MARCOS DE LECTURA DEL CDIGO GENTICO

En gentica se llama marco abierto de lectura (siglas ORF del ingls Open reading frame) a la secuencia de ADN comprendida entre
un codn de inicio (AUG) de la traduccin y un codn de terminacin. En una secuencia de ADN cualquiera hay 6 posibles sentidos
en los que pueden aparecer marcos abiertos de lectura; dado que cada codn toma 3 nucletidos, existen 3 posibles lugares de
inicio para tomar los nucletidos de 3 en 3 en una cadena de ADN. A lo que hay que sumar los otros 3 posibles marcos abiertos de
lectura si el ADN es traducido tomando como molde la cadena de ADN complementaria, dando el sentido de lectura opuesto.
Estos marcos abiertos de lectura se denominan +1, +2, +3, -1, -2 y -3.
En un ejemplo con la secuencia 5' aactgcagtacgtaacgtca 3'
3ttgacgtcatgcattgcagt 5
Marcos de lectura:
+3 5' a act gca gta cgt aac gtc a 3'
+2 5' aa ctg cag tac gta acg tca 3'
+1 5' aac tgc agt acg taa cgt ca 3'
-1 3' ttg acg tca tgc att gca gt 5'
-2 3' tt gac gtc atg cat tgc agt 5'
-3 3' t tga cgt cat gca ttg cag t 5'

MUTACIONES
A los cambios estables en la cadena de DNA que son capaces de ser heredados, se les conoce como mutaciones.
1. Sustitucin: Es un cambio de un nucletido por otro.


Pueden darse tres casos:
a. Mutacin silenciosa
En este tipo de mutacin hay un cambio en una de las bases del DNA de forma que el triplete de nucletidos se modifica, pero sigue
codificando para el mismo aminocido. Esto es as porque el cdigo gentico tiene cierto margen de seguridad y para cada
aminocido hay varias combinaciones de tripletes que lo determinan.
Por ejemplo, lo tripletes CCA y CCC determinan que en esta posicin de la protena se site una prolina. As, si se produce por error
este cambio, ser un cambio silente, porque el aminocido codificado por ambos tripletes es el mismo, la prolina.
b. Mutacin de sentido errneo
En este tipo de mutacin hay un cambio en una de las bases del DNA de forma que el triplete codifica para un aminocido diferente
del que debera, es decir, en esa posicin de la protena habr un aminocido incorrecto, lo que puede alterar ms o menos la
funcin de la protena dependiendo de su localizacin e importancia.
c. Mutacin sin sentido
En este tipo de mutacin hay un cambio en una de las bases del DNA de forma que el nuevo triplete que se forma determina la seal
de parada de la cadena de aminocidos. Esto es, se trunca la protena, no se contina formando a partir de ah. Segn dnde quede
truncada la protena ser capaz de preservar algo de funcin o no.
2. Insercin
En este tipo de mutacin se aade una o ms bases al DNA original. De esta forma se puede alterar el marco de lectura para formar
la protena o insertar aminocidos extra que son inadecuados.

3. Delecin
En este tipo de mutacin se pierden una o ms bases, es decir, se pierde un trozo de DNA alterando la cadena proteica que debera
formarse y su funcin. De esta forma se puede alterar el marco de lectura para formar la protena o eliminar aminocidos que son
propios de la cadena proteica. En ocasiones las deleciones son tan largas que pueden comprometer un gen entero o varios genes
contiguos.

8. Cambio de marco de lectura (Frameshift mutation)
Este tipo de mutacin se da cuando por insercin o prdida de pares de bases se cambia el marco de lectura. Para la decodificacin,
las bases se leen de tres en tres, esto es, cada tres bases determinan un aminocido.
Si se cambia el marco de lectura, cambia la forma de agrupar esas tres bases y se colocaran aminocidos errneos habiendo la
posibilidad de un codn de PARADA prematuro.


INTERCAMBIO GENTICO EN PROCARIOTAS
A veces existe recombinacin gentica bacteriana cuando una bacteria recibe genes externos y los incorpora en su material
gentico. Estos genes adquiridos pueden otorgarle nuevas caractersticas favorables.

Existen tres mecanismos, los tres ocurren con baja frecuencia en la naturaleza.

1. Transformacin

Los fragmentos de ADN en el medio (generalmente el material gentico liberado por las bacterias muertas) ingresa y es incorporado
por bacterias vivas.

2. conjugacin

El paso de informacin gentica de una bacteria donante a una receptora mediante un contacto fsico entre ambas.

Factor F: ~ 100 genes.
Es capaz de autorreplicarse, de manera que se transmite a la descendencia Posee un gen que codifica la protena
pilina la cual permite producir
Pili.
Cuando un pili contacta con otra bacteria se forma un conducto por el que puede pasar material gentico.
Se puede transferir el factor F de la donante a la receptora.

3. Transduccin

Transferencia de material gentico mediante un virus. El virus infecta la bacteria A y transfiere material gentico a B.

Puede ser de dos tipos:

Generalizada: Se transfiere cualquier gen, ya que el virus puede integrarse en cualquier punto de la bacteria donante.

Especializada: Se transfiere un determinado gen, ya que el virus infecta y se integra en una parte concreta del genoma.



