Sunteți pe pagina 1din 76

U.S.A.M.V.B.T.

PROIECT DE DIPLOMA
1
CAPITOLUL I. INTRODUCERE. GENERLITI
Plantele medicinale i aromatice au utilizri multiple, cu grade foarte
diferite de prelucrare. Cu produsele obinute din ele se asigur n principal
satisfacerea necesarului industriei chimico-farmaceutice autohtone, ca i
solicitrilor populaiei pentru o gam variat de sortimente (plante medicinale n
stare uscat i amestecuri de plante pentru ceaiuri, produse cosmetice cu etracte
din plante, siropuri, .a.!.
Produsele brute medicamentoase de origine vegetal, sau "drogurile#
vegetale se ntrebuineaz n scopul punerii n valoare a substanelor pe care le
conin cu deosebite caliti terapeutice. $tilizarea produselor vegetale poate fi
legat de proprietile lor fizice, cum este cazul sporilor de cornior (Lycopodium
sp.! sau a perilor seminelor de bumbac (Gossypidium sp.!. %a&oritatea
produselor sunt folosite ns pentru aciunea lor terapeutic, atribuit unor
principii active. 'in punct de vedere farmacodinamic, respectiv terapeutic, rolul
principiilor activi poate fi &ucat de o singur substan sau de un comple de
substane. Principiul sau principii activi pot fi etrai, respectiv izolai din
produsul vegetal i ntrebuinai ca i substane chimice pure. Prin sinteza
organic s-a a&uns la obinerea pe cale industrial a unui numr nsemnat de
principii activi. (n unele cazuri., aceti produi de sintez au nlocuit ntr-o
msur mai mic sau mai mare produsul vegetal, de eemplu ma&oritatea
vitaminelor. (n alte cazuri ntrebuinarea produsului natural continu s fie mai
rentabil din punct de vedere economic dec)t obinerea pe cale sintetic a
principilor activi, de eemplu ma&oritatea alcaloizilor. $tilizarea produsului
vegetal poate fi preferat fa de substana chimic pur i din punct de vedere
terapeutic. (n acest caz produsele vegetale se prefer pentru compleitatea
aciunii, asigurat de sinergismul diferiilor compui. *stfel, de eemplu, morfina
sau atropina obinute din plantele respective prezint o alt aciune dec)t
etractul de opiu sau beladon.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
2
'in momentul n care s-a a&uns la cunoaterea structurii chimice a
principiilor activi s-au lrgit posibilitile de valorificare a acestora prin+
-ntrebuinarea unor preparate farmaceutice, numite i galenice,
obinute dintr-un drog vegetal, de preferin cu un coninut prevzut de principii
activi,
-ntrebuinarea unui comple de principii activi obinut prin
ndeprtarea substanelor inactive numite substane balast,
-ntrebuinarea unui singur component considerat ca cel mai important
dintre principii activi ai produsului respectiv,
- ntrebuinarea unui principiu activ obinut prin sintez.
Procentul la care a&ung principii activi n diferitele organe ale aceleai
plante variaz n limite largi. $nii compui se gsesc practic n toate esuturile
plantei respective, alii sunt localizai aproape n ntregime n anumite organe sau
esuturi.
-alorificarea raional a plantelor medicinale necesit cunoaterea
localizrii precise a principiilor activi. Prezena diferiilor compui sau a
esuturilor (metode citochimice i histochimice!. .tudiul structurii microscopice
i a localizrii principiilor activi intr n domeniul cercetrilor de farmacognozie.
/ocul n care un principiu activ apare n cadrul organismului vegetal
depinde n primul r)nd de rolul pe care acesta l &oac n metabolismul plantei.
Pentru a putea a&unge la mrirea coninutului de principii activi este
necesar s se cunoasc toi factorii care influeneaz biogeneza principiilor activi.
%etode de analize fotochimice, absolut necesare pentru studiul
plantelor medicinale i aromatice sunt cuprinse n tratatul lui Paech i 0race1.
2 mare parte a principiilor activi sunt considerai ca "substane
secundare#, care se formeaz n cursul proceselor de desimilaie.
Principal, fiecare celul vie poate s elaboreze diferite substane de
acest gen. (n multe cazuri, ns producerea masiv a acestora are loc n celulele
difereniate n acest scop, care se cunosc sub numele de esuturi de secreie.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
3
Clasificarea principiilor activi poate fi fcut dup natura lor chimic,
dup proprietile lor fizico-chimice i dup nsuirile lor biologice. $nele grupe
de principii activi sunt mai multe sau mai puin unitare din punct de vedere
chimic, n privina unei grupe funcionale sau n privina nucleului care st la
baza formulei structurale.
*lte categorii de compui naturali heterogeni din punct de vedere
chimic, dar mai mult sau mai puin unitare n privina proprietilor fizico-
chimice. *lte grupe de principii activi se stabilesc pe baza proprietilor biologice
pe care le prezint, ca de eemplu antibioticele sau vitaminele. (n anumite cazuri
criteriul unitii de structura i al aciunii biologice se suprapun.
Clasificrile actuale ale principiilor activi se bazeaz pe trei criterii+
natura chimic, proprietile fizico-chimice i aciunea biologic. Cele mai
importante grupe de principii activi sunt+ glucidele, pectinele, mucilagiile i
gumele, uleiurile grase, uleiurile eseniale, rezinele, acizii organici, glicozidele,
saponinele, materiile tanante, principiile amare, vitaminele, alcaloizii, coloranii
vegetali, antibioticele i fitoncidele, substane minerale.
Cercetrile de laborator efectuate au stabilit c+ -n imensa ma&oritate a
cazurilor, cantitatea de principii activi nu este aceeai n toate organele unei
plante medicinale, ntr-un organ acumul)ndu-se n concentraia cea mai mare, n
altul mai mic, i n altul chiar poate lipsi sau eista n cantitate negli&abil. 'e
aici rezult c trebuie s se cunoasc cu suficient precizie organul sau organele
cele mai bogate n principii activi, deoarece numai aa se va obine un produs
vegetal cu eficien terapeutic nu numai cert, dar i constant.
-cantitatea de principii activi din organul plantei cel mai bogat n ele nu
este aceeai n tot timpul anului i variaz n funcie de etapele sezoniere de
vegetaie ale plantei, gsindu-se n concentraie maim numai ntr-o anumit
perioad a anului, care trebuie s fie i timpul de recoltare al acestui organ,
alegerea momentului optim de recoltare fiind deosebit de important pentru
obinerea produselor de calitate superioar,
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
4
-stabilitatea n timp cantitativ i calitativ a principiilor activi dintr-un
organ de plant recoltat la timpul potrivit depinde pe de o parte de modul de
uscare al lui, iar pe de alt parte, de condiiile n care este pstrat.
3itoterapia i fitochimia reprezint azi o valoroas surs de inspiraie
pentru cercetrile fundamentale din domeniul medicamentelor. 'up ce s-a izolat
un principiu activ din plant i i s-a stabilit structura, se poate realiza nu numai
molecula iniial prin sinteza chimic, ci se poate obine i derivai cu o structur
asemntoare pentru a gsi alte medicamente valoroase.
Plantele i respectiv drogurile aromatice, c)t i uleiurile volatile
obinute din acestea sunt folosite pe scar industrial numai n scopuri
farmaceutice, dar i n urmtoarele domenii+ parfumerie, cosmetic, industria
spunurilor, pentru aromatizare, industria alimentar, la aromatizarea unor
dulciuri, buturi alcoolice i n cantitate de condiment la obinerea diferitelor
produse de carne, etc.
(n prezentul proiect de diplom se va face un studiu fitochimic asupra
plantelor de glbenele, Calendula Officinalis, prezent)ndu-se principii activi,
importana i utilizarea lor.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
5
CAPITOLUL II. PREZENTAREA PROBLEMEI
(n flora rii noastre, care numr aproimativ 4566 de specii de plante
superioare, se nt)lnesc reprezentani ai plantelor medicinale i aromatice.
7umrul lor se ridic la aproimativ 866, ceea ce nseamn c din 9 specii care
cresc pe teritoriul rii noastre, una i gsete utilizri n medicin.
Primele mrturii scrise asupra teritoriului i oamenilor pm)ntului
rom)nesc atest, c nc de pe timpul dacilor plantele medicinale erau cunoscute
i folosite. (mbogit ulterior cu noi cunotine, tradiia medicinii populare s-a
perpetuat din generaie n generaie, iar n ultimul secol aceasta se mpletete cu
studiul aprofundat al plantelor medicinale i aromatice.
'in aceast mare varietate de specii de plante medicinale i aromatice,
ca material de studiu s-a ales Calendula officinalis (glbenele!. 2riginar din
.udul :uropei, la noi se cultiv de mult timp ca plant ornamental. Prin cultur
s-a produs o serie de varieti decorative. (n scopuri medicinale se folosesc numai
varietile caracterizate prin flori duble de culoare galben-portocalie.
2.1. Descriere botaic!
.pecie anual (rarbienal!, cu rdcina
pivotant, tulpina nalt p)n la ;< cm,
puternic, ramificat i proas, are frunzele
oblonglanceolate alterne, sesile. 3lorile sunt
grupate n capitule terminale mari, prezint
flori ligulate, tridintate pe margini, de culoare
galben-portocalie i flori centrale tubuloase
de culoare galben. (nflorete din mai p)n n septembrie.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
6
.e utilizeaz ca produs vegetal fie numai florile marginale (Flores
Calendulae sine receptaculis!, fie ntregul capitul (Flores Calendulae
cumreceptaculis!. *mbele produse au miros slab aromat, gust amrui srat.
2.2. Te"o#o$ia %e c&#t&r!
2.2.1. Soiul cultivat
(n prezent n ara noastr se cultiv soiul "Plamen# cu inflorescene
mari, involte, portocalii.
2.2.2. Amplasarea culturii
=lbenelele nu sunt pretenioase fa de temperatur i umiditate.
.e dezvolt mulumitor pe toate tipurile de sol, prefer)nd soluri ad)nci,
bogate, af)nate, cu umiditate suficient, care se nclzesc uor. (n asolament pot
urma dup orice cultur pritoare anual. 7u se recomand monocultura pentru
a preveni atacul bolilor i duntorilor. 7u vor reveni pe acelai teren mai
devreme de 8 sau < ani.
2.2.3. Fertilizarea
*dministrarea ngrmintelor fosfatice contribuie la sporirea
numrului de inflorescene pe plant i la prelungirea duratei de nflorire, dac se
aplic n doze de 56->6 ?g@ha fosfor .a. mpreun cu ngrmintele cu azot.
(ngrmintele cu azot se recomand a se aplica n doz de 86-8<
?g@ha.
(ngrmintele cu potasiu se aplic n doz de 86-8< ?g@ha .a.
(ngrmintele cu fosfor i potasiu se aplic toamna sub artura de
baz, iar ngrmintele cu azot, primvara devreme. .e va acorda atenie
deosebit mrunirii, mprtierii uniforme a ngrmintelor pe suprafaa solului.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
7
2.2.4. Lucrrile solului
'up recoltarea plantei premergtoare se eecut artura ad)nc la A6-
A< cm dup care terenul se grapeaz. P)n toamna solul se va menine curat de
buruieni prin lucrri repetate cu discul. 0erenul n care se vor semna glbenelele
se va pregti folosind combinatorul sau discul n agregat cu grapa cu coli
reglabili, pentru af)nare, mrunire, nivelarea solului.
2.2.5. Semnatul
.e utilizeaz semntoarea .$P-A9, la care distribuitorul se regleaz
astfel nc)t s nu sparg seminele. .emnatul se efectueaz primvara devreme
n epoca B (martie!, norma de sm)n fiind de 5 ?g@ha, distana ntre r)nduri fiind
de <6 cm, ad)ncimea de semnat de A-4 cm asigur)ndu-se la rsrire o densitate
de 86-<6 plante@m
A
. 'up semnat se tvlugete pe r)nd. Pe suprafee mai mici
semnatul se poate face manual, n cuiburi, la distane de <6 cm. /a fiecare cuib
se introduc A-4 semine.
2.2.6. Lucrrile de ntreinere
Bmediat dup ce au rsrit se eecut manual plivitul pe r)nd i prsila
ntre r)nduri sprg)nd crusta i distrug)nd buruienile. Prsilele mecanice ntre
r)nduri i manuale se vor eecuta ori de c)te ori este necesar n cursul perioadei
de vegetaie. .e va acorda atenie loturilor semincere, din care se vor distruge
vetrele de cuscut, iar dup recoltarea seminelor, resturile se vor arde.
2.2.. !oli" duntori #i com$aterea acestora
(n culturile de glbenele, pagubele provocate de boli i duntori sunt
nensemnate. 0otui, n ultimul timp au fost semnalate boli ca+ finarea
(Sphaerathea fuliginea! i Sclerotinia sclerotinorum. .e recomand respectarea
msurilor agrofitotehnice i a msurilor de igien fitosanitar. Cuscuta este un
parazit foarte pgubitor care se nt)lnete pe plantele de glbenele.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
8
2.2.%. &ecoltarea
Cecoltarea se face ealonat c)nd s-au deschis primele A-4 r)nduri de
flori ligulate, ncep)nd cu luna iunie i continu)nd p)n n octombrie. .e
recolteaz florile ligulate de la capitulele deschise sau capitulele ntregi pe timp
nsorit, de ndat ce s-a ridicat roua p)n seara. 3lorile ligulate sau capitulele
ntregi se culeg numai n couri, la nceput numai la intervale de 4-8 zile, apoi
mai rar. Cu c)t se recolteaz mai regulat, cu at)t plantele formeaz mai multe
inflorescene. Producia de flori ligulate, uscate este de A la 4 D@ha, iar la
capitulele ntregi de E6-A6 D@ha.
2.2.'. (scarea #i condiionarea
'up cel mult 4-8 ore de la recoltare, florile ligulate i capitulele se
usuc, la umbr, n ncperi curate i uscate, n straturi subiri, care se introduc
des. $scarea se poate realiza i n usctorii cu aer cald la temperaturi de 86-8<
o
C,
dup ce n prealabil florile au fost uscate la umbr A-4 zile.
3lorile uscate n condiii bune trebuie s-i, menin culoarea natural.
%aterialul uscat se ambaleaz n lzi cptuite cu h)rtie i se pstreaz p)n la
livrare la ntuneric, n ncperi curate i uscate. Caportul de uscare la capitule este
de ;->@E.@4@.
2.'. Prici(ii acti)i i*o#a+i ,i i-(orta+a #or
Principii terapeutic activi fac parte din compoziia chimic a plantei.
Cele dou noiuni, principiu activ i compoziia chimic, nu se suprapun ns. (n
compoziia fiecrei plante gsim un numr foarte mare de compui chimici,
dintre care numai unii prezint interes terapeutic. %ulte grupe de substane intr
n mod obligatoriu n compoziia materiei vii, implicit ele se gsesc n plant.
*ceste substane ne intereseaz n calitate de principii activi numai atunci c)nd se
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
9
formeaz ntr-un procent ridicat, respectiv dac prin prezena lor se eplic
utilizarea medicinal. @8@
Coninutul general de principii activi din florile de glbenele este
reprezentat de lipide, glucide, flavonoide, saponine. 'espre coninutul lor sunt
semnalate o serie de date de literatur. -alorile se difereniaz mult ntre ele i se
raporteaz cu precdere la materialul uscat.
'eDue?er d urmtoarele valori+ saponine E6F, grsimi <,<F,
albumin 5F, celuloz AF, zaharuri reductoare <,<F, cenu E,4F. Coninutul
n ap l apreciaz .chindler la E6F.
Principii activi coninui de florile de glbenele sunt+ saponozidele
triterpenice, carotinoidele (licopina, alfa i beta caroten, neneolicopina *,
rubiantina, luteina, antofila, violaantina, flavoantina!, flavonoizi i glicozizi
flavonici, rutinozizii i derivai ai Duercetolului, ulei volatil, substane amare,
gumirezine, mucilagii i esteri colesterinici ai acizilor lauric, mastitic, palmitic i
margaric, acid malic, substane proteice, calendulina, etc @<@.
2.3.1. Saponinele
Compleul de saponine reprezint un amestec de glicozide triterpenice
acetilate de tipul beta-amirinei, a crei parte uor cristalizabil este denumit
beta-escin i n trecut s-a crezut c ar fi unitar glicozidul de baz. .-a dovedit
ns a fi un amestec de glicozide a cror agliconi sunt diesteri ai protoesciginei i
ai boringtogenolului C. Ca i componen acid se amintesc acizii acetic, alfa
metilbutilic, izobutilic, tioglicol, anghelic, i drept component zaharic, acizii
gluconici, glucoza, iloza i galactoza. :scina, s-a dovedit a avea o aciune
edeminhibitoare i de scdere a fragilitii vasculare. @5@
G. Hoguslav a efectuat separarea cromatografic n strat subire i gaz-
lichid a alcoolilor triterpenici trihidroipentaciclici din florile de glbenele.
Compuii titlu au fost etrai din flori prin fierbere cu :t
A
2 urmat de acetilare i
de cromatografia gazoas. @;@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
10
2.3.2. )arotinoidele
Carotinoidele se gsesc n toate esuturile verzi alturi de clorofil, n
cantiti variabile, n funcie de faza de vegetaie a plantei. Carotinoidele se
gsesc i n unele flori (petale, polen!, precum i n fructe, semine i rdcini. *u
o rsp)ndire universal gsindu-se at)t n plante inferioare, alge, ciuperci,
bacterii, c)t i n organismele animale. (n organismele animalelor superioare
carotinoidele au un rol esenial datorit legturii biochimice cu vitamina * i cu
retinenul, substan important n procesul biochimic al vederii. Carotinoidele
constituie un component indispensabil al hranei animalelor. 3iind pigmeni
liposolubili, se gsesc n esuturi solvite n lipide sau sub form cristalin.
