1

Tema 5.- Aplicaciones y criterios de uso de

la espectroscopia de emisin molecular en la
zona UV-visible: Espectrofluorimetra
El instrumento: parmetros de inters y calibracin.-
Descripcin de aplicaciones frecuentes.- Seleccin de
procedimientos adecuados para problemas concretos.-
Uso de la espectrofluorimetra como sistema de
deteccin en otras tcnicas instrumentales
2
Variables que afectan a la fluorescencia
y a la fosforescencia
Tanto la estructura molecular como el entorno
quimico van a influir en que una sustancia sea
o no luminiscente
Estos factores tambin determinan la
intensidad de emisin cuando tiene lugar la
fotoluminiscencia.
Rendimiento cuantico
El rendimiento cuantico, o la eficacia cuntica,
de fluorescencia o de fosforescencia es la
relacin entre el numero de molculas que
emiten luminiscencia respecto al numero total
de molculas excitadas.
Para moleculas altamente fluorescentes como
la fluoresceina, la eficacia cuantica, bajo
determinadas condiciones, se aproxima a la
unidad.
Las especies qumicas que no presentan una
fluorescencia apreciable tienen eficacias que
se aproximan a cero.
El rendimiento quntico de fluorescencia
para un compuesto se puede calcular a partir
de las constantes de velocidad relativas k
x
de
los procesos por los que el estado singulete
excitado mas bajo se desactiva:
fluorescencia (K
f
,), cruce entre sistemas (K
ces
),
conversin externa (kce), conversion interna
(kc
i
), predisociacion (kpd) y disociacion (kd).
3
Tipos de transiciones en fluorescencia
Es importante resaltar que la fluorescencia rara vez es consecuencia de la
absorcin de radiacin ultravioleta de longitud de onda menor de 250 nm, ya
que tal radiacin es suficientemente energtica como para producir la
desactivacin de los estados excitados por predisociacin o disociacin.
Por ejemplo, una radiacin de 200 nm corresponde a aproximadamente 140
kcal/mol; la mayora de las molculas tienen al menos algun enlace que se
puede romper con energas de esta magnitud. Como consecuencia, rara vez se
observa fluorescencia causada por transiciones ,*.
Este proceso de emision esta asociad transiciones menos energticas *,, y
*,n.
Como ya se ha dicho, una molecula en su estado electrnico excitado
normalmente pasa a su estado excitado mas bajo mediante una serie de
relajaciones vibracionales rpidas y conversiones internas que no producen
emisin de radiacin.
La fluorescencia surge, generalmente, de una transicin desde el nivel
vibracional ms bajo del primer estado electrnico excitado a uno de los
niveles vibracionales del estado electrnico fundamental.
Para la mayora de los compuestos fluorescentes, la radiacin se produce por
una transicin n,* o ,*, dependiendo de cual de ellas sea la menos
energtica.
4
Eficacia cuntica y tipo de transicin
Empricamente se observa que la fluorescencia se encuentra con mas
frecuencia en los compuestos con transiciones de ms baja energa es del tipo
,*. Las transiciones de menor energa, n, *, estn menos favorecidas. Por
tanto la eficiencia cuntica es ms elevada para transiciones ,*.
La mayor eficacia cuntica asociada a la transicin ,*, se explica de dos
maneras:
la absortividad molar de una transicion ,* es normalmente de 100 a 1.000 veces
superior que a la de un proceso n, *, y este valor representa una medida de la
probabilidad de la transicin en ambas direcciones. El tiempo de vida inherente
asociado con una transicin ,* es mas corto (10
-9
a 10
-7
s comparado con 10
-7
a
10
-5
s para una transicion n, *. .
Consideraciones termodinmicas sugieren que la constante de velocidad del cruce
entre sistemas kces es menor para estados excitados ,* ya que la diferencia de
energa entre los estados singulete/triplete es grande; esto es, se requiere mas
energa para desaparear los electrones del estado excitado * . Como consecuencia,
el solapamiento de los niveles vibracinales del triplete con los del estado singulete
es menor y la probabilidad de que ocurra un cruce entre sistemas es menor.
En resumen, la fluorescencia esta ms asociada con transiciones ,*, ya que
tales transiciones presentan tiempos de vida medios ms cortos y porque es
menos probable que tengan lugar los procesos de desactivacin que compiten
con la fluorescencia
5
Fluorescencia y estructura
La fluorescencia ms intensa y la ms til es la que presentan los compuestos
que contienen grupos funcionales aromticos con transiciones * de baja
energa.
Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas y
alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados tambin
pueden presentar fluorescencia, pero el numero de estos compuestos es
pequeo comparado con el numero de sistemas aromticos.
La mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes
en disolucin, la eficacia quntica normalmente aumenta con el numero de
anillos y con su grado de condensacin.
Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol, no
presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con estas
normalmente si la presentan.
En los heterociclos con nitrgeno, se cree que la transicin electrnica de ms
baja energa implica a un sistema n * que rpidamente se transforma en
un estado triplete e impide la fluorescencia. Sin embargo, la condensacin de
anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos, da lugar a un aumento en
la absortividad molar del pico de absorcin.
En estas estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as,
se observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el
indol.
6
Efectos de la sustitucin en el anillo
La sustitucin en el anillo bencnico provoca desplazamientos en la
longitud de onda de los mximos de absorcin y los correspondientes
cambios en los picos de fluorescencia.
Adems, la sustitucin afecta frecuentemente a la eficacia de la
fluorescencia; alguno de estos efectos se ilustran con los datos de los
derivados bencnicos de la Tabla.
La influencia de la introduccin de halgenos es sorprendente. El
descenso de fluorescencia se produce al aumentar el nmero atmico
del halgenos debido, en parte, al efecto del tomo pesado, que
aumenta la probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el estado
triplete.
Se cree que la predisociacin juega un papel importante tanto en el
iodobenceno como en los nitroderivados; estos compuestos tienen
enlaces de fcil ruptura que pueden absorber la energa de excitacin
seguida de una conversin interna.
La adicin de un acido carboxlico o de un grupo carbonilo en un anillo
aromtico generalmente inhibe la fluorescencia. En estos compuestos,
la energa de la transicin n * es menor que la de la transicin
*. Por ello, el rendimiento de la fluorescencia es normalmente
menor para el sistema del primer tipo.
7
Efecto de la sustitucin en la fluorescencia
8
Efecto de la rigidez estructural
Empricamente se comprueba que la fluorescencia est favorecida en
molculas con estructuras rgidas.
Las eficacias cunticas para el fluoreno y el bifenilo son proximas a
1,0 y 0,2, respectivamente, bajo condiciones de medida similares.
La diferencia en el comportamiento es el aumento en la rigidez
proporcionado por el puente que forma el grupo metileno en el
fluoreno. Se pueden citar muchos ejemplos similares.
Tambin se ha recurrido a la influencia de la rigidez estructural para
explicar el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes
orgnicos cuando estn formando un complejo con un ion metlico.
La intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es mucho
menor que la de su complejo con cinc:
9
Efecto de la rigidez
La falta de rigidez de una molcula probablemente
provoca un aumento de la velocidad de conversin
interna y un aumento en la probabilidad de
desactivacin no radiante.
Una parte de una molcula no rgida puede sufrir
vibraciones de baja frecuencia respecto a sus otras
partes y tales movimientos indudablemente
explican ciertas perdidas de energa no radiantes.
10
Efectos de la temperatura y del
disolvente
La eficacia cuntica de fluorescencia disminuye en la mayora de las
molculas al aumentar la temperatura, ya que al aumentar la frecuencia
de las colisiones, cuando la temperatura es elevada, aumenta la
probabilidad de desactivacin por conversin externa.
Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta la
probabilidad de la conversin externa y conduce al mismo resultado.
La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de disolventes
que contienen tomos pesados o de solutos con dichos tomos en su
estructura; como por ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el ioduro
de etilo. El efecto es similar al observado cuando se introducen, por
sustitucin de tomos pesados en compuestos fluorescentes
En estos casos, las interacciones espn-orbital provocan un aumento en
la velocidad de formacin de tripletes y en la correspondiente
disminucin de la fluorescencia.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia
a los disolventes compuestos que contienen tomos pesados
11
Efecto del pH en la fluorescencia
La fluorescencia de un compuesto aromtico con
sustituyentes cidos y bsicos en el anillo depende del pH
Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin
son probablemente diferentes para las formas ionizadas o
no ionizadas del compuesto. La Tabla anterior ilustra este
efecto con datos para el fenol y la anilina.
Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo
surgen del distinto nmero de especies resonantes
asociadas con las formas acidas y bsicas de las molculas.
Por ejemplo, la anilina tiene varias formas resonantes
mientras que el ion anilinio slo una. Esto es,
12
Efecto del pH en la fluorescencia
Cuanto mayor es el nmero de formas resonantes, mayor es la
estabilidad del primer estado excitado; la consecuencia es una
fluorescencia en la regin ultravioleta.
