O Genoma dos Sunos

Simone Eliza Facioni Guimares

1
Paulo Svio Lopes
2
Amauri Arias Wenceslau
3
Aldrin Vieira Pires
3
Maria Amlia Menck Soares
3
Fausto Moreira da Silva Carmo
4
A avaliao de animais para caractersticas quantitativas de importncia econmica tem
sido feita usando o valor gentico predito com base nas observaes fenotpicas do indivduo e/ou
de seus parentes. A partir do incio da dcada de 90 este panorama comeou a ser alterado pelo
incio de grandes projetos de mapeamento genmico em animais domsticos cujo objetivo principal
aplicar tcnicas moleculares na identificao e clonagem de genes de caractersticas
quantitativas (QTLs). De acordo com ARCHIBALD et al. (1994) o mapeamento gentico em
animais domsticos permite o entendimento do controle gentico de caractersticas complexas. O
mapeamento gentico, ou a varredura genmica apresenta vrias vantagens na identificao da
base molecular de um fentipo em particular. Com os mtodos bioqumicos necessrio predizer
os mecanismos envolvidos na gerao do fentipo; enquanto que pela tecnologia gentica
molecular pode-se varrer o genoma inteiro a procura de regies cromossmicas cuja variao pode
esta correlacionada com o fentipo em estudo.
Mapas genmicos
O propsito dos projetos de mapeamento encontrar marcadores genticos que cubram o
genoma produzindo um mapa em dois nveis: um mapa gentico e um mapa fsico. O mapa
gentico mostra as distncias estimadas entre marcadores a partir da quantidade de
recombinaes em cruzamentos experimentais. No possvel saber quais grupos de ligao
representam cada cromossomo, isso depende do mapa fsico, que permite identificar a localizao
de grupos de ligao em cromossomos especficos. Em um mapa, os marcadores genmicos s
tm valor quando so polimrficos, pois desta forma permitem identificar a posio e acompanhar
a herana de genes que possuem efeito fenotpico e que esto ligados queles.