Coninutul n aceti pigmeni depinde de faza de vegetaie i de o serie de factori
cum sunt+ condiiile de lumin, temperatur i sol.
*t)t sub form cristalin c)t i sub form de soluie, carotinoidele se
transform prin autooidare, mai repede sau mai ncet n produi incolori
rezultai n urma ruperii catenei. 'atorit firii oigenului sub form de compui
oigenai puin sensibili, carotinoidele intervin n procesele de oido-reducere.
$nele carotinoide ndeplinesc funcia de provitamine, iar altele particip la
procesul biochimic al vederii.
Preparatele de beta-caroten se ntrebuineaz n farmacie ca
provitamin *. 'atorit puterii de colorare i a solubilitii n grsimi
carotinoidele sunt folosite ca i colorani alimentari, ndeosebi pentru colorarea
margarinei. @5@
2.3.3. Flavonoidele
3lavonoidele sunt larg rsp)ndite n natur, ele gsindu-se i n florile
de glbenele. /or li se atribuie o aciune terapeutic n tratamentul insuficienei
venoase. :fectul farmacologic se eplic printr-o cretere a aciunii adrenalinei i
o activare enzimatic, respectiv inhibitoare. %ai au ca indicaii+ efect protector la
radiaii, scderea permeabilitii vaselor i creterea rezistenei capilarelor,
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
11
stimularea diurezei, efect moderat cardio- i vaso-stimulator, influenarea
schimbului calciului.
2.3.4. *itamina )
:ste cunoscut i sub denumirea de acid ascorbic sau vitamina
antiscorbutic. .e formeaz n toate plantele, a&ung)nd ns la procente mai
ridicate numai n anumite organe vegetale, care se utilizeaz ca surse naturale de
vitamina C. *ceast substan este uor distrus la uscarea organelor vegetale i
la prepararea etractelor. 'escompunerea enzimatic decurge rapid dac prile
vegetale sunt inute la temperaturi mai ridicate. 'escompunerea rapid are loc i
n prezena unor urme de metale grele. @E@
2.3.5. (leiurile eseniale +uleiuri volatile" uleiuri eterice,
.unt amestecuri de diferii compui chimici care n totalitatea lor
prezint anumite caractere fizico-chimice comune+ sunt volatile, au miros
aromatic caracteristic i sunt de regul solubile n alcool etilic. .pre deosebire de
uleiurile grase (uleiuri fie!, pata translucid pe care o prezint o pictur de ulei
esenial pe h)rtie dispare n scurt timp.
(n componena uleiurilor eseniale intr diferite hidrocarburi alifatice i
ciclice, saturate i nesaturate, precum i derivaii lor oidai. Pe l)ng
hidrocarburi i derivaii lor, n compoziia uleiurilor eseniale pot intra i compui
aromatici, respectiv fenolici.
2.3.6. Acizii or-anici +acizii car$onici,
.unt compui alifatici, ciclici sau aromatici, care conin una sau mai
multe grupri carboilice. .unt larg rsp)ndii n regnul vegetal, at)t n stare
liber, c)t i sub form de sruri i esteri. 3oarte frecvent nt)lnii sunt acizii+
malic, citric, oalic etc.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
12
Produsele bogate n acizi organici sunt ntrebuinate pentru corectarea
gustului neplcut al unor medicamente. *cizii organici contribuie la stabilizarea
vitaminei C n produsele vegetale. @E@
2.3.. Su$stanele minerale
.e gsesc n organismul vegetal pe de o parte sub form de sruri,
respectiv ioni, iar pe de alt parte sub form de combinaii organice. 'up
ndeprtarea total a coninutului n ap dintr-un anumit organ vegetal, se obine
"substana uscat# format n cea mai mare parte din substane organice i dintr-
un procent mic de substane minerale. Prin arderea substanelor organice apar
produi de descompunere, iar substanele minerale se oideaz. 2 parte din
produii de descompunere se volatilizeaz, iar cealalt parte nevolatil formeaz
cenua. Cantitatea maim de cenu care se obine dintr-un anumit organ
vegetal este caracteristica
$nele substane organice care se gsesc n produsele brute
medicamentoase de origine vegetal pot &uca rolul de substane de aciune. @E@
Ca urmare a principiilor activi pe care l conin glbenelele, florile
acestora prezint multe utilizri, at)t n medicin, c)t i n cosmetic i n ramura
alimentar.
0. Ho1adzhin, 0r. 7auchi eperimenteaz efectul sedativ i hipotensiv
al preparatelor de plante de Calendula Officinalis. .tudiul a pus n eviden
proprietile farmaceutice al etractului apos (E+E i 6,<+E cu :t2I 46F! n
alcool, din inflorescena de glbenele. 0estele pe obolani i pisici au artat
efectul inhibitor asupra .7C, cu aciune sedativ general marcant, la fel i un
efect hipotensiv datorat aciunii sale miotropice. /.'.
<6
a fost de 8< mg
subcutanat la oareci i <A5 mg la E66 ?g intravenos la obolani. @>@
%.=. Chaplins?a i -.2. =olov?in n urma eperienelor efectuate pun
n eviden aciunea antimicrobian a c)torva etracte din florile de Calendula
Officinalis. 'in florile proaspete de Calendula , sau din flori proaspt uscate s-a
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
13
realizat un etract la temperatura camerei, cu ap saturat cu CICl
4
(fraciunea E!
cu ;6F :t2I (fraciunea A! i cu ap fierbinte (fraciunea 4!. $n etract de ulei
s-a preparat prin amestecarea florilor cu :t2I i un etract, cu ulei de floarea
soarelui sau de pete, timp de 4 zile . Bnvestigarea bacteriologic a artat c
florile de glbenele conin componeni cu proprieti antimicrobiene care sunt
solubili n :t2I i insolubili n ap. @9@
*ciunea farmacodinamic a principiilor activi se poate rezuma astfel+
-iter, au efect diaforeic, sedativ, antiinflamator, gastrointestinal,
colagog i coleretic (datorit principiului amar, florile de glbenele mresc
secreia biliar!, cicatrizant (prin stimularea circulaiei s)ngelui la nivelul
esuturilor!.
-e.ter, acioneaz ca antiinflamator hemoroidal i cicatrizant.
$tilizrile terapeutice a preparatelor cu principii activi etrai din
glbenele, sunt at)t interne c)t i eterne. Bntern se administreaz n dis?inezii
biliare, ulcer gastric i duodenal, dismenoree, anterocolite, aritmii cardiace,
afeciuni hipertonice, stomatite, neoplasm gastric. :tern, se folosesc n tratarea
plgilor greu vindecabile, hemoroizi, degerturi, arsuri, eczeme, acnee, tenuri
uscate.
Produsul vegetal prelucrat prin etracii este utilizat pentru obinerea
unor dermoplaste+ loiuni, emulsii, unguente i pudre, pentru aciunea
antiinflamatoare, decongestionant, cicatrizant i antimicrobian. 'atorit
mirosului se utilizeaz ca insectifug n ncperi. @<@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
14
CAPITOLUL III. /TUDII DE LITERATUR
(n urma perfecionrii metodelor de identificare i etragere a
produilor naturali i a introducerii unor metode noi n studiul acestor substane,
apare astzi i mai evident compleitatea construciei chimice a organismelor
vegetale. 7umrul substanelor, ndeosebi organice, nt)lnite n plante este
uimitor de mare. 7umeroase din ele, cunoscute mai demult sau descoperite mai
recent, constituie produi de remarcabil importan biologic, farmaceutic sau
tehnic.
.copul prezentului proiect de diplom este studiul principiilor activi
din florile de glbenele.
'.1. /a(oie#e
3.1.1. .omenclatur. Structur.
.aponina din florile de glbenele face parte din grupa saponinelor de
tip triterpenic. .-a dovedit c saponinele considerate pure p)n n prezent, erau
de fapt amestecuri de astfel de substane. /a fel i escina, pe care 0schesche i
Golff au descoperit-o pentru prima dat prin C..... n mai multe componente,
dup ce n prealabil Gagner i Hosse au izolat dou componente izomere pe care
le-au denumit alfa i beta-escin i mai t)rziu alte dou saponine, criptoescina *
i H.
Criptoescina * a fost recunoscut de 0schesche i *en ca un amestec
de cel puin apte componente. :ist i o lucrare a lui Gin?ler care descrie
separarea C..... a escinei ntr-un glicosid principal i mai multe glicozide
secundare. %uli autori s-au strduit s clarifice structura escinei. *bia recent le-a
reuit lui Ioppe, =ieren i Hrodnerr ca i 0schesche i Golff izolarea unui
aglicon cu grupa esteric nemodificat i decelarea structurii sale prin analiz C.
Compleul de saponine prezint un amesctec de glicozide triterpenice
acetilate de tipul beta-amirinei, a crei parte uor cristalizabil este denumit
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
15
beta-escin i n trecut s-a crezut c ar fi unitar glicozidul de baz. .-a dovedit
ns a fi un amestec de glicozide a cror agliconi sunt diesteri ai protoescigeninei
i a boringtogenolului C. ca i componen acid se amintesc acizii acetic, alfa-
metilbutilic izobutilic, tioglicol, anghelic, i drept component zaharic acizii
gluconici, glucoza, iloza i galactoza. *cidul glucuronic este legat de scheletul
triterpenic printr-o grup 2I de C
4
beta-blicozidic i este n continuare legat de A
moli de zaharoz. *gliconi de baz sunt protoescigenin-AE-anghelat-AAacetat,
respectiv protoescigluin-AE-tiglat-AA-acetat. (ncercrile farmacologice relevate
p)n n prezent s-au efectuat cu saponina-escina i cu etractul total de semine.
'e aceea nu este surprinztor c s-au publicat cele mai contradictorii rezultate i
divergena asupra principiului activ din florile de Calendula nu a contenit.
3.1.2. /etode de recunoa#tere #i determinare
/a agitarea unei soluii de : se formeaz spum intens (efect general
sapo6ninic!. Pentru identificare este nevoie de compararea valorilor C
3
obinute
prin C.I. sau C..... cu etaloane.
Pentru recunoaterea aciunii hemolitice se pun cromatografele
developate ntre plci de gelatin sanguin sau se stropesc cu un amestec de E
parte s)nge defibrinat sau citrat sanguin i > pri soluie fiziologic de 7aCl.
.ensibilitatea este n domeniul 86 ug@pat. /a stropirea C..... cu acid sulfuric
<6F i ulterioar uscare, : d la lumina zilei o coloraie brun-rocat i n ultra-
violet o fluorescen galben care dup un tip trece n albastru. /a concentraii
mari : prezint iniial o fluorescen rou-portocalie.
2 metod gravimetric dup Comisch se fundamenteaz pe trecerea
saponinei etractelor escinice n alcaliescinol hidrosolubil. Prin adaos de ICl
diluat se obine pp escinolul hidrosolubil, care se determin gravimetric sau
alcalimetric. Coninutul etractelor cercetate se raporteaz la escin. %elnitschu?
determin separat B.*. i B... n seminele de castan dup o prealabil degresare.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
16
'in valorile gsite se stabilete prin transformarea coninutului n escigenina din
care n continuare se poate concluziona coninutul de saponin brut.
(n determinarea forometric dup 2verlach, reacioneaz : cu o soluie
p-dimetilaminobenzaldehida+ acid sulfuric. .e formeaz o soluie violet a crei
etincie se msoar la <;6 nm. /a identificarea fotometric dup .chlemmer se
reiau etractele de semine cu 6,E n ICl i se etrag cu Pn-2I@CICl
4
. 'up
concentrare se reia amestecul saponinic cu acid acetic gl. 3ormarea compleului
colorat se obine cu reactivul 3eCl
4
I
A
I2
8
. *baterea relativ standard l a<86
nm este de A,>F. (n locul acestui reactiv Panich folosete clorura de cobalt.
(nainte de determinarea colorimetric se face o separare prin C..... a saponinei
pe plci de silicagel.
3.1.3. &ol 0iziolo-ic
:scina este o substan cu nalt activitate farmaco-dinamic. 'oza
letal este apreciat de %oller pentru oareci, dup administrare intra venos la 6,9
mg@?g. /orens i %ale? au stabilit doza letal intra venos pentru oareci la A,<
mg@?g, pentru obolani la EA,4 mg@?g i pentru cobai la 9,E mg@?g corp.
Ceferitor la resorbia escinei, n literatur eist concepii divergente.
'up Iausschild, nu se poate dovedi o resorbie din tractul digestiv, iar dup
2rzechoJschi, ea este minim i insuficient. /a Corena i %ale?, care la escin
sau etract nu au vzut efecte asupra edemului, nu se gsesc date referitoare la
doza aplicat.
.chJeitzJr relateaz despre trei cazuri de intoicaii cu flori de
Candula la copii, cu un caz de deznodm)nt letal, dup un consum repetat de
material. Preziosi i %aJ?a au furnizat p)n n prezent, prin eperiene pe
animale, singurele dovezi pentru o resorbie suficient a escinei din canalul
digestiv. :i au obinut n eperiment rezultate identice, c)nd au aplicat p.o. <
mg@?g i i.v. E mg escin@?g corp. :. a. 2. a dus, referitor la nt)rzierea operaiei
morii la solicitare la frig a obolanilor fr rinichi auiliar, la rezultate deosebit
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
17
de bune. 'up administrarea i.v. de doze acut letale de escin la animale se
a&unge nemi&locit prin hemoliz la anoie, respectiv hipoie a parenchimurilor
vitale (ficat, rinichi!, la deces.
/a administrarea cronic zilnic i.v. de E@< './.
<6
(KE,E mg@?g! p)n la
46 d. nu apar la iepure nici schimbri chimice, nici patolego-anatomice.
Iemoliza intravital care apare la om dup o in&ecie i.v. de A mg : este de E
minut de la administrare i cu cea mai sensibil metod nedecelat. :scina se
leag foarte rapid, comple de albumin seric, nc)t se inhib puternic hemoliza.
%ecanismul de hemoliz decurge dup -ogel n primul r)nd printr-un atac al
proteinei membranei eritrocitei. :perimental. .-a dovedit o aciune
edeminnhibitoare i de scdere a fragilitii vaselor din partea escinei. :a se
instaleaz la > ore dup amplificare, este maim dup E5 ore i se menine
c)teva zile. :fectele hemolitice i antietrudative decurg paralel.
$n efect asupra tenosului venos nu se poate atribui. .e pare ns, c la
doze mai mici de E mg@?g corp, dup o scdere, apare o cretere a tensiunii
sanguine.
(n clarificarea mecanismului de aciune s-au strduit -ogel i $bel.
'up acetia, aciunea este legat de o fraciune auiliar renal intact. *ceste
constatri coincid cu cercetrile cu LacubicoJa ca i -ade? i Mozli? referitoare
la efectul general al saponinei asupra corteului suprarenal. 'eoarece n
ncercrile chimice s-a instalat foarte repede evitarea edemic, n centrul ateniei
stau dou aciuni ale escinei+
E! nemi&locit, dup aplicare se a&unge la formare de edeme localizate,
care se pare a fi condiionate de o obturare a capilarelor.
A! dup un timp mai lung de laten se a&unge la un efect secundar
maimal asupra suprarenalei. *cest efect se bazeaz pe un atac direct al
saponinei asupra corteului suprarenal, care duce la o secreie suplimentar de
E;-cetosteroid.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
18
Pe baza mecanismului de aciune a escinei se obin indicaii sub
influena compuilor activ ai corteului suprarenal, asupra metabolismului
celular. *cestea sunt edeme traumatice, distorsiuni grele, inflamaii trombotice i
traume cerebrale (commotio cerebri!.
'.2. 0#a)ooi%e#e
3lavonoidele reprezint o clas de substane fenolice larg rsp)ndite,
mai ales sub form de glicozizi. %ulte flavonoide sunt colorate, constituind unii
din principalii pigmeni vegetali, cum sunt antocianinele i flavonele. 'iferitele
flavonoide se aseamn prin scheletul comun format din dou inele benzenice
legate printr-un len de trei atomi de carbon (C
5
-C
4
-C
5
!. Cu ecepia chalconelor,
fragmentul C
4
se gsete ntr-un heterociclu cu oigen, piranic sau furanic,
condensat cu unul din nucleele benzenice. 'iferitele grupe de flavonoide se
deosebesc prin gradul de oidare al fragmentului C
4
. .e disting 5 tipuri de
flavonoide+ flavani, antocianidine, flavone, flavonone, chalcone, aurone. *cestea
deriv de la utmroarel esubstane+ flavan, flaven-4, flaven-A-on-8, flavonon-8,
benziliden-aceto-fenona i A-benziliden-cumarona.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
19
'iferiii reprezentani ai fiecrei grupe de flavonoide se caracterizeaz
prin grupri hidroilice i metoilice fiate n anumite poziii pe ciclurile * i H,
uneori i pe heterociclu. %ai rar se nt)lnesc reprezentani cu alte grupri
funcionale sau av)nd catene laterale. @>@ prin reacii de hidroilare,
dehidroilare, metilare sau demetilare, unii reprezentani aparin)nd aceleiai
grupe de flavonoide. *ceste transformri au o mare importan practic, deoarece
unele flavonoide larg rsp)ndite n natur, pot fi transformate n altele mai
valoroase din punct de vedere practic, dar mai puin rsp)ndite, cum este cazul
rutinei i Duercetinei, cu rol bine stabilit n terapeutic, fiind produse
farmaceutice de mare circulaie.
3.2.1. Flavone #i -licozizi 0lavonici
3lavonele sunt pigmeni galbeni, care se gsesc n flori, fructe i
frunze, sub form de glicozizi, iar n lemn i scoar, at)t libere, c)t i ca
glicozizi.
