în evidenţă 4 compuşi care s-au dovedit a fi

adenina, adenozina, guanina şi acidul uric. Acidul uric s-a recunoscut printr-o pată albastră.

  • 5.2.9. Cenuşa

Reziduul la calcinare a fost în mediu de 2% şi s-a dizolvat complet în HCl concentrat. Determinările spectrofotometrice au indicat ca elemente principale: MG, Ca, K şi Na şi ca auxiliari R (fosfaţi), Cu şi Mn. Ca anioni s-au identificat cloruri, sulfaţi şi fosfaţi.

5.2.10. Caracterizarea proteinelor din florile de Calendula

Prin cercetarea electroforetică a proteinelor din florile de gălbenele am urmărit separarea unui număr cât mai mare de componente şi am căutat să determin numărul de fracţiuni proteice care se găsesc ca atare într-o stare nedenaturată în ele. În acest scop am efectuat cercetări comparative între fracţiunile proteice obţinute din proteinele totale, prin electroforeză şi fracţiunile ”clasice” proteice obţinute prin separări chimice (albumina şi globulina).

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

53

Proteinele totale au fost obţinute prin transformarea tamponului utilizat în analiza electroforetică, în agent extractant. În acest fel proteinele nu trebuie să fie purificate decât prin dializă, astfel că se pot studia electroforetic, într-o stare fizică mai apropiată de cea nativă. Tamponul care permite o separare electroforetică bună fiind în acelaşi timp un extractant potrivit, este tamponul acetat-medinal cu pH= 8,2 şu putere ionică 0,15. Reproductibilitatea extracţiilor s-a realizat prin asigurarea unei omogenităţi constante a florilor de gălbenele de-a lungul tuturor experienţelor prin păstrarea constantă a raportului de extracţie, a temperaturii şi a duratei de extracţie. În acest fel s-a păstrat o concentraţie proteică asemănătoare (între 1,1- 1,4%) pentru fiecare experienţă, proteinele extrase reprezentând mai mult de 70% din totalul existent, ceea ce a permis să considerăm că proteina din extract este reprezent6ativă pentru întreaga floare. Analiza electroforetică a evidenţiat 3 fracţiuni proteice. Prin precipitare fracţionată cu (NH 4 ) 2 SO 4 s-a determinat că fracţiunea cu mobilitate electroforetică maximă este albumina iar celelalte două fracţiuni sunt globulinice. Confirmarea acestor rezultate s-a făcut prin precipitarea proteinelor totale cu ajutorul dializei, în cele două componente „clasice”, albumina şi globulina. Prin electroforeză, albumina s-a arătat omogenă iar globulina s-a separat în două fracţiuni notate cu ”1” şi „2”. Procentul relativ şi mobilităţile acestor componenţi în diferite condiţii ale electroforezei sunt redate în tabelul 12.

Tabelul 12

Condiţiile electroforezei

Albumina

Globulina „1”

Globulina „2”

pH

p.i.

T

M

%

M

%

M

%

6,8

0,15

19

-

12,5

-

50,0

-

38,0

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

54

6,8

0,20

19

-

14,7

-

61,3

-

24,0

8,2

0,15

18

-7,9

17,0

-7,3

45,0

-0,7

38,0

8,2

0,15

-

-

21,8

-

33,6

-

44,6

8,9

0,15

17

-

11,5

-

43,0

-

45,5

Prin aceste experienţe reiese că globulinele sunt formate din 2 fracţiuni care se găsesc bine individualizate în proteinele totale ale florii. Pentru confirmarea acestor rezultate am recurs la izolarea globulinelor şi cercetarea lor electroforetică separată. În aceste condiţii şa pH = 5,8 şi 6,8 globulinele s-au separat în 3 componenţi. Pentru a stabili dacă există 2 sau 3 componenţi globulinici independenţi mi-am propus să fracţionez globulinele prin metoda desalifierii prin dializă. Proteina s-a extras în NaCi 0,5M şi extractul purificat s-a dializat în curent continuu de lichid, cu agitare mecanică, faţă de o soluţie de NaCl de molaritate mai mică decât cea întrebuinţată la extracţie. Scăzând cu 0,5 unităţi de molaritate, concentraţia dializantului s-a obţinut 3 globuline notate cu A, B, C, precipitate la o concentraţie de NaCl de 0,15 şi 0,05 şi prin dializă faţă de apa distilată. Se pare deci că în florile de gălbenele există 3 globuline distincte care sunt separabile atât pe baza solubilităţii lor tipice, cât şi pe baza diferenţelor care există între valoarea potenţialului lor electroforetic. Comportarea electroforetică a celor 3 fracţiuni globulinice separate prin desalifiere a fost urmărită în diferite condiţii experimentale. Rezultatele obţinute sunt redate în tabelul 13.

Tabelul 13

Condiţiile electroforezei

Globulina

Fracţ.

M

%

Obs.

Glob.

