Com o constante aumento do conhecimento sobre os mecanismos bioqumicos em nvel
celular e molecular, mais e mais opes para intervenes farmacolgicas foram
identificados que sugerem novos caminhos para terapias desejados potencialmente permitindo cura para graves doenas, se no fatais. O outro lado dessa investigao a potencial utilizao indevida oferecida por um subconjunto de candidatos a novos frmacos, especialmente aqueles que promovem o crescimento muscular, estimular a produo de eritrcitos, ou aumentar a resistncia fsica e desempenho atltico por outras vias [1]. Tais drogas candidatos foram oferecidas e vendidas atravs de provedores baseados na Internet h anos, apesar da falta de aprovao clnico e, em alguns casos, a interrupo do seu desenvolvimento devido a efeitos colaterais graves. A 'clientela' alvo dessas ofertas composta de recreio, bem como atletas profissionais, com estes ltimos em risco de violar os regulamentos estabelecidos pela Agncia Mundial Anti-Doping (WADA) [2] Estes regulamentos conforme apresentado na Lista de Substncias Proibidas da WADA incluem uma categoria de substncias especialmente dedicado a esses compostos, ou seja, / suspensa candidatos 'no aprovados para uso humano' de drogas, conhecido como S0. A fim de permitir controles de dopagem abrangentes, atualizao de laboratrios acreditados, expandir e melhorar a sua carteira de ensaios analticos, a maioria dos quais dependem de espectrometria de massa de cromatografia aproxima [3,4]; No entanto, a implementao de novos compostos em protocolos de testes de drogas esportes requer uma quantidade substancial de informaes, incluindo dosagem teraputica, farmacocintica, metabolismo e eliminao. Alm disso, as propriedades fsico-qumicas especficas poderia exigir coleo dedicada amostra e condies de transporte, a preparao da amostra ou procedimentos analticos para garantir a sensibilidade e especificidade necessria para detectar o analito alvo com limites de deteco (LOD) [5] Com as restries no oramento, tempo, volume de amostra (s), pessoal de laboratrio e instrumentao, laboratrios de testes de drogas esportes, porm, so instados a combinar o nmero de testes de deteco possvel, sem comprometer as exigncias analticas necessrias, de preferncia utilizando e ampliando abordagens analticas existentes. Assim, menus de teste precisam ser organizados de forma racional e sua adequao finalidade como procedimento de teste inicial adequada tem de ser demonstrada. Enquanto antigamente classes de drogas ditou a composio dos ensaios analticos, hoje em dia o equipamento analtico disponvel comumente rege as estratgias de ensaio utilizados [3]. At o momento, matrizes de controle de doping de rotina so urina, soro e sangue, ocasionalmente complementada por matrizes alternativas, como o cabelo, potencialmente, fornecendo elementos de prova. Os protocolos de coleta de seguir os regulamentos rigorosos e exigem formao de controle de doping diretores / flebotomistas; horrios e condies de transporte devem ser controlados e documentados especialmente no caso de amostras de sangue para o Passaporte Biolgico Atleta (ABP), onde tambm se aplicam aos prazos para transporte e anlise. Alm disso, o armazenamento da amostra (urina e soro) tem de ser assegurada por at 10 anos para permitir re-teste se for solicitado. Na presente reviso, a literatura publicada entre 2009 e 2013 a respeito emergente, 'designer', e as drogas so discutidas no mbito do controlo de dopagem humanos descontinuado. Desafios decorrentes da caracterstica estrutural de substncias so apresentados e estratgias de identificao e deteco de metablitos so delineadas para uma seleco representativa de compostos que cobrem analitos massa molecular baixa e alta da composio de cidos no peptdico, peptdico e ribonucleico. 2. Os compostos que afetam o desempenho do msculo esqueltico Devido ao substancial nmero de compostos com impacto evidente ou presumido na fisiologia do msculo esqueltico e / ou desempenho, as substncias consideradas na seguinte so divididos nas categorias de produtos de baixa e alta massa molecular. 