4.

Cromatografa de lquidos de alta resolucin

TEMA 4. CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIN
4.0. CARACTERSTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
4.0.1. Caracter!t"ca! #$! "#%&rta'te!
4.0.(. E)*"%&! +"!%&'",-e! e' e- +e%arta#e't& +e I'.e'"era Q*#"ca / e'
-&! Ser0"c"&! T1c'"c&! +e "'0e!t".ac"2' +e -a U'"0er!"+a+ +e A-"ca'te
4.1. INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
4.1.1. Rec"%"e'te! %ara -a 3a!e #20"- / !"!te#a! %ara e- trata#"e't& +e -&!
+"!&-0e'te!
4.1.(. S"!te#a! +e ,&#,e&
4.1.2.1. Tipos de bombas
4.1.2.2. Amortiguadores de pulsos
4.1.2.3. Control del caudal y sistemas de programacin
4.1.4. S"!te#a! +e "'/ecc"2' +e #*e!tra
4.1.4. C&-*#'a! %ara cr&#at&.ra3a +e -)*"+&!
4.1.4.1. Columnas analticas
4.1.4.2. Precolumnas
4.1.4.3. Termostatos
4.1.4.4. Tipos de rellenos de la columna
4.1.5. Detect&re!
4.1.5.1. Detectores de absorbancia
4.1.5.2. Detectores de luorescencia
4.1.5.3. Detectores de ndice de reraccin
4.1.5.4. Detector de dispersin de lu!
4.1.5.5. Detectores electro"umicos
4.(. TIPOS DE CROMATOGRAFA 6PLC
4.(.1. Cr&#at&.ra3a +e re%art&
4.2.1.1. Columnas para cromatograa con ases unidas
"umicamente
4.2.1.2. #stablecimiento del m$todo en cromatograa de reparto
4.2.1.3. Aplicaciones de la cromatograa de reparto
4.(.(. Cr&#at&.ra3a +e a+!&rc"2'
4.2.2.1. %eleccin del disol&ente en cromatograa de adsorcin
4.2.2.2. Aplicaciones de la cromatograa de adsorcin
4.(.4. Cr&#at&.ra3a "2'"ca
4.2.3.1. #"uilibrios de intercambio inico
4.2.3.2. 'ellenos de intercambio inico
4.2.3.3. Aplicaciones inorg(nicas de la cromatograa nica
4.2.3.4. Aplicaciones org(nicas y bio"umicas
4.(.4. Cr&#at&.ra3a +e e7c-*!"2' %&r ta#a8&!
4.2.4.1. 'ellenos de columna
4.2.4.2. Aplicaciones de la cromatograa de e)clusin por tama*os
4.0
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.0. CARACTERISTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
4.0.1. Caracter!t"ca! #$! "#%&rta'te!
A%-"cac"&'e! %r"'c"%a-e!: Tcnica de separacin para los materiales menos voltiles e
inicos; anlisis cuantitativo de multicomponentes.
Fe'2#e'& #&-ec*-ar: Reparto entre una solucin lquida y un substrato
9e'ta:a! e' e- a'$-"!"! c*a-"tat"0&: Separa materiales para su eamen por medio de
otras tcnicas.
9e'ta:a! e' e- a'$-"!"! c*a't"tat"0&: !plicacin amplia a los materiales menos voltiles"
anlisis de multicomponentes.
M*e!tra %r&#e+"& +e!ea,-e: #0 m$
L"#"tac"&'e! +e- #1t&+&: Se tarda en desarrollar el mtodo
L"#"tac"&'e! %ara -a #*e!tra: %in$una
4.0.(. E)*"%&! +"!%&'",-e! e' e- +e%arta#e't& +e I'.e'"era Q*#"ca / e' -&!
Ser0"c"&! T1c'"c&! +e I'0e!t".ac"2' +e -a U'"0er!"+a+ +e A-"ca'te
&pto de 'n$eniera (umica
Tres cromat$ra)os S*imad+u.
&etectores de absorbancia ultravioleta" de conductividad inica y de ndices de
re)raccin.
Termostatos para control de la temperatura de la columna.
Servicios Tcnicos de 'nvesti$acin
Tres cromat$ra)os ,S*imad+u" -aters y &ione. todos con posibilidades de $radientes
de concentracin de eluyente.
&etectores de absorcin ultravioleta" ndices de re)raccin" )luorescencia" conductividad"
serie de diodos ,/0. y espectrometra de masas.
Termostatos para control de la temperatura de la columna.
/n inyector automtico de muestras.
4.#
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1ste captulo trata de los cuatro tipos bsicos de cromato$ra)ia en los que la )ase
mvil es un lquido: ,#. cromatografa de reparto; (2) cromatografa de adsorcin, o
lquido- slido; (3) cromatografa inica; y (4. cromatografa de eclusin por
tama!os, o en geles. Todo este captulo tiene relacin con las aplicaciones en columna de
estos cuatro importantes tipos de cromato$ra)ia.
1n una primera etapa la cromato$ra)ia de lquidos se reali+aba en columnas de
vidrio con dimetros de # a 2 cm y lon$itudes de 20 a 200 cm. 1n este tipo de columnas
reali+ Ts3ett sus traba4os ori$inales. 5ara ase$urar unos caudales ra+onables" el
dimetro de las partculas de la )ase estacionaria slida por lo $eneral era de #20 a 600
m. 'ncluso as" los caudales eran ba4os" lle$ando a unas pocas dcimas de mililitro por
minuto. 1n consecuencia" los tiempos de separacin eran lar$os 7a menudo de varias
*oras7. 8os intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de
vaco" o por bombeo no resultaron e)ectivos" puesto que el aumento de caudal ori$inaba
un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en
las $r)icas de la altura de plato )rente al caudal y el resultado era una menor e)icacia.
1n las primeras etapas del desarrollo de la cromato$ra)a de lquidos" los
cient)icos se dieron cuenta de que se podan conse$uir $randes aumentos en la e)icacia
de la columna disminuyendo el tama9o de las partculas de los rellenos. Sin embar$o" no
)ue sino *asta )inales de los a9os sesenta cuando se desarroll la tecnolo$a adecuada
para producir y utili+ar rellenos de tama9o de partcula del orden de los : o #0 m. 1sta
tecnolo$a requiere una instrumentacin so)isticada" que contrasta con las simples colum7
nas de vidrio de la cromato$ra)a de lquidos clsica. 5ara distin$uir estos procedimientos
ms nuevos de los mtodos bsicos" que todava se utili+an con )ines preparativos" se
emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta resolucin ,;58<..
1s incuestionable que la cromato$ra)a de lquidos de alta resolucin es la tcnica
de separacin ms ampliamente utili+ada" con unas ventas anuales de equipos de ;58<
que se aproiman a la ci)ra de cientos de miles de millones de pesetas. 8as ra+ones de la
popularidad de esta tcnica son su sensibilidad" su )cil adaptacin a las determinaciones
cuantitativas eactas" su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o
termolbiles y" sobre todo" su $ran aplicabilidad a sustancias que son de primordial
inters en la industria" en muc*os campos de la ciencia y para la sociedad en $eneral.
!l$unos e4emplos de estos materiales incluyen los aminocidos" protenas" cidos nu7
cleicos" *idrocarburos" carbo*idratos" dro$as" terpenoides" pla$uicidas" antibiticos
esteroides" especies or$anometlicas y una cierta variedad de sustancias inor$nicas.
8a =i$ura 4.# pone de mani)iesto que los distintos procedimientos que utili+an la
cromato$ra)a de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de
aplicacin se re)iere. !s" para solutos con masas moleculares superiores a #0 000" a
menudo se utili+a la cromato$ra)a de eclusin" aunque a*ora tambin es posible tratar
estos compuestos con cromato$ra)ia de reparto en )ase inversa. 5ara especies inicas de
ba4a masa molecular" se utili+a con )recuencia la cromato$ra)ia de intercambio inico.
8os mtodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no inicas. !dems"
este procedimiento se utili+a muc*as veces para la separacin de los inte$rantes de una
serie *omlo$a. 8a cromato$ra)ia de adsorcin se eli$e con )recuencia para separar
compuestos como" por e4emplo" los *idrocarburos ali)ticos de los alco*oles ali)ticos.
4.6
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.#. !plicaciones de la cromato$ra)a de lquidos
5or otro lado" la discusin sobre el ensanc*amiento de banda del tema 6 es
aplicable a la cromato$ra)ia de lquidos. ! continuacin se ilustra el importante e)ecto del
tama9o de partcula del relleno y se describen otras dos causas del ensanc*amiento de
+ona" que a veces son de notable importancia en cromato$ra)ia de lquidos"
E3ect&! +e- ta#a8& +e %artc*-a +e- re--e'&. 1l coe)iciente de trans)erencia de masa de
la )ase mvil es )uncin inversa del cuadrado del dimetro de las partculas que
constituyen el relleno. <omo consecuencia de ello" la e)icacia de una columna de ;58<
debera me4orar espectacularmente cuando disminuye el tama9o de partcula. 5or
e4emplo una reduccin del tama9o de partcula de 42 a > m ori$ina una disminucin de
die+ o ms veces de la altura de plato.
E'!a'c;a#"e't& +e ,a'+a e7trac&-*#'a e' cr&#at&.ra3a +e -)*"+&!. 1n
cromato$ra)ia de lquidos" tiene lu$ar a veces un ensanc*amiento de banda si$ni)icativo
)uera del relleno de la columna. 1ste ensanc*amiento" denominado ensanc"amiento de
#anda etracolumna, tiene lu$ar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como
los que se utili+an en los sistemas de inyeccin" en los detectores y en los tubos que
conectan los distintos componentes del sistema. 1l ensanc*amiento proviene de la di)e7
rente velocidad de )lu4o que *ay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del
tubo y las del centro. <omo consecuencia" la parte central de una banda de soluto se
mueve con ms rapide+ que la peri)eria. 1n cromato$ra)ia de $ases la di)usin compensa
la dispersin etracolumna. Sin embar$o" la di)usin en los lquidos es si$ni)icativamente
menor" y con )recuencia este tipo de ensanc*amiento de banda se *ace evidente.