Tampon

pH

p.i.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

55

Amoniu

9,2

0,075

A

A

1

-13,0

67,3

 

A

2

-1,0

32,7

Acetat

3,8

0,100

A

A

1

-15,0

68,8

 

A

2

-3,9

31,2

Amoniu

9,2

0,075

A

A

1

-

70,0

Pe hârtie

A

2

-

30,0

amoniu

9,2

0,075

B

B

1

-10,0

77,5

 

B

2

-0,6

22,5

Acetat-

6,9

0,150

B

B

1

-7,6

75,7

 

medinal

B

2

-3,8

24,3

Acetat

3,8

0,100

B

B

1

-17,0

58,9

 

B

2

-4,8

41,1

Acetat

3,8

0,100

B

B

1

-

60,8

Pe hârtie

B

2

-

39,2

Acetat-

6,9

0,150

C

C

-7,7

100,0

Temperatura la toate determinările a fost de 18 o C. Deşi rezultatele analizei electroforetice arată că globulina A şi B sunt proteine independente, am considerat că cele 3 globuline reprezintă componente independente existente fracţiunile electroforetice ale globulinelor A şi B nu pot fi afectate deoarece ele nu au fost prelucrate cu solvenţi organici care pot produce modificări în structura lor. Pentru a arăta că aceste 3 globuline sunt componente dine definite, deosebite una de cealaltă am recurs la analiza lor cromatografică şi polarografică. Cromatografia unidimensională, descendentă a aminoacizilor proveniţi prin hidroliza acidă a acestor 3 globuline a arătat că ele posedă următorii aminoacizi comuni: acid aspartic, glicocol, histidină, serină, valină, plus metionina şi leucina plus izoleucina. În afara acestora, fiecare globulină posedă aminoacizii specifici:

-globulina A: acid glutamic, alanină, prolină. -globulina B: alanină, cistină + cisteină, fenilalanină. -globulina C: acid glutamic, arginină, fenialanină. Determinările polarografice s-au efectuat într-o soluţie test Brdicke cu cobalt trivalent. Semnalul treaptă proteică are o înălţime şi un aspect diferit pentru cele trei globuline la aceiaşi concentraţie de 3,6 x 10 -3 g% (tabelul 14)

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

56

Tabelul 14. Înălţimea treptei proteice la cel e3 globuline şi la albumine

Proteine

Înălţimea treptei (mm)

Globulina A

11

Globulina B

4

Globulina C

13

Albumina

42

Se observă că treapta albuminei este de 3-4 ori mai mare decât cea a globulinelor. Heterogenitatea albuminei a fost cercetată electroforetic după îndepărtarea urmelor de globuline din preparatele pure de albumină. Rezultatele obţinute sunt reproduse în tabelul 15.

Tabelul 15

Condiţiile electroforezei

Fracţiunea „1”

Fracţiunea „2”

Obs.

Tampon

pH

p.i.

M

%

M

%

Amoniu

9,2

0,075

-9,5

25,0

-1,6

75

Acetat

3,8

0,050

-6,1

32,0

-1,4

68,0

Amoniu

9,2

0,075

-

38,0

-

72,0

Pe hârtie

Temperatura la toate determinările a fost de 17 o C. Cercetarea electroforetică a arătat că albumina din florile de Calendula, la fel ca albuminele celorlalte leguminoase este o proteină heterogenă compusă din mai mulţi componenţi. Nu putem afirma cu precizie că albumina posedă numai doi componenţi, deoarece na-m putut cerceta heterogenitatea ei decât la două Ph-uri extreme. La Ph-urile intermediare albumina nu se reia în concentraţie satisfăcătoare pentru a putea fi analizată electroforetic. Punctul izoelectric al albuminei a fost măsurat prin determinarea pH-ului la care variază vâscozitatea soluţiei apoase de albumină prezintă un minim şi s-a găsit că este cuprins între

4,7-4,8.

Neconcordanţa dintre numărul de fracţiuni obţinute prin analiză electroforetică a proteinelor totale şi cel obţinut prin analiza electroforetică separată a albuminelor şi a globulinelor se poate explica prin capacitatea redusă de separare a aparatului de electroforeză de care dispunem. Prin tehnica pe hârtie, proteinele totale deşi se separă în trei fracţiuni curbele electroforetice au o

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

57

asimetrie evidentă care ne-a sugerat că proteina totală a fost dovedită prin îndepărtarea unei cantităţi de globulină din extract prin dializă. Pe măsură ce cantitatea de globulină îndepărtată creşte, analiza electroforetică pune în evidenţă un număr mai mare de fracţiuni. După 10 ore de dializă s-au evidenţiat 5 fracţiuni proteice dintre care 2 cu mobilitate mai mare sunt componente albuminice, iar celelalte 3 cu mobilitate apropiată sunt probabil globulinele A, B, C. rezultatele acestor determinări au întărit convingerea că în florile de Calendula există 3 componenţi globulinici şi cel puţin 2 componenţi albuminici.

  • 5.3. Încercări cu depozitare

Cu probele culese am făcut încercări de depozitare timp de peste 10 luni. Probele au fost împărţite în 3 categorii: o parte în stare normală, o parte mărunţită şi uscată la temperatura camerei, iar a treia parte uscată la 40 o C (după mărunţire) şi apoi măcinate în moara cu ciocănele. În urma experienţelor efectuate s-a constatat că conţinutul de escină şi flavonoide scade în cazul probelor macerate datorită unor reacţii fermentative. La a doua categorie scăderea ambelor valori cu toate că este mai mult sau mai puţin semnificativă, este în ansamblu minoră. La ultima categorie, însă, nu s-a pus în evidenţă o scădere a conţinutului. În concluzie, florile mărunţite, uscate bine la aer liber pot fi întrebuinţate fără pierderi timp de un an.