/a cunoaterea constituiei compuilor flavonici au contribuit n primul
r)nd cercetrile lui *.=. Perhin i .t. Mostanec?i. *u fost sintetizate numeroase
flavone, dar nu toate au corespondent natural. (n natur s-au gsit peste o mie de
compui flavonici. 7umrul gruprilor hidroilice i metoilice variaz de la A
p)n la 5. gruprile metoilice se gsesc mai ales pe inelul H. $n numr mai mic
de compui flavonici conin grupe metil, dioimetil sau catene mai lungi, de
tipul+
CI
4

-CI
A
-CI
A
-C- CI
4
, sau sunt condensai cu unele cicluri.
2I
=lucidele care particip la construcia glicozizilor flavonici sunt n
primul r)nd+ '-glucoza, /-ramnoza, /Narabinoza, '-iloza i acidul '-
glucuronic. *ceste glucide pot participa i sub form de biglucide sau triglucide
cum sunt+ rutinoza, apioza, robinoza, soforoza i altele
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
20
Cesturile glucidice se gsesc fiate la una sau dou din gruprile
hidroilice ale compusului flavonic.
Pro(riet!+i 1i*ice
3lavonele sunt substane cristalizate, colorate n galben. =licozizii
flavonici cristalizeaz bine, fiind solubili n ap, metanol i etanol. .olubilitatea
flavonelor este variat. =ruparea OC2 - C K C- are putere cromofor mic, dar
datorit con&ugrii cu nucleele aromatice precum i datorit gruprilor
hidroilice, culoarea se intensific. $n efect deosebit asupra nchiderii culorii
galbene au gruprile hidroilice din 4 i 8 datorit posibilitii de formare a unei
structuri chinoide.
3lavonoidele prezint n $.-. dou sau trei benzi de absorbie.
=ruprile hidroilice din anumite poziii au efect batocrom caracteristic, iar
transformarea acestora n grupri metoilice are un efect hipocrom. 'eterminarea
poziiei benzilor de absorbie n $.-. permite caracterizarea compuilor flavonici.
3lavonele prezint o serie de proprieti chimice ce se datoresc agliconului.
Ac+i&ea a#ca#i#or ,i aci*i#or
.ub aciunea alcalilor inelul pironic se deschide, stabilindu-se un
echilibru ntre flavon i dicetona rezultat.
Ceacia de deschidere a ciclului pironic fiind reversibil, alcalii i acizii
pot avea aciune izomerizant asupra flavonelor. *stfel de reacii de izomerizare
sub aciunea acizilor au fost folosite n scopuri preparative. @9@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
21
3.2.2. Flavonoli ai 0lorilor de )alendula
0#a)oo#i 2 3 e.tract s.&.
Fraciunea lipofil
-cvercetin O 4 O glucozid (soDuercitin! -
-chempferol O 4 - glocozidoramnozid 6,6;<
- chempferol O 4 - ilozidoglucozid -
-cvercetin O 4 - glucozidoramnozid -
- chempferol O 4 - diglicozid 6,E66
-cvercetin O 4 - ilozidoglicozid 6,A66
Fraciune hidrofil
- cvercetin O 4 - diglicozid -
- chempferol O 4 - glucozidoilozidoglucozid E,A<6
- cvercetin O 4, 4 - diglucozid 6,<66
- cvercetin O 4 O ilozidoglucozid O 4 - glucozid 6,<66
3raciunea lipofil reprezint E4,8F i cea hidrofil 5EF din ansamblul fraciei
flavonolice
3.2.3. .omenclatur. Structur
3iind polifenoli, flavonele i flavonolii pot trece n anumite condiii
dintr-o structur chinonic i s acioneze drept catalizator redo, pe care fapt se
i bazeaz activitatea lor biochimic.
.tructura determinat pentru efectul flavonic dup .chills i =oodhart
este+ grupa chinonic la C O 8, dubla legtur ntre C OA i C O4 i grupe 2I la C
O 4 i C O 8, n timp ce la flavonoli grupa chinonic ce se formeaz la nucleul A-
fenillic este activat n plus de 2I de la C O 4. /oth i 'ietrich au pus n
eviden uurina de oidare a derivailor flavonolici cu o grup o-dihidroi n 4,
8. Pentru a concretiza comportarea diferit a hidroi-flavonolilor, ei au stabilit
ntre altele i potenialele redo ale rutinei i cvercetinei. Cezultatele relev
influena determinant a grupei 4-2I libere. *stfel cvercetina a avut fa de
rutin un potenial cu E66 m- mai negativ. (n comparaie cu sistemul
benzocatechina@o-benzochinona, a crui rest este atrgtor de electroni, restul 4-
2I este donor de electroni. 'e asemenea s-a putut dovedi tendina mai slab de a
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
22
da reacii secundare n cazul derivailor o-chinonici ai flavonolilor fa de
compuii fr grupe 4-2I libere prin titrare discontinu.
3.2.4. /etode de recunoa#tere #i determinare
/a tratarea etractelor escinice cu zinc sau magneziu n soluie de acid
clorhidric, soluia iniial galben se coloreaz n rou. .e formeaz prin reducere
i cu recuperarea unui rest zaharic, anticianidin clorurile, respectiv derivai de
chempferol clorur de pelargonidin, iar din derivaii cvercetinei, clorura de
cianidin.
'up Mussner, aceast reacie se poate aplica n determinri
colorimetrice. 3lavonele dau cu sruri incolore de *l, Pb, Cd, Cu, 3e, H, .b ,i Hi
n urma burocromiei, combinii puternice colorate n galben(glicozida
chempferilic! sau portocaliu (glicozida cvercetinic!. *lte proprieti se
utilizeaz frecvent la recunoaterea cromatografic i la determinri colorimetrice
cantitative.
'eterminarea cantitativ dup 2verlach se face cu 3lovobnost
C
, un
comple aminoestiester al acidului difenilboric. .e preteaz pentru determinarea
coninutului etractelor de flori de Calendula, deoarece coninutul de flavonoide
se pateu raporta direct la cvercetin. 2 substan de referin pentru etractele de
semine nu se cunoate la aceast metod. 2verlach a considerat ne&ust alegerea
unei flavonoide la nt)mplare, ca referin, dac proprietile ei ca absorbie a
luminii dup efectuarea reaciei de culoare nu au coincis cu cele ale etractelor
escinei, sau dac lipsesc date eacte referitoare la flavonoidele de determinat.
'eoarece etractele de semine cercetate de autor au dat n condiiile reaciei
descrise un maim de absorbie la aceeai lungime de und, pare acum dup
cunoaterea eact a structurii ma&oritii flavonoidelor din semine, ntemeiat
raportarea la cvervetin. /a determinarea colorimetric dup Comisch cu *lCl
4
n
tampon CI
4
C22I g.l.@P1 se calculeaz coninutul de flavoniode cu echivalent
de rutin. %etoda se preteaz la determinarea substanei pure i a etractelor
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
23
deoarece se msoar numai intensificarea culorii prin formarea compleului de
aluminiu i soluia de compensare este aceeai soluie tampon flavonolic, ca cea
de msurat, ns fr adaos de sare de *l. 'ificultatea apare la determinarea
asupra etractelor de semine neco&ite, deoarece pigmentul co&ii chiar n diluia
aferent determinrii, intensific culoarea duc)nd la dificultatea recunoaterii
etinciei. 'e fapt, nici nu este ntocmit raportarea la echivalent de rutin
deoarece nu este prezent rutin n semine.
'eterminarea colorimetric dup Iorhammer a fost propus pentru
determinarea coninutului etractelor escinei, pentru noua carte de homeoterapie
a medicamentelor n =ermania. 'up hidroliza flavonelor care conin drept
aglicon comun cvercetina, urmeaz colorarea cu o soluie <F Pr2Cl
A
i
msurarea etinciei la 84< nm. Coninutul de flavonoli se citete de pe o curb
de ealonare ridicat n aceleai condiii ca i cvercetina pur. 'eoarece etractul
hidrolizat conine pe l)ng cvercetin cantitate apropiat de chempferol, pare
problematic obinerea unui etalon adevrat. 'e aceea se pot numai compara
coninuturile flavonoidice ale fiecrui etract ntre ele. @9@
3.2.5. &ol 0iziolo-ic
2 metod biologic o constituie testul Petechien dup %uschaJec? n
form modificat de *uster. Pe buri depilate de obolani se determin valoarea
.og-ului la care Q din c)mpurile eaminate reacioneaz n Petechien (mici
hemoragii cutanate!. *poi se aplic animalului soluia de determinat. 'up A8 de
ore, zonele din imediata vecintate a c)mpurilor investigate trebuie s reziste la o
solicitare .og cu c.p. 46F.
2 alt cale modificat dup Mova?s i 3oldi care efectueaz testul pe
partea dorsal depilat a obolanilor de ambele pri a coloanei vertebrale const
n inerea n prealabil a obolanilor A-4 sptm)ni la un regim scorbutigen. 0ot un
efect tenacizant al capilarelor se atribuie dup Paris i compuilor '-catechin i
catechin de argasit. *ceasta nu este surprinztoare, n msura n care catechinele
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
24
pot fi asimilate drept flavonoli hidrogenai sau antocianuri hidrogenate.
Catechinele pure nu s-au impus n terapie datorit instabilitii lor.
'.'. Pi$-e+ii caroteoi%ici
3.3.1. Sursele #i 0actorii care in0lueneaz coninutul de pi-meni
carotenoidici
Carotenoidele sunt pigmeni naturali, neazotai, larg rsp)ndii n
natur, care datorit dublelor legturi con&ugate din molecula lor, imprim
esuturilor n care apar o culoare galben, portocalie, roie, sau chiar albastr, de
diferite nuane. .pre deosebire de restul pigmenilor naturali (flavone, calcone,
aurone, antociani, chinone, pigmeni indolici, pigmeni porfirinici, etc!
carotenoidele sunt cei mai rsp)ndii pigmeni care se gsesc at)t n regnul
vegetal c)t i n cel animal.
Plantele superioare (angiosperme i gimnosperme! conin un numr
relativ mare i variat de carotenoide, at)t n esuturile fotosintetizante (frunze,
tulpini, muguri, sepale,etc! c)t i n cele nefotosintetizante (fructe, flori, semine,
rdcini, polen, plantule etiolate!. 'up 0.G. =oodJin carotenoidele se gsesc
localizate predominant n cloroplastele i cromoplastele organismelor vegetale. (n
anumite condiii ele pot s apar i n sucul citoplasmatic, etraplasmatic, mai cu
seam toamna, c)nd se produce degradarea plastidelor, precum i la unele alge,
fapt ce imprim toamna esuturilor i mediului acvatic culoarea carotenoidelor. (n
cloroplastele din celulele i esuturile fotosintetizante, carotenoidele se gsesc
predominant sub form de complee caroteno-proteice, carotenolipoproteice,
carotenolipidice incorporate n gr)nele cloroplastelor. *ceste complee ale
carotenoidelor intr n alctuirea fotosistemelor B i BB, care nfptuiesc procesul
de fotosintez. 3elul i coninutul carotenoidelor difer n cele dou fotosisteme.
(n fotosistemul B predomin coninutul beta-carotinei fa de cel al luteinei (sau a
altor antofile! fiind ntr-un raport de E,8+E. (n fotosistemul BB, coninutul
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
25
carotenoidelor hidrocarburice (beta-carotina, alfa-carotina! este cu mult mai mic
dec)t cel al antofilelor. Pe baza a numeroase analize efectuate cu plante din
diferite regiuni ale globului pm)ntesc, s-a a&uns la constatarea c n esuturile
verzi fotosintetizante se gsesc n mod constant 8 carotenoide principale, n
urmtoarele proporii+ beta-carotina A<F, luteina 86F, violaantina E>F i
aloantina EAF. *lturi de aceste carotenoide principale n esuturile verzi apar
frecvent, dar nu constant i alte carotenoide n cantiti mici cum sunt+ alfa-
carotina, beta-carotina, zeaantina, anteraantina, fitoemul i fitofluemul.
Coninutul carotenoidelor din esuturile fotosintetizante depinde de natura
speciei, pigmenii fiind determinai genetic, precum i de influena condiiilor de
mediu.
'up :.B. %ercer, H.7. 'avies i 0.G.=oodJin, n frunzele de Vicia
sativa, coninutul fitoemului i al fitofluemului este de aproimativ E66 de ori
mai mare dec)t al beta-carotinei. 'up =. Hritton i 0.G. =oodJin, n frunzele
de Syngonium coninutul neoantinei este mai mare dec)t al violaantinei, iar n
frunzele de Fremontia, coninutul zeaantinei este la fel de ridicat ca i cel al
luteinei. P.G. Ber?oJs?i a artat c coninutul carotenoidelor hidrocarburice este
cuprins ntre < i 45F din totalul carotenoidelor, iar coninutul alfa-carotinei este
cuprind ntre 6 i 86F din totalul carotenoidelor hidrocarburice.
(n esuturile fotosintetizante, antofilele se gsesc n stare liber,
neesterificate sau esterificate, ncorporate n gr)nele cloroplastelor. 0.G.
=oodJin a artat c n urma mbtr)nirii cloroplastelor (predominant toamna!,
c)nd acestea ncep s se dezintegreze, antofilele sunt eliberate n citoplasm,
unde se produce esterificarea sau eterificarea acestora. Coninutul beta-carotinei
n frunze variaz ntre A66 i ;66 Rg@g material uscat, n funcie de natura speciei.
'up /.C.=. -aladon i C... %ummer1 la unele plante dionice,
frunzele plantelor femele au un coninut mai mare de carotenoide dec)t frunzele
plantelor mascule. 3runzele tinere au n general un coninut de carotenoide mai
mare dec)t frunzele btr)ne. (n natur, alturi de plantele autotrofe, eist i
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
26
plante semiparazite, n frunzele crora se gsesc aceleai carotenoide de baz ca
i n frunzele plantelor autotrofe. Ca un aspect caracteristic apare faptul c
pigmentul principal l constituie beta-carotina. 'up 0.G. =oodJin,
carotenoidele au o larg rsp)ndire nu numai n organismele autotrofe ci i n
organismele i esuturile nefotosintetizante. 3ructele alturi de glucide,
aminoacizi, vitamine, acizi organici, taninuri, etc., conin un numr nsemnat de
carotenoide. *ici ma&oritatea carotenoidelor se gsesc alturi de pigmenii
flavonoidici, fiind localizate predominant n coa&.
Principalele carotenoide ale speciei Calendula officinalis sunt+ licopina,
alfa i beta-caroten, neolicopina *, rubintina, luteina, antofila, violaantina i
flavoantina. @E6@
3.3.2. .omenclatur. Structur. 1roprieti 0izico2c3imice.
Primul pigment carotenoidic izolat sub form cristalin a fost din
morcov, cruia Gac?enroder n E>4E i-a atribuit denumirea de caroten. $lterior s-
a constatat c aceast hidrocarbur este alctuit din 4 izomeri i anume+ alfa-,
beta- i gama-carotina. 'enumirea carotenoidelor provine n cea mai mare parte
de la denumirea sursei naturale din care s-a etras.
Primele propuneri cu privire la nomenclatura raional au fost fcute n
E98; de ctre P. Marer, fiind mbuntite n E956. (n aceast nomenclatur se
folosesc litere greceti pentru fiecare molecul care este considerat o entitate
distinct. 7umerotarea atomilor de carbon din molecule se face cu cifre arabe,
pentru prima &umtate a moleculei C
86
, de la st)nga la dreapta, n ordine
cresc)nd, iar pentru cea de-a doua &umtate, de la dreapta la st)nga.
Ca proprieti fizice, ma&oritatea carotenoidelor sunt substane colorate
i colorante ntruc)t posed un cromofor alctuit din cel puin >-9 duble legturi
con&ugate. Cele care conin mai puin de >-9 duble legturi CKC con&ugate sunt
incolore, cele cu E6 duble legturi au o culoare galben, cele cu EE duble legturi
au culoare portocalie, iar cele cu peste EE duble legturi sunt roii.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
27
Pigmenii carotenoidici se dizolv bine n solveni organici i n lipide.
Carotenoidele oigenate se solv numai n solveni organici polari. Carotenoidele
prezint un miros caracteristic slab aromat. 7u sunt toice, nici iritante. Punctele
de topire sunt n general situate sub A<
o
C, marea ma&oritate fiind cuprinse ntre
E;6-A66
o
C. @E6@
3.3.3. /etode de e4tracie" separare" dozare #i identi0icare
*legerea metodei de etracie este determinat n principal de natura
materialului vegetal, de uurina etraciei cu solveni, de proprietile i
cantitatea pigmenilor prezeni.
0.G. =oodJin i =. Hritten, n scopul eliminrii lipidelor au aplicat
urmtorul procedeu de saponificare+ la etractul carotenoidic s-ai adugat E ml
etanol sau metanol E6F i soluie de hidroid de potasiu E<F. (n cazul n care
etractul carotenoidic nu s-a dizolvat bine n etanol sau metanol i s-a adugat un
volum mic de eter sau benzen i apoi soluia alcoolic de hidroid de potasiu,
solventul iniial fiind eliminat prin antrenare cu vapori de ap. './. 3lether a
utilizat dou variante ale procedeului de saponificare+
a! O amestecul alcalin a fost nclzit timp de <-E6 minute,
ferit de lumin, pe baia de ap, sub atmosfer de azot i apoi rcit,
b! O amestecul alcalin, ferit de lumin a fost lsat la
temperatura camerei sub atmosfer de azot timp de EA-E5 ore,
.-a constatat c prima variant este economic, iar a doua variant
prezint avanta&ul c pigmenii carotenoidici, cum sunt antofilele, care sunt
deosebit de termolabili, nu sunt epui operaiei de nclzire.