1
Pesquisadora visitante. Departamento de Zootecnia/UFV
2
Professor adjunto. Departamento de Zootecnia/UFV
3
Aluno de doutorado em Gentica e Melhoramento/UFV
4
Aluno de doutorado em Zootecnia/UFV
Mapeamento de QTLs e genes candidatos
Por definio, QTLs (quantitative trait loci) so regies cromossmicas relacionadas com a
variao fenotpica das caractersticas quantitativas. Como poucos locos economicamente
importantes so conhecidos, e os QTLs no tm suas bases moleculares definidas, estes tm sido
referidos mais como uma associao estatstica do que como entidade biolgica, sendo sua
herana acompanhada pelos marcadores. Portanto, QTLs podem ser melhor definidos como
associaes estatsticas entre dados relativos a uma regio genmica e a variabilidade fenotpica
existente entre populaes segregantes (LI, 1998).
O mapeamento em animais domsticos envolve duas estratgias bsicas: 1) cruzamento
entre duas populaes divergentes que tenham fixado, ou estejam prximas da fixao para
diferentes alelos; 2) utilizao de populaes comerciais com grandes pedigrees que possuam
dados completos de acasalamentos. De acordo com ANDERSSON et al. (1998), o cruzamento
entre populaes divergentes tem como vantagens: 1) alelos de grande efeito podem estar
segregando; 2) maior poder nas anlises estatsticas, devido a alta heterozigosidade nos QTLs; 3)
o poder das anlises estatsticas aumenta, pois a fase de ligao entre marcadores e dentro de
QTLs devem ser consistentes entre toda F1; 4) o aumento na heterozigosidade aumenta o nmero
de marcadores e cruzamentos informativos. Como principal desvantagem, um QTL detectado por
meio deste delineamento no estar necessariamente controlando a variao gentica em
populaes comerciais, devendo ser testado antes de qualquer introgresso. Apesar desta
desvantagem, este tem sido o mtodo de eleio nos projetos de mapeamento nos animais
domsticos.
Com relao aos marcadores utilizados nos programas de mapeamento genmico tem-se
tambm tradicionalmente duas opes: os microssatlites e os genes candidatos, embora outros
possam ser utilizados. Os microssatlites tm sido considerados os principais marcadores em
programas de varredura genmica, pois apresentam todas as qualidades requeridas em um bom
marcador: so altamente polimrficos, apresentam baixo ndice de mutao e sua herana
Mendeliana (ao contrrio da herana polignica dos QTLs).
Os genes candidatos por sua vez so genes sequenciados de funo biolgica conhecida
e so diretamente responsveis pela expresso de determinada caracterstica. Podem ser genes
estruturais ou genes regulatrios em uma via bioqumica. ROTHSCHILD e SOLLER (1999) citam
que a metodologia de estudo de genes candidatos no tem alto custo e apresenta as seguintes
vantagens: alto poder estatstico, ampla aplicabilidade, simplicidade operacional e conveniente
aplicao seleo assistida por marcadores, MAS (Marker Assisted Selection). De acordo com
estes autores, quando existem informaes a respeito de stios polimrficos, cria-se a base para a
genotipagem de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) por meio de tcnicas rpidas e fceis de
implementar para a varredura de grandes populaes.
De acordo com FAHRENKRUG (2001), o uso desta classe de marcadores SNPs -
poder refinar os mapas genticos e comparativos, provendo uma fonte de marcadores prpria
para uso em grande escala e de baixo custo. Concordando com esta afirmativa, MYAKISHEV et al.
(2001), desenvolveram um novo mtodo para genotipagem em grande escala de SNPs que
envolve apenas uma amplificao por SNP e feita em um nico tubo, no havendo necessidade
de manuseio das amostras ps-PCR. De acordo com estes autores as possibilidades so
basicamente anlise de genes candidatos, varreduras genmicas e diagnsticos mdicos.
A utilidade destes sistemas j se encontra descrita na literatura. VENTA et al (2001)
utilizaram os SNPs na identificao de mais de 70 genes em sunos, ces, cavalos, gatos e gado
sendo que mais de 50 foram confirmados por anlise de restrio. Um dado que refora o uso
destes sistemas foi a inexistncia de falsos positivos. ERNST et al. (2001) citam que pode-se usar
os SNPs aliados a tcnicas tradicionais na identificao de novos marcadores no genoma suno.
Estes autores tm utilizado pools de DNA na identificao de SNPs obtendo seqncias de alta
qualidade. Quando h suspeita de SNPs, as amostras daquele pool so sequenciadas
individualmente.
Outra tcnica que tem sido utilizada na gerao de marcadores o sequenciamento de
cDNAs expressos. A identificao de sequncias expressas pode trazer um volume de