CAPITOLUL VI. PARTE EXPERIMENTALĂ

  • 6.1. Metode de extracţie

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

58

6.1.1. Extracţia selectivă şi succesivă

Produsul vegetal prelucrat prin extracţie este utilizat pentru obţinerea unor termoplaste şi face obiectul a numeroase studii. S-a urmărit realizarea unor soluţii extractive bogate în principii activi, în condiţii de extracţie avantajoasă. În experienţele efectuate de Eliza Gafiţeanu, Ioana Matei şi Dorina Lazăr, acestea au ales solvenţii de extracţie selectivi pentru fracţia hidrofila (flavone, glicozidele acidului oleanolic, calendulozidele, A-H, alcoolii terpenici:

arnidiol şi furnadiol) şi cea lipofilă (caroten, ulei volatil, esteri ai colesterolului cu acizii graşi). Solvenţii utilizaţi au fost: alcoolii, propilen glicolul, cloroformul, eterul de petrol, uleiul de floarea soarelui şi parafina lichidă. Procesul prim aplicat se bazează pe principiul extracţiei selective şi succesive cu diferiţi solvenţi, începând cu cel mai lipofil. Acest procedeu se realizează la cald şi permite o separare a principiilor activi din produsul supus extracţiei, în funcţie de caracterul lipofil sau hidrofil al acestora. Pentru extracţie s-a folosit eter de petrol, cloroform şi alcool. Epuizarea produsului vegetal cu eter de petrol şi apoi cu cloroform s-a realizat cu ajutorul aparatului Soxhlet. Pentru extracţia cu alcool s-a recurs la refluxare, din cauza punctului de fierbere ridicat al soluţiei extractive alcoolice faţă de soluţia cloroformică şi eter- petrolică. Capacitatea de extracţie al solvenţilor a fost apreciată prin determinarea cantitativă a carotenilor extraşi în eter de petrol şi cloroform, şi a flavonelor extrase în alcool. Procedeul de extracţie este prezentat în figura 1.

6.1.2. Macerarea

Macerarea este unul din procedeele aplicate pe scară largă pentru obţinerea extractului cu utilizare în dermopreparate, operaţia de extracţie

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

59

realizându-se la temperatura camerei, ceea ce menajează principiile active. Procedeul de macerare este redat în figura 2.

Figura 1.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

60

Calendulae flos

Extracţie selectivă şi succesivă cu diferiţi solvenţi, începând cu cel mai lipofil

Extracţie cu eter de petrol la Soxhlet

F i l t r a r e

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 60 Calendulae flos Extracţie selectivă şi succesivă cu diferiţi solvenţi, începând cu
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 60 Calendulae flos Extracţie selectivă şi succesivă cu diferiţi solvenţi, începând cu
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 60 Calendulae flos Extracţie selectivă şi succesivă cu diferiţi solvenţi, începând cu

Soluţie extractivă eter petrolică

Reziduu vegetal

U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA 60 Calendulae flos Extracţie selectivă şi succesivă cu diferiţi solvenţi, începând cu
Extracţie cu cloroform la Soxhlet Soluţie extractivă cloroformică Reziduu vegetal Extracţie cu alcool prin refluxare Decantare
Extracţie cu cloroform la Soxhlet
Soluţie extractivă
cloroformică
Reziduu vegetal
Extracţie cu alcool prin refluxare
Decantare şi filtrare

Soluţie extractivă alcoolică

Schema de extracţie selectivă şi succesivă a produsului „Calendulae flos” cu diferiţi solvenţi, începând caz cel mai lipofil.

Figura 2.

Calendulae flos

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

61

Extracţie prin dubla macerare cu:

Alcool etilic Cloroform Decantare şi filtrare Soluţii extractive alcoolice Soluţii extractive cloroformice A 1 A 2
Alcool etilic
Cloroform
Decantare şi filtrare
Soluţii extractive
alcoolice
Soluţii extractive
cloroformice
A 1
A 2
C 1
C 2
Reziduu vegetal
Reziduu vegetal
Extracţie prin macerare cu:
Ulei de floarea soarelui
Propilenglicol
Decantare şi filtrare
Soluţie extractivă
uleioasă
Soluţie extractivă
propilenglicolică

Schema de extracţie a produsului „Calendulae flos” prin macerare

6.1.3. Digestia

A stat la baza altor serii de extracţii şi s-a desfăşurat conform schemei

din figura 3.

Figura 3.