La influencia del pH en la fluorescencia de ciertos compuestos se ha
utilizado para la deteccin de puntos finales en valoraciones cido/base.
Por ejemplo, la fluorescencia de la forma fenlica del cido l-naftol-4-
sulfnico no es detectable por el ojo humano, ya que tiene lugar en la
regin ultravioleta. Sin embargo, cuando el compuesto se convierte en
ion fenolato debido a la adicin de una base, el pico de emisin se
desplaza hacia longitudes de onda de la regin visible donde puede
verse claramente.
Es interesante resaltar que este cambio tiene lugar a un pH diferente al
esperado por la constante de disociacin del compuesto. La explicacin
de esta discrepancia es que la constante de disociacin acida para la
molcula excitada difiere de la constante de la misma especie en el
estado fundamental.
Los cambios en las constantes de disociacin de cidos y bases con la
excitacin son normales y algunas veces son hasta cuatro o cinco
rdenes de magnitud superiores
13
Efecto del oxigeno disuelto
La presencia de oxigeno disuelto suele reducir la
intensidad de fluorescencia de una disolucin.
Este efecto puede ser el resultado de una oxidacin
de las especies fluorescentes inducida
fotoqumicamente.
Sin embargo, con ms frecuencia la amortiguacin
(quenching) tiene lugar como consecuencia de las
propiedades paramagnticas del oxigeno molecular,
que favorecen el cruce entre sistemas y la conversin
de las molculas excitadas al estado triplete.
Otras especies paramagnticas tambin tienden a
amortiguar la fluorescencia
14
Efecto de la concentracin en la
intensidad de fluorescencia
La potencia de la emisin fluorescente F es proporcional a
la potencia radiante del haz de excitacin absorbido por el
sistema.
donde P
0
es la potencia del haz que incide sobre la
disolucin y P es su potencia despus de atravesar una
longitud b del medio.
La constante K' depende de la eficacia cuntica del proceso
de fluorescencia.
Con el objeto de relacionar F con la concentracin c de la
especie fluorescente, se escribe la ley de Beer de la forma
(
15
donde es la absortividad molar de las moleculas fluorescentes y bc es
la absorbancia, A.
Sustituyendo una ecuacin en la otra se tiene:
El termino exponencial puede desarrollarse como una serie de
Maclaurin
Siempre que 2,303 bc = A < 0,05, los trminos posteriores del
corchete son despreciables respecto al primero
En estas condiciones, el error relativo mximo cometido al despreciar
todos los trminos excepto el primero es de 0,13 por 100.
Por ello, se puede escribir
16
La representacin grafica de la potencia fluorescente de una disolucin
frente a la concentracin de las especies emisoras debera ser lineal a
bajas concentraciones.
Cuando c es tan elevada que la absorbancia es mayor que
aproximadamente 0,05, los trminos de mayor orden de la ecuacin
anterior adquieren importancia y la linealidad se pierde; entonces F
toma un valor inferior al obtenido en la extrapolacin de la lnea recta
de la representacin grafica.
Otros dos factores, responsables tambin de las desviaciones negativas
de la linealidad a elevadas concentraciones, son la autoamortiguacin y
la autoabsorcin.
El primero es el resultado de colisiones entre molculas excitadas. La
transferencia de energa por va no radiante sucede, quizs, de una
manera anloga, a como ocurre la transferencia de energa a las molculas
del disolvente en una conversin externa. Se puede esperar que la
autoamortiguacion aumente con la concentracion debido a la mayor
probabilidad de que tengan lugar colisiones.
La autoabsorcin tiene lugar cuando la longitud de onda de emisin se
solapa con un pico de absorcin; la fluorescencia, entonces, disminuye
porque la radiacin emitida atraviesa la disolucin y es reabsorbida por
otras molculas fluorescentes.
17
Espectros de emisin y exitacin
La Figura muestra los tres tipos de espectros fotoluminiscentes del
fenantreno.
Los espectros de excitacion (E en la figura) se obtienen midiendo la
intensidad luminiscente a una longitud de onda fija mientras se varia
la longitud de onda de excitacin
Como la primera etapa en la generacin de la emisin fluorescente es
la absorcin de radiacin, para crear los estados excitados, un
espectro de excitacin es prcticamente idntico a un espectro de
absorcin realizado bajo las mismas condiciones.