2.1. Substncias de baixa massa molecular 2.1.1. Estabilizadores Rianodina-receptor-calstabin complexo (Rycals) Estudos sobre a arritmia cardaca, bem como sarcopenia (como definido como a perda relacionada com a idade de massa muscular, fora e capacidade de exerccio) e distrofia muscular revelaram a importncia do receptor de rianodina 1 (RyR1) e seu canal de Ca2 + complexo de parceiro de edifcio molcula calstabin-1 (protena de ligao FK506 12, FKBP12) no que diz respeito funo muscular esqueltico e cardaco normal. Substancial de investigao sobre os mecanismos de modificaes ps-traduo foi realizada em modelos animais e, mais recentemente, tambm em seres humanos, indicando particularmente e S-nitrosilao (hiper) fosforilao de RyR1 como principais factores da AGING-, Disease, ou induzida por exerccio-comprometimento funcional dos micitos [6-8]. Uma terapia potencial baseado em derivados de benzotiazepina candidatos a frmacos, tais como a teraputica de primeira e de segunda gerao o JTV- 519 e S107 (Fig. 1a, 1 e 2) [9], que foram mostrados para reduzir a fadiga muscular e melhorar o exerccio capacidade em roedores de laboratrio, restaurando o complexo RyR1-FKBP12. Consequentemente, a relevncia de tais compostos para testes de drogas esportes foi reconhecido e foram estabelecidos ensaios de deteco para as drogas intactas e / ou gerados in vitro metablitos no sangue e na urina. O comportamento de espectrometria de massa de o JTV-519 e S-107 foi estudado in extenso que utiliza ionizao por electrospray (ESI) e de dissociao induzida por coliso (CID) [10], bem como de ionizao de electres (EI) [11] empregando alta resoluo / alta preciso espectrometria de massa, rotulagem istopo estvel e, no caso de ESI-CID, experimentos / D-H cmbio. Por meio das informaes obtidas, foram desenvolvidos mtodos de ensaio para a urina [10,11] e no plasma [12] que permite a deteco das molculas intactas na LODs de 0,1-6 ng / ml. No caso de plasma sanguneo, as concentraes mximas de candidatos a frmacos aps a dosagem teraputica eram esperados a cerca de 40 ng / ml, que foi bem dentro da janela de deteco do mtodo de ensaio desenvolvido. Na ausncia de dados sobre a eliminao e metabolismo (renal) das benzotiazepinas, as amostras de urina foram sujeitos a hidrlise enzimtica seguido por extraco lquido-lquido (LLE) dos analitos alvo e a deteco subsequente por meio de chromatography- lquido de massa (em tandem) espectrometria de massa (LC-MS / MS) ou cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS). A fim de complementar a abordagem mais analtica com metabolitos putativos, fase-I e fase-II reaces metablicas foram simulados para o S-107 in vitro, produzindo espcies predominantemente N- e S-oxigenados, bem como metabolitos N e O-desmetilados. Alm disso, cido glucurnico conjugado da droga intacta e seu produto metablico fase-I desmetilada-O foram identificados representando alvos viveis para controles de dopagem futuros [13]. Alm disso, o desenvolvimento de compostos derivados de benzotiazepina da prxima gerao precisa de posterior considerao, por exemplo, no que diz respeito ao candidato a frmaco ensaio clnico de fase-II referido como ARM036 (Aladorian, Fig. 1a, 3) [14], o espectro de massa inica do produto das quais apresentado na Fig. 1b. 2.1.2. Moduladores seletivos dos receptores dos andrognios (SARM) Moduladores de receptores de andrgeno seletivos no-esterides (SARMs) tm sido objeto de extensos ensaios pr-clnicos e clnicos desde que os primeiros-in-class compostos foram identificados em 1998, predominantemente, visando o tratamento e preveno da sarcopenia, osteoporose e as perdas relacionadas com a doena de massa muscular esqueltica, a fora ea funo [15,16]. Alm disso, a utilidade potencial de SARMs em cardiologia tem sido discutido [17], eo interesse substancial em novas entidades de drogas com propriedades SARM-como ainda est na inclinao de acordo com comentrios recentes [16,18] e publicaes sobre os avanos na SARM- investigao relacionada com [19-21]. Com o aumento da quantidade de possveis candidatos no-esterides e esterides drogas SARM, cujos exemplos so ilustrados na Fig. 2 (13/04), a carteira de compostos potencialmente mal utilizados em esportes expandido em conformidade [22,23] e ensaios de deteco mais ampla informao sobre o metabolismo