Calendulae flos

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

62

 

Digestie la 60 o C – 6 ore cu:

 
   
           
propilenglicol propilenglicol +alc. benzilic 1%

propilenglicol

propilenglicol propilenglicol +alc. benzilic 1%

propilenglicol +alc. benzilic 1%

propilenglicol propilenglicol +alc. benzilic 1%

ulei de

floarea

ulei de floarea

ulei de floarea

parafină lichidă+

parafină

lichidă+

soarelui

soarelui

alcool

 
 

+alc.benzilic1%

benzilic1%

/P/

/P A /

/U/

/U A /

 

/P LA /

   

Decantarea şi presarea

reziduului,

filtrare

   
     
Digestie la 60 C – 6 ore cu: propilenglicol propilenglicol +alc. benzilic 1% ulei de floarea
Digestie la 60 C – 6 ore cu: propilenglicol propilenglicol +alc. benzilic 1% ulei de floarea

/P/

/P A /

/U/

/U A /

 

/P LA /

6.2. Identificarea şi determinarea componentelor

6.2.1. Metode de recunoaştere şi determinarea saponinelor

La agitarea unei soluţii de E se formează spuma intensă (efect general saponinic). Pentru identificare este nevoie de compararea valorilor R F obţinute prin C.H. sau C.S.S. cu etaloane. Pentru recunoaşterea acţiunii hemolitice se pun cromatogramele developate între plăci de gelatină sanguină, sau se stropesc cu un amestec de o parte sânge defibrinat sau citrat sanguin şi 8 părţi soluţie fiziologică de NaCl. Sensibilitatea este în domeniul 40 ug/pată. La stropirea C.S.S. cu H 2 SO 4 50% şi uscare ulterioară, E de la lumina zilei o coloraţie brun-roşcată şi în ultraviolet o fluorescenţă galbenă, care după un timp trece în albastru. La concentraţii mari E prezintă o fluorescenţă roşie- portocalie. Pentru determinarea indicelui hemolitic sunt de respectat exact condiţiile de încercare pentru reproductibilitatea rezultatelor. Este de remarcat, că s-au observat proprietăţi hemolitice diferite pentru saponina escinica nativa şi E pură izolată.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

63

O metodă gravimetrică după Romisch se fundamentează pe trecerea extractelor escinice în alcaliescinoli hidrosolubili. Prin adaos de HCl diluat se obţine pp. escinolul hidrosolubil care se determină gravimetric sau alcalimetric. Conţinutul extractelor cercetate se raportează la E. În determinarea fotometrică după Overlach, E reacţionează cu o soluţie p-dimetilaminobenzaldehidă: acid acetic: acid sulfuric. Se formează o soluţie violetă, a cărei extincţie se măsoară la 570 nm. La identificarea fotometrică după Schlemmer se reiau extractele de seminţe cu 0,1 m HCl şi se extrag cu Pn-OH / CHCl 3 . După concentrare se reia amestecul saponinic cu acid acetic glacial. Formarea complexului colorat se obţine cu reactivul FeCl 3 · H 2 SO 4 . În locul acestui reactiv Pasich foloseşte clorura de cobalt. Înainte de determinarea colorimetrică se face o separare prin C.S.S. a saponinei pe plăci de silicagel.

6.2.2. Metode de recunoaştere şi determinare a flavonoidelor

la tratarea extractelor escinice cu Zn şi Mg în soluţie de HCl, soluţia iniţială galbenă se colorează în roşu. Se formează prin reducere şi cu ruperea unui rest zaharic anticianidin - clorurile respectiv derivaţii de chemferolclorura de

pelargonidin, iar din derivaţii cvrcetinei, clorura de cianidin. După Kussner această reacţie se poate aplica în determinări colorimetrice. Flavonele dau cu săruri incolore de aluminiu, plumb, cadmiu, cupru, fier, bor, stibiu şi bismut în urma butocromiei, combinaţii puternic colorate în galben (glicozida chempferolică) sau în portocaliu (glicozida cvercetinică). Aceste proprietăţi se utilizează frecvent la recunoaşterea cromatografică şi la determinări colorimetrice cantitative. Determinarea cantitativă după Overlach se face cu Flavognost R , un complex aminoetilester al acidului difenil boric. Se pretează pentru determinarea conţinutului extractelor de flori de gălbenele deoarece conţinutul de flavonoide se poate raporta direct la cvercetina. O substanţă de referinţă pentru extractele de seminţe nu se cunoaşte la această metodă. Overlach a considerat nejustă alegerea

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

64

unei flavonoide la întâmplare, ca referinţă, dacă proprietăţile ei de absorbţie a luminii după efectuarea reacţiei de culoare, nu au coincis cu cele a extractelor escinice sau dacă lipsesc date exacte referitoare la flavonoidele de determinat. Deoarece extractele de seminţe cercetate de autor au dat în condiţiile reacţiei descrise un maxim de absorbţie la aceeaşi lungime de undă, pare acum după cunoaşterea majorităţii flavonoidelor din seminţe, întemeiata raportare la cvercetină. La determinarea colorimetrică după Romisch cu AlCl 3 în tampon CH 3 COOH şi gl./Py. se calculează conţinutul de flavonoide ca echivalent de rutin. Metoda se pretează la determinarea substanţei pure şi a extractelor, deoarece se măsoară numai intensificarea culorii prin formarea complexului de Al şi soluţia de compensare este aceeaşi soluţie tampon flavolonică ca cea de măsurat, însă fără adaos de sare de Cl. Dificultatea apare la determinarea extractelor de seminţe necojite deoarece pigmentul cojii chiar şi în diluţia aferentă determinării intensifică culoarea, ducând la dificultatea recunoaşterii extincţiei. De fapt, nici nu este întocmită raportarea la echivalent de rutin deoarece nu este prezent rutin în seminţe. Determinarea colorimetrică după Horhammer a fost propusă pentru determinarea conţinutului extractelor escinice pentru noua carte de homeopatie a medicamentelor în Germania. După hidroliza flavonelor, care conţin drept aglicol comun cvercetina, urmează colorarea cu o soluţie 5% ZrOCl 2 şi măsurarea extincţiei la 435 nm. Conţinutul de flavonol se citeşte de pe o curbă de etalonare ridicată în aceleaşi condiţii cu cvercetina pură. Deoarece extractul hidrolizat conţine pe langa cvercetina, cantitate apropiată de chempferol, pare problematică obţinerea unui etalon adevărat. De aceea se pot numai compara conţinuturile flavonoidice ale fiecărui extract între ele. O metodă biologică o constituie testul Petechien după Suschaweck în forma modificată de auster. Pe burţi epilate de şobolani se determină valoarea