informaes nunca visto para a deteco dos genes relacionados com a variao dos fentipos e
descoberta de QTLs. A identificao dos ESTs (Expressed sequence tags) tem sido facilitada nos
ltimos anos pela disseminao das tcnicas de extrao e manipulao do RNA, alm da
possibilidade de comparao entre os ESTs gerados na cincia animal com os existentes nos
vastos bancos de dados humanos. Isso faz com que o mapeamento comparativo e tambm a
similaridade gnica permitam a identificao de novos genes candidatos. Neste sentido, tcnicas
como o ddPCR (differencial display PCR) tem permitido a descoberta de novos genes expressos
em condies diversas. De acordo com CLUTTER (1999), as possibilidades de estudo das
sequncias expressas iro aumentar nos prximos anos com o refinamento das tecnologias dos
microarrays e a maior oferta dos chips de sequncias sunas. Ainda de acordo com este autor, a
quantidade de informao obtida depender apenas da originalidade e da eficincia do
delineamento experimental utilizado na gerao das amostras.
Projetos de Mapeamento do Genoma Suno
Pode-se dizer que o estudo do genoma suno tem dois alicerces bsicos: primeiro estaria
na importncia comercial da produo suincola, visto ser a carne suna a mais consumida no
mundo, respondendo por um total de 45% de toda carne comercializada; o segundo seria a
possibilidade de desenvolver animais para xenotransplantes de rgos para humanos. O genoma
suno composto por 19 pares cromossmicos, com comprimento de cerca de trs bilhes de
pares de bases de DNA, o que gera, tal como em humanos, um mapa em torno de 3000 cM
(centiMorgans).
De acordo com ROTHSCHILD e PLASTOW (1999), os esforos da comunidade cientfica
internacional tm sido significativos para que o mapeamento genmico das espcies domsticas
possa ser utilizado em programas comerciais. O PigMap Project (ARCHIBALD et al., 1994) iniciou-
se na Europa, financiado pela Comunidade Econmica Europia. Atualmente, o PigMap conta com
cerca de 20 laboratrios europeus, alm de outros laboratrios na Amrica do Norte, sia e
Oceania.
O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), deu incio a dois processos:
um desenvolvido no Meat Animal Research Center no Clay Center, Nebraska; o outro o National
Animal Genome Research Program, desenvolvido sob direo do USDA a partir de 1993. Este foi
desenhado para promover uma estrutura que estimule a colaborao para o mapeamento gentico
em todas as espcies, incluindo sunos. A partir de ento, cientistas de entidades privadas e
governamentais criaram o Swine Genome Technical Committee. Alm destes, outros projetos tm
sido desenvolvidos, e um resumo de cada um deles pode ser verificado no site
http://www.genome.iastate.edu/maps/recent/QTL_proj.html. A associao destes projetos, fez com
que o status do mapa gentico suno evolusse rapidamente, sendo hoje um dos mais completos.
Em 1989, 50 genes e marcadores estavam mapeados, atualmente mais de 2000 genes e/ou
marcadores j foram localizados, apesar de nem todos terem sido publicados.
Identificao de QTLs em populaes de sunos geneticamente divergentes
Em animais domsticos, o primeiro estudo que identificava QTLs foi publicado na revista
Science, em que ANDERSSON et al (1994), relatavam a presena de QTL para deposio de
gordura no cromossomo 4 de sunos, estes autores se valeram de cruzamentos divergentes entre
linhas comerciais de sunos e o porco selvagem europeu. De modo geral, em sunos os projetos de
mapeamento tm se valido da estratgia de cruzamentos entre linhas geneticamente divergentes
para produo de populaes experimentais. Nos EUA, tm sido utilizadas as raas chinesas, e as
equipes europias continuam utilizando o porco selvagem europeu e tambm as raas chinesas
para seus cruzamentos divergentes.
No Brasil, em 1998, iniciou-se no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de
Viosa a construo de uma populao segregante de sunos, utilizando como base gentica
fmeas de linhagens comerciais e machos da raa nativa Piau. Estes cruzamentos permitiram a
seleo de animais F1, que por acasalamentos inter se produziram a gerao F2, onde esto em
anlise mais de 500 animais.
O DNA de todos os animais (parentais, F1 e F2) est sendo extrado e armazenado.
Tecidos orgnicos da gerao parental foram coletados no momento do abate para anlise da
expresso de mRNAs. Na granja, os animais F2 tm sido avaliados para crescimento, ganho de
peso, consumo alimentar individual e converso alimentar, espessura de toucinho e rea de olho
de lombo (Tabela 1).
Tabela 1 - Mdia e desvio padro dos dados obtidos de 70 a 105 dias de idade nos animais F2