4.:
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
<uando se utili+an columnas de peque9o dimetro" el ensanc*amiento
etracolumna puede *acerse bastante importante. 1n este caso" todos los es)uer+os *an
de orientarse a la reduccin del radio de los tubos del sistema eternos a la columna.
E3ect& +e- ta#a8& +e #*e!tra e' -a e3"cac"a +e -a c&-*#'a. 8a cantidad de muestra
,$ de muestra?$ de relleno. tambin a)ecta a la e)icacia de la columna. 5ara las
aplicaciones con columnas de reparto y adsorcin" la e)icacia decrece notablemente con
la cantidad de muestra. 1n columnas de )ase inversa el decrecimiento en e)icacia es
muc*o mas peque9o.
4.1. INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
<on ob4eto de alcan+ar un caudal de eluyente ra+onable con rellenos de tama9o
de partcula entre : y #0 m" que" por otra parte" son comunes en la moderna
cromato$ra)ia de lquidos" se requieren presiones de al$unos cientos de @ilos por
centmetro cuadrado. <omo consecuencia de estas elevadas presiones" el equipo
necesario para la ;58< tiende a ser ms so)isticado y caro que el que se utili+a en otros
tipos de cromato$ra)ia. 8a =i$ura 4.6 muestra un esquema de los componentes
)undamentales de un cromat$ra)o de lquidos de alta resolucin tpico. <ada uno de los
componentes se trata en los prra)os que si$uen a continuacin.
=i$ura 4.6. 1squema de un aparato de ;58<
4.4
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.1.1. Rec"%"e'te! %ara -a 3a!e #20"- / !"!te#a! %ara e- trata#"e't& +e -&!
+"!&-0e'te!
/n aparato moderno de ;58< se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o
de acero inoidable" cada uno de los cuales contiene unos 200 m8 de un disolvente. 8os
recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los $ases disueltos 7en
$eneral o$eno y nitr$eno7 que inter)ieren )ormando burbu4as en los sistemas de
deteccin. /n des$asi)icador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco" un
sistema de destilacin" dispositivos para calentar y a$itar los disolventes o" como se
muestra en la =i$ura 4.6" sistemas de difusin que permiten arrastrar los $ases disueltos
)uera de la solucin mediante )inas burbu4as de un $as inerte de ba4a solubilidad. <on
)recuencia estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la )iltracin del polvo y
de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. %o es necesario que los
des$asi)icadores y los )iltros sean partes inte$rantes de los sistemas de ;58< como se
muestra en la =i$ura 4.6. 5or e4emplo" una )orma conveniente de tratar los disolventes
antes de introducirlos en el recipiente" consiste en )iltrarlos mediante el vaco a travs de
un )iltro de poro muy peque9o. 1ste tratamiento elimina los $ases adems de la materia
en suspensin.
/na separacin que utili+a un solo disolvente de composicin constante se
denomina una elucin isocr$tica. <on )recuencia" la e)iciencia de la separacin se
aumenta notablemente por una elucin con gradiente. 1n este caso se utili+an dos ,y a
veces ms. disolventes con una polaridad si$ni)icativamente distinta. /na ve+ comien+a
la elucin" se vara la relacin de los disolventes de )orma pro$ramada" a veces
continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. 8os instrumentos en
la moderna ;58< a menudo estn equipados con unos dispositivos que permiten
introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de me+cla a una
velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los disolventes se puede
modi)icar lineal o eponencialmente con el tiempo.
8a =i$ura 4.: ilustra la venta4a de una elucin con $radiente en la separacin de
una me+cla de clorobencenos. 8a curva ,b. corresponde a la elucin isocrtica con
metanol?a$ua 20:20 ,v?v.. 8a curva ,a. muestra la elucin con $radiente" que se inicia
con una me+cla 40:>0 de los dos disolventes y se va aumentando la concentracin de
metanol un AB?min. Cbsrvese que la elucin con $radiente acorta notablemente el
tiempo de separacin sin sacri)icar la resolucin de los primeros picos. %tese tambin
que la elucin con $radiente produce unos e)ectos similares a los producidos por la
pro$ramacin de temperatura en cromato$ra)a de $ases.
4.1.(. S"!te#a! +e ,&#,e&
8os requisitos para un sistema de bombeo en ;58< son ri$urosos e incluyen:
,#. la $eneracin de presiones por encima de 400 @$?cm
6
" ,6. un )lu4o libre de
pulsaciones" ,:. un intervalo de caudales de 0.# a #0 m8?min" ,4. el control y
reproducibilidad del caudal me4or del 0"2B relativo y ,2. componentes resistentes a la
corrosin ,4untas de acero inoidable o te)ln.. &ebe subrayarse que las altas presiones
que $eneran las bombas de ;58< no constituyen un ries$o de eplosin" debido a que
los lquidos no son muy compresibles. &e este modo" la rotura de un componente del
sistema slo supone una prdida de disolvente. 1s evidente que esta prdida puede
suponer un ries$o de incendio.
4.2
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.:. De4ora de la e)iciencia de la separacin mediante la elucin con $radiente.
<olumna de # m 6.# mm d.i. de acero inoidable" relleno #B 5ermap*ase C&S.
Duestra: 2 8 de bencenos clorados en isopropanol. &etector: )otmetro de /0 ,624
nm.. <ondiciones: temperatura >0E<" presin A0 @$?cm
6
. ,a. elucin con $radiente:
metanol 40B ? a$ua >0B e incremento de la proporcin de metanol a una velocidad de
un AB ? min ,b. 1lucin isocrtica con metanol 20B ? a$ua 20B
4.1.2.1. Tipos de bombas
Se utili+an tres tipos de bombas" cada una con sus propias venta4as y desventa4as:
bombas recprocas" bombas de 4erin$a o de despla+amiento y bombas neumticas o de
presin constante.
8as bombas recprocas" que se utili+an en aproimadamente el F0B de los
sistemas de ;58< comerciali+ados" consisten" por lo $eneral" en una peque9a cmara en
la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por
un motor. &os vlvulas con cierre de bola" que se abren y cierran alternativamente"
controlan el )lu4o del disolvente *acia dentro y *acia a)uera de un cilindro. 8as bombas
recprocas tienen la desventa4a de que producen un )lu4o con pulsaciones" las cuales se
*an de amorti$uar dado que su presencia se mani)iesta como ruido en la lnea base en el
cromato$rama. 1ntre las venta4as de las bombas recprocas se pueden citar su peque9o
volumen interno ,:2 a 400 m8." sus altas presiones de salida ,por encima de los 200
@$?cm
6
." su )cil adaptacin a la elucin con $radiente" y sus caudales constantes" que
son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad
del disolvente.
4.1.2.2. Amortiguadores de pulsos
4.>
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Duc*os de los detectores utili+ados en ;58< son sensibles a variaciones de
)lu4o. /n mtodo sencillo de amorti$uacin contiene un )uelle )leible o un $as
compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la
ener$a de pulsacin. <uando la bomba se rellena esta ener$a se libera para ayudar a
suavi+ar la pulsacin de presin. 8os amorti$uadores electrnicos de pulsos
proporcionan una carrera *acia delante corta y rpida del pistn" y ense$uida la carrera
rpida de recar$a de la bomba. 1l peque9o impulso *acia delante amorti$ua el pulso de
)lu4o llevando disolvente a la presin del sistema.
4.1.2.3. Control del caudal y sistemas de programacin
<omo una parte de sus sistemas de bombeo" muc*os instrumentos comerciales se
equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal
mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la
salida de la bomba. <ualquier di)erencia entre la se9al y un valor preestablecido se utili+a
para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
5or otro lado" la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicin
del disolvente bien sea de una )orma continua o bien de )orma escalonada.
4.1.4. S"!te#a! +e "'/ecc"2' +e #*e!tra
! menudo" el )actor limitante en la precisin de las medidas en cromato$ra)a de
lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. 1l
problema se a$rava por el ensanc*amiento de banda que acompa9a a la sobrecar$a de las
columnas. 5or ello" los volGmenes que se emplean *an de ser muy peque9os" de unas
pocas dcimas de microlitro a tal ve+ 200 8. !dems" se *a de poder introducir la
muestra sin despresuri+ar el sistema.
1n cromato$ra)a de lquidos el mtodo ms ampliamente utili+ado para la
introduccin de la muestra utili+a bucles de muestra" como el que se muestra en la =i$ura
4.4. 1stos dispositivos estn normalmente inte$rados en el equipo cromato$r)ico y *ay
bucles intercambiables que permiten la eleccin de tama9os de muestra desde 2 a 200
8. <on bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de *asta 200
@$?cm
6
con una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin eisten vlvulas
de inyeccin de micromuestras" con bucles con volGmenes de 0"2 a 2 8.
=i$ura 4.4. Hucle de muestra para cromato$ra)a de lquidos.
4.I
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.1.4. C&-*#'a! %ara cr&#at&.ra3a +e -)*"+&!
8as columnas para cromato$ra)a de lquidos se construyen de ordinario con tubo
de acero inoidable de dimetro interno uni)orme. <ientos de columnas empaquetadas
que di)ieren en tama9o y relleno se comerciali+an por distintos )abricantes y su coste
oscila" por lo $eneral" de :0 000 a #00 000 pesetas.
4.1.4.1. Columnas analticas
8a mayora de las columnas para cromato$ra)a de lquidos tienen una lon$itud
entre 2 y :0 cm. 5or lo comGn" las columnas son rectas y se pueden alar$ar" si es
necesario" acoplando dos o ms columnas. 1l dimetro interno de las columnas es a
menudo de 4 a #0 mm y los tama9os de las partculas de los rellenos ms comunes son :"
2 y #0 m.
Tal ve+ la columna ms )recuentemente utili+ada es la de 62 cm de lon$itud y 4.>
mm de dimetro interno" y empaquetada con partculas de 2 m. 1stas columnas tienen
de 40 000 a >0 000 platos?metro.