Por otro lado, los espectros de fluorescencia y de fosforescencia (F y
P, respectivamente), suponen la excitacin a una longitud de onda fija
mientras se registra la intensidad de emisin como funcin de la
longitud de onda.
18
Como ya se ha sealado, la fotoluminiscencia
normalmente tiene lugar a longitudes de onda ms
largas que las longitudes de onda de excitacin.
Adems, las bandas fosforescentes se encuentran, en
general, a longitudes de onda mas largas que las
bandas de fluorescencia, ya que, en la mayora de los
casos, el estado triplete excitado tiene menor energa
que el correspondiente estado singulete.
De hecho, la diferencia de longitudes de onda entre los
dos proporciona una medida til de la diferencia de
energa entre los estados excitados singulete y triplete.
19
INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA
FLUORESCENCIA Y LA FOSFORESCENCIA
Los distintos componentes de los
instrumentos para la medida de la
fotoluminiscencia son similares a los que se
encuentran en los fotmetros o
espectrofotmetros ultravioleta/visible.
La Figura muestra una configuracin
caracterstica de estos componentes en los
fluorometros y los espectrofluorimetros.
Casi todos los instrumentos de fluorescencia
utilizan pticas de doble haz tal como se
muestra, para compensar las fluctuaciones
en la potencia de la fuente.
El haz de la muestra pasa primero a travs
de un filtro o un monocromador de
excitacin, que transmite la radiacin que
provocara la fluorescencia pero excluye o
limita la radiacin de la longitud de onda de
la emisin fluorescente.
20
APLICACIONES Y METODOS
FOTOLUMINISCENTES
Es inherente a los mtodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables a
intervalos de concentracin ms bajos que las medidas espectrofotomtricas de
absorcin y se encuentran entre las tcnicas analticas mas sensibles.
El aumento de sensibilidad se debe a que el parmetro relacionado con la
concentracin en fluorimetria y en fosforimetria F se puede medir
independientemente de la potencia de la fuente P
0
.
Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluacin de P
0
y de P,
ya que la absorbancia, que es proporcional a la concentracin, depende de la
relacin entre estas dos cantidades.
La sensibilidad de un mtodo fluorimtrico puede mejorarse aumentando P
0
o
mediante la amplificacin adicional de la seal de fluorescencia.
Por el contrario, en espectrofotometra, un aumento en P
0
da lugar a un cambio
proporcional en P y, por ello, no afecta a la A.
Por tanto, los mtodos fluorimtricos tienen, generalmente, sensibilidades que
son de uno a tres ordenes de magnitud superiores a los correspondientes de
absorcin.
La precisin y la exactitud de los mtodos fotoluminiscentes son habitualmente
ms pobres que las de los procedimientos espectrofotomtricos en un factor
entre, quizs, dos y cinco. Generalmente, los mtodos fosforescentes son menos
precisos que sus correspondientes mtodos fluorescentes.
21
Determinacin fluorimtrica
de especies inorgnicas
Los mtodos inorgnicos fluorimetricos son
de dos tipos.
Mtodos directos que conllevan la formacin de un
quelato fluorescente y la medida de su emisin.
Mtodos basados e basa en el descenso de la
fluorescencia que resulta de la accin
amortiguadora de la sustancia que va a ser
determinada.
La ultima tcnica se ha utilizado ms en la
determinacin de aniones.
22
Cationes que forman quelatos
fluorescentes
Existen dos factores que limitan enormemente el nmero de iones de
metales de transicin que forman quelatos fluorescentes.
En primero lugar, muchos de estos iones son paramagnticos; esta
propiedad aumenta la velocidad de cruce entre sistemas al estado
triplete. Por tanto, la desactivacin por fluorescencia es poco
probable, aunque puede observarse fosforescencia.
Un segundo factor es que los complejos de los metales de transicin
se caracterizan por presentar muchos niveles de energa poco
espaciados, que aumenta la probabilidad de desactivacin por
conversin interna.
Los iones de los metales que no son de transicin son menos
susceptibles a los procesos de desactivacin; y es para estos
elementos, para los que se han desarrollado las principales
aplicaciones inorgnicas de la fluorimetria.
Hay que sealar que los cationes de los metales que no son de
transicin son generalmente incoloros y tienden a formar quelatos
que tambin lo son. Por ello, la fluorimetria a menudo complementa
a la espectrofotometria.
23
24
Reactivos fluorimetricos
Los reactivos fluorimetricos ms utilizados en
el anlisis de cationes son los que presentan
estructuras aromticas con dos o mas grupos
funcionales dadores que permitan la
formacin de quelatos con el ion metlico.