.. /iaaen-Lensen, dup realizarea saponificrii a etras pigmenii
carotenoidici astfel+ soluia saponificat i rcit a fost amestecat cu eter etilic
(E+E! ntr-o p)lnie de separare, dup care s-a adugat ap p)n la apariia celor
dou faze, carotenoidele afl)ndu-se n stratul eteric superior. 3aza inferioar a
fost eliminat, etracia repet)ndu-se p)n la etracia complet a pigmenilor.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
28
Pentru a evita emulsionarea spunurilor, au fost adugai c)iva mililitri de alcool
sau de soluie concentrat de sare (7aCl, %g.2
8
, (7I
8
!
A
.2
8
!. .oluiile eterice
reunite s-au splat cu ap ntr-o p)lnie de separare p)n la ndeprtarea complet
a alcaliilor, s-au uscat peste sulfat de sodiu anhidru, s-au filtrat i evaporat
secundar. 7. *rpin, L./. 3iasson au constatat c separarea carotenoidelor dintr-un
amestec este str)ns legat de caracterul hidrofil datprat gruprilor funcionale din
molecul i de polaritatea moleculei, caracteristici care fac posibil eistena a
dou tipuri de metode de separare+ una de repartiie ntre dou faze lichide
nemiscibile ntre ele i a doua, de separare prin proprietatea de absorbie pe
absorbant.
C. Honnett i *.M. %allams au separat carotinele de antofile prin
repartiia etractului n faza lichid-lichid ntre eter de petrol i metanol apos (9<-
96F!. *ceti autori au constatat c separarea prin repartiie ntre lichid-lichid
poate fi o alternativ a saponificrii n vederea eliminrii clorofilelor din etracte
care conin carotenoide sensibile la alcali, procedeul fiind nsoit fie de repartiia
unei soluii n eter de petrool cu metanol >8F, c)nd antofilele trec n hipofaza
metanolic, clorofilele n epifaz sau de etracia unei soluii metanolice a unui
pigment cu eteri de petrol, p)n c)nd toate clorofilele sunt terminate. (n ambele
cazuri antofilele din hipofaz au fost trecute n eter etilic i apoi splate cu ap.
H.I. 'avies a efectuat se pararea pigmenilor carotenoidici
nesaponificabili din etract n eter de petrol prin agitarea ntr-o p)lnie de
separare, conin)nd metanol 96F c)nd toate antofilele coninute n etract cu A
sau mai multe grupe 2I sau grupe carbonil au trecut n faza metanolic. (n
epifaz au rmas carotenele, cetocarotenoidele, epoizii, eterii i esterii
carotenoidici. 'in hipofaz, fraciunea metanolic, carotenoidele s-au trecut n
eter etilic apoi au fost splate cu ap i uscate. .-a constatat c cea mai
important tehnic de izolare a carotenoidelor n stare pur este cromatografia pe
coloan.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
29
.. /iaaen-Lensen i *. Lensen au utilizat ca procedeu pentru separarea
carotenoidelor cromatografia inzone, c)nd amestecul de carotenoide aflat ntr-un
solvent nepolar a fost aplicat n partea superioar a coloanei, pentru developare
fiind utilizat un solvent potrivit p)n la separarea zonelor pe coloan. Coloana a
fost demontat, absorbantul selecionat pe zone i fiecare zon eluat individual
cu un solvent polar. =. Hritton a aplicat ca procedeu de separare pe coloan
cromatografia eluiei n trepte, c)nd proba de amestec a pigmenilor este aplicat
n partea superioar a coloanei n solvent nepolar (eterul de petrol!, iar coloana
este splat prin developare cu solvent, n care solventul polar este mrit treptat.
Pigmenii sunt eluai n mod succesiv, n ordinea creterii activitii lor de
absorbie, de la zona de &os spre cea de sus a coloanei i colectai sub form de
eluat. 3iecare zon eluat a fost evaporat la sec, redizolvate ntr-un volum mic
de solvent, n vederea eaminrii prin recromatografierea pe coloan,
spectofotometrice.
:. .tahel a efectuat separarea pigmenilor carotenoizi prin metoda
cromatografiei pe strat subire. Probele individuale care au fost separate
preliminar prin cromatografia pe coloan au fost n continuare cromatografiate pe
strat subire utiliz)nd ca absorbant silicagel =, la care s-a adugat o soluie de 4F
hidroid de potasiu. :luarea a fost efectuat cu eter etilic, sau eter etilic ce
conine <-E6F etanol, n cazul carotenoidelor polare. C. .ubbara1an a efectuat
identificarea carotenoidelor n tratarea cu triclorura de stibiu, acid sulfuric
concentrat, c)nd a aprut o coloraie albastr. I.I. .train trat)nd o soluie eteric
de pigment carotenoidic cu o soluie de acid clorhidric A6F, a observat apariia
unei coloraii albastre, pe aceast cale reuind identificarea <,>-epoi
carotenoidelor. @9@
*nna MuroJs?a, '. Malemba i B. =ola au comparat calitativ i
cantitativ componentele izo-p.m1reistat (B%P!, propilen-glicol (P=!, i
aD.propilen glicol (*=! din etractul inflorescenelor de glbenele. :tractul BP%
trebuie s conin setul complet al carotenoizilor plantei. 'e aceea cele mai bune
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
30
rezultate au fost obinute cu un etract galben B%P i cu un P=. (n toate
etractele au fost prezente flavonoidele, inclusiv n etractul *=. au fost prezeni
acizii fenolici cu ecep
Ba acidului o-hidroifenilacetic. :tractul *= conine puini
carotenoizi. Coninutul de tanin i oleanozide a fost crescut n etractul *=. dup
o perioad de stocare de 5-A8 ore, componentele etractului s-au schimbat,
etractul av)nd proprieti organoleptice bune. @EE@.
3.3.4. &ol 0iziolo-ic
Colul i funciile pigmenilor carotenoidici constituie cea mai
important latur a lor, fapt pentru cate li se i &ustific prezena n organismele
vii.
Carotenoidele n organismul uman constituie sursa de retinol. Bau parter
la colorarea pielii, ceea ce a dus la utilizarea lor ca ageni fotoprotectori n boli
fotoreceptoare i chiar ca ageni anticancerigeni. Heta-carotina este cea mai
important, predomin)nd n legume, fructe i zarzavaturi, care sunt consumate de
om i din aceast cauz, fiind provitamina *, are cea mai mare activitate
biologic.
s-a fcut o corelaie ntre carotenodermie cu valori sczute i diferite
boli infecioase, cum sunt malaria, pneumonia, gripa, etc., s-a sugerat ca
nivelurile crescute ale carotenemiei pot preveni infeciile. :ist de asemenea o
corelaie ntre carotenemie i bolile de ficat. Pacienii cu astfel de afeciuni au o
carotenemiei sczut, datorit capacitii reduse de absorbie a carotenelor
cauzate de leziuni al eficatului.
Pigmenii carotenoidici au proprietatea de a prote&a hematiile
mpotriva fotohemolizei induse de un pigment porfirinic eogen sau endogen.
Carotenoidele sunt utilizate n industria farmaceutic, cu precdere pentru
colorarea unor preparate farmaceutice, c)t i pentru deinerea unor preparate
tonice i dietetice regenerative.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
31
'.4. Aci%&# ascorbic 5)ita-ia C6
3.4.1. Surse" 0actori ce in0lueneaz coninutul de acid ascor$ic
:ste foarte rsp)ndit n regnul vegetal, unde se gsete n toate plantele
superioare i n unele plante inferioare. 3oarte bogate n vitamina C sunt fructele
multor plante (yrciaria glomerata+ A,8-A,;F!, dar i unele frunze (Vicia
amoenas!. (n cantiti mari se mai gsete n fructele de ardei, coacze negre,
mce, nuci necoapte, lm)i, mandarine etc.
(n urma studiilor efectuate de L.=. Good i '.I. Cruic?shan? n E988,
de 0a?euchi n E9<5, de .. Hose i H.C. =uha n E9<9. s-a a&uns la concluzia c
n frunzele plantelor, acidul ascorbic s-ar gsi asociat cu proteine form)nd un
comple numit ascorbigen frunzele tinere sunt mai bogate dec)t cele btr)ne.
Cantitatea maim de vitamina C se gsete n petinol i la suprafaa frunzelor.
3.4.2. .omenclatur. Structur #i proprieti 0izico2c3imice.
*cidul / (S! O ascorbic (vitamina C! are formula molecular C
5
I
>
2
5
i
se prezint ca o pulbere cristalin alb, fr miros, cu gust acru. .tructura a fost
dedus de :./. Iirst i colaboratorii si i de 3. %ichael i M. Craft n E944.
*cidul ascorbic poate fi privit ca lactona acidului A-ceto-/-gluconic
(forma enolic!. Cele dou grupri enolice din molecul determin caracterul
acid i reductor al vitaminei C. (n ap aceasta este solubil. 'in etanol-eter
cristalizeaz sub form de foie cu p.t. E96-E9A
o
C. Cotaia specific n ap (alfa!
'
T A4
o
crete n decurs de trei zile la T 4E
o
, pentru a scdea ncet p)n la 6
o
C, n
metanol (alfa!
'
T 8>
o
.
(n ap acidul ascorbic se titreaz n prezena fenolftaleinei ca un acid
monobazic. *cest caracter se datoreaz gruprii enolice de la C
4
a crei constant
de disociere este M K 8,E; fa de M K EE,<; a gruprii enolice de la C
A
. n soluie
acid, acidul ascorbic este destul de stabil, n soluii alcaline, ndeosebi n
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
32
prezena luminii i de cantiti catalitice de metale, este oidat de oigenul
atmosferic n acid dehidro-/-ascorbic, datorit pierderii celor doi atomi de
hidrogen de la gruprile enolice. 2idarea are loc repede sub aciunea unor
oidani slabi. *genii reductori, chiar slabi reoideaz acidul dehidroascorbic,
n acid ascorbic. 2idanii mai puternici determin o scindare a moleculei
acidului dehidroascorbic prin ruperea legturii ntre C
A
i C
4
, cu formarea de acid
oalic i acid /-treonic.
(n plante oidarea acidului ascorbic este catalizat de ascorbinoidaza
i reducerea acidului dehidroascorbic este catalizat de ctre ascorbin-reductaza.
Prin intervenia ascorbinreductazei, dup %. Uamaguchi i %.*. Locel1n, E9<A,
acidul dehidroascorbic poate fi redus n acid ascorbic de ctre glutation.
(n esuturile vegetale transformarea acidului ascorbic n acid
dehidroascorbic se realizeaz prin reacii de oidare enzimatic i neenzimatic.
2idarea enzimatic are loc sub aciunea ascorbinoidazei, identificat n diferite
plante i dovedit a fi o Cu-proteid. 2idarea neenzimatic a acidului ascorbic
este catalizat n esuturile vegetale de sruri ale metalelor grele. @9@
3.4.3. /etode de separare" dozare #i identi0icare
/.*. .chin&ans?i i /... MasarnoJs?i au efectuat etracia sub
influena ultrasunetelor cu frecvena de 8>6-<66 MIz, intensitatea de A6G@cm
A
i
un timp de epunere de E< secunde. Compar)ndu-se acest etract cu un etract
normal s-a observat c prin tratare cu ultrasunete se micoreaz timpul de
etracie, iar cerinele acestui etract corespund farmacopeei. @EA@
.tanislaJ Mrauzer i PbignieJ Hoz1? recomand metoda de etracie a
lui 3ellemberg. Cercetrile asupra vitezei de catabolizare a vitaminei C arat c
pierderile care apar sunt determinate de punerea n libertate de .2
A
care nu este
legat de (CI
4
!C2. /a metoda lui Pi&anoJs?i, n fierbere se pierde mai mult de
E6F din vitamina C, la etraciile tehnice pierderile fiind mai mari. @E4@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
33
Conform patentului francez numrul E644685 din A4@6A@E9<E, autorul
%ichel Cormar a efectuat etracia selectiv pentru separarea vitaminei C prin
utilizarea unui sistem format din A lichide miscibile i o substan solid solubil
n unul din lichide. %etoda folosete ca solveni miscibili cu apa, acetona, etil-
cetona, iar ca substan solid utilizat pentru separarea amestecului lichid n
dou faze, zaharoza, clorura de calciu, sulfatul de amoniu, sulfatul de zinc i
iodura de sodiu. $n amestec de aceton i ap se separ prin adaos de clorur de
calciu n dou faze, faza superioar format, conin)nd 95,A6F aceton, 8,>6F
ap, <9,46F ap i 4<,<6F clorur de calciu. @E8@
/etzig :. i 3uec?er M. au propus o metod de determinare prin
electroforez la curent nalt a vitaminei C. (n cadrul metodei, probele au fost
pregtite fc)ndu-se amestecul cu soluie AF acid oalic. .oluia filtrat a fost
utilizat pentru electroforeza pe o sticl plat de A6 A6 cm, cu un strat subire de
pudr de celuloz la 566 - i A6 m* pentru 56-96 minute. Handele de acid
ascorbic au fost marcate n lumin ultraviolet, ndeprtate i developate cu alaun
ferici o-fenentrolin-ICl. %surtoarea spectrofotometric a fost fcut la <E6
nm. *cidul dehidroascorbic a fost determinat ca osazon. @E<@.
3.4.4. &ol 0iziolo-ic
*cidul ascorbic i dehidroascorbic formeaz n celule un sistem de
oido-reducere foarte important, care ia parte n numeroase procese metabolice
din organism. *cest sistem regleaz potenialul de oido-reducere celular i
contribuie la transportul hidrogenului pe cale neenzimatic, imprim)nd esturilor
vegetale ale fanerogramelor un caracter reductor. *cidul ascorbic stimuleaz
metabolismul glucidelor, lipidelor, glico-proteidelor i a numeroi aminoacizi. *u
o aciune antioidant, de aprare a vitaminelor liposolubile i a glutationului.
-itamina C ndeplinete rolul de activator general al metabolismului celular.
*cidul ascorbic are o activitate vitaminic mai mare dec)t a acidului
dehidroascorbic. (n avitaminoza accentuat se produce la om boala numit
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
34
scorbut, caracterizat prin hemoragii la nivelul gingiilor (gingivite!, apariia de
hematoame, tulburri digestive, anemie, stri de subfebrilitate, etc. 0ransformarea
reversibil a acidului ascorbic n acid dehidroascorbic se face mai uor prin
intermediul glutationului i respectiv a diglutationului. @E5@
'.7. U#ei&ri#e $rase 5#i(i%e )e$eta#e6
3.5.1. Structur #i proprieti 0izico2c3imice
/ipidele sunt substane de rezerv formate din esteri ai glicerinei cu
diferii acizi grai. *cizii grai sunt alifatici i pot fi saturai (acidul butiric,
capronic, lauric, palmitic i stearic! sau nesaturai (acidul oleic, linoleic etc.!. Prin
saponificarea acestora trigliceridele se pun n libertate compusul alcoolic,
glicerina.
$leiurile grase prezint o serie de proprieti fizico-chimice comune.
.unt lichide nevolatile (uleiuri fie!, grase la pipit, care nu se amestec cu apa,
dar sunt solubile n benzen, cloroform, eter, sulfur de carbon, eter de petrol,
benzin, etc. Cu ecepia unor uleiuri grase (ulei de ricin! sunt greu solubile sau
insolubile n alcool etilic. Culoarea glbuie a unor uleiuri vegetale se datoreaz
coninutului lor n carotenoizi. $nele uleiuri grase ntinse ntr-un strat subire
rm)n lichide (uleiuri nesicative!. *lte uleiuri se transform cu timpul ntr-o
mas elastic (uleiuri sicative!, proprietate pentru care sunt utilizate n diferite
scopuri tehnice.
3.5.2. Surse. Factori de in0luen. &ol 0iziolo-ic.
$leiurile grase se gsesc n cantiti mari (46-<6F! n diferite semine,
care servesc la obinerea lor pe cale industrial. $nele uleiuri sunt folosite n
scopuri farmaceutice, respectiv terapeutice, n calitate de solveni ai unor
medicamente liposolubile, precum i pentru prepararea unor unguente, emulsii
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
35
etc. $leiurile grase n componena crora intr acizii grai nesaturai ntr-un
procent mai mare, &oac rolul vitaminei 3. (n ultimii ani se consider c lor le
revine un rol important n metabolismul colesterolului, fiind apreciat n
prevenirea i tratamentul *.0... $nele uleiuri vegetale sunt utilizate ca i
medicamente coleretice sau purgative.
*lturi de trigliceride n plante se gsesc n cantitate mai mic steride,
compui n care componentul alcoolic este fitosterolul sau alt alcool steroidic.
.teridele se deosebesc de uleiurile grase prin lipsa proprietilor de saponificare
n mpre&urrile n care se saponific trigliceridele. :le formeaz fraciunea
insaponificabil din diferite uleiuri grase.
L. 0uroJs?a urmrete variaiile sterolilor liberi i obligai n
Calendula officinalis n timpul creterii. .tudiul distribuiei sterolilor n timpul
creterii plantelor arat c perioada germinaiei a fost caracterizat prin hidroliza
esterilor sterolici, a sterolilor liberi. Perioada nfloririi este caracterizat prin
acumularea esterilor sterolici, sterol-glicozidelor i sterolilor liberi n toate
organele plantei, particular n flori. Perioada senescenei este caracterizat prin
hidroliza esterilor sterolici n lstari i prin esterificarea sterolilor n rdcini i
semine. @E;@
G. .aniszoJs?a epune rezultatul cercetrii localizrii intracelulare a
biosintezei tocoferolului n Calendula officinalis. (
4
I! fitol a fost administrat
protoplatilor din frunze i din fraciile subcelulare, etichet)nd dinamica ;-
monometiltocolului, >-monometiltocolului, ;,>-dimetiltocolului i <,;,>,-
trimetiltocolului i relaia fitilchinonelor la fel de bune ca a vitaminei M
E
. Prin
condensarea cu acid homogentisic au fost formulai doi izomeri
metilfitilchinone(A-metil-<-fitobenzochinone! i (A-metil-5- fitobenzochinone!.