ea eliminao so vitais para controles de dopagem apropriadas. Consequentemente, estudos focados no metabolismo de SARMs e possibilidades de detectar intacta, bem como SARMs metabolizados foram iniciados e continuados, e foi demonstrada a relevncia ea necessidade de mtodos de ensaio adequados com os primeiros resultados analticos adversos (AAFS) para SARMs em 2010 e nos anos seguintes [24,25]. Foram estabelecidos os ensaios analticos para SARMs de plasma [12,26], manchas secas de sangue (DBS) [27], e na urina visando tanto as substncias intactas (plasma e DBS) ou metablitos principais (urina), identificados e caracterizados em em estudos in vitro [28] e in vivo [29-31]. Apesar das semelhanas estruturais entre algumas modestas SARMs que compreendem, por exemplo uma unidade de anilina substitudo na posio 4, uma heterogeneidade substancial de farmacforos est presente em SARMs actualmente investigados, incluindo (entre outros) arylpropionamide, quinolinona, tropanol, tetra-hidroquinolina, hidantona, tiofeno, fenil-oxadiazol, e derivados de esterides (Fig. 2, Tabela 1) . Por isso, vrios projetos foram necessrios fornecendo perspectivas sobre principais vias metablicas e do comportamento de espectrometria de massa de identificar e caracterizar compostos- alvo. Todos os SARMs recentemente estudados em um contexto de controle de doping demonstrado bons ou excelentes propriedades de ionizao usando electrospray, apoiando assim a deteco sensvel destes compostos e produtos metablicos relacionados em amostras de teste de drogas esportes empregando estratgias-MS LC baseados MS-/ [3,32]. SARMs Arylpropionamide-derivados estavam entre a primeira categoria de agentes anablicos emergentes investigada com ESI-MS / MS, EI-MS (/ MS), e sob in vitro e in vivo em condies de metabolismo. Foi observada uma concordncia substancial entre os resultados de in vitro e estudos in vivo, e amostras de urina de estudo de ps-administrao do arylpropionamide SARMs derivados S-4 e S- 22 (Fig. 2, 4 e 5, respectivamente) predominantemente renderam os conjugados cido glucurnico das drogas intactas e correspondentes metabolitos mono-hidroxilados como analitos viveis para controles de dopagem de rotina [29,30] com LODs para os candidatos da droga encontrada intacta abaixo de 1 ng / ml. Complementares, LODs de 0,05-20 ng / ml [27,33] e 10 ng / ml [26] foram determinados em DBS e do plasma, respectivamente, para a teraputica intactas. Substncia caracterizao por meio de tcnicas de espectrometria de massa, particularmente LC-MS / MS empregando espectrometria de massa de alta resoluo / alto rigor, foi ainda realizada para as arylpropionamides relacionadas com S-1, S-9, S-23 e S-24 [34], todos dos quais tambm foram submetidos a sistemas que simulam reaes metablicas, tais como microssomal humano fgado [28] ou fngica [35] preparativos para fornecer material de referncia para as metas (provisrios) para o teste de drogas de esportes. De igual modo, as investigaes sobre a espectrometria de massa de SARM e sua deteco em urina humana foram conduzidos para quinolinone- (por exemplo, LGD-2226, a Fig. 2, 6), tetrahydroquinoline- (por exemplo, S-40503, Fig. 2, 8), e hidantona -derived substncias (por exemplo, BMS564929, a Fig. 2, 10) [34], complementado por estudos mais recentes sobre fenil-oxadiazol- (RAD140, a Fig. 2, 11) e base de SARM tropanol (ACP-105, Fig. 2, 12) [36]. A eliminao do ACP-105 foi ainda estudada num modelo de rato, demonstrando a produo de vrios mono- diferente e metabolitos bishydroxylated que servem como analitos alvo preferidos como o composto administrado foi detectada apenas intacta at 24 h [31]. Em contraste, humana in vitro e in vivo em estudos com RAD 140 sugeriu a utilizao do SARM administrado como composto alvo urinrio para fins de controlo de dopagem como reaces metablicas apenas modestos para um anlogo de mono-hidroxilados foram observados e RAD140 foi detectada em ps-administrao de amostras de urina estudo at 8 dias [37]. Enquanto comentrios recentes sobre SARMs em desenvolvimento clnico ter se referido a estrutura da droga candidato LGD-4033 no divulgado [16], os fornecedores com base na Internet de SARMs atribuiu 4- (2 - ((S) -2,2,2- trifluoro-1 -hidroxietil) pirrolidin-1-il) -2- (trifluorometil) -benzonitrilo (Fig. 2, 13) a ele. Apesar da ausncia de confirmao, a entidade de drogas faz parte das patentes da LIGAND farmacutica sobre compostos com propriedades SARM-like [38] e, portanto, tambm um candidato para controles de dopagem. Assim, ensaios de deteco so necessrias, nomeadamente luz de sua disponibilidade indiscutivelmente ilcita e informaes sobre as propriedades de espectrometria de massa da substncia e seu metablito (s) so necessrios para complementar esportes rotina de testes de drogas (Fig. 3). 