A continuacin se muestran las estructuras
de los cuatro reactivos ms utilizados:
25
26
Determinacin fluorimetrica de
especies orgnicas
El nmero de aplicaciones del anlisis fluorimetrico a
especies orgnicas y bioqumicas es impresionante.
Se han recopilado los mtodos para la determinacin de
mas de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad
de compuestos orgnicos, enzimas y coenzimas, agentes
medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas.
Es incuestionable que las aplicaciones ms importantes
de la fluorimetria se encuentran en el campo del anlisis
de productos alimentarios, farmacuticos, muestras
clnicas y productos naturales.
La sensibilidad y la selectividad del mtodo hacen que
sea una herramienta particularmente valiosa en estos
campos.
27
Mtodos fosforimtricos
Los mtodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser
complementarios, ya que los compuestos fuertemente fluorescentes
presentan una dbil fosforescencia y viceversa.
Por ejemplo, entre los hidrocarburos aromticos con anillos
condensados, aquellos que contienen tomos pesados como halogenos
o azufre, con frecuencia presentan una fuerte fosforescencia; por otro
lado, los mismos compuestos sin la presencia del tomo pesado tienden
a presentar fluorescencia en lugar de fosforescencia.
La fosforimetra se ha utilizado para determinar una gran variedad de
especies orgnicas y bioqumicas que incluyen sustancias como cidos
nucleicos, aminocidos, purina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos del
petrleo y pesticidas. Sin embargo, el mtodo no ha alcanzado el uso
tan difundido de la fluorimetria, quizs debido a la necesidad de bajas
temperaturas y a la, generalmente, peor precisin de las medidas
fosforescentes.
Por otro lado, es atractiva la mayor selectividad potencial de los
procedimientos de fosforescencia. La razn de estas diferencias de
comportamiento se debe a que la fosforescencia eficaz necesita el cruce
entre sistemas rpido para poblar el estado triplete excitado, que, vuelve
a reducir la concentracin de molculas en el singulete excitado y, por
tanto, aumenta la intensidad de fosforescencia.
28
Fosforimetra a temperatura ambiente
Durante las ultimas dos dcadas, se ha dedicado un esfuerzo
considerable al desarrollo de mtodos fosforimtricos que
puedan llevarse a cabo a temperatura ambiente.
Se utilizan dos procedimientos generales:
Fosforescencia de los compuestos adsorbidos en la superficie de
slidos, como puede ser un filtro de papel. En estas aplicaciones, se
dispersa una disolucin de analito sobre el solido y se evapora el
disolvente. Se mide, entonces, la fosforescencia de la superficie.
La matriz rgida minimiza la desactivacin del estado triplete por
amortiguacin colisional.
La amortiguacin colisional afecta mucho ms a la fosforescencia que
a la fluorescencia debido al mayor tiempo de vida del estado triplete.
El segundo mtodo a temperatura ambiente supone la solubilizacion
del analito en micelas formadas por detergente, en presencia de
iones metlicos pesados.
Las micelas aumentan la proximidad entre los iones de los metales
pesados y el fosforforo, aumentando as la fosforescencia.
29
Micelas
Se emplean detergentes o molculas con
extremo hidroflico y otro hidrofbico
30
Aplicacin de la fluorimetria y la fosforimetria
para la deteccin en cromatografa liquida
Las medidas de fotoluminiscencia proporcionan un importante mtodo
para la deteccin y determinacin de los componentes de una muestra
que eluyen de columnas cromatogrficas o en electroforesis capilar.
Medidas de tiempos de vida
La medida de los tiempos de vida en luminiscencia estaba restringida
inicialmente a sistemas fosforescentes, donde los tiempos de
desactivacin eran suficientemente largos para permitir una fcil medida
de la intensidad emitida en funcin del tiempo.
Varios fabricantes de instrumentos ofrecen un equipo para el estudio de
las velocidades de desactivacin de la luminiscencia en la escala de
tiempos de fluorescencia (10
-5
a 10
-8
s). Este equipo emplea laseres
pulsantes que generan impulsos de radiacin con anchuras de 70 a 100
ps para la excitacin y tubos foto-multiplicadores de tiempo de barrido
rpido para la deteccin.
Los instrumentos de este tipo proporcionan informacin que resulta til
en estudios bsicos de transferencia de energa y amortiguacin.