%ai t)rziu a fost adugat ciclizarea gama-tocoferolului care poate fi metilat la
alfa-tocoferol. Ceacia slab a fost localizat n cloroplaste i microzomi. C)iva
monometiltocoli i metilfitilbenzochinone au fost decelai la fel de buni ca
vitamina M
E
put)nd fi transportai la cloroplaste i mitocondrii. @E>@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
36
Conform studiului realizat de C.C. Hadami, uleiul din seminele de
glbenele conine monohidroiacid n proporie de aproimativ <F din acidul
gras. @E9@ P. Go&ciec?oJs?i a investigat efectul acidului oleanolic sintetizat
individual n frunzele plantelor de glbenele. * fost probat ca raportul i direcia
transportului depinde de etapa de vegetaie i de poziia frunzei pe plant. Cel
mai mare raport al transportului a fost observat din nivelul superior al frunzelor
ctre inflorescen, n perioada nfloritului. Perioada de dup eplozie a fost
caracterizat de ncetinirea migraiei acidului oleanolic din frunz. %igraia a fost
direcionat din partea de &os a frunzelor n special ctre rdcini. @A6@
G. .aniszoJs?a i L. C1gir studiind schimburile n nivelul
prenilchinonelor i tocoferolilor n Calendula officinalis n timpul vegetaiei,
afirm c plastochinonele, ubichinonele, gama-metiltocolul i alfa-
tocoferolchinonele, alfa i gama-tocoferolii cresc continuu de la faza de sm)n
la cea de nflorire. (n timpul senescenei nivele lor au sczut cu ecepia
ubichinonelor. Bnvestigarea s-a efectuat n semine, lstari i flori. (n rdcini s-au
gsit doar ubichinone i puini alfa-tocoferoli. @AE@
M. .zasz menioneaz c de la E8 componente izolate din uleiuri de
Calendula officinalis, numai 8 sunt identificate+ gama-murolon, deltacadinon,
guaiol i terreiol. Coninutul uleiului este diferit n diferitele pri ale florilor.
*cest fapt, eplic contradiciile din literatur date de coninutul uleiului din
inflorescen. Coninutul n ulei a organelor varietii cu flori galbene, cu
ecepia mugurilor i a florilor ligulate, a fost mai mare dec)t a varietii cu flori
portocalii. 0otui, compoziia uleiului nu a fost diferit n cele dou variante. @AA@
'.8. Materia#e#e taate 5Tai&ri6
3.6.1. Structur #i proprieti 0izico2c3imice
0aninurile alctuiesc o grup de principii activi unitari, mai mult din
punct de vedere al proprietilor tehnologice dec)t din punct de vedere chimic.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
37
.unt substane care pot fi utilizate la tbcirea pielii. :le prezint proprietatea
comun de a precipita proteinele, alcaloizii i acetatul de plumb. =ustul lor este
astringent.
'in punct de vedere chimic materialele tanante aparin grupei
polifenolilor i pot fi de dou tipuri+ compui formai din fenoli prin esterificare,
n unele cazuri n combinaii cu glucidele i compui cu nucleu condensat.
.ubstanele din prima categorie pot fi hidrolizate prin fierbere cu acizi minerali.
.ubstanele din categoria a doua conin nuclee flavonoide, sunt nrudite cu
catechinele i antocianinele i spre deosebire de substanele din grupa precedent,
nu pot fi hidrolizate cu acizi. (n urma nclzirii uscate primele dau pirogalol, le
conin, materialele tanante produc reacii de culoare cu srurile de metale grele.
(n prezena clorurii ferice, materiile tanante hidrolizabile dau o coloraie sau un
precipitat albastru p)n la negru, iar cele cu nucleu condensat, o coloraie n
verde. %ateriile tanante acioneaz asupra mucoaselor, coaguleaz proteinele i
n consecin prezint o aciune hemostatic. @E@
3.6.2. /etode de e4tracie" separare" dozare #i identi0icare
0aninurile din produsele vegetale au o constituie foarte variat i
prezint tendina de a se condensa i de a se oida, structura lor at)t n produsul
vegetal c)t i n soluiile etractive se modific n timp, iar activitatea astringent
a preparatelor nu este legat de cantitatea de taninuri.
0aninurile sunt solubile n ap, alcool, glicerol, aceton, puin solubile
sau insolubile n eter, cloroform, benzen, n soluii alcaline sau acide, sub
aciunea luminii i a oigenului se descompun repede. G. /ang n studiile sale a
artat c un reactiv general pentru taninuri este acidul fosfoJolframic. Pentru a
mri specificitatea acestei reacii, autorul procedeaz n prealabil la o precipitare
a taninurilor cu acetat de zinc n mediu amoniacal, apoi separ precipitatul, pune
taninurile n libertate cu acid sulfuric diluat i trateaz n mediu slab alcalin cu
acid fosfoJolframic, c)nd s eobine o coloraie albastr, datorit aciunii
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
38
reductoare a acestora. Prin acest procedeu sunt eliminate substanele strine care
pot falsifica rezultatele+ glicozidele polifenolice nu sunt precipitate cu acetatul de
zinc, flobafenele dei sunt precipitate nu se dizolv n acid sulfuric diluat.
$n procedeu analog care folosete pentru identificare reactivul arsen
Jolframic a fost propus de =. =rieger. 0aninurile au fost precipitate cu acetat de
plumb i gelatin, separate prin centrifugare i aduse din nou n soluie cu
a&utorul acidului fosforic. .oluia limpede, sau clarificar prin filtrare a fost
tratat cu reactiv arsen Jolframic p)n la apariia unei coloraii albastre.
Ceactivul a fost preparat prin nclzirea n reflu timp de A ore a amestecului
format din E66g Jolframat de sodiu, 46 g acid arsenic, <6 ml acid sulfuric i 466
ml ap. .oluia s-a filtrat i s-a adus la E666 ml cu ap.
3.6.3. &ol 0iziolo-ic #i utilizri practice
Colul fiziologic al taninurilor este puin cunoscut. Cercetrile recente
par s indice c taninurile se acumuleaz n esuturi care nu mai constituie sediul
unui metabolism activ i c ar ndeplini rolul de substane ce prote&eaz planta
mpotriva atacului din partea viruilor i a microorganismelor.
*./. CursanoJ a artat c, catechinele libere fac parte din sistemele
redo ale plantei, put)nd constitui transmitori ntre enzime oidante i
substraturi oidabile. 0aninurile se utilizeaz pe scar larg n procesul de
tbcire a pielii. (n acest scop se folosesc etractele apoase obinute din organe
vegetale bogate n tanin. 0aninurile se mai utilizeaz la fabricarea unor cerneluri,
n alte ramuri ale industriei chimice, n farmacie, n industria tetil, la limpezirea
vinurilor i la laboratoarele de chimie.
'.9. Protei%e#e
Proteidele sunt cele mai importante poliprotide, ele fiind substane de
baz n manifestrile sub orice form a vieii. (n locul denumirii de proteide se
folosete adeseori numele de substane sau materii proteice, sau cel de proteine.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
39
3..1. &sp5ndire
Proteidele sunt componente nelipsite ale oricrei celule vegetale sau
animale. :le se gsesc n cantitate mare n nucleul celular i formeaz mare mas
a protoplasmei celulare. Proteidele se gsesc i n sucurile care circul n
organismele vegetale, n general n toate organele plantei, n cantitate mai mare
afl)ndu-se n semine. (n organismele vii proteidele prezint caractere coloidale.
3runzele plantelor tinere conin 46-86F proteide din substana uscat, dar
coninutul lor scade la mbtr)nire.
3..2. /etode de izolare" puri0icare #i dozare
Proteidele solubile se etrag din esuturile fin divizate, cu ap sau
soluii de sruri sau de alcali, corespunztor solubilitii diferitelor proteide.
Proteidele greu solubile se etrag cu acid formic sau cu soluie de uree,
guanidin, proidin, etc., c)teodat cu acizi minerali tari. :tragerea se face n
toate cazurile la temperatur &oas i repede.
'in soluii proteidele por fi precipitate prin coagularea soluiei
concentrate sau prin precipitarea cu alcooli sau aceton. Pentru a separa
proteidele ntre ele i totodat de substane strine, se folosete mai frecvent
metoda precipitrii fracionate cu sulfat de amoniu sau sulfat de magneziu de
diferite concentraii, sau precipitarea fracionat cu alcool sau aceton. 2binerea
proteidelor n stare perfect pur este de cele mai multe ori o operaie dificil, care
necesit aplicarea succesiv a mai multor metode. 2 serie de proteide se pot
separa n stare cristalin, dar cristalele au de multe ori o structur neunitar,
datorit faptului c proteide diferite pot cristaliza mpreun. Bdentificarea
proteidelor se face prin reacii caracteristice de culoare i de precipitare.
'ozarea proteidelor din materiile vegetale se face de obicei pe baza
determinrii coninutului n azot dup metoda M&eldahl. Cezultatele care se obin
n urma degradrii materiilor vegetale, dup M&eldahl, prezint proteide numite
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
40
brute, pentru c azotul determinat nu provine eclusiv de la proteide, ci de la alte
substane azotate. Pentru determinarea proteidelor pure, ele trebuie separate de
celelalte substane prin precipitare cu reactivi specifici, ca de eemplu cu
hidroid de cupru, acetat de plumb, alcool ;>F etc. Proteidele digestibile se
determin n condiii de digestie eperimental, prin hidroliza cu pepsin n
mediu acid.
3..3. &ol 0iziolo-ic
Proteidele sunt substane indispensabile pentru orice organism viu.
$nele proteide constituie elemente structurale ale tuturor celulelor, altele sunt
substane de rezerv i substane cu activitate biologic ridicat. /a unele plante
s-a constatat c substanele proteice din frunze pot fi folosite ca substrat
respirator.
CAPITOLUL I:. CONCLUZIILE /TUDIULUI DE
LITERATUR
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
41
(n urma studiului efectuat se poate constata c utilizarea florilor de
glbenele este relativ veche, ele reprezent)nd o surs inepuizabil de principii
activi, cu deosebit importan n practica farmaceutic, cosmetic i chimic.
3iind o plant eistent n flora spontan i cultivat a rii noastre,
puin pretenioas la condiiile de mediu, cultivat i n c)mpia de vest, prezenta
lucrare de diplom i-a propus s+
-efectueze studii fitochimice referitoare la principii activi ai florilor de
glbenele+ saponozide triterpenice, carotenoide (licopina, alfa i beta caroten,
noelicotina *, rubiantina, luteina, antofila, violaantina, flovoantina!,
flavonoizi i glicozizi flavonici, rutinozizi, mucilagii, esteri colesterinici ai
acizilor lautic, miristic, palmitic i margaric, vitamina C, acid malic, substane
proteice, calendulina i altele.
-stabileasc condiiile optime de etracie integral a principiilor activi.
CAPITOLUL :. REZULTATE. DI/CUII. CONTRIBUII
ORIGINALE
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
42
7.1. Ob+ierea e.tracte#or
(n acest scop s-au folosit flori de categoria a BB-a (pierderi de umiditate
<6F!. Coninutul n : a fost de <,;F, de flavonoide 6,A>F i de uleiuri <,A4F.
5.1.1. /acerarea
%acerarea s-a fcut dup metoda clasic.
!.".".". acerarea metanolic
.-au preparat macerate cu concentraii metanolice n raport decimal
E+<. Proba s-a umflat puternic n solvent metanolic de 6-<6F volum. (n
concentraie metanolic mare, umflarea a fost minor. Bntensitatea culorii
etractelor a crescut n sens invers. Culoarea etractului metanolic a fost galben
deschis. /a %e2I >6F (vol! s-a putut observa o culoare intens galben deschis,
care la scderea coninutului de %e2I a trecut n galben-brun. %aimul
intensitii de culoare a fost la %e2I E6F (vol.!. %acerarea cu %e2I este
optim numai pentru determinarea flavonoidelor.
/a scderea concentraiei de %e2I p)n la zero nu s-au nregistrat
diferene considerabile n eficacitatea la etracie. 'eci %e2I este mai bun
solvent pentru izolarea etraciei flavonoidelor. .urprinztor de mare este
coninutul de : (calculat ca beta-:! n etractul apos. Crete p)n la %e2I 86F
(vol.! pentru a rm)ne relativ constant p)n la %e2I 96F (vol.!, nregistr)ndu-
se un optim de 56F. 3oarte ciudat este scderea coninutului de : n etract de
%e2I pur c)nd nu a&unge nici la A din valoarea etractului apos (0abel E!
6a$elul 1
MeO; 2 )o# E 2 0#a)ooi%e -$2 Co+i&t&# e.tracte#or
2
6 6,A>8 E<,E5 A,5E
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
43
E6 6,56< E;,E; 4,46
A6 6,;65 E;,;5 4,>4
46 6,>96 E;,>6 4,98
86 E,6E6 E;,;4 8,68
<6 E,6;A E>,<8 8,64
56 E,E86 E9,E4 8,64
;6 E,EE6 E9,A5 4,95
>6 E,685 E9,<> 4,9A
96 E,6E; A6,E8 4,A4
E66 6,856 8E,>6 4,EA
!.".".#. acerarea etanolic
.-au abordat macerate cu un raport de etracii E+< p)n la E+E6 n
concentraii decalare de :t2I. $n randament optim s-a atins la E+< cu :t2I <6-
>6F vol. 'ac n cazul maceratului metanolic am vzut c pentru %e2I 96F
fa de %e2I E6F coninutul de % este de A, n cazul celor etanolice relaia
este invers. .chimbarea raportului de etracie este E+E6 duce la mbuntiri
nesemnificative ale randamentului care nu &ustific efortul depus (0abel A!.
6a$elul 2
EtO; 2 )o# E 2 0#a)ooi%e -$2 Co+i&t&# e.tract&#&i
2
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
44
Caport de etracie E+<
6 6,AA6 E<,46 A,5E
E6 6,9<5 86,;8 4,<;
A6 E,6A6 8A,85 4,;;
46 E,6;6 88,;< 8,6E
86 E,EA6 8<,>6 8,65
<6 E,E>6 85,A6 8,EE
56 E,E56 85,86 8,A6
;6 E,E>6 8;,56 8,AA
>6 E,E>6 85,66 8,6<
96 6,<89 45,96 A,6<
E66 6,E9> EE,A6 E,AE
Caport de etracie E+E6
6 6,EA6 E>,68 E,69
E6 6,<<; A<,68 E,9E
A6 6,5E8 4E,>< A,A4
46 6,56< 44,<> A,<5
86 6,5A4 45,>E A,<>
<6 6,544 45,8> A,5>
56 6,5<6 45,46 A,54
;6 6,5>< 4<,>E A,;<
>6 6,;E6 4<,59 A,5E
96 6,;EA AA,>> E,;<
E66 6,E56 EA,E9 E,4<
!.".".$. %u&la macerare
$tilizarea cloroformului pentru etracia carotenilor este ilustrat de
randamentele obinute (6,6>8< gF la prima macerare i 6,656; gF la o doua
macerare!. Poate fi evideniat propilenglicolul, care etrage at)t carotenii, c)t i
flavonele, dar cu randament mai mic dec)t ceilali solveni.
Prin reunirea maceratelor alcoolice, cu cele de ulei de floarea soarelui
i respectiv, maceratelor cloroformice cu maceratul n propilenglicol, urmat de
ndeprtarea solvenilor volatili din amestecurile nemacerate, rezult soluii
etractive bogate n principii activi cu caracter hidrofil i lipofil. *ceast metod
realizeaz preparate etractive mbogite n ambele fraciuni. @A4@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
45
5.1.2. 6ur$oe4tracia
Ca durat optim a etraciei cu :t2I 95F s-a gsit E6 minute (0abel 4!
6a$elul 3
Ti-( e.tract E 2 P&ct %e e.trac+ie
< 6,4;8 6,4A>
E6 6,8A4 6,4;E
E< 6,8A4 6,4;E
A6 6,8A8 6,4;A
7ici n :t2I apos nu s-a nregistrat o umflare puternic a materialului
mrunit ca la macerat, ns totui prezent. 'in reziduul etraciei aproape c nu
s-a putut recupera prin presare solvent nc)t este suficient o cltire a florilor
mrunite. Culoarea etractelor a virat de la galben-deschis p)n la galben intens.
/a :t2I E6F, etractul apos galben deschis a fost tulbure i nu s-a putut filtra.
2ptimul randament n flavonoide s-a obinut cu :t2I <6-56F vol. Vi coincide cu
randamentul de :, a crui maim este la :t2I 86-;6F vol. Cantitatea cea mai
mare n etract uscat s-a atins la 86 vol. 7ici n acest caz nu eist un paralelism
ntre coninutul optim de substan activ, intensitate de culoare i coninut de
etract uscat (0abel 8!.
6a$elul 4
EtO; 2 )o# 7 8 0#a)ooi%e -$2 Co+i&t&# e.tract&#&i 2
6 6,E; E8,86 6,9>
E6 6,5; AA,46 A,66
A6 6,96 44,86 4,;A
46 E,E4 8E,6> <,6;
86 E,E4 8>,A5 8,;E
<6 E,E8 <4,46 <,46
56 E,E> <6,;< 8,59
;6 E,E> 88,6A 4,9>
>6 6,99 45,66 4,AA
96 6,>E A5,46 A,AE
E66 6,8< E;,56 E,<;

5.1.3. 1ercolarea
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
46
Prepararea percolatelor s-a fcut dup o modificare a prescripiei
clasice, deoarece aceasta nu este economic pentru o producie de mare tona&. .-a
urmrit reproducerea condiiilor industriale la scar mic.