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

65

Sog-ului la care jumătate din câmpurile examinate reacţionează în Petechien. Se aplică animalului soluţia de determinat. După 24 h, zonele din imediata vecinătate din câmpurile investigate trebuie să reziste la o solicitare Sog cu c.p. 30%. O altă cale modificată care efectuează testul pe partea dorsală epilată a şobolanilor de ambele părţi ale coloanei vertebrale. Şobolanii se ţin în prealabil 2-3 săptămâni la un regim scorbutigen.

6.2.3. Metode de recunoaştere şi determinare a alantoinei

Identificarea alantoinei s-a efectuat în infuzii 5% preparate din produse cu şi fără receptacul, asupra cărora s-a practicat reacţia Adamkiewicz-Hopkins- Colle. Rezultatele intens pozitive au condus la separarea şi identificarea cromatografică prin procedeul Tyihac modificat, folosind hârtie Whatmann 2 şi o soluţie extractivă purificată (5 g produs vegetal în 20 ml etanol). Developarea s-a efectuat cu n-butanol-acid acetic-apă, 4:2:2 v/v (parcurs util = 8-10 cm); iar relevarea s-a făcut cu o soluţie 1% p-dimetil-aminobenzaldehidă în HCl soluţie 2 n, urmată de menţinerea cromatogramei uscate la 50 o C în etuvă timp de 5 minute. În aceste condiţii din soluţia de analizat s-au separat 2 spoturi ce s-au colorat în galben, el cu R f = 0,81, corespunzând alantoinei martor. Din aceste motive s-a considerat oportună determinarea cantitativă a acestei diureide din cele două spoturi de produs vegetal, în scopul stabilirii celei mai bune calităţi. S-a aplicat metoda Kaczmarec şi Walicka, adaptată la colorimetrul Speckol C. Zeiss Jena, principiul metodei constând în colorimetrarea fenil- hidrazonei acidului glicoxilic rezultat din hidroliza succesivă a alantoinei. Pentru stabilirea condiţiilor de lucru s-a determinat mai întâi dependenţa dintre absorbanţă şi lungimea de undă, precizând minima de absorbţie la 650 nm, iar maxima la 520 nm, iar apoi dependenţa dintre concentraţie şi absorbanţă cu ajutorul unei soluţii apoase 0,04 g % alantoină sintetică, din care s-au luat

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

66

cantităţile înregistrate în tabel. Absorbanţa corespunzătoare acestora s-a determinat la 520 nm, în cuve de 1 cm grosime.

Nr.

Nr. ser etalon

mg. alantoină / ml sol.

Absorbanta

crt.

  • 1 0,250

0,004

0,285

  • 2 0,500

0,008

0,305

  • 3 0,750

0,012

0,330

  • 4 1,000

0,016

0,335

  • 5 1,250

0,020

0,390

  • 6 1,500

0,024

0,570

  • 7 2,000

0,032

0,550

  • 8 3,000

0,048

0,455

6.2.4. Metode de separare şi identificare a substanţelor tanante

Separarea şi identificarea cromatografică a derivaţiilor o-dihidroxi- fenolici (O.D.P.); S-a efectuat din soluţiile extractive hidroalcoolice 10% în metanol de

  • 50 o , din care s-a adus la start 0,1 ml. Ca martor s-au folosit soluţii alcoolice

0,01% de acid cafeic şi acid clorogenic, din care s-au luat 0,03 ml. S-a practicat cromatografia pe hârtie Schelicher Schull 2040 b, în sistem ascendent, folosind ca soluţie HCl 0,1 n. După developarea şi uscarea cromatogramelor s-au delimitat spoturile în uv, apoi s-au pulverizat cu soluţie alcoolică 3% de FeCl 3 şi cu reactiv Arnow. Din analiza cromatogramelor respective au atras atenţia spoturile cu: R f = 0,43 şi 0,66 prezente îmn ambele soluţii de analizat, ce se comportă identic cu acidul cafeic şi clorogenic, faţă de reactivul de relevare folosit. Determinarea cantitativă a O.D.P.-urilor folosind metoda fotocolorimetrică a lui Jonson, care constă în determinarea absorbanţilor derivaţilor diozoici ai polifenolilor, de culoare de roşu-portocalie rezultaţi din cuplarea acestora, cu reactivul Arnow (1 g nitrat de sodiu, 1 g molipdat de sodiu şi apă la 10 ml). În acest scop s-au preparat soluţii extractive hidroalcoolice 5%