2.1.3. Activadores sirtuin-1 Sirtuins (1-7) representam uma famlia de enzimas dependentes de NAD + histona deacetilase, com sirtuina-1 (SIRT1) ser um regulador chave na desacetilao de substratos proteicos moduladores do metabolismo, tais como protenas caixa forkhead (FOXO) e receptor activado pelo proliferador de peroxissoma coativador ~ 1 ~ (PGC-1 ~) [39]. Desde a descoberta do efeito de ativar a SIRT1 do resveratrol com impacto significativo no msculo contedo mitocondrial esqueltico, vida til estendida e anti- envelhecimento, bem como as propriedades antidiabticas em modelos animais, muito esforo foi investido em pesquisas sobre entidades sintticas de drogas ativador SIRT1 (STACS) [40,41]. Apesar de um amplo debate sobre o mecanismo (s) subjacente responsvel pelos efeitos benficos observados [42-46], uma srie de STACS levar candidatos a medicamentos, como SRT1720, SRT1460, e SRT2104 (Fig. 4, 14 e 15) foi produzido e tem sido objecto de ensaios clnicos avanados desde ento. O resultado, sem dvida comparvel de administrao STAC com outros moduladores metablicos, como por exemplo, AICAR (vide infra), em termos de farmacologicamente reforada resistncia tem provocado preocupaes quanto ao potencial uso indevido dessas substncias. Consequentemente, foram estabelecidos ensaios analticos para STACS de primeira gerao e compostos modelo adicionais no sangue e na urina. Alm disso, in vitro e em estudos de biotransformao in vivo foram conduzidos para fornecer informaes sobre alvos viveis para janelas de deteco estendidos no teste de drogas esportes rotina. Referncia sub-posies STAC comercialmente disponveis e sintetizados incluindo SRT1720 e quatro compostos estruturalmente relacionados foram estudados quanto seu comportamento ESI-MS e MS / MS e medido a partir de plasma humano [47]. Um total de 100 l ~ do espcime foi enriquecida com um oito vezes anlogo deuterado de SRT1720 e resveratrol deuterado (normas internas), e as protenas plasmticas foram precipitados por meio de acetonitrilo. O sobrenadante foi analisado por LC-ESI-MS / MS no modo de monitorizao de reaco mltipla (MRM), permitindo que os limites de deteco para entre 0,1 e 1 ng / ml. Considerando-se as concentraes plasmticas relatados de STACS em ensaios clnicos atingindo at 390 ng / ml, as LODs realizados demonstram a adequao ao objetivo da abordagem apresentada. A fim de complementar a abordagem com anlises realizadas a partir da urina, analitos alvo foram gerados usando em sistemas de biotransformao in vitro [48]. As principais reaces metablicas includos N-oxidao e hidroxilao, e os produtos resultantes foram ainda observados em estudos subsequentes de administrao de rato [49]. Por meio dos STACS intactas, o mtodo de ensaio foi caracterizado indicando limites de deteco para os analitos alvo em matriz urinria de 0,5 ng / ml. Ele continua a ser esclarecido se as drogas intactas ou metablitos selecionados sero os compostos mais adequados para anlises de rotina de controle de doping; no entanto, a opo de princpio para detectar estes compostos no sangue / plasma e na urina estabelecida e tem a finalidade de pesquisa anti-doping pr-ativa e preventiva. 