Electroforesis en Geles de Poliacrilamida PDF

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Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque

Electroforesis de cidos nuclicos en geles de poliacrilamida

Introduccin

La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de bajo peso
molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el trabajo con microsatlites
o SSR en la construccin de mapas de ligamiento, estudios poblacionales y en la seleccin
asistida por marcadores moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta til para el
aislamiento de pequeas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolucin,
geles de agarosa.

La tcnica consiste en la elaboracin de una fina capa de gel de acrilamida adherida a una
lmina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la migracin
responde a la carga negativa neta de la molcula de ADN y la concentracin del gel. Las
secuencias de ADN ms pequeas migran a mayor velocidad mientras que las grandes se
quedan atrs.

La tcnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cmara de electroforesis, la
preparacin de la solucin de poliacrilamida y el llenado de la cmara, la pre-corrida del gel, la
corrida de las muestras y la tincin del gel.

Los geles de poliacrilamida pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son, se utilizan para
la corrida de microsatlites. Estos presentan altas concentraciones de urea (5M) y son corridos
a elevadas temperaturas (50-55
o
C), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan separadas
durante la electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los productos de PCR son
desnaturalizados, a fin de incrementar la resolucin de la separacin, mediante calentamiento a
95
o
C y tratamiento con formamida.

La visualizacin de las bandas puede hacerse directamente por tincin con bromuro de etidio
(geles de agarosa) o nitrato de plata, a travs de autoradiografa utilizando iniciadores
marcados con radioistopos en la reaccin de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan
geles de secuenciacin. La deteccin mediante fluorescencia es el mtodo analtico con mayor
sensibilidad, mientras que la deteccin radioactiva y mediante tincin con AgNO
3
tienen
sensibilidad equivalente (Comincini et al. 1995, Christensen et al. 1999, Creste et al. 2001).

La deteccin en geles de poliacrilamida teidos con nitrato de plata ofrece, segn nuestra
experiencia, la mejor relacin costo-beneficio. Aunque laboriosa esta metodologa ofrece una
alta resolucin, requiere de equipos poco sofisticados. La deteccin mediante fluorescencia,
en contraste, es costosa pues requiere de equipos sofisticados, cuya adquisicin slo se justifica
en aquellos laboratorios que manejan grandes volmenes de muestras. La deteccin radiactiva
requiere P
32
, el cual es costoso. Adicionalmente, este radioistopo representa riesgos para la
salud por lo que su manejo en el laboratorio requiere de equipamiento de seguridad que
aumentan los costos de la deteccin.

Existen diversos protocolos para la tincin del ADN en geles de poliacrilamida con AgNO
3

(Beidler et al. 1982, Bassam et al. 1991, Sanguinetti et. al. 1994). En este protocolo se sigue el
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mtodo propuesto por Beidler et al. 1982, con pequeas modificaciones. Estudios comparativos
han demostrado que este mtodo tiene una alta sensibilidad de deteccin y exhibe poco
problemas de background en relacin a otras metodologas (Creste et al. 2001). La tincin con
AgNO
3
consta de varias etapas o pasos cuyos tiempos de incubacin son crticos para la
obtencin de buenos resultados. La preparacin de soluciones para la tincin requiere agua de
excelente calidad (bidestilada y desionizada). Estas soluciones pueden ser reutilizadas un
nmero limitado de veces. Los pasos de lavado de los geles tambin requieren de agua
bidestilada.

De especial cuidado con la metodologa de tincin con AgNO
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es todo lo relativo a la limpieza y
manejo de las cmaras de electroforesis utilizadas. El manejo de estas cmaras requiere de un
espacio de trabajo bien estructurado a fin de minimizar accidentes que podran ocurrir durante
la preparacin y corrida de los geles, el lavado de los vidrios, o los distintos pasos del proceso de
tincin. Aqu describimos el ensamblaje y preparacin de dos modelos comerciales de cmaras
de electroforesis. Sin embargo, los principios son aplicables a otros modelos.

El tratamiento de desechos luego de los procesos de electroforesis y tincin son de vital
importancia a fin de evitar la contaminacin de los espacios de trabajo y del personal. La
solucin de AgNO
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debe ser precipitada con sales y filtrada antes de ser descartada en el
lavaplatos. Los restos de poliacrilamida, luego del desprendimiento de geles, al igual que todos
aquellos desechables en contacto con ella (servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser
depositados en bolsas plsticas aptas para incineracin debidamente etiquetadas.