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

67

în metanol de 50 o din produsul cu şi fără receptacul, din care s-a luat câte un ml în baloane cotate de 10 ml, adăugându-se 1 ml soluţie 0,5 n HCl, 1 ml de reactiv Arnow, 1 ml soluţie soluţie NaOH şi metanol în completare până la semn. Intensitatea coloraţiilor obţinute a fost măsurată cu fotocolorimetrul Speckol la 510 nm, în paralel cu probe martor în care s-a înlocuit reactivul Arnow cu 1 ml apă. Prin interpolarea absorbantelor în curba etalon, determinată anterior, s-a calculat conţinutul acestor derivaţi la 0,90-1,0 g % în sortul cu receptacul şi 0,45-0,55 %, în sortul fără receptacul. /23/

6.3. Contribuţii originale

6.3.1. Obţinerea extractelor

  • 6.3.1.1. Macerarea metanolică

S-au preparat macerate cu concentraţii metanolice în raport decimal de

1:5.

  • 6.3.1.2. Macerarea etanolică

Am abordat macerarea concentraţii decadale de EtOH.

cu raport de extracţie

1:5

până

la 1:10,

în

  • 6.3.1.3. Turboextracţia

Extractele au fost obţinute cu un aparat Ultraturex R . S-a pus în vasul de extracţie o parte seminţe mărunţite şi 4 părţi lichid de extracţie. După 5 minute a

fost oprit aparatul deoarece temperatura a ajuns la 30 o C. după 15 minute masa s-a răcit suficient pentru a extrage din nou pentru 5 minute. Extractul s-a păstrat la rece 3 zile, apoi s-a filtrat. Ca durata optimă de extracţie cu EtOH 96% s-a găsit

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

68

  • 6.3.1.4. Percolarea

Percolarea s-a făcut în vase cilindrice. Raportul drog : solvent a fost de 1:4. După umectarea în raport 1:4 a materialului, masa, mai mult sau mai puţin umflată, s-a acoperit şi s-a apăsat cu un strat de perle de sticlă. Recipientul s-a umplut încet cu extractant evitându-se pe cât posibil formarea de bule mari de aer. S-a lăsat să se stea 24 h, apoi s-a percolat cu o viteză de curgere de 5-7 picături / minut. Când stratul de extractant a fost de 1-2 cm, peste drog, s-a umplut cu solvent proaspăt, până la captarea a 5 picături de percolat. Extractele s-au păstrat 3 zile la rece apoi s-au filtrat.

6.3.2. Identificarea componentelor

  • 6.3.2.1. Identificarea complexului saponinic (escina)

Identificarea escinei s-a făcut prin C.S.S. pe silicagel Co, cu o soluţie de n PrOH/EtOH/H 2 O (4:3:3). Pentru detecţie s-a folosit 20% SbCl 3 în CHCl 3

amb. sau 50 H 2 SO 4 . După stropirea cu reactivi, plăcile s-au uscat 10 minute la

  • 105 o C. Escina s-a recunoscut printr-o culoare gri la lumina zilei, la stropire cu

SbCl 3 şi printr-o fluorescenţă galbenă în uv la stropire cu 50% H 2 SO 4 .

  • 6.3.2.2. Identificarea flavonoidelor

Flavonoidele le-am pus în evidenţă prin eluare integrală de pe coloană cu MeOH de diferite concentraţii şi C.S.S. pe silicagel G. Merck (2 ore activare la 105 o C, sau uscare la aer). S-a elaborat în acest timp un sistem care permite o bună separare: n PrOH/H 2 O/PEG/CH 3 COOEt (6,5:2,5:1:10). Detecţia s-a făcut cu soluţie (CH 3 COO) 2 Pb şi reactiv NEU în uv filtrat.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

69

În

funcţie

de

cantitatea

aplicată

s-au

pus

în

evidenţă

9-20

de

flavonoide. Pentru determinarea conţinutului de flavonoide în extractele de seminţe s-a aplicat metoda Horhkmmer.

  • 6.3.2.3. Identificarea aminopurinelor

S-a făcut determinarea din eluatul coloanei supus de separare după Winterfeld. Fracţia purinică captată s-a C.H. pe hârtie Schleicher and Schiel 20043 cu sistem BuOH/H 2 O/EtOH (50:35:15). În uv s-au pus în evidenţă 4 compuşi care s-au dovedit a fi adenina,

adenozina, guanina şi acidul uric. Pentru identificarea acidului uric L.H. a fost stropită la 80 o C cu o soluţie (în părţi egale) de reactiv Folin-Denis şi Na 2 CO 3 2n amestecate proaspăt înainte de aplicare. S-a uscat cromatograma 5-10 minute la

  • 80 o C. Acidul uric s-a recunoscut printr-o pată albastră.