Tambin" se *an empe+ado a )abricar columnas de alta resolucin ms rpidas" las
cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. 1stas columnas
pueden tener dimetros internos que oscilan entre # y 4.> mm y se rellenan con partculas
de : o 2 m. ! menudo su lon$itud es de : a I.2 cm. 1stas columnas tienen *asta #00
000 platos?metro y presentan la venta4a de la rapide+ y del mnimo consumo de
disolvente. 8a Gltima propiedad es de considerable importancia" puesto que los di7
solventes de alta pure+a que se requieren en cromato$ra)a de lquidos son muy caros.
4.1.4.2. Precolumnas
1n muc*as ocasiones" para aumentar la vida de la columna analtica" se coloca
delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los
disolventes. !dems" en cromato$ra)a lquido7lquido" la precolumna sirve para saturar
la )ase mvil con la )ase estacionaria y as minimi+ar las prdidas de sta en la columna
analtica. 8a composicin del relleno de la precolumna debe ser seme4ante al de la
columna analtica; sin embar$o" el tama9o de partcula es por lo comGn mayor para
minimi+ar la cada de presin.
4.1.4.3. Termostatos
1n muc*as aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura" y las
columnas traba4an a temperatura ambiente. Sin embar$o" muc*as veces si se controla la
temperatura de la columna en unas pocas dcimas de $rado cent$rado" se obtienen
me4ores cromato$ramas. 8a mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente
*ornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de
$rado" desde la temperatura ambiente *asta #20 E<. 5ara poder controlar con precisin la
temperatura" las columnas tambin se pueden colocar en camisas con a$ua que proven$a
de un ba9o a temperatura constante.
4.1.4.4. Tipos de rellenos de la columna
1n cromato$ra)a de lquidos se *an utili+ado dos tipos bsicos de rellenos"
pelicular y de partcula porosa. 1l primero consiste en bolas de vidrio o de polmero" no
porosas y es)ricas con unos dimetros caractersticos de :0 a 40 m. 1n la super)icie de
estas bolas se deposita una capa del$ada y porosa de slice" alGmina o de una resina de
intercambio inico. 5ara al$unas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional"
constituido por una )ase estacionaria lquida que se mantiene )i4a por adsorcin. 8as
bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa super)icial or$nica.
4.A
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
5or lo $eneral" los rellenos peliculares se utili+an ampliamente en las precolumnas y no
en las columnas analticas.
8os tpicos rellenos de partculas porosas de cromato$ra)a de lquidos estn
)ormados por micropartculas porosas con dimetros entre : y #0 m y con la menor
dispersin posible para un tama9o determinado. 8as partculas son de slice" alGmina o
resinas de intercambio inico" aunque la slice es el material ms comGn. 8as partculas
de slice se sinteti+an a$lomerando partculas de slice de tama9os in)eriores al micrn en
unas condiciones tales que se )orman partculas mayores con dimetros muy uni)ormes.
8as partculas que resultan se recubren muc*as veces con pelculas or$nicas" que se
unen qumica o )sicamente a la super)icie.
4.1.5. Detect&re!
! di)erencia de la cromato$ra)ia de $ases" en la cromato$ra)a de lquidos no *ay
detectores tan aplicables universalmente ni tan )iables como los detectores de ioni+acin
de llama y de conductividad trmica. /no de los mayores retos en el desarrollo de la cro7
mato$ra)a de lquidos *a sido el per)eccionamiento de los detectores.
/n detector ideal para cromato$ra)a de lquidos debera poseer todas las
propiedades listadas en relacin con la cromato$ra)a de $ases" con la ecepcin de que
un detector para cromato$ra)a de lquidos no es necesario que sea sensible en un
intervalo tan $rande de temperaturas. !dems" un detector de ;58< debe tener un
volumen interno mnimo a )in de reducir el ensanc*amiento de banda.
8os detectores en cromato$ra)ia de lquidos son de dos tipos bsicos. 8os
detectores #asados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la
)ase mvil" tal como el ndice de re)raccin" la constante dielctrica" o la densidad" que se
modi)ica por la presencia de los analitos. 5or contraste" los detectores #asados en una
propiedad del soluto responden a al$una de las propiedades del soluto" como la
absorbancia /0" )luorescencia" o intensidad de di)usin" que no son propias de la )ase
mvil. 1n la Tabla 4.# se indican los detectores ms comunes empleados en ;58< y
al$unas de sus propiedades ms importantes. /n in)orme de #FA6 sobre :>2 traba4os
publicados en los que tena un papel importante la cromato$ra)ia de lquidos" revel que
el I# B se utili+aban en la deteccin de la absorcin /0" el #2B la )luorescencia" el
2"4B el ndice de re)raccin" el 4":B empleaba medidas electroqumicas y el 4":B
restante otras medidas.
4.1.5.1. Detectores de absorbancia
8a =i$ura 4.2 muestra el esquema de una cubeta de )lu4o en )orma de J para la
medida de la absorbancia de los e)luentes de una columna cromato$r)ica. ! )in de
minimi+ar el ensanc*amiento de banda etracolumna" el volumen de estas cubetas *a de
ser lo menor posible" de modo que los volGmenes se limitan por lo comGn de # a #0 8 y
las lon$itudes de la cubeta de 6 a #0 mm. 8a utili+acin de cubetas de este tipo est
restrin$ida a presiones no mayores de unos 20 @$?cm
6
.
4.F
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Tabla 4.#. <aractersticas de los detectores de ;58<

=i$ura 4.2. <elda de detector ultravioleta en ;58<
Duc*os detectores de absorbancia son dispositivos de doble *a+" en los que uno
de los *aces pasa por la cubeta de )lu4o y el otro a travs de un )iltro que reduce su
intensidad. 5ara comparar las intensidades de los dos *aces se utili+an detectores
)otoelctricos contrastados. Tambin se utili+an instrumentos de un solo *a+. 1n este
caso" las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un
ordenador y al )inal se recuperan para el clculo de la absorbancia.
4.#0
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Detectores de absorbancia ultra&ioleta con iltros. 8os detectores de absorcin /0 ms
simples son los )otmetros de )iltros con una lmpara de mercurio como )uente. 8o ms
comGn en estos casos es aislar la lnea intensa a 624 nm por medio de )iltros; en al$unos
equipos tambin se pueden utili+ar las lneas a 620" :#:" ::4 y :>2 nm empleando otros
)iltros. Resulta obvio que este tipo de detector se utili+a de )orma restrin$ida para
aquellos solutos que absorben a al$una de estas lon$itudes de onda. !l$unos $rupos
)uncionales or$nicos y diversas especies inor$nicas e*iben una banda anc*a de ab7
sorcin a una o ms de esas lon$itudes de onda.
Detectores de absorbancia ultra&ioleta con monocrornadores. 8a mayora de los
)abricantes de instrumentos de ;58< o)recen detectores que consisten en un
espectro)otmetro de barrido con ptica de red. !l$unos se limitan a la radiacin
ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible. Se pueden
ele$ir varios modos operacionales. 5or e4emplo" se puede obtener el cromato$rama
completo a una sola lon$itud de onda o alternativamente" cuando los picos que eluyen
estn su)icientemente separados" se puede ele$ir distinta lon$itud de onda para cada
pico. 1n este caso" debe emplearse el control por ordenador para ele$ir la me4or lon$itud
de onda en cada caso. <uando se desean los espectros completos con )ines de
identi)icacin" se puede parar el )lu4o del eluyente durante un tiempo su)iciente que
permita el barrido de la re$in de lon$itud de onda que interesa.
8os detectores espectro)otomtricos de ultravioleta ms potentes son los
instrumentos de series de diodos. !l$unos )abricantes o)recen este tipo de instrumentos"
que permiten reco$er los datos de un espectro completo en aproimadamente un
se$undo. &e esta )orma" los datos espectrales para cada pico cromato$r)ico se pueden
reco$er y almacenar a medida que van saliendo de la columna. /na de las )ormas de
presentacin de los datos espectrales" que resulta Gtil para la identi)icacin de las
especies y para ele$ir las condiciones de la determinacin cuantitativa" consiste en un
$r)ico tridimensional tal como el que se muestra en la =i$ura 4.>. 1n este caso" los
espectros se obtuvieron a intervalos de cinco se$undos. 8a aparicin y desaparicin de
cada uno de los esteroides en el e)luente de la columna resulta evidente.
=i$ura 4.>. 1spectros de absorcin del e)luente de una columna de ;58<
tomados a intervalos de 2 s para una me+cla de tres esteroides.
4.##
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Detectores de absorbancia en el inrarro+o. <omercialmente se o)recen dos tipos de
detectores de in)rarro4o. 1l primero con barrido de lon$itud de onda que proporcionan
tres se$mentos de )iltro semicirculares. 1l se$undo" muc*o ms so)isticado" es un tipo de
detector in)rarro4o que se basa en los instrumentos de trans)ormada de =ourier.
8as cubetas de los detectores de in)rarro4o son seme4antes a las de radiacin
ultravioleta ecepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de )luoruro
de calcio. 8as lon$itudes de la cubeta oscilan de 0.6 a #.0 mm" y los volGmenes de #.2 a
#0 8. 8os instrumentos de in)rarro4o ms sencillos pueden traba4ar a una o ms
lon$itudes de onda; alternativamente" se pueden obtener los espectros de los picos
parando el )lu4o en su tiempo de elucin. 8os instrumentos con trans)ormada de =ourier
se utili+an de manera anlo$a a los instrumentos de series de diodos para las medidas de
absorbancia ultravioleta que se *an descrito en la seccin anterior.
/na de las mayores limitaciones al uso de los detectores de in)rarro4o se debe a la
ba4a transparencia de muc*os de los disolventes que se utili+an. 5or e4emplo" las bandas
anc*as de absorcin in)rarro4a del a$ua y de los alco*oles impiden prcticamente el uso
de este detector para muc*as aplicaciones.