PLSMIDOS

Los plsmidos o vectores son molculas circulares de ADN que se replican de manera independiente al cromosoma de la clula
hospedera. De manera natural se encuentran en las bacterias en tamaos que van desde 5,000 hasta 400,000 pb.
Las principales partes de los plsmidos son:
El origen de replicacin: Permite al plsmido replicarse dentro de la bacteria independiente de la divisin celular.
Gen de resistencia a un antibitico: Se utiliza para seleccionar las bacterias que han sido transformadas con el plsmido. Al crecer las
bacterias en un medio con el antibitico correspondiente al gen de resistencia nicamente las bacterias que tengan el plsmido
sern capaces de resistir la presencia del antibitico.
Sitio de clonacin mltiple: Es un fragmento de ADN que contiene muchas de las secuencias reconocidas por las enzimas de
restriccin lo que facilita el diseo de estrategias de ADN recombinante.

ENZIMAS DE RESTRICCIN
Las enzimas de restriccin cortan los enlaces fosfodiester del ADN a partir de una secuencia palindrmica que reconocen (secuencias
que se leen igual en ambas direcciones).
Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material
gentico extrao que entre en la clula.
Las enzimas de restriccin se utilizan en la clonacin molecular para generar fragmentos para ser subclonados en los vectores
apropiados, y as obtener molculas de ADN recombinante.

Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie
de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos
indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.
Ej:
Eco RI E = gnero Escherichia co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:

1. Cohesivos o pegajosos:

2. Romo:

La concentracin de las enzimas de restriccin se cuantifica en unidades, una unidad de enzima se define como la cantidad de
enzima que se necesita para cortar 1g de DNA en 1 hora.
CLONACIN MOLECULAR
La clonacin molecular hace referencia al proceso de aislar una secuencia de ADN de inters y obtener mltiples copias de ella en un
organismo. Mediante mtodos artificiales.
Primero se obtienen muchas copias del ADN de inters (inserto). Generalmente este paso se hace por reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR).
Se selecciona y purifica un vector de trabajo.
Se hace la digestin con enzimas de restriccin tanto del inserto como del vector.
Se hace la ligacin de los fragmentos para obtener el plsmido recombinante.
El plsmido recombinante se transforma en las clulas hospederas.
Las clulas transformadas se seleccionan en platos con antibitico. Las colonias que crezcan contienen un plsmido, pero no
necesariamente el plsmido recombinante. Por lo tanto se acosturmbra a utilizar otras estrategias para diferenciar las colonias con
plsmidos recombinantes de las no recombinantes, como se hizo en la prctica de laboratorio.



LIGACIN
La ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una cadena de ADN y el extremo 3 de otra cadena
de ADN.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombre en ingls Polymerase Chain Reaction) permite generar una gran
cantidad de copias de un fragmento de ADN.
Procedimiento: En un tubo de PCR se agrega el ADN molde. Adems debemos aadir una pareja de primers o iniciadores
complementarios a los extremos del fragmento que se quiere amplificar.


Adems del ADN y de los primers, es necesario aadir los 4 tipos de desoxirribonucletidos trifosfatos (dNTPs) que componen el
ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP, en una mezcla equimolar de cada uno de ellos). Por ltimo se aade la ADN polimerasa que, en este
caso, ha de ser una polimerasa especial capaz de resistir las elevadas temperatura.
Una vez tenemos todos los componentes se han incorporado al tubo de PCR. Se inicia el ciclo trmico en un termociclador as:
1. Desnaturalizacin. A una temperatura de 94
o
C, durante aproximadamente 1 min, el ADN de doble cadena se separa en
cadenas sencillas.
2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar entre 40
o
C y 60
o
C .La duracin de
este paso puede oscilar entre minuto y 2 minutos. En este paso los primers se unen al ADN molde.
3. Extensin. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72
o
C y se deja actuar a la ADN polimerasa durante 1 minuto por
cada 1000 bases que se quieran amplificar. En este paso se da la formacin de las copias de las cadenas de ADN.
Estos tres pasos constituyen un ciclo. En el termociclador se programa en forma automtica alrededor de 40 ciclos por reaccin para
obtener mltiples copias del fragmento deseado.



P rimer delantero
P rimer i nvers o



ELECTROFORESIS DE ADN
La electroforesis es cuando molculas cargadas son forzadas a ir a travs de una matriz debido a un flujo de corriente elctrica. Bajo
condiciones fisiolgicas los grupos fosfatos de los cidos nucleicos son ionizados y migrarn al electrodo positivo (nodo) cuando se
colocan en presencia de un campo elctrico.
Una molcula de ADN cortada con enzimas de restriccin genera diferentes fragmentos. Estos pueden ser separados en base a su
tamao utilizando un gel de electroforesis.
El gel puede estar hecho de agarosa o poliacrilamida, aumentando la concentracin de estos compuestos disminuye el tamao de
poro en el gel haciendo ms difcil el desplazamiento del ADN.
En la electroforesis, a mayor tamao menor ser la migracin del fragmento y a menor tamao mayor ser la migracin del
fragmento.
El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrn de bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un
tamao particular.
El tamao de cada fragmento puede ser determinado utilizando una referencia o una escalera de ADN cuyos fragmentos tienen
pesos moleculares conocidos.