    • 6.3.2.4. Identificarea acidului ascorbic

Soluţia apoasă a acizilor carbonilici s-a tratat cu exces de apă. S-au tratat sărurile de bariu precipitate, s-au dizolvat în puţină apă şi s-au tratat până la slab acid cu H 2 SO 4 . Identificarea s-a făcut C.H. ascendent pe hârtie Schleicher Schull 2043 b cu nBuOH/CH 3 COOH gl./H 2 O (7:1:2). Ca detecţie s-a folosit în părţi egale AgNO 3 . 0,1 n şi NH 3 0,1 n. S-a putut pune în evidenţă acid ascorbic în comparaţie cu etalonul.

  • 6.3.2.5. Identificarea metioninei

Punerea în evidenţă a aminoacizilor în soluţia mamă s-a făcut cu soluţie ninhidrină 3%. S-a obţinut o coloraţie slab purpurie. Recunoaşterea metioninei după separarea flavonoidelor s-a făcut cu soluţie pentacianonitrosil ferat (III) de Na 1% printr-o colorare în roşu.

  • 6.3.2.6. Identificarea aneurin-HCl

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

70

Identificarea s-a făcut după separarea colinei cu K 2 /Fe (CN) 3 soluţie proaspătă, prin formarea unei fluorescenţe albastră violetă, care a reapărut la adăugarea de 2 picături KOH 1 n.

6.3.2.7. Identificarea colinei S-a făcut din extractul pur şi identificat ca picrat (pentru 237-239 o C).

CAPITOLUL VII. CONCLUZII FINALE

În urma studiului pe care l-am efectuat şi a analizei de ansamblu a rezultatelor înregistrate în cursul cercetărilor întreprinse pentru realizarea unor soluţii extractive din florile de Calendula officinalis bogate în principii activi, se desprind următoarele concluzii:

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

71

-s-a efectuat un studiu al condiţiilor de extracţie în care s-a ţinut seama de compoziţia chimică complexă a produsului vegetal, natura solventului şi metodele de extracţie; -s-au utilizat solvenţi de extracţie care să fie cât mai selectivi şi să nu determine combinaţii chimice cu componenţii principiilor activi, să asigure stabilitatea soluţiei extractive în timp; -eficienţa solvenţilor şi a procedeelor de extracţie aplicate au fost apreciate cantitativ şi calitativ prin determinarea conţinutului în flavone, exprimate în rutozid, şi a conţinutului de caroten, exprimaţi în β-caroten; -a fost verificată eficienţa unor procedee de extracţie (macerarea metanolică, macerarea etanolică, turboextracţia, percolarea) şi eficienţa solvenţilor, procedeul de extracţie prin macerare dovedindu-se a fi cel mai eficient.

BIBLIOGRAFIE

1.

EVDOCHIA COICIU; GABRIEL RACZ – „Plantele medicinale şi aromatice”, Editura Academiei R.P.R., 1962.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

72

  • 2. CONSTANTINESCU, GR.; ELENA HAŢIEGANU BURUIANĂ – „Să ne cunoaştem plantele medicinale, proprietăţile lor terapeutice şi modul lor de folosire”, Editura Medicală, 1987.

  • 3. „Tehnologii cadru ale plantelor medicinale şi aromatice”, Editura Ceres,

1993.

  • 4. CRĂCIUN, F; BUJOR, O.; ALEXAN, M. – „Farmacia naturii”, Editura Ceres, 1976.

  • 5. MOCANU, ST.; RĂDUCANU, D. – „Plante medicinale-tezaur natural în terapeutică”, Editura Militară, 1986.

  • 6. BODEA, C. – „Tratat de biochimie vegetală”, Editura Academiei R.P.R., 1964, Volumul I.

  • 7. Chemical Z.B.L. – I, 3972, 1937.

  • 8. Chemical abstract, Volumul 103, nr.15, 1985.

  • 9. BODEA, C. – „Tratat de biochimie vegetală”, Editura Academiei R.P.R., 1964, Volumul II.

    • 10. TAMAŞ, V.; NEAMŢU, G. – „Pigmenţi carotenoidici şi metaboliţi”, Editura Ceres, 1986.

    • 11. Chemical abstract, vol. 101, nr.24, 1984.

    • 12. Chemical Z.B.L., 16417, 1959.

    • 13. Chemical Z.B.L., nr.5, 2976, 1965.

    • 14. Chemical abstract, volum 45, nr.9, 1956.

    • 15. Chemical abstract, volum 75, nr.10, 1971.

    • 16. Chemical abstract, volum 101, nr.24, 1984.

    • 17. Chemical abstract, volum 69, nr.7, 1968.

    • 18. Chemical abstract, volum 107, nr.11, 1988.

    • 19. Chemical abstract, volum 64, nr.10, 1966.

  • 20. Chemical abstract, volum 69, nr.21, 1968.

  • 21. Chemical abstract, volum 103, nr.21, 1985.

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

73

23. Farmacologia, nr.4, Editura Medicală, 1987. 24. JIANU, I. – „Curs de chimie şi biochimie vegetală”, anul universitar 1990-1991, I.A.T.

Notă: bibliografia s-a citat în ordinea utilizării în prezenta lucrare de diplomă.

CUPRINS

Cap.I. Introducere. Generalităţi…………………………………………….

...

1

Cap.II. Prezentarea problemei……………………………………………

5

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

74

  • 2.2. Tehnologia de cultură…………………………………………………

6

  • 2.2.1. Soiul cultivat…………………………………………………….