4.1.5.2. Detectores de luorescencia
8os detectores de )luorescencia para ;58< son seme4antes en dise9o a los
)luormetros y espectro)luormetros. 1n la mayora de ellos" la )luorescencia se detecta
por medio de un detector )otoelctrico colocado perpendicularmente respecto al *a+ de
ecitacin. 8os detectores ms sencillos utili+an una )uente de ecitacin de mercurio" y
uno o ms )iltros para aislar la radiacin )luorescente. 8os )uturos desarrollos en los
detectores de )luorescencia probablemente se basarn en el uso de )uentes de lser
sintoni+ables" las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad.
/na venta4a in*erente a los mtodos de )luorescencia es su alta sensibilidad" que
resulta ser ms de un orden de ma$nitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. 1n
cromato$ra)a de lquidos se *a aprovec*ado esta venta4a para la separacin y
determinacin de los componentes )luorescentes de las muestras.
4.1.5.3. Detectores de ndice de reraccin
1stos detectores miden la di)erencia de ndice de re)raccin" entre el disolvente
que en su camino *acia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el e)luente
de la columna que pasa por la otra mitad. 8os dos compartimentos estn separados por
una placa de vidrio montada a un n$ulo de modo que si las dos disoluciones di)ieren en
el ndice de re)raccin se produce una desviacin de un *a+ de lu+ incidente. 1l des7
pla+amiento del *a+ con respecto a la super)icie )otosensible del detector provoca una
variacin de la se9al de salida" la cual" una ve+ ampli)icada y re$istrada" proporciona el
cromato$rama.
8os detectores de ndice de re)raccin tienen la venta4a de que responden a casi
todos los solutos. 1s decir" son detectores universales anlo$os a los detectores de llama
en cromato$ra)ia de $ases. !dems" son )iables y no dependen del caudal. Sin embar$o"
son muy sensibles a los cambios de temperatura" y se *an de mantener a una temperatura
constante en unas pocas milsimas de $rado cent$rado. 5or otra parte" no son tan
sensibles como la mayora de los otros detectores" y por lo $eneral no se pueden utili+ar
en la elucin con $radiente.
4.#6
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.1.5.4. Detector de dispersin de lu!
Recientemente" se *a comerciali+ado un nuevo tipo de detector $eneral para la
;58<" el detector de dispersin de lu% ,18S&.. 1n este detector" el e)luente de la
columna se pasa a un nebuli+ador donde se convierte en una )ina niebla mediante un )lu4o
de nitr$eno o aire. 8as )inas $otitas se llevan a travs de un tubo de conduccin a tem7
peratura controlada donde tiene lu$ar la evaporacin de la )ase mvil" lo que ori$ina
unas )inas partculas de analito. 8a nube de partculas de analito pasa a travs de un *a+
lser. Dediante un )otodiodo de silicio se detecta la radiacin dispersada
perpendicularmente al )lu4o.
/na de las mayores venta4as de este tipo de detector es que su respuesta resulta
ser aproimadamente la misma para todos los solutos no voltiles. !dems es
notablemente ms sensible que el detector de ndice de re)raccin.
4.1.5.5. Detectores electro"umicos
8os )abricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de
detectores electroqumicos. 1stos dispositivos se basan en cuatro mtodos
electroanalticos que incluyen la amperometra" la voltamperometra" la coulombimetra y
la conductimetra.
4.(. TIPOS DE CROMATOGRAFA 6PLC
4.(.1. Cr&#at&.ra3a +e re%art&
8a cromato$ra)ia de reparto *a lle$ado a ser el tipo de cromato$ra)ia de lquidos
ms ampliamente utili+ado. 1n el pasado" la mayora de las aplicaciones se *an re)erido a
compuestos polares no inicos de ba4a a moderada masa molecular K :000.. Sin
embar$o" recientemente se *an desarrollado al$unos mtodos que *an etendido las
separaciones de reparto a los compuestos inicos.
8a cromato$ra)ia de reparto se puede subdividir en cromato$ra)ia
lquido- lquido y cromatografa con fases unidas qumicamente (enla%adas). 8a di7
)erencia entre estas tcnicas radica en la )orma como se retiene la )ase estacionarla sobre
las partculas soporte del relleno. 1n lquido7lquido" la )ase estacionaria lquida se retiene
sobre la super)icie del soporte por adsorcin )isica. 1n )ase unida qumicamente" la )ase
estacionaria se une qumicamente a la super)icie del soporte. 8a cromato$ra)ia de
reparto" al principio era del tipo lquido7lquido; sin embar$o" en la actualidad los
mtodos de )ase enla+ada son los que predominan debido a las desventa4as de los
sistemas lquido7lquido. /na de esas desventa4as es la prdida de )ase estacionaria por
disolucin en la )ase mvil" lo que *ace necesario un peridico recubrimiento de las
partculas del soporte. 5or otra parte" el problema de la solubilidad de la )ase estacionaria
impide el uso de los rellenos de )ase lquida en la elucin con $radiente. 8a discusin se
centrar eclusivamente en la cromato$ra)ia de reparto con )ases unidas qumicamente.
4.2.1.1. Columnas para cromatograa con ases unidas "umicamente
1n cromato$ra)ia de reparto" los soportes para casi todos los rellenos con )ases
unidas qumicamente se preparan con slice r$ida o composiciones constituidas
bsicamente por slice. 1stos slidos estn )ormados por partculas mecnicamente
resistentes" porosas y uni)ormes" con dimetros de :" 2 o #0 m. 8a super)icie de la slice
totalmente *idroli+ada est constituida por $rupos SiC; qumicamente reactivos. 8as
super)icies de slice caractersticas contienen cerca de A mol?m
6
de $rupos SiC;.
4.#:
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
8os recubrimientos de )ase enla+ada ms utili+ados son los siloanos" que se
)orman por reaccin de la super)icie *idroli+ada con un or$anoclorosilano.
'ellenos de ase in&ersa y de ase normal. 1n relacin con las polaridades
relativas de las )ases mvil y estacionaria" se distin$uen dos tipos de cromato$ra)ia de
reparto. 'nicialmente" la cromato$ra)a de lquidos utili+aba )ases estacionarias de elevada
polaridad tales como el a$ua o el trietilen$licol colocadas sobre partculas de slice o
alGmina. 5or ra+ones *istricas" a este tipo de cromato$ra)ia se le conoce a*ora como
cromatografa en fase normal. 1n la cromatografa en fase in&ersa (o re&ersa), la )ase
estacionaria es no polar" con )recuencia se trata de un *idrocarburo" y la )ase mvil es
relativamente polar ,como el a$ua" el metanol o el acetonitrilo.. 1n cromato$ra)ia en )ase
normal" el componente menos polar se eluye primero" debido a que relativamente es el
ms soluble en la )ase mvil y un aumento de la polaridad de la )ase mvil provoca una
disminucin del tiempo de elucin. 5or contraste" en los mtodos en )ase inversa" los
componentes ms polares aparecen primero" y un aumento de la polaridad de la )ase
mvil aumenta el tiempo de elucin.
8os rellenos de )ase enla+ada se clasi)ican como de )ase inversa cuando el
recubrimiento unido qumicamente tiene un carcter no polar" y de )ase normal cuando el
recubrimiento contiene $rupos )uncionales polares. Tal ve+ las tres cuartas partes de toda
la cromato$ra)la de lquidos de alta resolucin se llevan a cabo normalmente con rellenos
de )ase inversa. 5or lo $eneral" el $rupo R del siloano en estos recubrimientos es una
cadena <
A
,n7octilo. o una cadena <
#A
,n7octadecilo.. 1n estas preparaciones" los $rupos
de *idrocarburo de cadena lar$a se alinean el uno 4unto al otro y en perpendicular a la
super)icie de la partcula" dando una estructura seme4ante a una broc*a o a un cepillo.
8a =i$ura 4.I ilustra el e)ecto de la lon$itud de la cadena del $rupo alquilo sobre
la e)iciencia. <omo se esperaba" las cadenas ms lar$as ori$inan rellenos que muestran
una mayor retencin. !dems" una mayor lon$itud de la cadena permite una mayor
cantidad de muestra.
1n la mayora de las aplicaciones de la cromato$ra)ia en )ase inversa" la elucin se
lleva a cabo con una )ase mvil de elevada polaridad como es el caso de una solucin
acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como metanol" acetonitrilo
o tetra*idro)urano. Se *a de procurar que el p; sea menor de" aproimadamente" I"2
porque si no puede tener lu$ar la *idrlisis del siloano" lo que ori$inara la de$radacin
o destruccin del relleno.
<on rellenos de )ase enla+ada en )ase normal" R en la estructura del siloano es
un $rupo )uncional polar como es el caso de los $rupos ciano ,7<
6
;
4
<%." diol
,7<
:
;
>
C<;
6
<;C;<;
6
0;." amino ,7<
:
;
>
%;
6
. y los dimetilamino ,7<
:
;
>
%,<;
:
.
6
. 8as
polaridades de estos materiales de relleno varan en un $ran intervalo" siendo el tipo
ciano el menos polar y el tipo amino el ms polar. 8os rellenos de diol son de una
polaridad intermedia. <on los rellenos de )ase normal" la elucin se reali+a con
disolventes relativamente no polares" tales como el etilter" el cloro)ormo y el n7*eano.
4.#4
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.I. 1)ecto de la lon$itud de la cadena en la e)iciencia de las columnas de siloano
en )ase inversa empaquetadas con partculas de 2 m. =ase mvil: 20?20 metanol?a$ua.
<audal # m8?min
4.2.1.2. #stablecimiento del m$todo en cromatograa de reparto
1n cromato$ra)ia de lquidos" el establecimiento del mtodo tiende a ser ms
comple4o que en cromato$ra)ia de $ases" debido a que cuando la )ase mvil es lquida"
los componentes de la muestra interaccionan con ambas )ases" la estacionaria y la mvil.