Ceferitor la culoare i intensitate, percolatele s-au comportat ca i
maceratele i turboetractele. 'eosebit de mare este coninutul de escin n
percolatul apos, care cu valoarea de 6,;>F reprezint aproimativ <AF din
randamentul maim. Cea mai bun etracie de escin s-a obinut cu :t2I <6-
;6F vol, :t2I 95F a dat randamentul cel mai slab. $n rezultat surprinztor s-a
obinut, referitor la randamentul n flavonoide, pentru care a rezultat un maim
de etracie apoas. .imilar pentru coninutul de etract uscat (0abel <!.
6a$elul 5
EtO; 2 )o# E 2 0#a)ooi%e -$2 Co+i&t&# 3 e.tract 2
6 6,;> <8,6E <,>>
E6 6,9A <4,68 <,;4
A6 E,65 <8,A6 <,54
46 E,A6 <E,8A <,<A
86 E,4> <6,>6 <,86
<6 E,<E <6,A6 <,A5
56 E,<E 8;,46 <,E<
;6 E,<E 86,6A 8,9A
>6 E,86 46,6E 8,56
96 6,>6 A6,8> A,;8
E66 6,88 E<,88 E,45
5.1.4. 9nterpretarea rezultatelor
Candamentul cel mai bun n escin (0abel 5! s-a obinut cu :t2I <6-
;6F vol. -aloarea de E4A,<6 Rg@g se datoreaz ncercrilor analitice la care
escina s-a izolat material cu :t2I 95F. Pentru date mai eacte n privina
coninutului de escin, trebuie etrase cu :t2I ;6F vol., n loc de 96F vol.
Pentru flavonoide se nregistreaz o cretere a randamentului n funcie
de solventul utilizat. 7u s-au nregistrat valori peste E66F.
6a$elul 6
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
47
Meto%a Esci! <$=$
%acerare cu %e2I E+< 86-56 86-56
%acerare cu :t2I E+< <6->6 E64,<6 ;6,66 ><,66
0urboetracie cu :t2I E+< <6-;6 E64,<6 <6-<< 9>,;
Percolare cu :t2I E+< <6-;6 E4A,<6 6-<< 95,86
Pe baza raportului de etracie este neaprat necesar o umflare a
produsului pentru o etracie ehaustiv a escinei. 'ac este suficient escina
trece foarte repede n soluie i de eemplu n cazurile percolrii se gsesc
aproape integral n primele pri de percolat similar i flavonoidele. .olubilitatea
mei bun n medii apoase s-a recunoscut optic prin intensificarea culorii brun-
rocate a etractelor. Percolarea este metoda cea mai adecvat pentru escin.
Pentru flavonoide este n egal msur at)t percolarea c)t i turboetracia.
7.2. I%eti1icarea ,i %eter-iarea co-(oete#or
5.2.1. )omple4ul saponinic
Bdentificarea : (escin!, respectiv a compleului saponinic, s-a efectuat
prin C..... pe silicagel Co. 'eoarece n literatur nu prea eist referiri la
solubilitatea escinei :, sau ele sunt contradictorii, s-a stabilit solubilitatea : n
c)iva solveni (0abel ;!.
6a$elul
/o#)et E 2 =#it= =re$=
:t2:t (n vol 6,66;5
CICl
4
(n vol. 6,66;;
I
A
2 6,66;-6,6E 6,6A<6
:t2I $or solubil AE,;66
%e2I $or solubil A<,>>6
(n elaborarea unei metode adecvate de determinare a : n etracte
escinice sau preparate, i a verificrii coninutului de : a florilor de Calendula de
diferite proveniene, s-au verificat metoda escinic dup Comich i determinarea
fotometric dup .chlemmer. 'eterminrile dup prima metod au dat cu escina
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
48
pur (lu)nd n considerare coninutul de ap al substanei! date insuficient
reproductibile pentru o determinare eact.
%ar&a de eroare apreciat la S<F este de fapt mai mare i atins numai
de un operator rutinat. (n rare cazuri s- a regsit cantitatea de escin introdus.
'eosebit de dificil s-a dovedit aducerea la sec a probelor datorit fierberii
eplozive, ncercarea se compromite. :vaporarea a dus la un consum mare de
timp apropiat mai avanta&os. .-a regsit substana luat n lucru E66F. -alorile
au fost ntre 9; i E68F. /a reproducerea metodei s-a gsit ca o splare ulterioar
a reziduului de la evaporarea etractelor cu eter, n scopul ndeprtrii sterinelor
sau grsimilor coantrenate n ciuda recomandrilor autorului, duc la pierderi de
escin i la variaii de reproductibilitate a rezultatelor.
Cu toate c escina deine aceeai solubilitate n :t2I ca n CICl
4
aceasta din urm influeneaz reproductibilitatea n mod favorabil. $nul din
motive este faptul c CICl
4
fa de :t2I, solubilizeaz complet grsimile. 2
prelucrare a fraciunilor de splare eteric a dus n toate cazurile la regsirea
diferenei de p)n la E66F.
(n determinarea coninutului de escin n florile de Calendula etractul
s-a fcut dup metoda %elJitschu?. %runirea n moara cu ciocane (Pironette! a
dus ns la rezultate reproductibile.
5.2.2. Flavonoidele
Pentru determinarea coninutului de flavoniode n etractele de semine
s-a aplicat metoda dup Iorc?mmer. :a reprezint premizele unei investigaii de
rutin i este aplicabil n cazul florilor de Calendula . soluii cu un coninut
diferit de cvercetin au fost determinate dup aceast metod, iar valorile au fost
citite pe o curb de etalonare a unei soluii standard de cvercetin. (n toate
cazurile s-a regsit cantitatea de cvercetin introdus. /a izolarea flavonoidelor
din florile de Calendula s-a gsit cea mia avanta&oas metod de fierbere, cu
%e2I (0abel >!.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
49
6a$elul %
/&rsa E 2 0#a)ooi%e 2
$...*.H. >,;5 6,A;
H$PB*V 8,A< 6,AE
'2%*.7:* >,85 6,A;
%2V7BW* >,6; 6,A5
H2CV* 5,AE 6,A4
H:CP2-B* 5,E; 6,A8
3BHBV <,>A 6,AE
3X=:0 <,A6 6,E>
/$=2L 5,6E 6,E9
.*C$ <,84 6,AE
B*H/*7BW* 8,54 6,E;
(n completarea tabelului >, se va lua n considerare urmtorul tabel
adiacent+
Meto%a %e i*o#are 0#a)ooi%e 526
:tracie cu .ohlet (E6 ore! 6,A4>-6,A8<
3ierbere cu :t2I 6,AA6-6,AE<
3ierbere cu %e2I 6,AE;-6,A;5
7e-a suscitat interesul dac, coninutul de escin, respectiv flavonoide
prezint pe l)ng variaii sezoniere i variaii teritoriale. (n acest scop s-au ales
flori de Calendula n diferite zone ale Hanatului, dup mrunire, uscare i
mcinare, rezult clar c influenarea coninutului nu este geografic, ci de mediu
ambiant.
5.2.3. )arotenoidele
:liza =afiteanu, Boana %atei, Buliana Popovici i 'orina /azr, n
cercetrile efectuate asupra florilor de Calendula au urmrit realizarea unor
soluii etractive bogate n principii active, n condiii de etracie avanta&oase.
Coninutul n flavone i caroteni la etracia selectiv i succesiv a
produsului "Calendula flos# cu diferii solveni, ncep)nd cu cel mai lipofil, a fost
urmtorul (0abel 9!+
6a$elul '
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
50
/o#)et Ra(ort
%ro$=so#)et
Meto%e
%e
e.trac+ie
D&rata
%e
e.trac+ie
Co+i&t 3 $2 3>
3lavonoide
(n rutozid!
Caroteni (beta
caroteni!
:ter de
petrol
E66@D.s. :tracie
n
.ohlet
P)n la
epuizare
- 6,E68;
cloroform E66@D.s. :tracie
n
.ohlet
P)n la
epuizare
- 6,6E59
*lcool E66@E66 refluare - 6,4< -
(n scopul realizrii unor randamente superioare s-a ales raportul
drog@solvent de <@E66 i au fost respectate condiiile prevzute la "macerarea
repetat#. Pe baza rezultatelor obinute n prima serie de etracie s-a ales ca
solvent cloroformul i alcoolul, urm)nd ca n faza viitoare, acelai produs vegetal
s fie etras prin macerare simpl cu propilenglicol i respectiv cu ulei de floarea
soarelui.
Coninutul n flavone i caroteni obinut la etracia prin macerarea
produsului "Calendula flos# a fost cel redat n tabelul E6.
6a$elul 1:
/o#)et Ra(ort
%ro$=so#)et
Co+i&t&# 3 $2 3>
0#a)oe 53
r&to*i%6
Carotei 53 beta
carotei6
*lcool E6@E66 6,A9E5 -
alcool E6@E66 6,A<54 -
Cloroform E6@E66 - 6,6>8<
Cloroform E6@E66 - 6,656;
$lei de floarea
soarelui
E6@E66 - 6,6A69
Propilenglicol E6@E66 6,6A6;E 6,6454
.e constat c randamentul n flavone este asemntor la cele A soluii
alcoolice, de unde rezult utilitatea macerrii dubl i capacitate mare de
etracie a alcoolului (6,A95E gF, 6,A<54 gF fa de 6,6A6;E gF c)t etrage
propilenglicolul!. @A4@
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
51
/a etracia produsului "Calendula flos# prin digestie, coninutul n
flavone i caroten este cel redat n tabelul EE.
6a$elul 11
/o#)et Ra(ort
%ro$=so#)et
Co+i&t&# 3 $2 3>
0#a)oe 53
r&to*i%6
Carotei 53 beta
carotei6
Propilenglicol E6@E66 6,6E<6 6,6864
Propilenglicol i
alcool benzilic
E6@E66 6,6E98 6,68;A
$lei de floarea
soarelui
E6@E66 - 6,6EE5
$lei de floarea
soarelui
E6@E66 - 6,6EA8
Parafin lichid i
alcool benzilic EF
E6@E66 - 6,6E6>
*dausul de alcool benzilic la propilenglicol i ulei de floarea soarelui
este n favoarea conservrii i mrete randamentul de etracie pentru flavone i
pentru caroten.
$leiul de parafin utilizat ntr-o singur variant de etracie cu alcool
benzilic, realizeaz un coninut sczut de caroteni (6,6E6> gF!. (n cazul
digestiilor cu propilenglicol se observ o cretere a coninutului n caroteni
(6,68;A gF!, fa de procedeul prin macerare (6,6454 gF!, dar nu i a
coninutului n flavone (6,6A6;E gF! la macerat i 6,6E98 gF la digestie!.
5.2.4. Acidul ascor$ic
.oluia apoas a acizilor carboilici s-a tratat cu eces de ap. (n urma
filtrrii a avut loc identificarea prin C.I. ascendent. .-a putut pune n eviden
acid ascorbic n comparaie cu etalonul.
5.2.5. /etionina
Punerea n eviden a aminoacizilor n "soluia mam# s-a fcut cu
ninhidrin 6,4F. .-a obinut o coloraie slab purpurie. Cecunoaterea metioninei
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
52
dup separarea flavonoiodelor s-a fcut cu soluie pentacianonitrosil ferat (BBB! de
sodiu EF printr-o coloraie n rou.
7.2.8. Co#ia
.-a izolat din etractul pur i s-a identificat ca picrat (p.t. A4;-A49
o
C!.
5.2.. Aneurin2;)l
Bdentificarea s-a fcut dup separarea colinei cu soluie proaspt de
M
A
@3e(C7!
5
@ prin formarea unei fluorescene albastru-violet care a reaprut la
adugarea a dou picturi M2I En.
5.2.%. Aminopurinele
(n ultraviolet s-au pus n eviden 8 compui care s-au dovedit a fi
adenina, adenozina, guanina i acidul uric. *cidul uric s-a recunoscut printr-o
pat albastr.
5.2.'. )enu#a
Ceziduul la calcinare a fost n mediu de AF i s-a dizolvat complet n
ICl concentrat. 'eterminrile spectrofotometrice au indicat ca elemente
principale+ %=, Ca, M i 7a i ca auiliari C (fosfai!, Cu i %n. Ca anioni s-au
identificat cloruri, sulfai i fosfai.
5.2.1:. )aracterizarea proteinelor din 0lorile de )alendula
Prin cercetarea electroforetic a proteinelor din florile de glbenele am
urmrit separarea unui numr c)t mai mare de componente i am cutat s
determin numrul de fraciuni proteice care se gsesc ca atare ntr-o stare
nedenaturat n ele. (n acest scop am efectuat cercetri comparative ntre
fraciunile proteice obinute din proteinele totale, prin electroforez i fraciunile
#clasice# proteice obinute prin separri chimice (albumina i globulina!.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
53
Proteinele totale au fost obinute prin transformarea tamponului utilizat n analiza
electroforetic, n agent etractant. (n acest fel proteinele nu trebuie s fie
purificate dec)t prin dializ, astfel c se pot studia electroforetic, ntr-o stare
fizic mai apropiat de cea nativ. 0amponul care permite o separare
electroforetic bun fiind n acelai timp un etractant potrivit, este tamponul
acetat-medinal cu pIK >,A u putere ionic 6,E<.
Ceproductibilitatea etraciilor s-a realizat prin asigurarea unei
omogeniti constante a florilor de glbenele de-a lungul tuturor eperienelor
prin pstrarea constant a raportului de etracie, a temperaturii i a duratei de
etracie. (n acest fel s-a pstrat o concentraie proteic asemntoare (ntre E,E-
E,8F! pentru fiecare eperien, proteinele etrase reprezent)nd mai mult de ;6F
din totalul eistent, ceea ce a permis s considerm c proteina din etract este
reprezent5ativ pentru ntreaga floare.
*naliza electroforetic a evideniat 4 fraciuni proteice. Prin precipitare
fracionat cu (7I
8
!
A
.2
8
s-a determinat c fraciunea cu mobilitate
electroforetic maim este albumina iar celelalte dou fraciuni sunt globulinice.
Confirmarea acestor rezultate s-a fcut prin precipitarea proteinelor
totale cu a&utorul dializei, n cele dou componente "clasice#, albumina i
globulina. Prin electroforez, albumina s-a artat omogen iar globulina s-a
separat n dou fraciuni notate cu #E# i "A#.
Procentul relativ i mobilitile acestor componeni n diferite condiii
ale electroforezei sunt redate n tabelul EA.
6a$elul 12
Co%i+ii#e e#ectro1ore*ei A#b&-ia G#ob&#ia ?1@ G#ob&#ia ?2@
(; (.i. T M 2 M 2 M 2
5,> 6,E< E9 - EA,< - <6,6 - 4>,6
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
54
5,> 6,A6 E9 - E8,; - 5E,4 - A8,6
>,A 6,E< E> -;,9 E;,6 -;,4 8<,6 -6,; 4>,6
>,A 6,E< - - AE,> - 44,5 - 88,5
>,9 6,E< E; - EE,< - 84,6 - 8<,<
Prin aceste eperiene reiese c globulinele sunt formate din A fraciuni
care se gsesc bine individualizate n proteinele totale ale florii. Pentru
confirmarea acestor rezultate am recurs la izolarea globulinelor i cercetarea lor
electroforetic separat. (n aceste condiii a pI K <,> i 5,> globulinele s-au
separat n 4 componeni.
Pentru a stabili dac eist A sau 4 componeni globulinici independeni
mi-am propus s fracionez globulinele prin metoda desalifierii prin dializ.
Proteina s-a etras n 7aCi 6,<% i etractul purificat s-a dializat n curent
continuu de lichid, cu agitare mecanic, fa de o soluie de 7aCl de molaritate
mai mic dec)t cea ntrebuinat la etracie. .cz)nd cu 6,< uniti de molaritate,
concentraia dializantului s-a obinut 4 globuline notate cu *, H, C, precipitate la
o concentraie de 7aCl de 6,E< i 6,6< i prin dializ fa de apa distilat. .e pare
deci c n florile de glbenele eist 4 globuline distincte care sunt separabile at)t
pe baza solubilitii lor tipice, c)t i pe baza diferenelor care eist ntre valoarea
potenialului lor electroforetic. Comportarea electroforetic a celor 4 fraciuni
globulinice separate prin desalifiere a fost urmrit n diferite condiii
eperimentale. Cezultatele obinute sunt redate n tabelul E4.
6a$elul 13
Co%i+ii#e e#ectro1ore*ei G#ob&#ia 0rac+.
G#ob.
M 2 Obs.
Ta-(o (; (.i.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
55
*moniu 9,A 6,6;< * *
E
*
A
-E4,6
-E,6
5;,4
4A,;
*cetat 4,> 6,E66 * *
E
*
A
-E<,6
-4,9
5>,>
4E,A
*moniu 9,A 6,6;< * *
E
*
A
-
-
;6,6
46,6
Pe h)rtie
amoniu 9,A 6,6;< H H
E
H
A
-E6,6
-6,5
;;,<
AA,<
*cetat-
medinal
5,9 6,E<6 H H
E
H
A
-;,5
-4,>
;<,;
A8,4
*cetat 4,> 6,E66 H H
E
H
A
-E;,6
-8,>
<>,9
8E,E
*cetat 4,> 6,E66 H H
E
H
A
-
-
56,>
49,A
Pe h)rtie
*cetat- 5,9 6,E<6 C C -;,; E66,6
0emperatura la toate determinrile a fost de E>
o
C.