2.1.4. AICAR (5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonuclesido) Monofosfato de adenosina (AMP) -carves ativados protena quinase (AMPK) um fator essencial da biognese e funo [50] mitocondrial. Devido ao papel fundamental das mitocndrias do msculo esqueltico na sade e na doena, bem como em exerccio, numerosos estudos sobre as pelo menos parcialmente claro mecanismos de biognese mitocondrial tm sido realizados com o objetivo de identificar potencial farmacolgico significa para curar geneticamente causado (por exemplo, Duchenne muscular distrofia, DMD, ou esclerose lateral amiotrfica, ALS) e no-gentica (por exemplo, obesidade ou sndrome metablica) desordens [51]. O chamado regulador mestre de nmeros mitocondrial o mencionado anteriormente PGC-1 ~, controle da clula "powerhouse", que afetada por fatores de estresse, como a restrio calrica e exerccio [52]. O activao de PGC-1 ~ pode ser desencadeada por meio da expresso de genes, bem como as modificaes ps-traducionais, incluindo a fosforilao, a qual (entre outros factores) depende da atividade da AMPK, uma vez que apenas o fosforilada PGC-1 Acredita-se que ~ para ser subsequentemente preparado SIRT1 por via desacetilao e capaz de induzir a expresso do gene requerida para mitochondriogenesis. Esta interconexo, a relevncia da AMPK e sua ativao atravs de agonistas potentes como o ribonucleosido 5-amino-4-imidazolecarboxamide (AICAR, 4 Fig. 16) [53] ter sido a razo para incluir este composto e substncias relacionadas com a Lista de Substncias Proibidas da WADA em 2009, o primeiro classificado como substncia doping gentico e mais tarde como modulador metablico [2]. O administrao do AICAR natural e clula-permevel AMPK activador para roedores de laboratrio a 500 mg / kg / dia foi mostrado para activar eficazmente a AMPK via de sinalizao resultando numa melhoria da resistncia de ratos no treinado por 23-44% [54]. Este apoiou a necessidade da incluso do composto em doping programas de controle, bem como o fato de que a substncia tenha sido prontamente disponvel como qumica e via fornecedores baseados na Internet [23], e supostamente encontrou o seu caminho no mundo do esporte, entretanto, [55, 56]. Devido ocorrncia natural de AICAR em urina humana, proporcionando evidncia para o uso ilcito da candidata no aprovada droga tem exigido analtica estratgias semelhantes s abordagens sofisticadas utilizadas para a deteco de desvio esteride natural / endgena. Por meio de espectrometria de cromatografia lquida / istopo conjunto de diluio de massa (LC-IDMS / MS), que ocorre naturalmente concentraes urinrias de AICAR foram quantificados em uma populao de 499 atletas, demonstrando uma correlao significativa dos nveis urinrios AICAR e gnero, tipo de esporte (por exemplo, a resistncia ea fora do esporte) e ponto de tempo da coleta da amostra (ou seja, dentro / fora de competio) [57]. Um valor mdio de cerca de 2200 ng / ml foi relatada, e tendo em considerao um outro conjunto de 500 amostras de urina coletadas de atletas de recreio, um nvel-limite provisrio de 3500 ng / ml foi sugerido (resultados no publicados). No entanto, a simples ultrapassagem de concentraes urinrias Aicar acima dos valores de referncia no permitiro comprovar o abuso de AICAR sinttico, particularmente devido s variaes intra e inter- individuais substanciais; tal informao ir permitir que, no entanto, e ainda desencadear anlises de suporte ou refutar um possvel a administrao de AICAR e, eventualmente, revelando a fonte do composto (endgena ou exgena). Uma matriz alternativa, presumivelmente, conservando AICAR administrado durante um perodo de tempo prolongado o eritrcito. Aps a introduo na corrente sangunea, AICAR foi demonstrado que atravessa a clula vermelha do sangue (RBC) da membrana seguido pela sua converso no derivado monofosfato 5 ~, que no permite o seu efluxo a partir do RBC e provoca uma acumulao de a produzida AICAR- ribtido, sem dvida, para o tempo de vida do eritrcito. Assim, medindo concentraes AICAR-ribtido intra-eritrocitrios poderia fornecer informaes complementares para saber se os nveis anormalmente elevados prevalecer ou no. Um ensaio analtico quantitativo tambm com base em LC-IDMS / MS foi estabelecido para a AICAR- ribtido nos eritrcitos, e 99 amostras dos atletas recreativos foram medidos para obter os intervalos de valores fisiolgicos normais (10-500 ng / ml) da substncia a analisar [58]. Por meio de reaes in vitro de incubao, a administrao de doses farmacolgicas de AICAR foram simulados, demonstrando um aumento da presso intra-eritrocitrios concentraes AICAR-ribtido de 10/01 ~ g / ml fornecendo