PRCTICA 4

Determinacin Cualitativa de Clorofila a y b por Cromatografa en Capa Fina

Introduccin:
Los pigmentos vegetales, que se encuentran en los cloroplastos, son molculas qumicas
que reflejan o transmiten la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un pigmento
depende de la absorcin selectiva de ciertas longitudes de onda de la luz y de la reflexin de otras.
El color verde de las plantas esta dado por la clorofila, que se encarga de absorber la luz
necesaria para realizar la fotosntesis. Existen 4 tipos de clorofila: a (ms abundante), b (pigmento
accesorio), c y d. Los dos tipos de clorofila ms importantes son la a y la b, la diferencia entre ellas
consta en que la clorofila a tiene un grupo CH
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en el anillo II, mientras que la clorofila b tiene un
grupo CHO en esa misma posicin. La clorofila c y d son propias de algas y bacterias. Adems
existen otros pigmentos presentes en las plantas como por ejemplo los caratenoides que actan
como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosntesis. Estos le confieren la coloracin
amarilla y roja a las platas.
Unas de las tcnicas para determinar la presencia de clorofila a y b en plantas es la
cromatografa en capa fina.

Fundamento:
Los pigmentos vegetales pueden ser separados utilizando la tcnica de cromatografa en
capa fina. Dependiendo de la naturaleza de los pigmentos, el grado diferente de solubilidad en
los disolventes de la fase mvil va a ser distinto, esto permite su separacin cuando la misma
asciende a travs de la placa cromatogrfica. Los pigmentos ms solubles en la fase mvil
ascendern ms rpido que aquellos que poseen una solubilidad menor. Sobre la fase
estacionaria se observaran varias bandas de distintos colores y grosores, dependiendo del tipo y
abundancia del pigmento en el material vegetal.
Los pigmentos cloroflicos son insolubles en agua, pero s son solubles en solventes
orgnicos. A los solventes que extraen simultneamente los pigmentos del material vegetal se les
denomina extractores. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y a
stos se les llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo.

Objetivos:
1. Utilizar la tcnica de cromatografa en capa fina para separar pigmentos vegetales.
2. Comprender el fundamento de la separacin de compuestos de una mezcla por medio del
la tcnica de cromatografa en capa fina.

Materiales:
Espinaca
Hojas de una planta (nombre comn y cientfico conocido)
Placa de aluminio 7 x 7 cm recubiertas de slica gel para cromatografa de capa fina
Cmara cromatogrfica
Capilares sin heparina adelgazados
Regla de 30 cm
Lpiz o portaminas
Mortero con pistilo
Probeta 50 y 100 ml


Reactivos:
ter de petrleo
Ciclohexano
Acetato de etilo
Acetona
Etanol
Sulfato de magnesio anhidro

Procedimiento:

Preparacin muestra
1. Triturar 1.5 g de muestra con 0.5 g de sulfato de magnesio anhidro y 1.0 g de arena
durante 10 minutos aproximadamente.
2. Transferir el material triturado a un tubo de ensayo que contenga acetona, la cual debe de
cubrir todo el material agregado, y agitar.
3. Dejar reposar por 10 minutos y transferir la acetona a un vial para almacenar.

Preparacin Fase Mvil
1. Preparar 50 ml de fase mvil: ter de petrleo/ciclohexano/acetato de
etilo/acetona/etanol 30:8:5:5:2
2. Saturar la cmara cromatografica durante 20 minutos con la fase mvil preparada.

Preparacin Fase Estacionaria
1. Sobre una placa previamente preparada recubierta con slica gel trazar con un lpiz una
recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de ste de 1 cm. Realizar este
procedimiento con cuidado para no destruir el material.
2. Sobre esta lnea colocar los puntos de referencia necesarios para llevar a cabo el anlisis.

Desarrollo de la Cromatografa:
1. Llevar a cabo la tcnica correspondiente al sembrado en la pgina de la seccin de
tcnicas complementarias al inicio de este manual.
2. Introducir la placa a la cmara cromatografica y tapar
3. Dejar correr la fase mvil hasta que el frente llegue a 1 cm del borde superior de la placa.
4. Sacar el papel de la cmara y trazar con lpiz una lnea sobre el frente.
5. Marque con lpiz las manchas de las muestras.

Resultados:
1. Calcular los factores de retencin.

Cuestionario:
1. Cul es la polaridad de los solventes utilizados?
2. Cules son los principales pigmentos extrados y cmo se ubican en el cromatograma?
3. Por qu algunos pigmentos recorren ms distancia de la fase estacionaria que otros?





Bibliografa:

1. Quach, H. et al. An Improved Method for the Extration and Thin-Layer Cromatography of
Clorophyll a and b from Spinach. Journal of Chemical Education. Vol. 81, No. 3. Marzo
2004.
2. Castrejn, E, et al. Extraccin y Separacin de Pigmentos Vegetales. Universidad del Valle
de Mxico.