5or el contrario" en la cromato$ra)la de $ases" la )ase mvil se comporta como un $as
ideal y no contribuye al proceso de separacin; slo sirve como portador de los
componentes de la muestra a travs de la )ase estacionaria. 1s decir" en cromato$ra)a de
$ases" el que la )ase mvil sea *elio" nitr$eno o *idr$eno no a)ecta si$ni)icativamente a
la separacin. Duy al contrario" el ito de una separacin cromato$r)ica de reparto
depende de que la )ase mvil sea acetonitrilo" *eano o bien dioano.
%eleccin de la columna en las separaciones cromatogr(icas de reparto. /na
buena cromato$ra)a con )ases mviles interactivas" requiere un equilibrio adecuado
entre las )uer+as intermoleculares eistentes entre los tres participantes activos en el
proceso de la separacin 7el soluto" la )ase mvil y la )ase estacionaria. 1stas )uer+as
intermoleculares se describen cualitativamente en trminos de polaridad relativa de cada
uno de los reactivos. 8as polaridades en orden creciente para varios $rupos )uncionales
del analito son: *idrocarburos K teres K steres K cetonas K alde*dos K amidas K
aminas K alco*oles. 1l a$ua es ms polar que cualquier compuesto que conten$a al$uno
de los anteriores $rupos )uncionales.
!l ele$ir una columna para una separacin cromato$r)ica de reparto" la
polaridad de la )ase estacionaria *a de ser bastante similar a la de los analitos" y para la
elucin se utili+a entonces una )ase mvil con una polaridad considerablemente distinta.
1ste procedimiento por lo $eneral resulta ms adecuado que si las polaridades del soluto
y de la )ase mvil son parecidas pero di)ieren muc*o con respecto a la )ase estacionaria.
1n este caso" la )ase estacionaria a menudo no puede competir e)ectivamente por los
componentes de la muestra" y los tiempos de retencin se *acen demasiado cortos para
las aplicaciones prcticas. 1n el otro etremo" por supuesto" se encuentra el caso de que
las polaridades del soluto y de la )ase estacionaria sean demasiado parecidas y totalmente
distintas de la )ase mvil; en estas circunstancias" los tiempos de retencin se *acen
ecesivamente lar$os.
4.#2
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1n resumen pues" si se quieren obtener buenas separaciones en un tiempo
ra+onable" las polaridades del soluto" de la )ase mvil y de la )ase estacionaria se *an de
armoni+ar cuidadosamente. 5or des$racia" las teoras que relacionan las interacciones de
la )ase mvil y la )ase estacionaria con una serie determinada de componentes de una
muestra son imper)ectas" y en el me4or de los casos" un cient)ico slo puede ele$ir la
)ase estacionaria de una manera $eneral. /na ve+ *ec*a la eleccin" el cient)ico *a de
reali+ar una serie de ensayos tentativos obteniendo los cromato$ramas con varias )ases
mviles *asta que se lle$a a una separacin satis)actoria. Si la resolucin de todos los
componentes de la me+cla resulta imposible" se *a de ele$ir otro tipo de columna.
%eleccin de la ase m&il en la cromatograa de reparto
&e los tres mtodos para me4orar la resolucin de una columna cromato$r)ica
basados en la variacin del nGmero de platos" )actor de capacidad @L y )actor de
selectividad " en cromato$ra)ia de lquidos" el )actor de capacidad @L es el que ms
)cilmente se puede manipular de los tres" debido a que este parmetro depende consi7
derablemente de la composicin de la )ase mvil. Tal como se *a subrayado
anteriormente" para una e)iciencia ptima" @L debera estar en el intervalo comprendido
entre 6 y 2; sin embar$o" para me+clas comple4as" este intervalo se *a de etender tal ve+
de 0.2 a 60 para que todos los picos de los componentes ten$an tiempo de aparecer.
1n al$unas ocasiones" el a4uste de @' no es su)iciente para obtener picos
individuales sin superposicin y entonces se *a de recurrir a la variacin de los )actores
de selectividad. &e nuevo en este caso" la )orma ms simple de producir variaciones en
es modi)icando la composicin de la )ase mvil" procurando sin embar$o" mantener @L
dentro de un intervalo ra+onable. !lternativamente" se puede cambiar eli$iendo un
relleno de columna distinto.
#ecto de la uer!a del disol&ente sobre los actores de capacidad. 8os
disolventes que interaccionan )uertemente con los solutos a menudo se les denomina
disolventes M)uertesN o disolventes polares. 5ara describir cuantitativam"ente la polaridad
de los disolventes" se *an desarrollado varios ndices. 1l ms Gtil para la cromato$ra)a
de reparto parece ser el ndice de polaridad () desarrollado por Synder. 1ste parmetro
se basa en las medidas de la solubilidad para la sustancia en cuestin en tres disolventes:
dioano ,un aceptor de protones de dipolo dbil." nitrometano ,un aceptor de protones
de dipolo intenso. y el etanol ,un donador de protones de dipolo intenso.. 1l ndice de
polaridad es una medida numrica de la polaridad relativa de varios disolventes. 8a Tabla
4.6 lista los ndices de polaridad ,y otras propiedades. para varios disolventes que se
utili+an en cromato$ra)ia de reparto. Cbsrvese que el ndice de polaridad vara de #0.6
para un compuesto muy polar como el a$ua *asta 6 para los )luoroalcanos muy poco
polares. <ualquier ndice de polaridad que se desee entre esos lmites se puede conse$uir
por me+cla de dos disolventes adecuados.
!nteriormente se *a subrayado que la )orma ms )cil de me4orar la resolucin
cromato$r)ica de dos especies es manipulando el )actor de capacidad @L, el cual puede a
su ve+ modi)icarse cambiando el ndice de polaridad del disolvente. 1n este caso" el
control de 5L se consi$ue con )acilidad utili+ando )ases mviles consistentes en me+clas
de dos disolventes. 5or lo comGn" un cambio de 6 unidades en 5L ori$ina ,muy
aproimadamente. una variacin de die+ veces en @L
4.#>
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Tabla 4.6. 5ropiedades de las )ases mviles cromato$r)icas mas comunes
Duc*as veces" en las separaciones en )ase inversa" se emplea una me+cla de
disolventes )ormada por a$ua y un disolvente or$nico polar. 1l )actor de capacidad se
manipula entonces )cilmente variando la concentracin de a$ua. 1l e)ecto de estas
manipulaciones se puede observar en los cromato$ramas de las =i$uras 4.A a y b" donde
la muestra es una me+cla de seis esteroides. <on una me+cla del 4# B de acetonitrilo y
2FB de a$ua" @L tiene un valor de 2" y los dems analitos se eluyen en un tiempo tan
corto ,aproimadamente 6 min. que la separacin resulta bastante incompleta. !l
aumentar el porcenta4e de a$ua a I0" la elucin tiene lu$ar en I min" lo que dobla el valor
de @L. 1n estas circunstancias el tiempo total de elucin es su)iciente para permitir la
separacin" aunque el valor de al)a para los compuestos # y : no sea lo su)icientemente
$rande para una buena resolucin.
,nluencia de la ase m&il en las selecti&idades. 1n muc*os casos" a4ustar @L a
un nivel adecuado es todo lo que se necesita para una separacin satis)actoria. Sin
embar$o" cuando todava se superponen dos bandas" como en la =i$ura 4.Ab" se *a de
procurar aumentar el )actor de selectividad para las dos especies. 1sta variacin se
puede llevar a cabo convenientemente cambiando la naturale+a qumica de la )ase mvil
mientras se mantiene ms o menos el mismo valor de @L.
5ara la cromato$ra)a en )ase inversa se *a desarrollado un procedimiento de
optimi+acin de cuatro disolventes que permite establecer el sistema que" en teora"
resolver una me+cla dada en el mnimo tiempo. 1n este caso" se *an utili+ado tres
disolventes compatibles para a4ustar los valores de . Se incluyen metanol" acetonitrilo y
tetra*idro)urano. 1l a$ua se emplea para a4ustar la )uer+a de la me+cla y de este modo
conse$uir un valor adecuado de @L.
8a =i$ura 4.A ilustra la sistemtica empleada para el desarrollo de la separacin
de seis esteroides por cromato$ra)ia en )ase inversa basada en cuatro disolventes. 8os
dos primeros cromato$ramas muestran los resultados iniciales para determinar el valor
mnimo de @L que se requera. <on un @L de #0 eiste espacio su)iciente en la escala de
tiempos para la separacin de picos; sin embar$o" en estas condiciones los valores de
para los componentes # y : ,y en menos etensin para 2 y >. no son su)icientemente
$randes como para obtener una separacin satis)actoria. <on el ob4etivo de encontrar
4.#I
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
unos me4ores valores de se reali+aron ensayos adicionales; en todos los casos la
proporcin de a$ua se a4ustaba para obtener una @L de #0. 1n las =i$uras 4.A c y d se
muestran los resultados obtenidos en los ensayos con las me+clas metanol?a$ua y
tetra*idro)urano?a$ua. Se reali+aron eperimentos adicionales variando sistemticamente
los pares de disolventes or$nicos ,en cada caso @L se a4ustaba a #0 mediante el a$ua..
=inalmente" la me+cla mostrada en la =i$ura 4.Ae se eli$i como la me4or )ase mvil para
la separacin del $rupo particular de compuestos ensayado.
=i$ura 4.A. Sistemtica eperimental para la separacin de los seis esteroides. 1n ,a. y
,b. se muestra el uso del a$ua para el a4uste de @L. 8os e)ectos de la variacin de a @L
constante se muestran en ,b." ,c." ,d. y ,e.. <olumna: 0.4 #20 mm empaquetada con
partculas de 2 m con )ase inversa enla+ada <
A
. Temperatura: 20E<. <audal: : cm
:
?min.
&etector: /07624 nm. <ompuestos: ,#. prednisona; ,6. cortisona; ,:. *idrocortisona;
,4. deametasona; ,2. corticosterona; ,>. cortoeolona.