Para el trabajo analtico, las medidas de tiempo de vida incrementan la
selectividad de los mtodos luminiscentes, ya que permiten el anlisis de
mezclas que contienen dos o ms especies luminiscentes con diferentes
velocidades de relajacin.
31
Detector fluorimtrico de haz simple
Es uno de los detectores ms
sensibles en HPLC
La radiacin de excitacin suele ser
generada por una lmpara de
vapor de mercurio que proporciona
una radiacin intensa a 253.7 nm.
Numerosas sustancias
fluorescentes se excitan con esta
radiacin.
La radiacin se enfoca con lentes
de cuarzo y la radiacin
fluorescente se detecta con una
fotoclula.
La sensibilidad del detector
permite detectar 1x 10
-9
g/ml de
analito con un rango dinmico
lineal amplio
32
Example of a separation monitored by a simple
fluorescence detector
Separation of a mixture of priority pollutants.
The excitation light was approximately
monochromatic at 254 nm and all wavelengths
of the fluorescent light was sensed by the photo
cell.
Column: 2 Pecosphere5C C18 (150 mm x 4.6 mm) in
series. Mobile Phase: 90% acetonitrile/10% water. Flow
rate: 2.0 ml/min. Detector Fluorescence (Excitation 254 nm
total emission sensed). Sample: 20 ml of NBS Standard
15. Benzo(ghi)perylene 14.Indeno(1,2,3,cd)pyrene 13. Dibenz(a,h)anthracene
12. Benzo(k)fluoranthene 11. Benzo(k)fluoranthene 10. Benzo(b)fluoranthene
9. Chrysene 8. Benzo(a)anthracene 7. Pyrene
6. Fluoranthracene 5. Anthracene 4. Phenanthrene
3. Acenaphthene 2. Fluorene 1. Naphthalene
33
QUIMIOLUMINISCENCIA
La aplicacin de la quimioluminiscencia a la
qumica analtica es de desarrollo relativamente
reciente. Las reacciones qumicas que producen
quimioluminiscencia son pocas, limitando, as, el
procedimiento a un nmero relativamente pequeo
de especies.
Algunos de los compuestos que reaccionan dando
quimioluminiscencia son componentes importantes
del medio ambiente.
Para estos casos, la alta selectividad, la sencillez y
la extrema sensibilidad del mtodo son la causa de
su creciente utilizacin
34
El fenmeno de la quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia se produce cuando una reaccin qumica
genera una especie electrnicamente excitada, que emite luz
cuando vuelve al estado fundamental o que transfiere su energa a
otra especie que, posteriormente, da lugar a una emisin.
En los sistemas biolgicos tambin se producen reacciones
quimioluminiscentes, en estos casos, el proceso se suele denominar
bioluminiscencia:
lucirnagas, ciertas algas y medusas, bacterias, protozoos y crustceos.
La qumica de los distintos procesos bioluminiscentes naturales no se
conoce totalmente.
35
Quimioluminiscencia en el laboratorio
Hace ms de un siglo se descubri que ciertos compuestos
orgnicos relativamente sencillos tambin eran capaces de
presentar quimioluminiscencia. El tipo de reaccin ms
sencilla de dichos compuestos para producir
quimioluminiscencia se puede formular como:
A + B = C* + D
C* = C + hv
C* representa a la especie C en el estado excitado.
El espectro de luminiscencia es el del producto de reaccin C.
La mayora de las reacciones quimioluminiscentes son
considerablemente ms complicadas de lo que sugieren las
reacciones anteriores.
36
Eficiencia cuntica de la
quimiolumiuniscencia
En quimioluminiscencia, la intensidad de radiacin I
CL
(fotones emitidos por segundo) depende de la
velocidad de la reaccin qumica (dC/df) y de la
eficacia cuntica de quimioluminiscencia
CL
(fotones
emitidos por molcula que ha reaccionado).
El ltimo trmino es igual al producto de la eficacia
cuntica de excitacin
EX
(estados excitados por
molculas que han reaccionado) y la eficacia cuntica
de emisin
EM
(fotones por estado excitado).
Estas relaciones se describen mediante la ecuacin.
I
CL
=
CL
dC/dt =
EX

EM
dC/dt
Los sistemas quimioluminiscentes tiles en anlisis,
generalmente presentan valores de
CL
comprendidos entre 0,01 y 0,2.
37
Medida de la quimioluminiscencia
La instrumentacin para las medidas de la
quimioluminiscencia es notablemente sencilla y puede
consistir tan slo en un recipiente de reaccin
adecuado y un tubo fotomultiplicador.