1. Montaje de la cmara de electroforesis preparacin de la solucin de poliacrilamida,
llenado del gel y pre-corrida del gel

En este segmento se explica el montaje de dos tipos de cmaras de electroforesis, una es de Bio-
Rad modelo Sequi-Gen GT Systems, que a diferencia de la segunda tiene un compartimiento
detrs del vidrio al que no se adhiere el gel, el cual va lleno del buffer de corrida TBE. Esto
permite que la corriente circule a travs del sistema y caliente el vidrio a una temperatura
controlada y homognea en toda su superficie. El segundo modelo es una cmara de
secuenciacin dual de CBF Scientific, esta es una cmara de electroforesis tradicional compuesta
por dos vidrios que se unen mediante cinta adhesiva a los que se le ajusta una lmina de
aluminio que permite el calentamiento controlado del gel. Ambas cmaras comparten el
tratamiento de los vidrios pero se diferencian en el ensamblaje y corrida del gel.

La preparacin de las cmaras y geles debe hacerse utilizando siempre guantes ya que la
acrilamida en una substancia neurotxica que se absorbe por la piel.

Lo ideal es trabajar en espacios separados, uno donde se trabaja el vidrio donde va adherido el
gel un espacio diferente para trabajar el otro vidrio.

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1.1. Materiales
- Baldes de 8 L
-Bandejas plsticas con tapa (70cm largo, 60cm ancho,10cm de profundidad)
-Beakers (250 mL, 500mL, 1L, 2L, 4L)
-Cinta adhesiva para cubrir las placas de PCR
-Embudos
-Frascos mbar (4L)
-Gafas de proteccin
-Gaza
-Gradillas
-Guantes de ltex
-Guantes de nitrilo
-Magnetos
-Papel filtro Whatman 1 y 2
-Peines tiburn 68 pozos y 100 pozos
-Probetas (10 mL, 100mL, 500mL, 1L, 2L)
-
-Soporte para pipetas
-Tapas para placas flexibles
-Termmetro
-Toallas Kimwipe
-Tubos de micro-centrifuga (1-2 mL)
-Vidrios adicionales para cmaras de electroforesis vertical

1.2. Equipos
-Balanza analtica
-Balanza digital
-Bao Mara
-Bloque trmico
-Bomba de vaco
-Campana de extraccin
-Cmara de electroforesis vertical
-Escner
-Congelador -20 C
-Congelador -80 C
-Nevera 4C
-Fuente de poder 3000 V
-Horno microondas
-Microcentrifuga
-Mquina de hielo
-Ph-metro digital
-Pipetas 0.2-2 uL, 1-10 uL, 20-200 uL, 100-1000 uL
-Pipeta multicanal (Hamilton) para servir muestras en el gel de acrilamida (1-
-Placa de agitacin
-Termociclador

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1.3. Reactivos
-Acido actico glacial
-cido brico
-Acetato de potasio
-Acetato de sodio
-Acrilamida
-Agua deionizada, agua bidestilada
-Azul de bromofenol
-Bind silane
-Bis-acrilamida
-EDTA
-Etanol grado molecular
-Etanol tcnico
-Formaldehido (37%)
-Formamida redestilada
-Nitrato de plata
-Persulfato de amonio
-SIGMACOTE o Repel-silane
-TBE 10X
-TEMED
-Tiosulfato de sodio
-Trizma base
-Urea
-Xylene Cyanol

1.4 Preparacin de Soluciones

A) Soluciones de poliacrilamida

Acrilamida 6%, 5 M de urea (1 L)
Reactivo Cantidad
Acrilamida 57 g
Bis Acrilamida 3 g
TBE 10X 50 ml
Urea 300,3 g

Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 4% , 5 M urea (1L)
Reactivo Cantidad
Aclilamida y bisacrilamida 40 g
TBE 10X 50 ml
Urea 300,3 g

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Notas:

En todos los casos, disuelva la acrilamida en 500 ml de agua doblemente deionizada tibia y agregue el
TBE, despus agregue la urea y complete el volumen.
Filtre la acrilamida con papel Whatman 2
Prepare la solucin en la campana de extraccin con mscara de proteccin y guantes.
Evite exponer a la luz
Almacene la solucin a 4 C.

B) Etanol-cido Actico (50 ml)

Reactivo Cantidad

Etanol grado molecular 95% 50 mL
Acido actico glacial

Notas:
Agregue el cido actico a la solucin en la campana de extraccin.
Almacene la solucin a temperatura ambiente.