4.#A
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1n )ase normal se *a utili+ado un sistema de cuatro disolventes similar" en el cual los
disolventes para el control de la selectividad son etileter" cloruro de metileno y
cloro)ormo; para el a4uste de la )uer+a del disolvente se utili+a n7*eano. <on este
sistema de cuatro disolventes" se dice que es posible la optimi+acin con un nGmero
mnimo de ensayos.
4.2.1.3. Aplicaciones de la cromatograa de reparto
8os rellenos con )ases unidas qumicamente" cuando se utili+an en )ase inversa en
combinacin con disolventes muy polares ,a menudo acuosos. se aproiman al sistema
ideal y universal para la cromato$ra)a de lquidos. 5ara investi$ar la separacin de
nuevos tipos de muestras" estos son los rellenos que se utili+an en primer lu$ar debido a
su amplio intervalo de aplicabilidad" su adecuacin" y a la )acilidad con que pueden
modi)icarse @L y variando las )ases mviles acuosas.
8a Tabla 4.: enumera unos cuantos e4emplos caractersticos entre la $ran
variedad de aplicaciones de la cromato$ra)ia de reparto en diversos campos. 8a =i$ura
4.F ilustra dos de los muc*os miles de aplicaciones de la cromato$ra)a de reparto con
)ases unidas qumicamente para el anlisis de materiales de consumo e industriales.
Tabla 4.:.
4.(.(. Cr&#at&.ra3a +e a+!&rc"2'
8a cromato$ra)a de adsorcin" o lquido7slido" es la )orma clsica de
cromato$ra)a de lquidos que introdu4o Ts3ett por ve+ primera a principios de este
si$lo. Ds recientemente" se *a convertido en un mtodo importante de ;58<.
8as Gnicas )ases que se utili+an en ;58< lquido7slido son la slice y la alGmina"
siendo la primera la que se pre)iere para casi todas las aplicaciones debido a su mayor
capacidad de car$a y a su mayor diversidad de presentaciones. <on pocas ecepciones"
las caractersticas de adsorcin de los dos adsorbentes son similares. <on ambos" el
orden de tiempos de retencin es: ole)inas K *idrocarburos aromticos K *aluros O
sul)uros K teres K nitrocompuestos K esteres O alde*dos O cetonas K alco*oles O
aminas K sul)onas K sul)idos K amidas K cidos carbolicos.
4.#F
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.F. !plicaciones de la cromato$ra)a de )ase enla+ada. ,a. !ditivos en bebidas
re)rescantes. <olumna 4.> 620 mm empaquetada con rellenos de )ase enla+ada polares
,nitrilo.. &isolvente en modo isocrtico: <;
:
C; >B ? ;
6
C F4B. <audal # m8?min.
,b. 'nsecticidas or$ano)os)orados. <olumna 4.2 620 mm empaquetada con partculas
de 2 m con )ase enla+ada <
A
. Pradiente de <;
:
C; >IB ? ;
6
C ::B a <;
:
C; A0B ?
;
6
C 60B. <audal 6 m8?min. 1n ambos casos la deteccin /0 es a 624 nm.
4.2.2.1. %eleccin del disol&ente en crornatograa de adsorcin
1n cromato$ra)ia lquido7slido" la Gnica variable que se puede utili+ar para
optimi+ar @Q y es la composicin de la )ase mvil ,por contraste con la cromato$ra)ia
de reparto" donde el relleno de la columna tiene un e)ecto acusado sobre ..
!)ortunadamente" en la cromato$ra)a de adsorcin" las modi)icaciones del disolvente
provocan una $ran variacin en la resolucin y en el tiempo de retencin" y casi siempre
se suele encontrar la )ase mvil adecuada.
-uer!a del disol&ente. 1n cromato$ra)ia de adsorcin se *a comprobado que el
ndice de polaridad 5L" que se *a descrito anteriormente" puede servir como una $ua de
la )uer+a de los disolventes. Sin embar$o" un ndice muc*o me4or es la fuer%a eluyente
0
que es la ener$a de adsorcin del disolvente por unidad de super)icie. 1ste parmetro
depende del adsorbente" siendo los valores de
0
para la slice 0.A veces los de la alGmina.
1n la Tabla 4.6" los valores de
0
de la Gltima columna corresponden a la alGmina.
Cbsrvese que las di)erencias entre disolventes con respecto a
0
se corresponden
bastante bien con las que se dan entre los valores de 5Q.
#leccin de los disol&entes. 1l procedimiento para la eleccin del disolvente en
cromato$ra)a de adsorcin es seme4ante al descrito para las separaciones de reparto. 1s
4.60
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
decir" se eli$en dos disolventes compatibles" uno de los cuales es demasiado )uerte ,
0
demasiado $rande. y el otro resulta ser demasiado dbil. 0ariando la relacin entre los
dos disolventes se puede obtener el valor adecuado para @Q. Se *a encontrado que un
aumento de 0.02 unidades en el valor de
0
por lo $eneral disminuye : o 4 veces los
valores de @L. &e este modo" se pueden conse$uir $randes variaciones de @L, y casi
siempre se puede encontrar un sistema binario entre los disolventes de la Tabla 4.6 que
proporcione unos tiempos de retencin adecuados para cualquier tipo de muestra. 5or
des$racia"
0
no vara linealmente con la relacin de volGmenes" como era el caso de 5Q
en la cromato$ra)a de reparto; por ello es ms di)cil calcular la me+cla ptima para la
separacin.
<uando se presenta una superposicin de picos" el cambio de un disolvente )uerte
por otro" manteniendo @L ms o menos constante" permite cambiar los valores de y a
menudo obtener la resolucin que se desea. 1stas pruebas de tanteo son tediosas y a
veces resultan inGtiles.
=i$ura 4.#0. !plicacin tpica de cromato$ra)a de adsorcin: separacin de cis y trans
pira+olina. <olumna #00 0.: cm" slice pelicular. =ase mvil: 20B cloruro de metileno ?
isooctano. <audal 0.62 m8?min. &etector /0 624 nm.
4.2.2.2. Aplicaciones de la cromatograa de adsorcin
8a =i$ura 4.# indica que la cromato$ra)ia de adsorcin es ms adecuada para
compuestos no polares probablemente con masas moleculares in)eriores a 2000. 8os
mtodos de cromato$ra)a de adsorcin y los de reparto" aunque en al$Gn caso se
superponen" tienden a ser complementarios.
1n $eneral" la cromato$ra)a lquido7slido es ms adecuada para muestras que
son solubles en disolventes no polares" y que por tanto tienen una solubilidad limitada en
4.6#
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
los disolventes acuosos que son los que se utili+an en los procedimientos de reparto en
)ase inversa. <omo en cromato$ra)a de reparto" los compuestos que tienen distintos
$rupos )uncionales por lo $eneral se pueden separar" /na caracterstica particular de la
cromato$rar)a de adsorcin" que no es compartida por otros mtodos" es su capacidad
para di)erenciar compuestos ismeros. 8a =i$ura 4.#0 ilustra una aplicacin
caracterstica de la cromato$ra)ia de adsorcin.
4.(.4. Cr&#at&.ra3a "2'"ca
8a cromato$ra)a inica est relacionada con los mtodos modernos y e)icaces
para la separacin y determinacin de iones que se basan en el uso de las resinas de
intercambio inico. 8a cromato$ra)a inica empe+ a desarrollarse a mediados de los
a9os setenta" cuando se demostr que mediante las columnas de ;58< rellenas con
resinas de intercambio catinico o aninico" se podan resolver )cilmente me+clas de
cationes o aniones. 5or entonces" la deteccin se reali+aba por lo $eneral con medidas de
conductividad.
8a cromato$ra)ia inica se desarroll durante el proyecto Dan*attan que
optimi+aba la separacin con resinas de intercambio catinico de los cationes de las
tierras raras estrec*amente relacionados. 1ste espectacular traba4o" en el cual se basa la
teora de las separaciones por intercambio inico" se etendi tras la 6R Puerra Dundial a
muc*os otros tipos de materiales y al )inal condu4o a los mtodos automati+ados para la
separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en me+clas comple4as. 1l
desarrollo de la ;58< moderna empe+ a )inales de los a9os sesenta" pero su aplicacin
a la separacin por intercambio inico se retras debido a la ineistencia de un mtodo
$eneral y sensible para la deteccin de especies como los cationes alcalinos y
alcalinotrreos" y aniones como los *aluros" acetato y nitrato. 1sta situacin se remedi
en #FI2 al desarrollarse por tcnicos de &o3 <*emical <ompany la tcnica de supresin
del e)luente" la cual *ace posible la deteccin conductimtrica de los iones eluidos. 1sta
tcnica se describe posteriormente.
4.2.3.1. #"uilibrios de intercambio inico
8os procesos de intercambio inico se basan en los equilibrios de intercambio
entre los iones de una disolucin y los iones del mismo si$no que estn en la super)icie
de un slido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble. &urante varias
dcadas se *an utili+ado intercambiadores inicos naturales como las arcillas y las
+eolitas. ! mediados de los a9os treinta se )abricaron por primera ve+ resinas de
intercambio inico sintticas para eliminar la dure+a del a$ua" la desioni+acin del a$ua y
la puri)icacin de las disoluciones. 8os puntos activos ms comunes en las resinas de
intercambio catinico son los $rupos de cido sul)nico 7S0
:
7
;
S
" un cido )uerte" y los
$rupos de cido carbolico T<CC
7
;
S
" un cido dbil. 8os intercambiadores aninicos
contienen $rupos de amina cuaternaria T%,<;
:
.
:
S
C;
7
o $rupos de amina ternaria
primaria T%;
:
S
C;
7
los primeros son de base )uerte y los Gltimos de base dbil.
<uando un intercambiador inico de cido sul)nico se pone en contacto con un
disolvente acuoso que contiene cationes D
S
" se establece un equilibrio de intercambio
entre este catin y el ;
S
de los $rupos

sul)nicos de la resina. &e )orma seme4ante" se
comporta un intercambiador de cido dbil. 1n el caso de los intercambiadores aninicos
el equilibrio se establece entre el anin del disolvente acuoso y los C;
7
de los $upos
amina de la resina polimrica.