Generalmente, no es necesario ningn dispositivo
para seleccionar la longitud de onda, ya que la nica
fuente de radiacin es la reaccin qumica entre el
analito y el reactivo. Diversos fabricantes de
instrumentos ofrecen fotmetros quimioluminiscentes.
La seal caracterstica de un experimento
quimioluminiscente en funcin del tiempo alcanza
rpidamente un mximo cuando la mezcla del analito
y del reactivo es completa; a continuacin la seal
desciende de manera que se ajusta ms o menos a
una funcin exponencial
Normalmente, en el anlisis cuantitativo la seal se
integra para un perodo de tiempo fijo y se compara
con patrones tratados de forma idntica.
Como medida alternativa se utilizan las alturas de los
picos. A menudo se obtienen relaciones lineales entre
la seal y la concentracin, para intervalos de
concentracin de varios rdenes de magnitud.
38
Aplicaciones analticas de la
quimioluminiscencia
Los mtodos quimioluminiscentes tienen,
generalmente, una elevada sensibilidad, ya que, en
ausencia de ruido, se miden bajos niveles de
radiacin.
Adems, se evita la atenuacin de la radiacin que
tiene lugar cuando sta atraviesa un filtro o un
monocromador.
De hecho, los lmites de deteccin vienen
determinados, no tanto por la sensibilidad del
detector, sino por la pureza de los reactivos.
Los lmites de deteccin caractersticos se
encuentran dentro del intervalo de partes por billn
(o a veces menos) a partes por milln.
39
Anlisis de gases
Los mtodos quimioluminiscentes para la
determinacin de gases, se originaron por la
necesidad de encontrar medios muy sensibles
para la determinacin de contaminantes
atmosfricos como el ozono, los xidos de
nitrgeno y los compuestos azufrados.
De estos mtodos, uno de los ms utilizados es el
destinado a la determinacin de monxido de
nitrgeno; las reacciones son:
NO + O
3
= NO
2
* +O
2
NO
2
* = NO
2
+ h (= 600 a 2800 nm)
40
El ozono procedente de un electrogenerador y las
muestras de la atmsfera son arrastrados de forma
continua al recipiente de reaccin, donde se sigue
el curso de la radiacin luminiscente mediante un
tubo fotomultiplicador.
Se ha encontrado una respuesta lineal para
concentraciones de monxido de nitrgeno desde 1
ppb hasta 10.000 ppm.
Este procedimiento se ha convertido en el ms
utilizado en el control de la concentracin de este
importante constituyente atmosfrico desde el nivel
del mar hasta altitudes de 20 km
41
La reaccin del monxido de nitrgeno con el ozono se ha
utilizado, tambin, en la determinacin de xidos de nitrgeno
de estados de oxidacin superiores.
Por ejemplo, el contenido de dixido de nitrgeno en los gases
de escape de los automviles se ha determinado por
descomposicin trmica del gas a 700 C en un tubo de acero.
La reaccin es: N0
2
= NO +O
Al menos dos fabricantes ofrecen actualmente un instrumento
para la determinacin de nitrgeno en materiales slidos o
lquidos que contienen entre un 0,1 y un 30 por 100 de
nitrgeno. Las muestras se pirolizan en una atmsfera de
oxgeno bajo condiciones en las que el nitrgeno se convierte
cuantitativamente en monxido de nitrgeno
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Anlisis del ozono
Para el control del ozono atmosfrico se utiliza un mtodo
quimioluminiscente
La determinacin se basa en la luminiscencia producida
cuando el analito reacciona con el colorante rodamina B,
adsorbido sobre una superficie de gel de slice activada.
Este procedimiento es sensible a concentraciones de ozono
inferiores a 1 ppb; la respuesta es lineal hasta 400 ppb de
ozono.
El ozono tambin se puede determinar en fase gaseosa
como consecuencia de la quimioluminiscencia producida
cuando el analito reacciona con el etileno.
Ambos reactivos son especficos para el ozono.
43
Anlisis de compuestos azufrados en
la atmsfera
Otro importante mtodo quimioluminiscente en fase gaseosa se utiliza
para la determinacin de compuestos azufrados de la atmsfera,
como el sulfuro de hidrogeno, el dixido de azufre y los mercaptanos.
En estos casos, la muestra se quema en una llama de hidrogeno para
dar un dmero de azufre, que posteriormente se descompone
emitiendo luz. Por ejemplo, con el dioxido de azufre, las reacciones
son:
Aqu, la radiacin emitida cae dentro de la zona azul, con picos a 384
y 394 nm. Su intensidad es proporcional al dmero de azufre excitado.