'ei rezultatele analizei electroforetice arat c globulina * i H sunt
proteine independente, am considerat c cele 4 globuline reprezint componente
independente eistente fraciunile electroforetice ale globulinelor * i H nu pot fi
afectate deoarece ele nu au fost prelucrate cu solveni organici care pot produce
modificri n structura lor. Pentru a arta c aceste 4 globuline sunt componente
dine definite, deosebite una de cealalt am recurs la analiza lor cromatografic i
polarografic. Cromatografia unidimensional, descendent a aminoacizilor
provenii prin hidroliza acid a acestor 4 globuline a artat c ele posed
urmtorii aminoacizi comuni+ acid aspartic, glicocol, histidin, serin, valin,
plus metionina i leucina plus izoleucina.
(n afara acestora, fiecare globulin posed aminoacizii specifici+
-globulina *+ acid glutamic, alanin, prolin.
-globulina H+ alanin, cistin T cistein, fenilalanin.
-globulina C+ acid glutamic, arginin, fenialanin.
'eterminrile polarografice s-au efectuat ntr-o soluie test Hrdic?e cu
cobalt trivalent. .emnalul treapt proteic are o nlime i un aspect diferit
pentru cele trei globuline la aceiai concentraie de 4,5 E6
-4
gF (tabelul E8!
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
56
6a$elul 14. <nlimea treptei proteice la cel e3 -lo$uline #i la al$umine
Proteie A!#+i-ea tre(tei 5--6
=lobulina * EE
=lobulina H 8
=lobulina C E4
*lbumina 8A
.e observ c treapta albuminei este de 4-8 ori mai mare dec)t cea a
globulinelor. Ieterogenitatea albuminei a fost cercetat electroforetic dup
ndeprtarea urmelor de globuline din preparatele pure de albumin. Cezultatele
obinute sunt reproduse n tabelul E<.
6a$elul 15
Co%i+ii#e e#ectro1ore*ei 0rac+i&ea ?1@ 0rac+i&ea ?2@ Obs.
Ta-(o (; (.i. M 2 M 2
*moniu 9,A 6,6;< -9,< A<,6 -E,5 ;<
*cetat 4,> 6,6<6 -5,E 4A,6 -E,8 5>,6
*moniu 9,A 6,6;< - 4>,6 - ;A,6 Pe h)rtie
0emperatura la toate determinrile a fost de E;
o
C.
Cercetarea electroforetic a artat c albumina din florile de Calendula,
la fel ca albuminele celorlalte leguminoase este o protein heterogen compus
din mai muli componeni. 7u putem afirma cu precizie c albumina posed
numai doi componeni, deoarece na-m putut cerceta heterogenitatea ei dec)t la
dou Ph-uri etreme. /a Ph-urile intermediare albumina nu se reia n concentraie
satisfctoare pentru a putea fi analizat electroforetic. Punctul izoelectric al
albuminei a fost msurat prin determinarea pI-ului la care variaz v)scozitatea
soluiei apoase de albumin prezint un minim i s-a gsit c este cuprins ntre
8,;-8,>.
7econcordana dintre numrul de fraciuni obinute prin analiz
electroforetic a proteinelor totale i cel obinut prin analiza electroforetic
separat a albuminelor i a globulinelor se poate eplica prin capacitatea redus
de separare a aparatului de electroforez de care dispunem. Prin tehnica pe h)rtie,
proteinele totale dei se separ n trei fraciuni curbele electroforetice au o
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
57
asimetrie evident care ne-a sugerat c proteina total a fost dovedit prin
ndeprtarea unei cantiti de globulin din etract prin dializ. Pe msur ce
cantitatea de globulin ndeprtat crete, analiza electroforetic pune n eviden
un numr mai mare de fraciuni. 'up E6 ore de dializ s-au evideniat < fraciuni
proteice dintre care A cu mobilitate mai mare sunt componente albuminice, iar
celelalte 4 cu mobilitate apropiat sunt probabil globulinele *, H, C. rezultatele
acestor determinri au ntrit convingerea c n florile de Calendula eist 4
componeni globulinici i cel puin A componeni albuminici.
7.'. Acerc!ri c& %e(o*itare
Cu probele culese am fcut ncercri de depozitare timp de peste E6
luni. Probele au fost mprite n 4 categorii+ o parte n stare normal, o parte
mrunit i uscat la temperatura camerei, iar a treia parte uscat la 86
o
C (dup
mrunire! i apoi mcinate n moara cu ciocnele.
(n urma eperienelor efectuate s-a constatat c coninutul de escin i
flavonoide scade n cazul probelor macerate datorit unor reacii fermentative. /a
a doua categorie scderea ambelor valori cu toate c este mai mult sau mai puin
semnificativ, este n ansamblu minor. /a ultima categorie, ns, nu s-a pus n
eviden o scdere a coninutului. (n concluzie, florile mrunite, uscate bine la
aer liber pot fi ntrebuinate fr pierderi timp de un an.
CAPITOLUL :I. PARTE EBPERIMENTAL
8.1. Meto%e %e e.trac+ie
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
58
6.1.1. 74tracia selectiv #i succesiv
Produsul vegetal prelucrat prin etracie este utilizat pentru obinerea
unor termoplaste i face obiectul a numeroase studii. .-a urmrit realizarea unor
soluii etractive bogate n principii activi, n condiii de etracie avanta&oas.
(n eperienele efectuate de :liza =afieanu, Boana %atei i 'orina
/azr, acestea au ales solvenii de etracie selectivi pentru fracia hidrofila
(flavone, glicozidele acidului oleanolic, calendulozidele, *-I, alcoolii terpenici+
arnidiol i furnadiol! i cea lipofil (caroten, ulei volatil, esteri ai colesterolului
cu acizii grai!. .olvenii utilizai au fost+ alcoolii, propilen glicolul, cloroformul,
eterul de petrol, uleiul de floarea soarelui i parafina lichid.
Procesul prim aplicat se bazeaz pe principiul etraciei selective i
succesive cu diferii solveni, ncep)nd cu cel mai lipofil. *cest procedeu se
realizeaz la cald i permite o separare a principiilor activi din produsul supus
etraciei, n funcie de caracterul lipofil sau hidrofil al acestora. Pentru etracie
s-a folosit eter de petrol, cloroform i alcool. :puizarea produsului vegetal cu eter
de petrol i apoi cu cloroform s-a realizat cu a&utorul aparatului .ohlet.
Pentru etracia cu alcool s-a recurs la refluare, din cauza punctului de
fierbere ridicat al soluiei etractive alcoolice fa de soluia cloroformic i eter-
petrolic. Capacitatea de etracie al solvenilor a fost apreciat prin determinarea
cantitativ a carotenilor etrai n eter de petrol i cloroform, i a flavonelor
etrase n alcool. Procedeul de etracie este prezentat n figura E.
6.1.2. /acerarea
%acerarea este unul din procedeele aplicate pe scar larg pentru
obinerea etractului cu utilizare n dermopreparate, operaia de etracie
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
59
realiz)ndu-se la temperatura camerei, ceea ce mena&eaz principiile active.
Procedeul de macerare este redat n figura A.
0i$&ra 1.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
60
Calendulae flos
:tracie selectiv i succesiv cu diferii solveni, ncep)nd cu cel
mai lipofil
:tracie cu eter de petrol la .ohlet
3 i l t r a r e
.oluie etractiv Ceziduu vegetal
eter petrolic
:tracie cu cloroform la .ohlet
.oluie etractiv Ceziduu vegetal
cloroformic
:tracie cu alcool prin refluare
'ecantare i filtrare
.oluie etractiv alcoolic
Sc3ema de e4tracie selectiv #i succesiv a produsului =)alendulae
0los> cu di0erii solveni" ncep5nd caz cel mai lipo0il.
0i$&ra 2.
Calendulae flos
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
61
:tracie prin dubla macerare cu+
*lcool etilic Cloroform
'ecantare i filtrare
.oluii etractive .oluii etractive
alcoolice cloroformice
*
E
*
A
C
E
C
A
Ceziduu vegetal Ceziduu vegetal
:tracie prin macerare cu+
$lei de floarea soarelui Propilenglicol
'ecantare i filtrare
.oluie etractiv .oluie etractiv
uleioas propilenglicolic
Sc3ema de e4tracie a produsului =)alendulae 0los> prin macerare
6.1.3. ?i-estia
* stat la baza altor serii de etracii i s-a desfurat conform schemei
din figura 4.
0i$&ra '.
Calendulae flos
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
62
'igestie la 56
o
C O 5 ore cu+
propilenglicol propilenglicol ulei de ulei de parafin
Talc. benzilic EF floarea floarea lichidT
soarelui soarelui alcool
Talc.benzilicEF benzilicEF
@P@ @P
*
@ @$@ @$
*
@ @P
/*
@
'ecantarea i presarea reziduului, filtrare
@P@ @P
*
@ @$@ @$
*
@ @P
/*
@
8.2. I%eti1icarea ,i %eter-iarea co-(oete#or
6.2.1. /etode de recunoa#tere #i determinarea saponinelor
/a agitarea unei soluii de : se formeaz spuma intens (efect general
saponinic!. Pentru identificare este nevoie de compararea valorilor C
3
obinute
prin C.I. sau C..... cu etaloane.
Pentru recunoaterea aciunii hemolitice se pun cromatogramele
developate ntre plci de gelatin sanguin, sau se stropesc cu un amestec de o
parte s)nge defibrinat sau citrat sanguin i > pri soluie fiziologic de 7aCl.
.ensibilitatea este n domeniul 86 ug@pat.
/a stropirea C..... cu I
A
.2
8
<6F i uscare ulterioar, : de la lumina
zilei o coloraie brun-rocat i n ultraviolet o fluorescen galben, care dup un
timp trece n albastru. /a concentraii mari : prezint o fluorescen roie-
portocalie. Pentru determinarea indicelui hemolitic sunt de respectat eact
condiiile de ncercare pentru reproductibilitatea rezultatelor. :ste de remarcat, c
s-au observat proprieti hemolitice diferite pentru saponina escinica nativa i :
pur izolat.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
63
2 metod gravimetric dup Comisch se fundamenteaz pe trecerea
etractelor escinice n alcaliescinoli hidrosolubili. Prin adaos de ICl diluat se
obine pp. escinolul hidrosolubil care se determin gravimetric sau alcalimetric.
Coninutul etractelor cercetate se raporteaz la :.
(n determinarea fotometric dup 2verlach, : reacioneaz cu o soluie
p-dimetilaminobenzaldehid+ acid acetic+ acid sulfuric. .e formeaz o soluie
violet, a crei etincie se msoar la <;6 nm. /a identificarea fotometric dup
.chlemmer se reiau etractele de semine cu 6,E m ICl i se etrag cu
Pn-2I @ CICl
4
. 'up concentrare se reia amestecul saponinic cu acid acetic
glacial. 3ormarea compleului colorat se obine cu reactivul 3eCl
4
Y I
A
.2
8
. (n
locul acestui reactiv Pasich folosete clorura de cobalt. (nainte de determinarea
colorimetric se face o separare prin C..... a saponinei pe plci de silicagel.
6.2.2. /etode de recunoa#tere #i determinare a 0lavonoidelor
la tratarea etractelor escinice cu Pn i %g n soluie de ICl, soluia
iniial galben se coloreaz n rou. .e formeaz prin reducere i cu ruperea unui
rest zaharic anticianidin - clorurile respectiv derivaii de chemferolclorura de
pelargonidin, iar din derivaii cvrcetinei, clorura de cianidin.
'up Mussner aceast reacie se poate aplica n determinri
colorimetrice. 3lavonele dau cu sruri incolore de aluminiu, plumb, cadmiu,
cupru, fier, bor, stibiu i bismut n urma butocromiei, combinaii puternic colorate
n galben (glicozida chempferolic! sau n portocaliu (glicozida cvercetinic!.
*ceste proprieti se utilizeaz frecvent la recunoaterea cromatografic i la
determinri colorimetrice cantitative.
'eterminarea cantitativ dup 2verlach se face cu 3lavognost
C
, un
comple aminoetilester al acidului difenil boric. .e preteaz pentru determinarea
coninutului etractelor de flori de glbenele deoarece coninutul de flavonoide se
poate raporta direct la cvercetina. 2 substan de referin pentru etractele de
semine nu se cunoate la aceast metod. 2verlach a considerat ne&ust alegerea
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
64
unei flavonoide la nt)mplare, ca referin, dac proprietile ei de absorbie a
luminii dup efectuarea reaciei de culoare, nu au coincis cu cele a etractelor
escinice sau dac lipsesc date eacte referitoare la flavonoidele de determinat.
'eoarece etractele de semine cercetate de autor au dat n condiiile reaciei
descrise un maim de absorbie la aceeai lungime de und, pare acum dup
cunoaterea ma&oritii flavonoidelor din semine, ntemeiata raportare la
cvercetin.
/a determinarea colorimetric dup Comisch cu *lCl
4
n tampon
CI
4
C22I i gl.@P1. se calculeaz coninutul de flavonoide ca echivalent de
rutin. %etoda se preteaz la determinarea substanei pure i a etractelor,
deoarece se msoar numai intensificarea culorii prin formarea compleului de
*l i soluia de compensare este aceeai soluie tampon flavolonic ca cea de
msurat, ns fr adaos de sare de Cl. 'ificultatea apare la determinarea
etractelor de semine neco&ite deoarece pigmentul co&ii chiar i n diluia
aferent determinrii intensific culoarea, duc)nd la dificultatea recunoaterii
etinciei. 'e fapt, nici nu este ntocmit raportarea la echivalent de rutin
deoarece nu este prezent rutin n semine.
'eterminarea colorimetric dup Iorhammer a fost propus pentru
determinarea coninutului etractelor escinice pentru noua carte de homeopatie a
medicamentelor n =ermania.
'up hidroliza flavonelor, care conin drept aglicol comun cvercetina,
urmeaz colorarea cu o soluie <F Pr2Cl
A
i msurarea etinciei la 84< nm.
Coninutul de flavonol se citete de pe o curb de etalonare ridicat n aceleai
condiii cu cvercetina pur. 'eoarece etractul hidrolizat conine pe langa
cvercetina, cantitate apropiat de chempferol, pare problematic obinerea unui
etalon adevrat. 'e aceea se pot numai compara coninuturile flavonoidice ale
fiecrui etract ntre ele.
2 metod biologic o constituie testul Petechien dup .uschaJec? n
forma modificat de auster. Pe buri epilate de obolani se determin valoarea
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
65
.og-ului la care &umtate din c)mpurile eaminate reacioneaz n Petechien. .e
aplic animalului soluia de determinat. 'up A8 h, zonele din imediata
vecintate din c)mpurile investigate trebuie s reziste la o solicitare .og cu c.p.
46F. 2 alt cale modificat care efectueaz testul pe partea dorsal epilat a
obolanilor de ambele pri ale coloanei vertebrale. Vobolanii se in n prealabil
A-4 sptm)ni la un regim scorbutigen.
6.2.3. /etode de recunoa#tere #i determinare a alantoinei
Bdentificarea alantoinei s-a efectuat n infuzii <F preparate din produse
cu i fr receptacul, asupra crora s-a practicat reacia *dam?ieJicz-Iop?ins-
Colle. Cezultatele intens pozitive au condus la separarea i identificarea
cromatografic prin procedeul 01ihac modificat, folosind h)rtie Ghatmann A i o
soluie etractiv purificat (< g produs vegetal n A6 ml etanol!. 'eveloparea s-a
efectuat cu n-butanol-acid acetic-ap, 8+A+A v@v (parcurs util K >-E6 cm!, iar
relevarea s-a fcut cu o soluie EF p-dimetil-aminobenzaldehid n ICl soluie A
n, urmat de meninerea cromatogramei uscate la <6
o
C n etuv timp de < minute.
(n aceste condiii din soluia de analizat s-au separat A spoturi ce s-au
colorat n galben, el cu C
f
K 6,>E, corespunz)nd alantoinei martor.
'in aceste motive s-a considerat oportun determinarea cantitativ a
acestei diureide din cele dou spoturi de produs vegetal, n scopul stabilirii celei
mai bune caliti.
.-a aplicat metoda Maczmarec i Galic?a, adaptat la colorimetrul
.pec?ol C. Peiss Lena, principiul metodei const)nd n colorimetrarea fenil-
hidrazonei acidului glicoilic rezultat din hidroliza succesiv a alantoinei. Pentru
stabilirea condiiilor de lucru s-a determinat mai nt)i dependena dintre
absorban i lungimea de und, preciz)nd minima de absorbie la 5<6 nm, iar
maima la <A6 nm, iar apoi dependena dintre concentraie i absorban cu
a&utorul unei soluii apoase 6,68 g F alantoin sintetic, din care s-au luat
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
66
cantitile nregistrate n tabel. *bsorbana corespunztoare acestora s-a
determinat la <A6 nm, n cuve de E cm grosime.
Nr.
crt.
Nr. ser eta#o -$. a#atoi! = -# so#. Absorbata
E 6,A<6 6,668 6,A><
A 6,<66 6,66> 6,46<
4 6,;<6 6,6EA 6,446
8 E,666 6,6E5 6,44<
< E,A<6 6,6A6 6,496
5 E,<66 6,6A8 6,<;6
; A,666 6,64A 6,<<6
> 4,666 6,68> 6,8<<

6.2.4. /etode de separare #i identi0icare a su$stanelor tanante
.epararea i identificarea cromatografic a derivaiilor o-dihidroi-
fenolici (2.'.P.!,
.-a efectuat din soluiile etractive hidroalcoolice E6F n metanol de
<6
o
, din care s-a adus la start 6,E ml. Ca martor s-au folosit soluii alcoolice
6,6EF de acid cafeic i acid clorogenic, din care s-au luat 6,64 ml.