4.66
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1stos equilibrios pueden ser modeli+ados usando la constante de equilibrio U
e
de)inida por la ley de accin de masas aplicada a cada uno de los equilibrios de
intercambio. 1sta U
e
representa la a)inidad de la resina por los iones en disolucin D
S
relativa a otro ion ,en este caso" ;
S
.. <uando U
e
" es un valor alto" la )ase slida tiene
una $ran tendencia a retener los iones D
S
y cuando U
e
" es peque9a sucede lo contrario.
Seleccionando un ion de re)erencia comGn como el ;
S
" se pueden comparar
eperimentalmente las constantes de distribucin de distintos iones para una resina dada.
1stos eperimentos demuestran que los iones polivalentes se retienen muc*o ms
)uertemente que las especies con una sola car$a. Sin embar$o" dentro de un $rupo con la
misma car$a" se dan di)erencias relacionadas con el tama9o del ion *idratado y con otras
propiedades. &e este modo" para una resina tpica de intercambio catinico con $rupos
sul)nicos" los valores de U
e
" disminuyen se$Gn el orden Tl
S
V !$
S
V <s
S
V Rb
S
V U
S
V
%;
4
S
V %a
S
V ;
S
V 8i
S
. 5ara los cationes divalentes" el orden es Ha
6S
V 5b
6S
V Sr
6S
V <a
6S
V %i
6S
V <d
6S
V <u
6S
V <o
6S
V Jn
6S
VD$
6S
V/0
6
6S
.
5ara los aniones" U
e
" en las resinas de base )uerte disminuye en el orden SC
4
67
V
<
6
C
4
67
V '
7
V %C
:
7
V Hr
7
V <l
7
V ;<C
6
7
V <;
:
<C
6
7
V C;
7
V =
7
. 1sta secuencia debera
considerarse slo como una aproimacin" pues depende en parte de la resina y de las
condiciones eperimentales.
4.2.3.2. 'ellenos de intercambio inico
;istricamente" en cromato$ra)a de intercambio inico se *an empleado
peque9as partculas es)ricas porosas que se )orman en la copolimeri+acin del estireno y
del divinilbenceno emulsionados. 8a presencia de divinilbenceno ,normalmente en un
AB. ori$ina una polimeri+acin entrecru+ada que imparte estabilidad mecnica a las
bolitas. <on ob4eto de activar el polmero )rente a los iones" a la estructura se le unen
qumicamente $rupos )uncionales cidos o bsicos. 8os $rupos ms comunes son el
cido sul)nico y las aminas cuaternarias.
8as partculas polimricas porosas no resultan del todo adecuadas como rellenos
cromato$r)icos debido a la ba4a velocidad de di)usin de las molculas de los analitos a
travs de los microporos de la matri+ polimrica" y tambin debido a la compresibilidad
de la matri+. 5ara solventar este problema" se *an desarrollado dos nuevos tipos de
rellenos que se utili+an ms que el tipo de polmero poroso. /no es el relleno de
partcula pelicular en el que la super)icie relativamente $rande ,de :0 a 40 m. de una
partcula" es)rica y no porosa" de vidrio o polimrica se recubre con una resina sinttica
de intercambio inico. /n se$undo tipo de relleno se prepara recubriendo
micropartculas porosas de slice" tal como las que se utili+an en la cromato$ra)ia de
adsorcin" con una del$ada pelcula del intercambiador. <on cualquiera de ellas" se
obtiene un aumento de la e)icacia debido a que la di)usin en el polmero es ms rpida.
5or otra parte" la capacidad de car$a de estos rellenos es menor" especialmente los de
tipo pelicular.
4.6:
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.2.3.3. Aplicaciones inorg(nicas de la cromatograa nica
8a )ase mvil en cromato$ra)a de intercambio inico *a de tener las mismas
propiedades $enerales que se requieren para los otros tipos de cromato$ra)a. 1s decir"
*a de solubili+ar la muestra" tener una )uer+a de disolvente que condu+ca a tiempos de
retencin ra+onables ,valores de @Q adecuados." y debe interaccionar con los solutos de
tal )orma que )avore+ca la selectividad ,valores de adecuados.. 1n cromato$ra)a
inica las )ases mviles suelen ser disoluciones acuosas que pueden contener cantidades
moderadas de metanol u otros disolventes or$nicos miscibles con el a$ua; estas )ases
mviles" a menudo contienen especies inicas en )orma de disolucin re$uladora. 8a
)uer+a eluyente y la selectividad se determinan por el tipo y concentracin de esos
in$redientes a9adidos. 1n $eneral" los iones de la )ase mvil compiten con los iones del
analito por los puntos activos del relleno del intercambiador inico.
Cromatograa inica con columnas supresoras. <omo se *a se9alado
anteriormente" la aplicacin de la cromato$ra)ia inica para la determinacin de especies
inor$nicas no se desarroll debido a la )alta de un buen sistema de deteccin universal"
que permitiera la determinacin cuantitativa basada en las reas de los picos
cromato$r)icos. 8os detectores de conductividad eran la eleccin obvia para este
ob4etivo. 1stos detectores pueden tener una elevada sensibilidad" son universales para las
especies car$adas y" como norma $eneral" responden de una )orma predecible a los
cambios de concentracin. 5or otra parte" dic*os detectores son simples" baratos de
)abricar y mantener" )ciles de miniaturi+ar" y por lo comGn son robustos y de prolon$ada
duracin. 8a Gnica limitacin de los detectores de conductividad result ser un serio
problema que impidi su uso $enerali+ado. 1sta limitacin proviene de la elevada
concentracin de electrlito que se requiere para eluir la mayora de los iones analito en
un tiempo ra+onable. 1n consecuencia" la conductividad de los componentes de la )ase
mvil tiende a enmascarar la de los analitos" y por ello se reduce considerablemente la
sensibilidad del detector.
1n #FI2" el problema de la elevada conductividad del eluyente se resolvi
mediante la introduccin de la denominada columna supresora que se utili+a
inmediatamente a continuacin de la columna de intercambio inico. 8a columna
supresora est rellena con una se$unda resina de intercambio inico" que convierte
e)ica+mente los iones del disolvente en especies moleculares poco ioni+adas" sin alterar
los iones del analito. 5or e4emplo" cuando se separan y determinan cationes" se eli$e en
muc*as ocasiones el cido clor*drico como reactivo eluyente" y la columna supresora es
una resina de intercambio aninico en la )orma *idrido. 1l producto de la reaccin en
la columna supresora es a$ua. 1sto es"
;
S
,ac. S <l
7
,ac. S Resina
S
C;
7
,s. Resina
S
<#
7
,s. S ;
6
C
1s evidente que los cationes analito no se retienen en esta se$unda columna.
5ara la separacin de aniones" el relleno supresor es la )orma cida de una resina
de intercambio catinico. 1n este caso" el bicarbonato o carbonato de sodio puede
utili+arse como a$ente eluyente. 8a reaccin en la columna supresora es entonces
%a
S
,ac. S ;<C
:
7
,ac. S Resina
7
;
S
,s. Resina
7
%a
S
,s. S ;
6
<C
:
,ac.
4.64
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1n este caso" el cido carbnico muy poco disociado que se )orma no contribuye de
manera si$ni)icativa a la conductividad.
/n inconveniente de las columnas supresoras es la necesidad de re$enerarlas
peridicamente ,de ordinario" cada A o #0 *. a )in de convertir sus rellenos otra ve+ a la
)orma cida o bsica ori$inal. Sin embar$o" recientemente se dispone de supresores de
membrana que operan continuamente. 1n este caso" el eluyente y la disolucin supresora
)luyen en direcciones opuestas en ambos lados de unas membranas permeables de
intercambio inico. 5ara el anlisis de aniones" las membranas son resinas
intercambiadoras de cationes y para cationes" son intercambiadoras de aniones. <uando"
por e4emplo" se trata de eliminar los iones sodio del e)luente de la columna analtica" en la
corriente supresora )luye continuamente cido para la re$eneracin. 8os iones sodio del
e)luente se intercambian con los iones *idr$eno de la membrana y entonces mi$ran a
travs de la membrana *asta intercambiarse con los iones *idr$eno del reactivo
re$enerador. 1l dispositivo tiene una velocidad de intercambio notablemente alta; por
e4emplo" es capa+ de eliminar completamente los iones sodio de una disolucin 0.# D de
*idrido de sodio cuando el caudal del eluyente es de 6 m8?min.
8a =i$ura 4.## muestra dos aplicaciones de la cromato$ra)ia inica que utili+an
una columna supresora y deteccin conductimtrica. 1n cada caso" los iones estn
presentes al nivel de partes por milln" y el tama9o de las muestras es de 20 8 en un
caso y de #00 8 en el otro. 1l mtodo es de $ran importancia para el anlisis de aniones
debido a que actualmente no eiste un mtodo tan rpido y adecuado para muestras de
este tipo.
Cromatograa inica con una sola columna. Tambin se dispone de equipos
comerciales para cromato$ra)ia inica en los que no se utili+a una columna supresora.
1stos sistemas se basan en las peque9as di)erencias de conductividad que eiste entre los
iones de la muestra eluidos y los del eluyente que prevalecen. 5ara ampli)icar esas
di)erencias" se utili+an intercambiadores de ba4a capacidad" con los que es posible la
elucin utili+ando especies de ba4a conductividad equivalente. 8a cromato$ra)a con una
sola columna tiende a ser al$o menos sensible que la cromato$ra)a inica con columna
supresora.
4.2.3.4. Aplicaciones org(nicas y bio"umicas de la cromatograa inica
8a cromato$ra)ia de intercambio inico se *a aplicado a una variedad de sistemas
or$nicos y bioqumicos incluyendo dro$as y sus metabolitos" sueros" conservantes de
alimentos" me+clas de vitaminas" a+Gcares y preparaciones )armacuticas. 1l e4emplo de
una de estas aplicaciones se muestra en la =i$ura 4.#6" donde se separan con una
columna de intercambio catinico # #0
7A
moles de cada uno de los #I aminocidos de
una muestra.