Caracterstica Mdia Desvio padro

Peso aos 77 dias (kg) 20,74 4,15
Rao consumida (kg) 36,78 8,30
Peso aos 105 dias (kg) 33,18 6,89
Ganho de peso (kg) 12,47 4,13
Ganho de peso dirio (kg) 0,44 0,14
Espessura de toucinho aos 105 dias (cm)* 1,17 0,26
rea de olho de lombo aos 105 dias (cm
2
)* 9,27 7,35

Dados parciais de 123 animais avaliados; * animais vivos.
Em torno dos 65 quilos de peso vivo os animais tm sido abatidos e suas carcaas
avaliadas de acordo com os cortes utilizados na indstria. Basicamente, as caractersticas
mensuradas so: comprimento da carcaa, peso das vsceras, comprimento do intestino
delgado, espessura de toucinho, pH inicial (45 minutos), peso de pernil, lombo, carr, copa,
costela, paleta, cabea, papada, barriga, bacon e rim. Mensura-se tambm a rea do olho do
lombo e a espessura da gordura subcutnea na altura da 11

costela e do bacon (Tabela 2).

Tabela 2 Mdia e desvio padro dos dados coletados ao abate e na avaliao da carcaa e no
rendimento dos cortes dos animais F2

.
Caracterstica Mdia Desvio Padro
Peso da meia carcaa resfriada (kg) 25,18 1,69
Peso total do pernil (kg) 6,76 0,85
Peso do pernil limpo (kg) 4,82 0,43
Peso total da copa (kg) 2,20 0,35
Peso da copa limpa (kg) 1,62 0,26
Peso total da paleta (kg) 4,44 0,52
Peso da paleta limpa (kg) 2,63 0,31
Peso total do carr (kg) 3,40 0,41
Peso do lombo (kg) 1,12 0,17
Peso total do bacon (kg) 2,50 0,36
Espessura do bacon (mm) 24,87 5,90
Peso da costela (kg) 1,61 0,28
Peso total da papada (kg) 0,74 0,19
Peso total da cabea (kg) 1,47 0,19
Comprimento do intestino (m) 18,88 1,57

Dados parciais de 123 animais.
A qualidade da carne esta sendo avaliada principalmente pela cor (valores L, a e b), perda
dgua por gotejamento e cozimento, grau de maciez e pH 24 horas (tabela 3).
Tabela 3 Mdia e desvio padro dos dados obtidos pela anlise da qualidade da carne em
animais F2

.
Caracterstica Mdia Desvio padro
PH 45 minutos ps abate 6,56 0,28
PH 24 horas ps abate 5,66 0,12
Valor L 52,58 2,50
Valor a 1,41 0,75
Valor b 9,74 0,70
Perda de gua por gotejamento (%) 2,81 1,90
Perda de gua por cozimento (%) 33,28 2,88
Maciez (gr) 5563,55 851,01