De forma similar, la combustin de los compuestos fosforados en una
llama de hidrogeno da lugar a la emisin de radiacin a 526 nm,
debido a HPO*.
Se han llegado a obtener curvas de calibrado lineales para intervalos
de concentracin de ms de cuatro decenas. Estas dos tcnicas de
quimioluminiscencia en llama se emplean para la deteccin de
especies azufradas o fosforadas en el eluyente de las columnas de
cromatografa de gases.
44
Anlisis de especies inorgnicas
en fase lquida
Muchos de los anlisis llevados a cabo en fase
lquida utilizan sustancias quimioluminiscentes
orgnicas que contienen el grupo funcional
Estos reactivos reaccionan con el oxigeno, con
el perxido de hidrogeno y con muchos otros
agentes oxidantes fuertes dando lugar a un
producto de oxidacin quimioluminiscente.
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Reaccin del luminol
El luminol es el ejemplo ms
comn de este tipo de compuestos.
Reacciona con oxidantes fuertes,
tales como oxgeno, perxido de
hidrgeno, ion hipoclorito o
permanganato, en presencia de
una base fuerte.
A veces se necesita un catalizador
para que la reaccin transcurra a la
velocidad adecuada.
La emisin producida coincide con
el espectro de fluorescencia del
producto, el anin 3-aminoftalato
Se produce una
quimioluminiscencia azul con
mximo a 425 nm.
46
Usos de la reaccin del luminol
Dentro de ciertos limites, la intensidad de
quimioluminiscencia del luminol es proporcional a la
concentracin del oxidante, del catalizador o del luminol.
Como consecuencia, la reaccin proporciona un mtodo
sensible para determinar cualquiera de estas especies.
Por ejemplo, si se utiliza peroxido de hidrogeno como
oxidante, y como catalizador Co
2+
, se pueden determinar
concentraciones de este elemento inferiores a 0,01
nmol/L
Si el catalizador es Cr
3+
,se pueden determinar
concentraciones inferiores a 0,5 nmol/L y si es Cu
2+
,
concentraciones inferiores a 1 nmol/L.
Con algunos cationes tiene lugar una inhibicin de la
luminiscencia; en esos casos, el descenso en la intensidad
permite determinar sus concentraciones.
47
Anlisis de especies orgnicas
Para aumentar la selectividad de las reacciones quimioluminiscentes y
ampliar la quimioluminiscencia a analitos que no participan directamente
en las reacciones quimioluminiscentes, es comn llevar a cabo una
reaccin enzimtica, como etapa previa a la quimioluminiscente.
En este caso, el analito a determinar es el sustrato y uno de los
productos de la reaccin enzimtico se detecta por quimioluminiscencia.
Este mtodo se lleva a cabo, generalmente, en sistemas de flujo con
columnas rellenas de la enzima inmovilizada.
Recientemente se ha dirigido la atencin hacia los biosensores que
utilizan enzimas unidas a fibras pticas.
En la etapa de predeteccin se suelen utilizar enzimas oxidasas que
generan H
2
0
2
. No solo puede determinarse el H
2
0
2
con distintos
sistemas quimioluminiscentes, sino que el oxidante necesario (O
2
) esta
presente en la mayora de las muestras, especialmente en aquellas que
son disoluciones acuosas.
Asumiendo que por efecto del enzima se consigue una conversin
cuantitativa, se pueden determinar los sustratos cuyas concentraciones
estn por debajo de 10 a 100 nM, lo mismo que el H
2
0
2
. Dentro de los
sustratos detectados de esta forma se encuentran: glucosa, colesterol,
colina, acido rico, aminoacidos, aldehidos y lactato.
48
La metodologa anterior se puede ampliar utilizando etapas
enzimticas secuenciales para convertir finalmente al analito en una
cantidad equivalente de producto quimioluminiscente.
De esta forma se han determinado azcares distintos de la glucosa,
glucosidos, esteres del colesterol, creatinina y acetilcolina.
El luminol mas una peroxidasa, como catalizador, parece ser el
sistema ptimo para la determinacin de H
2
0
2
. El pico de intensidad
luminiscente se alcanza en aproximadamente 100 ms; el disolvente
es acuoso pero es compatible con algunos compuestos orgnicos; el
limite de deteccin est prximo a 0,1 pM, con un intervalo de
linealidad de tres a cuatro decenas de concentracin.