C) Persulfato de amonio 10% (50 ml)

Reactivo Cantidad

APS (NH
4
)
2
S
2
O
8
5 g
H
2
O deionizada 50 ml

Notas:
Evite exponer la solucin a la luz.
Almacene a 4 C.

Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 6% , 5 M urea (1 L)
Reactivo Cantidad
Aclilamida y bisacrilamida 60 g
TBE 10X 50 ml
Urea 300,3 g

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D) TBE 10X (1L)

Notas:
Ajuste el volumen con agua destilada.

Cmara de electroforesis modelo Sequi-Gen GT System (Bio-Rad)

Figura 1. Cmara de electroforesis modelo Sequi-Gen GT System (BioRad)

I. LAVADO DE LA CMARA

Lavado del vidrio

1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabn (detergente lquido diluido o ALCONOX).
2. Deje secar a temperatura ambiente.
3. Limpie la cara donde ir adherido el gel con etanol tcnico al 96%, 2 veces con toallas
comunes, 1 vez con toallas Kimwipe.

Lavado de la cmara

1. Limpie con agua el vidrio de la cmara.
2. Deje secar el agua.
Reactivo Cantidad
Trizma Base 108 g
cido brico 55 g
EDTA 0.5M 40 mL
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3. Limpie con etanol al 96%, 2 veces con toallas de papel comunes, 1 vez con toallas
Kimwipe.

Preparacin del vidrio

1. Mezcle 1 mL de solucin de etanol-cido actico (etanol 95% y acido actico 0,5%) con 3
uL de Bind Silane (Pharmacia Biotech, cdigo No 17-1330-01).
2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherir el gel, utilizando una
toalla Kimwipe.
3. Deje secar durante 5 min.

Preparacin de la cmara

1. Distribuya 100 uL de Sigmacote o, en su defecto, 300 uL de Repel Silane sobre el vidrio
de la cmara, utilizando una toalla Kimwipe.

II. ENSAMBLAJE DE LA CMARA Sequi-Gen GT System (Bio-Rad)

1. Limpie los separadores con etanol al 96% y colquelos en los bordes laterales del vidrio
de la cmara.
2. Coloque el vidrio (cara tratada) sobre la cmara.
3. Coloque los brazos, cuidando que queden al mismo nivel de la base de la cmara y el
vidrio.
4. Coloque la base.

III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA

1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extraccin) :

- 100 mL de solucin de acrilamida (4% o 6%)
- 600 uL de persulfato de amonio al 10%
- 100 uL de TEMED (GibcoBRL, No. catlogo 15524-010)

La mezcla debe hacerse rpidamente y con suavidad para evitar la formacin de burbujas.

2. Llene la jeringa y elimine las burbujas
3. Conecte la manguera a la jeringa, e inyecte rpidamente la solucin de acrilamida.
4. Introduzca el peine entre el vidrio y la cmara, y ajuste con ganchos metlicos.
5. Deje polimerizar por 1 hora.

IV. PRE-CORRIDA DEL GEL

1. Retire la base de la cmara.
2. Lave el vidrio, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo.
3. Coloque la cmara sobre la cubeta y llnela con TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE).
4. Retire el peine.
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5. Conecte la cmara a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 mA) y espere hasta alcanzar
45 C de temperatura.
6. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de
poliacrilamida.
7. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajstelo con
ganchos metlicos.
8. Limpie nuevamente el frente de corrida
9. Sirva entre 1 y 2 uL de solucin Stop en varios de los pozos.
10. Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 mA) durante 20 min o hasta alcanzar 50
o
C,
observando el recorrido de la solucin Stop.

Cmara de secuenciacin Dual de altura Ajustable (CBS Scientific).

Figura 2. Cmara de electroforesis CBS Scientific

I. LAVADO DE LA CMARA

Lavado del vidrio sin pestaa

1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabn (Detergente lquido, diluido o
ALCONOX).
2. Deje secar el vidrio.
3. Limpie la cara donde se adherir el gel 3 veces con etanol al 96%.

Lavado del vidrio con pestaa

1. Limpie con agua.
2. Deje secar el agua.
3. Limpie con etanol al 96%, tres veces.

Preparacin del vidrio sin pestaa

1. Mezcle 1 mL de solucin de etanol-cido actico (etanol 95% y acido actico 0,5%) con 3
uL de Bind Silane (Pharmacia Biotech, cdigo No 17-1330-01).
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2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherir el gel, utilizando una
toalla Kimwipe.