dados parciais de 123 animais.
O genoma dos animais tem sido estudado por trs estratgias bsicas: 1) Varredura
genmica com microssatlites espalhados aleatoriamente pelos cromossomos sunos, de acordo
com aqueles utilizados pelo US Pig Genome Project, que cedeu os primers fluorescentes ao
Laboratrio de Biotecnologia Animal do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de
Viosa. 2) Genes candidatos, escolhidos de acordo com a funo de suas protenas expressas. 3)
Expresso diferencial de mRNAs em diferentes rgos. Os primers para ddPCR foram tambm
cedidos pelo US Pig Genome Project.
Varredura Genmica
Num ensaio preliminar feito com os animais parentais e gerao F1, foram encontrados
novos alelos para diferentes loci de microssatlites (Tabela 4), o que parece mostrar a divergncia
gentica entre as linhagens e raas escolhidas para a gerao das famlias segregantes. Pode-se
observar que no apenas nos animais da raa nativa foram encontrados novos alelos, mas
tambm nas fmeas comerciais. Deve ser lembrado que uma nova variante allica representa no
apenas uma troca no locus que se estuda, mas pode estar indicando a presena de um bloco
cromossmico at ento no identificado, cujo tamanho em cM depender do grau de desequilbrio
de ligao em que se encontra a populao estudada.
TABELA 4 Dados relativos aos alelos dos marcadores microssatlites encontrados nos animais
parentais.
CROMOSSOMO 05
Microssatlite Alelos encontrados (pb) Alelos ainda no descritos (pb)
S0005
203, 223, 225, 231, 233, 237,
239, 241, 243, 245 e 253
223, 225 e 243 Piau e F1
233, 237, 245 e 253 Comerciais e F1
IGF1
195, 199, 201, 203, 205, 207
e 209
CROMOSSOMO 06
Microssatlite
Alelos encontrados (pb) Alelos ainda no descritos (pb)
SW122
110, 112, 114, 116, 118, 120,
122 e 124
116 Piau, Comerciais e F1
SW1057
142, 150, 156, 162, 166, 174,
176, 180, 184 e 188
142, 162, 176 e 180 Piau e F1
CROMOSSOMO 12
Microssatlite Alelos encontrados (pb) Alelos ainda no descritos (pb)
S0143 154, 158, 160, 162 e 166 158 e 166 Piau e Comerciais
SW874
199, 203, 205, 207, 209 e
211
Inicialmente, a varredura genmica ser feita utilizando 100 a 110 marcadores
espalhados pelo genoma. Numa segunda etapa, ser feito o mapeamento fino (fine mapping) em
que maior nmero de marcadores ser utilizado, enriquecendo as regies de QTLs.
Genes candidatos
Como a diferena fenotpica bsica entre as linhagens parentais est na deposio de
gordura e no crescimento, selecionou-se alguns genes envolvidos no desenvolvimento destas
caractersticas para serem inicialmente estudados. Entre estes so citados: leptina (Lep); receptor
da leptina (rLep), hormnio de crescimento (GH) e fator de crescimento semelhante a insulina I
(IGF-I). Para todos os genes foram construdos primers baseados nas sequncias depositadas em
bancos de dados, incluindo no apenas os exons, mas tambm introns e sequncias reguladoras
upstream. Aps as amplificaes para os quatro genes citados buscou-se na literatura descries
de RFLPs, que possibilitassem a deteco de polimorfismos por meio de enzimas de restrio nos
animais parentais. Entretanto, esta alternativa de anlise se mostrou infrutfera e o
sequenciamento dos amplificados para busca de SNPs mostrou-se necessria. O sequenciamento
foi feito a partir de pools de DNA amplificado, sendo um pool para os machos parentais e trs para
as fmeas.
O hormnio de crescimento participa de diferentes formas no metabolismo, podendo ter
aes tanto anablicas quanto catablicas. Sua ao nos tecidos se d por vias diretas ou
indiretas. No tecido adiposo, por exemplo, sua ao direta, entretanto na maioria dos tecidos, o
GH exerce um papel indireto, mediado pelas somatomedinas, principalmente o IGF-I. Apesar de
ser um gene muito conservado, no apenas dentro da espcie mas tambm entre as diferentes
espcies de mamferos, encontrou-se no GH um fragmento, que aps amplificao e anlise em
gel de poliacrilamida apresentou padro heteromrfico de migrao, o que caracteriza um SSCP
(Single Strand Conformational Polymorphism). Este fragmento foi encontrado no apenas entre os
machos nativos, mas tambm em algumas fmeas comerciais, por esta razo o sequenciamento
deste fragmento foi feito individualmente. Verificou-se aps a edio da sequncia que uma
deleo era a razo para o padro heteromrfico. Alm desta deleo, alguns SNPs foram tambm
encontrados.
Nos outros trs genes, aps a edio das seqncias, foram detectados SNPs tanto para