prova- de-conceito para esta abordagem. Mais dados para intervalos de referncia e amostras de estudo administrao autnticas sero necessrios para avaliar o significado destes nmeros; No entanto, o perfil intra-individual das concentraes Aicar pode ser uma contribuio sensvel ao Passaporte Biolgico Atleta (ABP) para permitir a sinalizao de um parmetro de sangue achado incomum. Resultados de testes conclusivos sobre a origem endgena ou exgena de uma substncia que ocorre naturalmente em amostra de controlo de dopagem de um atleta geralmente obtida por espectrometria de massa da relao isotpica (IRMS) [59]. Esta abordagem tcnica tem sido empregada com sucesso em anlises de esterides por mais de uma dcada em controles de dopagem, e sua utilidade para a resoluo do problema AICAR foi sugerida j em 2010. Dois grandes obstculos tiveram que ser gerenciado para a anlise IRMS sucesso de AICAR, ou seja, a baixa volatilidade do analito, o que exige uma derivatizao antes da introduo da substncia no interior das cromatografia de gs de combusto-IRMS (/ IRMS GC C /) do sistema, e o isolamento a partir de urina de AICAR sem fraccionamento isotpica. Ambos os desafios foram recentemente resolvidos, proporcionando um ensaio validado permitindo diferenciar sinttico e AICAR natural, por meio de sua assinatura istopo de carbono [60]. O mtodo de ensaio requer um volume de 3 ml de urina e amostras de urina Atualmente AICAR com nveis mais elevados do que 1500 ng / ml so recomendados para serem submetidos a GC / C / IRMS. Devido s quantidades considerveis de AICAR na urina, tambm LC- IRMS, que comumente inferior a GC / C / IRMS em termos de sensibilidade analtica, tem sido considerada como um meio vivel de medir a assinatura isotpica do carbono; a data no entanto, nenhuma metodologia foi estabelecida ou relatados. 2.1.5. Os inibidores da fosfodiesterase-4 (PDE4) Na continuao da busca por terapias de apoio terapia de doenas relacionadas com a mitocndria, o impacto da fosfodiesterase-4 inibidores (PDE4) foi recentemente revista. Fosfodiesterases compreendem uma famlia de 11 membros atualmente conhecidos com caractersticas especficas e agentes de estimular ou inibir. PDE4, um alvo importante na doena pulmonar obstrutiva (DPOC) tratamento crnico [61-63], catalisa a converso de 3 ~ -5 ~ monofosfato de adenosina cclico (cAMP) a 5 ~ -AMP. A sua inibio foi mostrado para resultar em uma srie de conseqncias que permitem explicar os efeitos benficos do resveratrol no especfico inibidor da PDE em modelos de teste animal [50,64], incluindo, entre outros, o aumento da biognese mitocondrial ea funo associada com uma melhor utilizao de gordura e, por ltimo mas no menos importante, maior o desempenho do exerccio. A administrao do arqutipo sinttico de PDE4 rolipram-inibidor (Fig. 4, 17) para roedores de laboratrio produziu resultados semelhantes, indicando que um outro regulador mestre do msculo esqueltico mitochondriogenesis a montante do acima relatado factores-chave (por exemplo, de AMPK e PGC-1 ~) possui foi identificado. Consequentemente, medicamentos aprovados e os candidatos de drogas nesta categoria, inevitavelmente, passar para o foco do teste de drogas de esportes e organizaes de pesquisa doping preventivas, revelando um nmero considervel de pelo menos 50 candidatos que foram mencionados como potenciais agentes teraputicos com propriedades inibidoras da PDE4 [65] ; no entanto, at data, apenas um (roflumilast, Fig. 4, 18) recebeu a aprovao clnica para o tratamento da DPOC [66,67]. Cilomilaste (Fig. 4, 19) avanou para a fase-III de ensaios clnicos [68], e inmeras novas entidades de drogas adicionais em desenvolvimento clnico pr-clnico ou incio recentemente foram resumidos em uma ampla reviso [65]. Devido a estes argumentos, a necessidade de testes de deteco capazes de triagem de inibidores de PDE4 como o resveratrol, rolipram, roflumilast e cilomilast foi notado e primeiras abordagens analticas foram apresentados recentemente [69]. Com base em dados publicados DMPK e em reaes de incubao in vitro, analitos alvo foram selecionados e massa espectrometricamente caracterizada, incluindo as drogas intactas, bem como os principais metabolitos. Enquanto