Preparacin del vidrio con pestaa

1. Distribuya 100 uL de Sigmacote o, en su defecto, 300 uL de Repel Silane sobre el vidrio
de la cmara, utilizando una toalla Kimwipe.

II. ENSAMBLAJE DE LA CMARA DE SECUENCIACIN DUAL DE ALTURA AJUSTABLE (CBS
SCIENTIFIC)

1. Limpie los separadores con etanol al 96% y pngalos en los bordes laterales del vidrio
con pestaa.
2. Coloque el vidrio sin pestaa (cara tratada) sobre el vidrio con pestaa.
3. Selle con cinta adhesiva los lados y el borde inferior de los vidrios. Hgalo con una sola
tira de cinta, reforzando la parte inferior.
4. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 a cada lado).

III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA

1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extraccin)

- 100 mL de solucin de acrilamida (4% o 6%)
- 600 uL de persulfato de amonio al 10%.
- 100 uL de TEMED (GibcoBRL, No. catlogo 15524-010)

La mezcla debe hacerse rpidamente y con suavidad para evitar la formacin de
burbujas.

2. Acueste los vidrios sobre la mesa.
3. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 de cada lado).
4. Recline los vidrios sobre el borde inferior derecho con una inclinacin de 45
o
y
lentamente vierta la acrilamida entre los vidrios.
5. Introduzca el peine entre los vidrios, y presione con ganchos.

IV. PRE-CORRIDA DEL GEL

1. Retire la cinta adhesiva de la base (borde inferior).
2. Lave los vidrios, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo.
3. Coloque la placa metlica sobre el vidrio con pestaa (antes de esto determine el nivel
al que debe ir la placa).
4. Coloque los vidrios (+ placa) sobre la cubeta de buffer inferior y ajstelos a la cubeta
superior con ganchos.
5. Llene las cubetas de TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE).
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6. Retire el peine.
7. Conecte el dispositivo a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 mA) y espere hasta
alcanzar 45C de temperatura.
8. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de
poliacrilamida.
9. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajstelo con
ganchos metlicos.
10. Limpie nuevamente el frente de corrida.
11.
12. Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 mA) durante 20 min observando el recorrido de
la solucin Stop.

2. Corrida del gel (se aplica a los dos modelos de cmara)

2.1. Preparacin de soluciones

A) Solucin Stop
Solucin Stop Concentracin en
solucin de trabajo
Volumen para 200 mL
Formamida redestilada 95% 190 mL
EDTA (0,5 M) 20 mM 8 mL
Azul de bromofenol 0,05% 0,1 g
Xylene Cyanol 0,05% 0,1 g
H
2
O deionizada 2 mL

Notas:
1. Utilice guantes.
2. Almacene la solucin a 4 C.

2.2. Protocolo

1. Agregue 5 uL de solucin Stop a cada uno de los productos de PCR (producto con un
volumen final de 10 a 20uL).
2. Desnaturalice las muestras (productos PCR) a 95 C durante 2 min.
3. Colquelas sobre hielo inmediatamente.
4. Detenga la pre-corrida.
5. Retire la urea que se ha acumulado en los pozos utilizando una jeringa (sin la punta
metlica) llena de buffer. Inyecte rpidamente el buffer en los pozos teniendo en cuenta
de no introducirles burbujas.
6. Coloque entre 2,5 a 3 uL de muestra por pozo. En caso dado de que los pozos se vuelvan
a llenar de urea, lmpielos individualmente utilizando una pipeta de 100uL.
7. Retire el peine, una vez que las muestras han recorrido 2 cm dentro del gel.
8. Corra las muestras (110 W, 3000 V, 400 mA) durante aproximadamente 2h.

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Notas:

1. Toda manipulacin de acrilamida debe hacerse con guantes.
2. La solucin de Stop tambin se trabaja con guantes pues contiene sustancias txicas.
3. Los PCR con solucin Stop pueden ser almacenados a -4C y reutilizados para otras -
electroforesis en geles de acrilamida e incluso en geles de agarosa.
4. El calor daa los peines, por esto es importante retirarlos a tiempo del gel.

3. Tincin de geles con Nitrato de plata

3.1. Soluciones de trabajo

A) Solucin Fijadora y de Parada (cantidades para preparar 3,5 L)

Reactivo Cantidad

cido Actico 350 ml
Agua deionizada 3,65 L

Notas:
Prepare la solucin en la campana de extraccin,
Utilice guantes de ltex.

