Vitamina B1

Principio de la tcnica
Es un mtodo microbiolgico para la determinacin cuantitativa de la vitamina B2 total
(aadida y natural) en los alimentos, los piensos y en los productos farmacuticos. El sistema
de probe is conformed a las norms internationals.
La vitamina B
1
se extrae de la muestra y el extracto se diluye. El Medio de ensayo y el extracto
se pipetea en los pocillos de una placa de microtitulacin que est recubierta con Lactobacillus
rhamnosus. El crecimiento de los Lactobacillus rhamnosus depende del suministro de vitamina
B1. Segn la adicin de vitamina B1, ya sea como estndar o como un compuesto de la
muestra, la bacterias crecen hasta que se consume la vitamina. La incubacin se realiza en la
oscuridad a 37 C durante 44 a 48 h.
La intensidad del metabolismo o el crecimiento de Lactobacillus rhamnosus en relacin con la
vitamina B1 se mide como la turbidez y se compara con una curva estndar. La medicin se
realiza utilizando un lector de placas de microtitulacin a 610-630 nm (como alternativa a 540-
550 nm)

Reactivos adicionales necesarios
sterile bench (sterile working is recommended
microtiter plate reader 610 - 630 nm (540 - 550 nm)
estufa a 37 C
bao de agua a 95 C
Autoclave
pH metro
centrifuga, > 8,000 x g
tips estriles for graduated micropipette 20 - 200 l and 100 - 1000 l
tubos estriles (15 and 50 ml) y viales estriles de 1.5 or 2.0 ml
balones y beakers
filtros estriles sterile filters polyethersulfon 0.2 m with syringe
HCl 1.0 mol / l and 0.1 mol / l
NaOH concentrado (40 g NaOH y 100 ml agua destilada)
NaOH 2 mol / l (8 g NaOH y 100 ml agua destilada)

Reactivos
taka diastase, aspergillus oryzae (ej. Fluka 86250)
fosfatasa cida Tipo II: de papa (ej Sigma P3752)
H2SO 0.1 mol / l
Acetato de sodio 2.5 mol / l (disolver 34 g sodium acetate trihydrate en 100 ml de agua)
- Buffer citrato pH 4,5: pesar 1,5 g de monohidrato de cido ctrico en un vaso de
precipitados de 100 ml, disolver el cido ctrico con aproximadamente 50 ml de agua
desionizada bajo agitacin ; aadir 12 ml de NaOH 1 mol / l (o 0,48 g de NaOH ); El pH debe ser
4,5 ( corregir con HCl 0,1 mol / l); trasvasar la solucin en un matraz aforado de 100 ml y llevar
a volumen con agua desionizada el buffer puede ser almacenado 3 das a 2 - 8 C.
Reactivos adicionales necesarios
- Agua desionizada
- Diastasa taka, aspergillus oryzae ; (por ejemplo Fluka 86250 )
- Fosfatasa cida, tipo II : de patata ( por ejemplo, Sigma P3752 )
- Buffer citrato pH 4,5: pesar 1,5 g de monohidrato de cido ctrico en un vaso de precipitados
de 100 ml, disolver el cido ctrico con aproximadamente 50 ml de agua desionizada bajo
agitacin ; aadir 12 ml de NaOH 1 mol / l (o 0,48 g de NaOH ); El pH debe ser 4,5 ( corregir con
HCl 0,1 mol / l); trasvasar la solucin en un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con
agua desionizada el buffer puede ser almacenado 3 das a 2 - 8 C.
- HCl 0,1 mol / l y 1,0 mol / l

Preparacin de la muestra
Para la determinacin de la adicin de vitamina B1 en muestras slidas, una extraccin
con cido caliente es generalmente suficiente. Las muestras lquidas se pueden utilizar
directamente Despus de la filtracin estril y la dilucin con agua estril del kit.
Para la determinacin del total de vitamina B1 (nativo y aadido) contenido, la
muestra tiene que ser tratada con enzimas.
Las muestras deben almacenarse protegidas de la luz a 4 C. El estndar y las muestras
deben ser manejados por triplicado. Las matrices de muestras desconocidas deben ser
analizadas con dos diluciones del extracto de la muestra. Los extractos de muestras
deben ser utilizados dentro de un da y se debe almacenar en la oscuridad hasta el
anlisis.
La extraccin de la muestra se lleva a cabo con 1 g (ml) de la muestra y se homogeniza
en 40 ml de agua desionizada o solucin de extraccin. Esto equivale a una muestra
factor de dilucin de extraccin de 40 .Este factor ya est incluido en la curva estndar
(vase el Certificado de Aseguramiento de la Calidad). Con muestras de baja cantidad
de vitamina B1 se pueden pesar hasta 5 g de muestra, esto debe tenerse en cuenta en
el clculo final).