o roflumilast e cilomilast cada produziu principalmente um metabolito razoavelmente abundante in vitro (roflumilaste-N-xido e cilomilaste hidroxilado), rolipram foi convertido em seis produtos metablicos resultantes da hidroxilao intensas e reaces de desalquilao. Utilizando um protocolo de preparao da amostra estabelecido para as amostras de urina consistindo de hidrlise enzimtica seguido por LLE e subsequente anlise por LC-MS / MS, LODs de 1-5 ng / ml para os compostos de interesse foram realizadas, e os dados de prova de conceito foram alcanados com a amostra de urina de um paciente recolhida aps o uso teraputico de roflumilaste. Devido ao aumento substancial no desempenho, como observado com roedores em um teste de esteira (time-to-exausto) eo nmero evi- dentemente elevado de mitocndrias no msculo esqueltico dos animais de experincia resultantes de administraes PDE4-inibidor, uso indevido dessas substncias no pode ser excluda e, pelo menos, a incluso em programas de monitoramento parece aconselhvel. 2.1.6. Peptdicos e no peptdicos secretagogos de GH (GHS) O multifacetado (e, possivelmente, melhorar o desempenho) efeitos do hormnio de crescimento humano (hGH), mediada principalmente por interesse substancial insulin- like growth factor-1 (IGF-1) para o msculo esqueltico, ter provocado e programas de pesquisa abrangente com medicinal e teraputico inteno no passado. Um dos muitos resultados notveis foi a descoberta de oralmente activos secretagogos da hormona do crescimento (GHS), com base em vrios diferentes, incluindo por exemplo farmacforos benzolactame, 4-spiropiperidina, capromorelin, e derivados de oxindole, tal como L-739943, MK-0677, CP-424391, e SM-130686, respectivamente, que esto representadas na fig. 4 exemplos como selecionadas de uma enorme variedade de potenciais candidatos a frmacos [70,71]. Desde GHS estimular a secreo de hGH atravs de uma via alternativa a partir da hormona de libertao da hormona do crescimento (GHRH, vide infra) e, possivelmente, proporcionar efeitos sinrgicos [72], o seu desenvolvimento clnico tem sido prosseguida complementar s terapias convencionais indicados na hGH / IGF-1 de cada eixo distrbios relacionados e declnio relativo idade. Aumentos sustentados do plasma IGF-1 foram relatados em estudos de administrao do GHS; no entanto, nenhum dos candidatos a frmacos de chumbo ainda recebeu aprovao clnica, possivelmente devido a benefcios limitados em comparao com as terapias de substituio e de hGH relatou o ganho de peso devido aos efeitos que estimulam o apetite do GHS. No entanto, os compostos, tais como MK-0677 tm estado disponveis atravs de fornecedores baseados na Internet, e os mtodos de deteco para a classe heterognea de GHS no-peptidilo so desejveis em rotina controlos de dopagem, de preferncia, utilizando metodologias comuns disponveis, tais como espectrometria de massa (Fig. 5a) . Alm destes GHS oral disponvel, uma variedade considervel de hormnio de crescimento peptdeos liberando (GHRP), agindo atravs das mesmas vias sobre a secreo de hGH foi desenvolvida a partir dos trabalhos seminais de Bowers e colaboradores demonstraram a capacidade de peptdeos curtos para regular liberao de hGH no incio de 1980 [73-75]. Um representante (Pralmorelin, GHRP-2) recebeu aprovao clnica de 2004 no Japo como uma ferramenta de diagnstico de deficincia de GH em adultos [76]. Enquanto a maioria dos GHRPs, uma seleo de que se resume na Tabela 2, que atualmente no possuem aprovao por qualquer autoridade de sade para uso teraputico humano, inmeras fontes do mercado negro foram identified como fornecedores de tais agentes [77,78] , o que sublinha a importncia de doping ensaios de controle, permitindo a anlise sensvel e abrangente do GHS. A abordagem genrica para este problema foi apresentado em 2012 por Pinyot et al., Que empregou um ensaio de ligao ao receptor competitivo [79,80]. Uma vez que todas partilham o GHS comum para se ligarem ao receptor de GHS 1a, o receptor ligado membrana pr-incubada com um ligando radiomarcado (125I-grelina), que deslocado pelo urinrio (GHS) de uma forma dependente da dose tal como demonstrado com 7 sinttica GHS em um estudo de prova de