B) Solucin de tincin (cantidades para preparar 3,5 L)

Reactivo Cantidad

Nitrato de plata 3,5 g
Formaldehdo (37%) 4,5 ml

Notas:
Evite exponer la solucin de AgNO
3
a la luz.
Prepare la solucin en la campana de extraccin.
Utilice guantes de ltex.

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C) Revelador (cantidades para preparar 3,5 L)

Reactivo Cantidad

Carbonato de sodio 105 g
Formaldehido (37%) 4,5 ml
Tiosulfato de sodio 650 ul

Notas:
Agregue el formaldehdo a la solucin en la campana de extraccin.
Almacene a 4 C.

D) Tiosulfato de sodio (10 ml)

Reactivo Cantidad

Tiosulfato de sodio 0,1 g
H
2
O deionizada 10 ml

Notas:
Almacene a 4C.

3.2. Protocolo

La tincin del gel con nitrato de plata consiste de 7 pasos sucesivos:

1. Fijacin: Sumerja el gel durante 20 min en solucin fijadora (cido actico 10%).
Nota. En este punto el gel puede permanecer un poco ms de tiempo, hasta una hora.

2. Lavado con dH
2
O: Espere a que escurra bien el gel del paso anterior y sumrjalo en agua
bidestilada o deionizada y agtelo suavemente. Repita esto tres veces con cambio de
agua entre lavado. Cada lavo tiene una duracin de 2 minutos, si en el ltimo lavado
nota restos de cido actico (manchas grasosas sobre el gel) repita una vez ms el
lavado.

3. Tincin: Escurra bien el agua del gel y sumrjalo en la solucin de nitrato de plata
durante 30 min. Es importante que el gel permanezca tapado durante este paso por que
la luz oscurece el gel.

4. Lavado con dH
2
O: Escurra bien el gel, sin tardarse y sumrjalo en agua bidestilada o
deionizada durante 10 segundos. Este es un paso crtico pues aqu se est retirando el
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exceso de nitrato de plata, si no lo lava bien la tincin saldr muy oscura, si lo lava
mucho se pierde la nitidez de las bandas.

5. Revelado: Escurra un poco el gel y sumrjalo en la solucin reveladora (Carbonato de
sodio + formaldehdo 37% + Tiosufato de sodio). Esta solucin debe estar entre 18 y
20C. Agite suavemente hasta que aparezcan las bandas de ADN (3 a 5 min). Este paso
es crtico, el gel se va oscureciendo lentamente y se empiezan a ver las bandas de ADN,
despus se hace ms rpida la tincin y se hace ms difcil de frenar.

6. Fijacin/Parada: Escurra el gel y sumrjalo en la solucin de parada (cido actico 10%).
En este paso el gel puede permanecer un par de horas.

7. Lavado con dH
2
O: Escurra bien el gel y sumrjalo en agua bidestilada o deionizada
durante 5 min, hasta eliminar los rastros del cido actico.

Notas:
1. Los distintos pasos de la tincin se realizan en bandejas plsticas con tapas plsticas o de
madera. El nitrato de plata es sensible a la luz por esto las bandejas y las tapas deben ser
opacas.
2. Las soluciones de fijacin y tincin pueden usarse hasta 10 veces, mientras que la de revelado
solo 4.
3. La solucin de revelado debe almacenarse en frio, 4C. Las otras soluciones se guardan a
temperatura ambiente.
4. Esta tcnica es muy sensible a los tiempos de incubacin de cada paso y a la temperatura y
calidad de la solucin de revelado.
5. La tincin con plata involucra la manipulacin de reactivos txicos como lo es el nitrato de
plata, el formaldehido y el cido actico, por ello se deben emplear guantes, mascarilla para la
boca y gafas. Tambin es una buena alternativa trabajar las soluciones peligrosas en cmara de
extraccin.

4. Desprendimiento de geles

Los vidrios de las cmaras de electroforesis son reutilizables, por esto despus de extraer los
datos del gel (llenar planillas de microsatelites con datos de alelos por ejemplo y escanear el gel
para tener un soporte grfico), se desprenden los geles del vidrio utilizando una solucin de
NaOH altamente concentrada. Este proceso debe hacerse en cmara de extraccin y con
guantes pues los vapores del NaOH son peligrosos.

4.1. Reactivos

-Hidrxido de sodio
-Agua deionizada

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4.2. Preparacin de soluciones

A) NaOH 5% (para 4 litros)

Reactivo Cantidad

NaOH 200 g
H
2
O deionizada 4L

Notas:
Complete el volumen con agua destilada y esterilice en el autoclave.
Almacene la solucin a 4C.