Solamente los extractos de muestras estriles o diluciones estriles de las mismas se deben
pipetear sobre la placa de microtitulacin. Las diluciones deben estar preparados con agua
estril del kit de prueba. Una filtracin estril de la muestra o el extracto de la muestra
siempre es necesario para:
- Muestras como zumos de frutas y bebidas isotnicas, que no se calientan durante extraccin
de la muestra (excepto cuando la muestra se calienta durante 30 min a 95 C en un bao de
agua)
- Muestras que contienen hierbas y especias, as como la miel y el t
- Mezclas de vitaminas, premezclas, tabletas (muestras altamente enriquecido, ver 6.3)
(excepto cuando la muestra se calienta 30 min a 95 C en un bao de agua)
- Muestras con bajas concentraciones de vitamina que son muy coloreadas (la etapa de
filtracin elimina la coloracin)
- Si la filtracin no es posible debido a partculas slidas o debido a grumos, la centrifugacin
debe llevarse a cabo antes de la etapa de filtracin estril (mayor de 8000 x g durante 5 min)
-La filtracin estril de la muestra no es necesario si la extraccin de la muestra se lleva a
cabo a 95 C durante 30 min. Sin embargo, la muestras extradas tienen que ser diluidas con
agua estril desde el kit de prueba (el medio de ensayo tiene que ser siempre filtrada)
Alto contenido de vitamina B1 en golosinas y caramelos
Pesar unos 15 - 20 g de golosinas o caramelos en un vial de centrfuga de 50 ml estril,
aadir aproximadamente 40 ml Redist o agua desionizada y disolver la muestra a 95
C en el bao de agua. Enfriar rpidamente por debajo de 30 C.
Transferir la solucin con Redist o agua desionizada cuantitativamente a un matraz
volumtrico de 100 ml y llenar hasta la marca con Redist o agua desionizada.
Transferir el volumen correspondiente a 1 g de material de ensayo (ver ejemplo a
continuacin) en un vial de centrfuga de 50 ml y llenar hasta 40 ml con agua destilada,
agitar y filtrar de manera estril (o calentar la muestra 30 minutos a 95C en un bao
de agua, luego enfriar hasta menos de 30C)
Dependiendo del grado de concentracin, diluir en 1,5 ml (o 2 ml) utilizando viales
estriles y agua estril del kit
6.3. Alto contenido de vitamina B2 en cpsulas, pldoras y mezclas de vitaminas
En primer lugar el peso de la cpsula o pastilla tiene que ser determinado (promedio de 5-10
cpsulas o pastillas). Luego las pldoras se homogeneizan en un mortero o mezclador. Las
cpsulas se cortan y se extraen abiertas.
6.3.1 Ejemplo de preparacin con 1 g tamao de la muestra y pre - extraccin
Pesar 1 g de pldoras, mezcla de vitaminas, premezcla o abra la cpsula en un vaso de
vidrio de 500 ml, aadir alrededor de 400 ml Redist o desionizada, agitar bien y ajustar
pH 4-5 con HCl.
Extrae durante 30 mintueos a 95C en un bao de agua. Agitar al menos 5 veces
mientras se extrae. Enfrar rpidamente a menos de 30C.
Transferir la solucin de muestra con agua destilada a un baln de 1000ml y llenar
hasta el aforo.
Transferir 1 ml a un vial de 50ml estril y llenar hasta 40 ml.
Filtrar de manera estril (o calentar la muestra 30 minutos a 95C en un bao de agua,
luego enfriar hasta menos de 30C)
Dependiendo del grado de concentracin, diluir en 1,5 ml (o 2 ml) utilizando viales
estriles y agua estril del kit

Atencin: Para el clculo del resultado, tiene que ser considerado el factor de dilucin de 1000
(1 g hasta 1000 ml). El paso de dilucin 1 ml hasta 40 ml ya est incluido en la curva estndar.