.-a practicat cromatografia pe h)rtie .chelicher .chull A686 b, n
sistem ascendent, folosind ca soluie ICl 6,E n. 'up developarea i uscarea
cromatogramelor s-au delimitat spoturile n uv, apoi s-au pulverizat cu soluie
alcoolic 4F de 3eCl
4
i cu reactiv *rnoJ. 'in analiza cromatogramelor
respective au atras atenia spoturile cu+ C
f
K 6,84 i 6,55 prezente mn ambele
soluii de analizat, ce se comport identic cu acidul cafeic i clorogenic, fa de
reactivul de relevare folosit. 'eterminarea cantitativ a 2.'.P.-urilor folosind
metoda fotocolorimetric a lui Lonson, care const n determinarea absorbanilor
derivailor diozoici ai polifenolilor, de culoare de rou-portocalie rezultai din
cuplarea acestora, cu reactivul *rnoJ (E g nitrat de sodiu, E g molipdat de sodiu
i ap la E6 ml!. (n acest scop s-au preparat soluii etractive hidroalcoolice <F
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
67
n metanol de <6
o
din produsul cu i fr receptacul, din care s-a luat c)te un ml
n baloane cotate de E6 ml, adug)ndu-se E ml soluie 6,< n ICl, E ml de reactiv
*rnoJ, E ml soluie soluie 7a2I i metanol n completare p)n la semn.
Bntensitatea coloraiilor obinute a fost msurat cu fotocolorimetrul .pec?ol la
<E6 nm, n paralel cu probe martor n care s-a nlocuit reactivul *rnoJ cu E ml
ap. Prin interpolarea absorbantelor n curba etalon, determinat anterior, s-a
calculat coninutul acestor derivai la 6,96-E,6 g F n sortul cu receptacul i
6,8<-6,<< F, n sortul fr receptacul. @A4@
8.'. Cotrib&+ii ori$ia#e

6.3.1. @$inerea e4tractelor
'.$.".". acerarea metanolic
.-au preparat macerate cu concentraii metanolice n raport decimal de
E+<.
'.$.".#. acerarea etanolic
*m abordat macerarea cu raport de etracie E+< p)n la E+E6, n
concentraii decadale de :t2I.
'.$.".$. (ur&oe)tracia
:tractele au fost obinute cu un aparat $ltrature
C
. .-a pus n vasul de
etracie o parte semine mrunite i 8 pri lichid de etracie. 'up < minute a
fost oprit aparatul deoarece temperatura a a&uns la 46
o
C. dup E< minute masa s-a
rcit suficient pentru a etrage din nou pentru < minute. :tractul s-a pstrat la
rece 4 zile, apoi s-a filtrat. Ca durata optim de etracie cu :t2I 95F s-a gsit
E6 minute.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
68
'.$.".*. Percolarea
Percolarea s-a fcut n vase cilindrice. Caportul drog + solvent a fost de
E+8. 'up umectarea n raport E+8 a materialului, masa, mai mult sau mai puin
umflat, s-a acoperit i s-a apsat cu un strat de perle de sticl. Cecipientul s-a
umplut ncet cu etractant evit)ndu-se pe c)t posibil formarea de bule mari de
aer. .-a lsat s se stea A8 h, apoi s-a percolat cu o vitez de curgere de <-;
picturi @ minut. C)nd stratul de etractant a fost de E-A cm, peste drog, s-a
umplut cu solvent proaspt, p)n la captarea a < picturi de percolat. :tractele
s-au pstrat 4 zile la rece apoi s-au filtrat.
6.3.2. 9denti0icarea componentelor
'.$.#.". +dentificarea comple)ului saponinic ,escina-
Bdentificarea escinei s-a fcut prin C..... pe silicagel Co, cu o soluie
de n Pr2I@:t2I@I
A
2 (8+4+4!. Pentru detecie s-a folosit A6F .bCl
4
n CICl
4
amb. sau <6 I
A
.2
8
. 'up stropirea cu reactivi, plcile s-au uscat E6 minute la
E6<
o
C. :scina s-a recunoscut printr-o culoare gri la lumina zilei, la stropire cu
.bCl
4
i printr-o fluorescen galben n uv la stropire cu <6F I
A
.2
8
.
'.$.#.#. +dentificarea flavonoidelor
3lavonoidele le-am pus n eviden prin eluare integral de pe coloan
cu %e2I de diferite concentraii i C..... pe silicagel =. %erc? (A ore activare
la E6<
o
C, sau uscare la aer!.
.-a elaborat n acest timp un sistem care permite o bun separare+ n
Pr2I@I
A
2@P:=@CI
4
C22:t (5,<+A,<+E+E6!. 'etecia s-a fcut cu soluie
(CI
4
C22!
A
Pb i reactiv 7:$ n uv filtrat.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
69
(n funcie de cantitatea aplicat s-au pus n eviden 9-A6 de
flavonoide. Pentru determinarea coninutului de flavonoide n etractele de
semine s-a aplicat metoda Iorh?mmer.
'.$.#.$. +dentificarea aminopurinelor
.-a fcut determinarea din eluatul coloanei supus de separare dup
Ginterfeld. 3racia purinic captat s-a C.I. pe h)rtie .chleicher and .chiel
A6684 cu sistem Hu2I@I
A
2@:t2I (<6+4<+E<!.
(n uv s-au pus n eviden 8 compui care s-au dovedit a fi adenina,
adenozina, guanina i acidul uric. Pentru identificarea acidului uric /.I. a fost
stropit la >6
o
C cu o soluie (n pri egale! de reactiv 3olin-'enis i 7a
A
C2
4
An
amestecate proaspt nainte de aplicare. .-a uscat cromatograma <-E6 minute la
>6
o
C. *cidul uric s-a recunoscut printr-o pat albastr.
'.$.#.*. +dentificarea acidului ascor&ic
.oluia apoas a acizilor carbonilici s-a tratat cu eces de ap.
.-au tratat srurile de bariu precipitate, s-au dizolvat n puin ap i
s-au tratat p)n la slab acid cu I
A
.2
8
. Bdentificarea s-a fcut C.I. ascendent pe
h)rtie .chleicher .chull A684 b cu nHu2I@CI
4
C22I gl.@I
A
2 (;+E+A!. Ca
detecie s-a folosit n pri egale *g72
4
. 6,E n i 7I
4
6,E n. .-a putut pune n
eviden acid ascorbic n comparaie cu etalonul.
'.$.#.!. +dentificarea metioninei
Punerea n eviden a aminoacizilor n soluia mam s-a fcut cu
soluie ninhidrin 4F. .-a obinut o coloraie slab purpurie. Cecunoaterea
metioninei dup separarea flavonoidelor s-a fcut cu soluie pentacianonitrosil
ferat (BBB! de 7a EF printr-o colorare n rou.
'.$.#.'. +dentificarea aneurin./Cl
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
70
Bdentificarea s-a fcut dup separarea colinei cu M
A
@3e (C7!
4
soluie
proaspt, prin formarea unei fluorescene albastr violet, care a reaprut la
adugarea de A picturi M2I E n.
'.$.#.0. +dentificarea colinei
.-a fcut din etractul pur i identificat ca picrat (pentru A4;-A49
o
C!.

CAPITOLUL :II. CONCLUZII 0INALE
(n urma studiului pe care l-am efectuat i a analizei de ansamblu a
rezultatelor nregistrate n cursul cercetrilor ntreprinse pentru realizarea unor
soluii etractive din florile de Calendula officinalis bogate n principii activi, se
desprind urmtoarele concluzii+
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
71
-s-a efectuat un studiu al condiiilor de etracie n care s-a inut seama
de compoziia chimic comple a produsului vegetal, natura solventului i
metodele de etracie,
-s-au utilizat solveni de etracie care s fie c)t mai selectivi i s nu
determine combinaii chimice cu componenii principiilor activi, s asigure
stabilitatea soluiei etractive n timp,
-eficiena solvenilor i a procedeelor de etracie aplicate au fost
apreciate cantitativ i calitativ prin determinarea coninutului n flavone,
eprimate n rutozid, i a coninutului de caroten, eprimai n Z-caroten,
-a fost verificat eficiena unor procedee de etracie (macerarea
metanolic, macerarea etanolic, turboetracia, percolarea! i eficiena
solvenilor, procedeul de etracie prin macerare dovedindu-se a fi cel mai
eficient.
BIBLIOGRA0IE
E. :-'2CIB* C2BCB$, =*HCB:/ C*CP O "Plantele medicinale i
aromatice#, :ditura *cademiei C.P.C., E95A.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
72
A. C27.0*70B7:.C$, =C., :/:7* I*WB:=*7$ H$C$B*7X O ".
ne cunoatem plantele medicinale, proprietile lor terapeutice i modul
lor de folosire#, :ditura %edical, E9>;.
4. "0ehnologii cadru ale plantelor medicinale i aromatice#, :ditura Ceres,
E994.
8. CCXCB$7, 3, H$L2C, 2., */:[*7, %. O "3armacia naturii#, :ditura
Ceres, E9;5.
<. %2C*7$, .0., CX'$C*7$, '. O "Plante medicinale-tezaur natural n
terapeutic#, :ditura %ilitar, E9>5.
5. H2':*, C. O "0ratat de biochimie vegetal#, :ditura *cademiei C.P.C.,
E958, -olumul B.
;. Chemical P.H./. O B, 49;A, E94;.
>. Chemical abstract, -olumul E64, nr.E<, E9><.
9. H2':*, C. O "0ratat de biochimie vegetal#, :ditura *cademiei C.P.C.,
E958, -olumul BB.
E6. 0*%*V, -., 7:*%W$, =. O "Pigmeni carotenoidici i metabolii#,
:ditura Ceres, E9>5.
EE. Chemical abstract, vol. E6E, nr.A8, E9>8.
EA. Chemical P.H./., E58E;, E9<9.
E4. Chemical P.H./., nr.<, A9;5, E95<.
E8. Chemical abstract, volum 8<, nr.9, E9<5.
E<. Chemical abstract, volum ;<, nr.E6, E9;E.
E5. Chemical abstract, volum E6E, nr.A8, E9>8.
E;. Chemical abstract, volum 59, nr.;, E95>.
E>. Chemical abstract, volum E6;, nr.EE, E9>>.
E9. Chemical abstract, volum 58, nr.E6, E955.
A6. Chemical abstract, volum 59, nr.AE, E95>.
AE. Chemical abstract, volum E64, nr.AE, E9><.
AA. Chemical abstract, volum 58, nr.>, E955.
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
73
A4. 3armacologia, nr.8, :ditura %edical, E9>;.
A8. LB*7$, B. O "Curs de chimie i biochimie vegetal#, anul universitar
E996-E99E, B.*.0.
.otA $i$lio-ra0ia s2a citat n ordinea utilizrii n prezenta lucrare de
diplom.

CUPRIN/
Ca(.I. Itro%&cere. Geera#it!+iCCCCCCCCCCCCCCCCC. E
Ca(.II. Pre*etarea (rob#e-eiCCCCCCCCCCCCCCCCC... <
A.E. 'escriere botanic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. <
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
74
A.A. 0ehnologia de cultur\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ 5
A.A.E. .oiul cultivat\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 5
A.A.A. *mplasarea culturii\\\\\\\\\\\\\\\\\... 5
A.A.4. 3ertilizarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ 5
A.A.8. /ucrrile solului\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ ;
A.A.<. .emnatul\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. ;
A.A.5. /ucrrile de ntreinere\\\\\\\\\\\\\\\\.. ;
A.A.;. Holi, duntori i combaterea acestora\\\\\\\\\\. ;
A.A.>. Cecoltarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. >
A.A.9. $scarea i condiionarea\\\\\\\\\\\\\\\... >
A.4. Principii activi izolai i importana lor\\\\\\\\\\\\. >
A.4.E. .aponinele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 9
A.4.A. Carotinoidele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. E6
A.4.4. 3lavonoidele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. E6
A.4.8. -itamina C\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ EE
A.4.<. $leiurile eseniale (uleiuri volatile, uleiuri eterice!\\\\\.. EE
A.4.5. *cizii organici (acizii carbonici!\\\\\\\\\\\\... EE
A.4.;. .ubstanele minerale\\\\\\\\\\\\\\\\\. EA
Ca(.III. /t&%ii %e #iterat&r!CCCCCCCCCCCCCCCCCCC E8
4.E. .aponinele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. E8
4.E.E. 7omenclatur. .tructur\\\\\\\\\\\\\\\... E8
4.E.A. 3lavone i glicozizi flavonici\\\\\\\\\\\\\\ E9
4.A.A. 3lavonoli ai florilor de Calendula\\\\\\\\\\\\. AE
4.A.4. 7omenclatur. .tructur\\\\\\\\\\\\\\\... AE
4.A.8. %etode de recunoatere i determinare\\\\\\\\\\ AA
4.A.<. Col fiziologic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ A4
4.4. Pigmenii carotenoidici\\\\\\\\\\\\\\\\\\. A8
4.4.E. .ursele i factorii care influeneaz coninutul de pigmeni
carotenoidici\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. A8
4.4.A. 7omenclatur. .tructur. Proprieti fizico-chimice\\\\\ A5
4.4.4. %etode de etracie, separare, dozare i identificare\\\\\ A;
4.4.8. Col fiziologic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ 46
4.8. *cidul ascorbic (vitamina C!\\\\\\\\\\\\\\\\ 4E
4.8.E. .urse, factori ce influeneaz coninutul de acid ascorbic\\\ 4E
4.8.A. 7omenclatur. .tructur i proprieti fizico-chimice\\\\.. 4E
4.8.4. %etode de separare, dozare i identificare\\\\\\\\\ 4A
4.8.8. Col fiziologic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 44
4.<. $leiurile grase (lipide vegetale!\\\\\\\\\\\\\\\ 48
4.<.E. .tructur i proprieti fizico-chimice\\\\\\\\\\... 48
4.<.A. surse. 3actori de influen. Col 3iziologic\\\\\\\\\ 4<
4.5. %aterialele tanante (taninuri!\\\\\\\\\\\\\\\\ 4;
4.5.E. .tructur i proprieti fizico-chimice\\\\\\\\\\.. 4;
4.5.A. %etode de etracie, separare, dozare i de identificare\\\.. 4;
4.5.4. Col fiziologic i utilizri practice\\\\\\\\\\\\.. 4>
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
75
4.;. Proteidele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\... 49
4.;.E. Csp)ndire\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 49
4.;.A. %etode de izolare, purificare i dozare\\\\\\\\\\. 49
4.;.4. Col fiziologic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ 86
Ca(.I:. Coc#&*ii#e st&%i&#&i %e #iterat&r!CCCCCCCCCCCC... 8E
Ca(.:. Re*&#tate. Disc&+ii. Cotrib&+ii ori$ia#eCCCCCCCCCC.. 8A
<.E. 2binerea etractelor\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 8A
<.E.E. %acerarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. 8A
<.E.E.E. %acerarea metanolic\\\\\\\\\\\\\\... 8A
<.E.E.A. %acerarea etanolic\\\\\\\\\\\\\\\.. 84
<.E.A. 0urboetracia\\\\\\\\\\\\\\\\\\\... 8<
<.E.4. Percolarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 85
<.E.8. Bnterpretarea rezultatelor\\\\\\\\\\\\\\\.. 85
<.A. Bdentificarea i determinarea componentelor\\\\\\\\\\ 8;
<.A.E. Compleul saponinic\\\\\\\\\\\\\\\\\ 8;
<.A.A. 3lavonoidele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. 8>
<.A.4. Carotenoidele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ 89
<.A.8. *cidul ascorbic\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. <E
<.A.<. %etionina\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. <A
<.A.5. Colina\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ <A
<.A.;. *neurin-ICl\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. <A
<.A.>. *minopurinele\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. <A
<.A.9. Cenua\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\... <A
<.A.E6. Caracterizarea proteinelor din florile de Calendula\\\\\ <A
<.4. (ncercri de depozitare\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. <;
Ca(.:I. Parte e.(eri-eta#!CCCCCCCCCCCCCCCCCC.. <>
5.E. %etode de etracie\\\\\\\\\\\\\\\\\\\... <>
5.E.E. :tracia selectiv i succesiv\\\\\\\\\\\\\. <>
5.E.A. %acerarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. <9
5.E.4. 'igestia\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\. 5A
5.A. identificarea i determinarea componentelor\\\\\\\\\\ 5A
5.A.E. %etode de recunoatere i determinarea saponinelor\\\\... 5A
5.A.A. %etode de recunoatere i determinare a flavonoidelor..\\\. 54
5.A.4. %etode de recunoatere i determinare a alantoinei\\\\\. 5<
5.A.8. %etode de separare i identificare a substanelor tanante\\\. 55
5.4. Contribuii originale\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. 5;
5.4.E. 2binerea etractelor\\\\\\\\\\\\\\\\\. 5;
5.4.E.E. macerarea metanolic\\\\\\\\\\\\\\... 5;
5.4.E.A. %acerarea etanolic\\\\\\\\\\\\\\\. 5;
5.4.E.4. 0urboetracia\\\\\\\\\\\\\\\\\.. 5>
5.4.E.8. Percolarea\\\\\\\\\\\\\\\\\\\.. 5>
5.4.A. Bdentificarea componentelor\\\\\\\\\\\\\\. 5>
5.4.A.E. Bdentificarea compleului saponinic (escina!\\\\\... 5>
5.4.A.A. Bdentificarea flavonoidelor\\\\\\\\\\\\\ 59
U.S.A.M.V.B.T. PROIECT DE DIPLOMA
76
5.4.A.4. Bdentificarea aminopurinelor\\\\\\\\\\\\ 59
5.4.A.8. Bdentificarea acidului ascorbic\\\\\\\\\\\.. 59
5.4.A.<. Bdentificarea metioninei\\\\\\\\\\\\\\ ;6
5.4.A.5. Bdentificarea aneurin-ICl\\\\\\\\\\\\\. ;6
5.4.A.;. Bdentificarea colinei\\\\\\\\\\\\\\\.. ;6
Ca(.:II. Coc#&*ii 1ia#eCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC ;E
Bib#io$ra1ieCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC... ;A

S-ar putea să vă placă și