4.62
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.##. !plicaciones tpicas de la cromato$ra)a ionica. ,a. Separacin de aniones en
una columna de intercambio aninico. 1luyente %a;<C
:
0.006AD ? %a
6
<C
:
0.006:D.
Tama9o de muestra 20 8. ,b. Separacin de iones alcalinos en una columna de
intercambio catinico. 1luyente: &iclor*idrato de )enilendiamina 0.062 D ? ;<l 0.0062
D. Tama9o de muestra #00 8
=i$ura 4.#6. Separacin de aminocidos con una columna de intercambio ionico.
Relleno: intercambiador catinico con un tama9o de partcula de Am.
4.6>
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
4.(.4. Cr&#at&.ra3a +e e7c-*!"2' %&r ta#a8&!
8a cromato$ra)ia de eclusin por tama9os" que tambin se *a denominado
cromato$ra)a en $eles permeables o de )iltracin en $eles" es una tcnica muy valiosa
que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular. 8os rellenos para la
cromato$ra)a de eclusin por tama9os estn constituidos por peque9as partculas ,de
unas #0 m. polimricas o de slice que contienen una red uni)orme de poros en los que
pueden di)undir las molculas del soluto y del disolvente. 1n los poros" las molculas son
atrapadas e)ectivamente y eliminadas del )lu4o de la )ase mvil. 1l tiempo de residencia
medio en los poros depende del tama9o e)ectivo de las molculas de los analitos. 8as
molculas que son ms $randes que el tama9o medio de poros del relleno son ecluidas y
de esta )orma" esencialmente no se retienen y" por tanto" son las primeras que eluyen. 8as
molculas que tienen dimetros que son si$ni)icativamente menores que los poros"
pueden penetrar a travs del laberinto de poros y as resultan atrapadas durante ms
tiempo; stas son las Gltimas en eluir. 1ntre estos dos etremos" estn las molculas de
tama9o intermedio cuya penetracin media en los poros depende de su dimetro. &entro
de este $rupo" tiene lu$ar el )raccionamiento" que est directamente relacionado con el
tama9o molecular y en cierto modo con la )orma molecular. Cbsrvese que las
separaciones por eclusin por tama9os di)ieren de los otros procedimientos que se *an
considerado" en que no implican una interaccin qumica o )sica entre los analitos y la
)ase estacionaria. &e *ec*o" se procura evitar este tipo de interacciones dado que
ori$inan una mala e)icacia de la columna.
4.2.4.1. 'ellenos de columna
1n cromato$ra)ia de eclusin por tama9os se encuentran dos tipos de rellenos"
partculas polimricas y partculas de slice" con dimetros de partcula que oscilan de 2 a
#0 m. 8os Gltimos tienen la venta4a de una $ran ri$ide+" lo que )acilita el
empaquetamiento; una mayor estabilidad" lo que permite el uso de una $ran variedad de
disolventes incluyendo el a$ua; una equilibracin ms rpida al cambiar el disolvente; y
una buena estabilidad a elevadas temperaturas. 8os inconvenientes de las partculas de
slice son su tendencia a retener solutos por adsorcin" y su capacidad para catali+ar la
de$radacin de las molculas del soluto.
1n un principio" la cromato$ra)a de eclusin por tama9os se llev a cabo
)undamentalmente utili+ando copolmeros de estireno7divinilbenceno entrecru+ados de
estructura seme4ante ,ecepto en que los $rupos sul)nicos estn ausentes. a los
utili+ados en comatro$ra)a inica. 1l tama9o de poro en estos polmeros se controla por
el $rado de entrela+amiento entre las cadenas polimricas y por tanto con la cantidad
relativa de divinilbenceno presente en la )abricacin. <omo consecuencia" los rellenos
polimricos se *an comerciali+ado con distintos tama9os promedio de poro" 8os $eles de
estirenodivinilbenceno son *idro)bicos y de este modo slo pueden utili+arse con )ases
mviles no acuosas. Sin embar$o" en la actualidad se dispone de $eles *idro)licos" que
*acen posible el uso de disolventes acuosos para la separacin de molculas $randes
solubles en a$ua como los a+Gcares. 1stos $eles *idro)licos son por lo $eneral polmeros
de estireno7divinilbenceno con $rupos sul)nicos" o poliacrilamidas.
8as partculas de vidrio y de slice porosas" que se comerciali+an actualmente"
tienen tama9os promedio de poro que oscilan entre 40 y 6200 !n$stroms. ! )in de
reducir la adsorcin" las super)icies de estas partculas se modi)ican por reaccin con
sustituyentes or$nicos. 1n la Tabla 4.4 se indican las propiedades de al$unos rellenos
comerciales y tpicos de la eclusin por tama9os.
4.6I
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1l intervalo Gtil de pesos moleculares para un determinado relleno de eclusin
por tama9os" se obtiene convenientemente a partir de una curva de calibracin. 1n ella"
se representa el peso molecular" que est directamente relacionado con el tama9o de las
molculas de soluto" )rente al volumen de retencin.
1l lmite de eclusin determina el peso molecular de una especie por encima del
cual no eiste retencin. Todas las especies que ten$an pesos moleculares mayores que el
lmite de eclusin" son tan $randes que no se retienen" y eluyen con4untamente para dar
un mismo pico. 1l lmite de permea#ilidad es el peso molecular por deba4o del cual las
molculas del soluto pueden penetrar completamente en los poros. 5or deba4o de este
peso molecular" todas las molculas del soluto son tan peque9as que eluyen en una sola
banda. ! medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al lmite de
eclusin" las molculas del soluto pasan cada ve+ ms tiempo" de promedio" en los
poros de las partculas y de este modo se mueven cada ve+ con mayor lentitud. 1s en la
re$in de permeabilidad selectiva en la que tiene lu$ar el )raccionamiento" dando lu$ar a
picos de soluto individuales.
8as curvas de calibracin eperimentales se obtienen )cilmente a partir de
productos estndar. 1n muc*as ocasiones" estas curvas las suministran los propios
)abricantes de los materiales de relleno.
Tabla 4.4.
4.2.4.2. Aplicaciones de la cromatograa de e)clusin por tama*os
8os mtodos de eclusin por tama9os se subdividen en la cromato$ra)a de
)iltracin en $el y la de $el permeable. 1n el primer tipo se utili+an disolventes acuosos y
rellenos *idro)licos. 1n el Gltimo" los mtodos se basan en disolventes no polares y en
rellenos *idro)bicos. 8os mtodos son complementarios en el sentido que en un caso se
aplican a muestras solubles en a$ua" y en el otro a sustancias solubles en disolventes
or$nicos poco polares.
/na de las aplicaciones ms Gtiles del procedimiento de )iltracin en $el consiste
en separar las molculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de
ba4o peso molecular y de las sales. 5or e4emplo" un $el con un lmite de eclusin de
varios miles" puede separar bien las protenas de los aminocidos y de los pptidos de
ba4o peso molecular.
/na aplicacin Gtil de la cromato$ra)ia de $el permeable es la separacin de
*omlo$os y oli$meros. 1stas aplicaciones se ilustran con los e4emplos que se muestran
en la =i$ura 4.#:.
4.6A
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
1l primero muestra la separacin de una serie de cidos $rasos con pesos
moleculares entre ##> y :44 mediante un relleno de poliestireno con un lmite de
eclusin de #000. 1l se$undo es el cromato$rama de una resina epoi comercial; en
este caso" n se re)iere al nGmero de unidades monomricas en las molculas de resina.
=i$ura 4.#:. !plicaciones de la cromato$ra)a de eclusin por tama9os. ,a. Separacin
de cidos $rasos. <olumna de poliestireno I.2 >00 mm con un lmite de eclusin de
#000. =ase mvil tetra*idro)urano. <audal #.6 m8?min. &etector: ndice de re)raccin.
,b. !nlisis de una resina epoi comercial ,nO nGmero de unidades monomricas en el
polmero.. <olumna de slice porosa >.6 620 mm. =ase mvil tetra*idro)urano. <audal
#.: m8?min
8a =i$ura 4.#4 ilustra una aplicacin de la cromato$ra)a de eclusin por tama9os a
la determinacin de $lucosa" sacarosa y )ructosa en cuatro tipos de +umos de )ruta. 1l
relleno" con un lmite de eclusin de #000" era un polmero de poliestireno entrela+ado
de caractersticas *idro)ilcas por la incorporacin de $rupos sul)nicos. /na columna de
62 cm con este relleno tena I>00 platos a una temperatura de traba4o de A0E<.
Ctra $ran aplicacin de la cromato$ra)ia de eclusin por tama9os es a la
determinacin rpida de los pesos moleculares" o de la distribucin de pesos moleculares
en los $randes polmeros o en los productos naturales. 1n este caso" se comparan los
volGmenes de elucin de la muestra con los volGmenes de elucin de compuestos
estndar que ten$an las mismas caractersticas qumicas.
8as venta4as ms importantes de los procedirnientos de eclusin por tama9os
son: ,#. tiempos de separacin cortos y bien de)inidos Wtodos los solutos salen de la
columna entre dos lmitesX; ,6. bandas estrec*as" que conducen a una buena sensibilidad;
,:. no *ay prdida de muestra" porque los solutos no interaccionan con la )ase
estacionaria; y ,4. no se desactiva la columna por interaccin del soluto con el relleno.
8as desventa4as son: ,#. debido a que la escala de tiempos en el cromato$rama es
corta" slo se pueden acomodar un nGmero limitado de bandas y ,6. no es aplicable a
muestras de componentes seme4antes" como las me+clas de ismeros. 5ara una
resolucin aceptable se necesita que la di)erencia de pesos moleculares sea la menos de
un #0B.
4.6F
4. Cromatografa de lquidos de alta resolucin
=i$ura 4.#4. &eterminacin de $lucosa ,P." )ructosa ,=. y sacarosa ,S. en +umos
enlatados
4.:0