4.3. Protocolo

1. Sumerja el vidrio en NaOH al 5% durante un par de horas.
2. Remueva el gel pasando suavemente la mano por el vidrio.
3. Lavar el vidrio inmediatamente con abundante agua. Esto se puede hacer fuera de cmara.
Nota: no olvide usa guantes y trabajar en cmara de extraccin.

5. Tratamiento de desechos

5.1. Precipitacin de la solucin de plata

5.2. Protocolo

1. Agregue a la solucin de plata 5 g de NaCl por litro de solucin.
2. Incube durante 24 h.
3. Filtre con papel de filtro Whatman 1.
4. Descarte la solucin acuosa en el lavaplatos y el precipitado en los desechos de
poliacrilamida.

Nota: El resto de las soluciones, cidos y el revelador se pueden desechar en el lavaplatos.

6. Tratamiento de cmaras contaminadas

6.1 Protocolo

1. Cubra la zona contaminada con un pedazo de gasa empaado en NaOH al 10%.
2. Espere 20 min y lave la cmara con abundante agua.
3. Cubra el vidrio de la cmara con una fina capa del producto que est utilizando para
repeler el gel (Sigmacote, Repel u otro) un par de veces.
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7. Anexos

7.1. Anexo1: Cuidado a tener con el manejo de la poliacrilamida

Proteccin personal

Todo el personal que ingrese al laboratorio debe tener bata y zapatos cerrados.

La manipulacin de soluciones y equipos del laboratorio (utensilios que estn en contacto con la
poliacrilamida, cmaras de electroforesis, lavaplatos) se debe hacer con guantes de ltex.

Es recomendable utilizar guantes de nitrilo para la manipulacin de la poliacrilamida y la solucin
de NaOH.

La preparacin de la solucin de poliacrilamida se debe hacer en la campana de extraccin con
mscara y guantes de nitrilo.

En caso de contaminacin con poliacrilamida se deben hacer lavados con abundante agua.
Notificar al responsable del laboratorio. Acudir al mdico si se presenta malestar.

rea de trabajo para la preparacin de geles de poliacrilamida

Debe estar separada del rea de trabajo donde se hacen PCR, extracciones y preparan reactivos y
debe estar identificada.

Debe permanecer limpia. Se recomienda hacer jornadas de limpieza frecuentes, segn el uso que
se le de al laboratorio.

No deben ponerse libros, cuadernos, etc., en las superficies donde se trabaje con poliacrilamida.

Cuidados a tener con la solucin de poliacrilamida.

La solucin de poliacrilamida debe almacenarse en una nevera a 4 C en botellones de vidrio
opaco. El botelln debe etiquetarse con el tipo de solucin (relacin de acrilamida: bis-acrilamida,
% de la solucin, concentracin de urea), la fecha de preparacin y el responsable de la
preparacin.

Desechos

Los desechos de poliacrilamida y todo material desechable que est en contacto con ella se
descartan en bolsas plsticas, debidamente etiquetadas, que son selladas con cinta adhesiva y
llevadas a incineracin.

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7.2. Anexo 2: organizacin del rea de trabajo

El rea de trabajo debe contar con:

-Dos mesones, uno para el tratamiento de las cmaras de electroforesis y otro para los vidrios.
Esto con el fin de evitar la contaminacin de las cmaras. Los mesones deben cubrirse
preferiblemente con plstico para evitar la contaminacin y facilitar la limpieza de los mismos.

-Un lavaplatos, con dimensiones apropiadas para el lavado de los vidrios y cmaras de
electroforesis. El desage debe estar provisto de una rejilla para evitar el paso de poliacrilamida
slida a la tubera.

-Una campana de extraccin para colocar permanentemente la bandeja con NaOH para el
desprendimiento de geles; para manipular el SIGMACOTE, el TEMED (en la mezcla de reactivos
para la polimerizacin del gel), el cido actico glacial (preparacin del etanol c. actico y de las
soluciones fijadora y de parada) y el formaldehdo 37% (para la preparacin del revelador).

-Un agitador, con las dimensiones apropiadas para poner en agitacin las bandejas de tincin
(opcional).

-Una plancha de calentamiento para la desnaturalizacin del ADN.

-Una bomba de vaco para filtrar las soluciones de poliacrilamida.

8. Bibliografa

Bassman BJ, Caetano-Anolls G, Gresshoff PM. 1991. Fast and Sensitive Silver Staining of DNA in
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Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque

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