os machos quanto para as fmeas parentais. Tem sido realizada busca de enzimas de restrio
que detectem estas trocas o que permitir o estabelecimento de um teste diagnstico eficiente
para uso em grande escala, para que o valor fenotpico destas substituies seja testado na
gerao segregante F2.
Expresso gnica diferencial em tecido adiposo
Aps a extrao, limpeza e quantificao do RNA total, as anlises tm sido feitas por dois
protocolos. Quando destinada a ddPCR, o cDNA gerado por primers ncora, e a amplificao
ocorre pelo uso dos mesmos ncoras que geraram o cDNA, acrescidos de primers arbitrrios.
Caso o mRNA seja utilizado para amplificao de genes especficos, RT-PCR, o cDNA gerado
pelo uso de oligo (dt)
12-18
, e a amplificao feita por primers gerados a partir da seqncia do gene
em questo. Para uso em ambos os protocolos, foram preparados quatro pools de RNA total dos
animais parentais, sendo: 1) pool dos machos nativos; 2) 1 pool de fmeas comerciais sem
Pietran (a raa Pietran no entra na composio gentica); 3) 2 pool de fmeas sem Pietran; 4)
pool de fmeas com gentica Pietran.
Pde-se verificar que o nvel geral de expresso gnica no tecido adiposo muito baixo.
Apesar disto, algumas sequncias diferencialmente expressas entre os pools dos animais
parentais foram identificadas. Estas sequncias tm sido extradas do gel de poliacrilamida,
reamplificadas e sequenciadas. A identificao das sequncias diferencialmente expressas tem
sido feita por confronto com o banco de dados disponvel no GenBank, por meio do programa
BLAST. Tm sido encontradas homologias com genes j descritos para humanos e camundongos,
mas principalmente as sequncias tm mostrado similaridade a ESTs j descritos.
Com relao a amplificao de cDNAs especficos, tem se buscado a identificao de
expresso do receptor da leptina. Existe consenso de que este gene no se expressaria no tecido
adiposo, entretanto, alguns autores tem proposto uma ao parcrina para a leptina (SIEGRIST-
KAISER et al. 1997) o que implicaria na existncia de receptores tambm no tecido adiposo. Foi
possvel obter a amplificao do cDNA do gene do receptor da leptina em todos os pools de cDNA.
A possibilidade deste fragmento resultar da amplificao de DNA genmico contaminante pode ser
descartada, pois nesta situao o fragmento seria de maior tamanho, 297 pb contra 145 pb. O
prximo passo ser o sequenciamento deste fragmento amplificado e a comparao com a
seqncia depositada no GenBank para confirmao dos achados. A execuo de Northern Blots
poderia ser outra alternativa, mas a quantidade de RNA extrada a partir de tecido adiposo no tem
se mostrado suficiente.
Consideraes finais
Pouco se sabe a respeito da origem das raas sunas nativas brasileiras. Estes animais
vinham sendo criados em pequenas propriedades rurais onde pela rusticidade e grande adaptao
s condies de manejo precrio exigiam poucos cuidados alimentares e sanitrios, fornecendo s
populaes alm da carne, a banha de que necessitavam (FRANA, 1991). Entretanto, esta
tendncia foi invertida durante a dcada de 90. Poucos so os remanescentes destas raas em
todo o pas.
Alm do seu fentipo relativo a deposio de gordura/carne ser o oposto das raas
comerciais, as raas nativas apresentam extrema resistncia a condies precrias de manejo e
doenas. IRGANG (1986) cita que a preservao do potencial gentico destas raas poderia ser
til, para eventuais cruzamentos destinados a aumentar a rusticidade de animais derivados
exclusivamente de raas importadas.
Somando-se a divergncia existente entre as raas escolhidas para originar a populao
de referncia, com o imenso conhecimento existente sobre o genoma suno, fica claro o potencial
multiplicador destas pesquisas genmicas. Na formao de populaes referncia para estudos de
mapas de ligao e efeitos de QTLs e genes candidatos, estes animais parecem apresentar um
grande potencial que s agora comea a ser explorado, e pelos primeiros resultados que esto
sendo obtidos, pode se dizer que muito h ainda para ser investigado.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Max F. Rothschild, coordenador do US Pig Genome Project
por ceder os primers para as genotipagens dos microssatlites e para as anlises de expresso
diferencial; Ao Prof. Luiz L. Coutinho (ESALQ/USP) pelo auxlio nos sequenciamentos; Ao CNPq,
CAPES e FAPEMIG pelo auxlio financeiro.
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