6

  • 2.2.2. Amplasarea culturii……………………………………………

...

6

  • 2.2.3. Fertilizarea……………………………………………………… 6

  • 2.2.4. Lucrările solului………………………………………………… 7

  • 2.2.5. Semănatul……………………………………………………… ..

7

  • 2.2.6. Lucrările de întreţinere…………………………………………

..

7

  • 2.2.7. Boli, dăunători şi combaterea acestora………………………….

7

  • 2.2.8. Recoltarea………………………………………………………

..

8

  • 2.2.9. Uscarea şi condiţionarea………………………………………

...

8

  • 2.3. Principii activi izolaţi şi importanţa lor……………………………….

8

  • 2.3.1. Saponinele………………………………………………………. 9

  • 2.3.2. Carotinoidele……………………………………………………. 10

  • 2.3.3. Flavonoidele……………………………………………………

..

10

  • 2.3.4. Vitamina C………………………………………………………

11

  • 2.3.5. Uleiurile esenţiale (uleiuri volatile, uleiuri eterice)……………

..

11

  • 2.3.6. Acizii organici (acizii carbonici)……………………………… ...

11

  • 2.3.7. Substanţele minerale…………………………………………….

12

Cap.III. Studii de literatură…………………………………………………

14

  • 3.1. Saponinele……………………………………………………………. 14

  • 3.1.1. Nomenclatură. Structură………………………………………

...

14

  • 3.1.2. Flavone şi glicozizi flavonici……………………………………

19

  • 3.2.2. Flavonoli ai florilor de Calendula……………………………….

21

  • 3.2.3. Nomenclatură. Structură………………………………………

...

21

  • 3.2.4. Metode de recunoaştere şi determinare…………………………

22

  • 3.2.5. Rol fiziologic……………………………………………………

23

  • 3.3. Pigmenţii carotenoidici……………………………………………….

24

  • 3.3.1. Sursele şi factorii care influenţează conţinutul de pigmenţi

carotenoidici…………………………………………………………………

..

24

  • 3.3.2. Nomenclatură. Structură. Proprietăţi fizico-chimice……………

26

  • 3.3.3. Metode de extracţie, separare, dozare şi identificare……………

27

  • 3.3.4. Rol fiziologic……………………………………………………

30

  • 3.4. Acidul ascorbic (vitamina C)…………………………………………

31

  • 3.4.1. Surse, factori ce influenţează conţinutul de acid ascorbic………

31

  • 3.4.2. Nomenclatură. Structură şi proprietăţi fizico-chimice…………

..

31

  • 3.4.3. Metode de separare, dozare şi identificare………………………

32

  • 3.4.4. Rol fiziologic…………………………………………………….

33

  • 3.5. Uleiurile grase (lipide vegetale)………………………………………

34

  • 3.5.1. Structură şi proprietăţi fizico-chimice…………………………

...

34

  • 3.5.2. surse. Factori de influenţă. Rol Fiziologic………………………

35

  • 3.6. Materialele tanante (taninuri)…………………………………………

37

  • 3.6.1. Structură şi proprietăţi fizico-chimice…………………………

..

37

  • 3.6.2. Metode de extracţie, separare, dozare şi de identificare………

..

37

  • 3.6.3. Rol fiziologic şi utilizări practice………………………………

..

38

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA

75

  • 3.7. Proteidele……………………………………………………………

...

39

  • 3.7.1. Răspândire………………………………………………………. 39

  • 3.7.2. Metode de izolare, purificare şi dozare………………………….

39

  • 3.7.3. Rol fiziologic……………………………………………………

40

Cap.IV. Concluziile studiului de literatură………………………………

...

41

Cap.V. Rezultate. Discuţii. Contribuţii originale…………………………

..

42

  • 5.1. Obţinerea extractelor………………………………………………….

42

  • 5.1.1. Macerarea………………………………………………………

..

42

  • 5.1.1.1. Macerarea metanolică……………………………………

...

42

  • 5.1.1.2. Macerarea etanolică………………………………………

..

43

  • 5.1.2. Turboextracţia…………………………………………………

...

45

  • 5.1.3. Percolarea………………………………………………………. 46

  • 5.1.4. Interpretarea rezultatelor………………………………………

..

46

  • 5.2. Identificarea şi determinarea componentelor…………………………

47

  • 5.2.1. Complexul saponinic……………………………………………

47

  • 5.2.2. Flavonoidele……………………………………………………

..

48

  • 5.2.3. Carotenoidele…………………………………………………… 49

  • 5.2.4. Acidul ascorbic………………………………………………….

51

  • 5.2.5. Metionina………………………………………………………

..

52

  • 5.2.6. Colina…………………………………………………………… 52

  • 5.2.7. Aneurin-HCl……………………………………………………. 52

  • 5.2.8. Aminopurinele…………………………………………………

..

52

  • 5.2.9. Cenuşa…………………………………………………………

...

52

5.2.10. Caracterizarea proteinelor din florile de Calendula……………

52

  • 5.3. Încercări de depozitare………………………………………………

..

57

Cap.VI. Parte experimentală………………………………………………

..

58

  • 6.1. Metode de extracţie…………………………………………………

...

58

  • 6.1.1. Extracţia selectivă şi succesivă………………………………….