conceito. As respostas positivas ou concentraes mnimas para GHS na urina variaram de 1.5E-10 1.0E-M para 06 com MK-0677 sendo o mais sensvel deteco. A anlise do pptido de libertao da hormona de crescimento GHRP-2 em ps-administrao de amostras de urina estudo foi ainda apresentado, sugerindo uma janela de deteco de cerca de 4,5 h para essa droga em particular. A confirmao da presena de uma substncia proibida que pertence classe de GHS foi recomendado e conduzida atravs de ensaios de LC-MS / MS dedicados. Tal metodologia baseada em espectrometria de massa de focagem particularmente na deteco de GHRP-2 e o seu principal metabolito (d-Ala-d (~ -naftilo) -Ala-Ala-OH) na urina humana foi publicado em 2010 por Okano et al. [81]. Aqui, uma GHRP-2 padro interno marcada com istopo foi usada para assegurar condies de preparao e anlise da amostra apropriados antes do espcime foi submetido a extraco de fase slida (SPE) e subsequente anlise por LC-MS / MS. O ensaio permitiu LODs de 20-50 pg / mL e foi aplicado a um estudo de excreo com dez voluntrios que receberam um bolus intravenoso de 100 ~ g de dicloridrato de GHRP-2. Enquanto foi encontrado o GHRP-2 intacto at 13 h, o metabolito acima mencionado foi detectado at 24 h, atravs da abordagem estabelecida. Do mesmo modo, um mtodo de rastreio foi estabelecida em 2011 direccionamento uma famlia de 8 GHRP (GHRP-1, -2, -4, -5, -6, alexamorelin, hexarelina, e ipamorelin), mais a anteriormente mencionada GHRP-2 metabolito utilizando um istopo diluio abordagem LC-MS [82]. Aqui, dois padres interno deuterado (d4-GHRP-4 e um D3-GHRP-2 metablito) foram adicionados e SPE foi realizada com uma resina de troca catinica fraco, antes de microbore separao LC de fase reversa e verificao completa de alta resoluo / de massa de alta preciso espectrometria, o que permitiu LODs de 0,2-0,5 ng / ml. A aplicabilidade do mtodo desenvolvido para as amostras de urina autnticos foi testado com um estudo da eliminao com 10 mg de GHRP-2 por via oral administradas a um voluntrio masculino. As anlises revelaram a ausncia de intacta GHRP-2 e rastreabilidade do GHRP-2 metablito at 20 h aps a administrao. Num estudo de acompanhamento, a configurao instrumental foi modificado para consistir de um sistema de nanoUHPLC interface para um analisador de massa de quadrupolo-Orbitrap [83]. Como resultado, os limites de determinao foram reduzido aproximadamente 20 vezes, para permitir a deteco de 2-10 pg / ml de cada uma das substncias. Como os dados DMPK da maioria GHRPs no esto disponveis, mas de grande importncia em termos de controles de dopagem, animais em estudos in vivo e in vitro em simulaes de reaes metablicas foram realizados para identificar e caracterizar os compostos alvo vivel para testes de drogas esportes abordagens [84]. Focando GHRP actualmente no aprovadas (excepto para o GHRP-2), sete libras COM foram administrados a ratos por via oral e intravenosa. Estes compostos (GHRP-1, -2, -4, -5, -6, alexamorelin, hexarelina, e ipamorelin) produziu pelo menos trs metablitos urinrios aps cada iv aplicao, que foram confirmados por humanos em simulaes in vitro e vai estender as opes de testes iniciais para GHRPs em controles de dopagem de rotina. Um espectro de massa inica do produto tpico de um GHRP intacta est descrita na Fig. 5b representa o GHRP-3. Dados phar-macokinetic Humanos para GHRP-6 foram apresentados por Cabrales et al. em 2012/2013 [85,86]. Utilizando uma abordagem de espectrometria de massa-diluio isotpica, o GHRP-6 foi determinada a partir de plasma com um LOQ de 5 ng / ml. As amostras foram enriquecidos com o GHRP-6 marcado com 13C, as protenas plasmticas foram esgotados por precipitao facilitado- acetona, e o analito alvo foi quantificado a partir do concentrado super-natant por nanoLC-Q / TOF MS utilizando uma coluna de nano LC monoltica. Na sequncia de um i.v. dose de bolus de 100, 200, ou 400 ~ g / kg de peso corporal, foram recolhidas amostras de plasma at 72 h, e o GHRP-6 concentraes foram encontrados a cair abaixo do limite de quantificao (5 ng / ml) aps 12 h ps- administrao. 2.2. High (er) substncias de massa molecular 2.2.1. O hormnio do crescimento liberando hormnios (GHRHs) Alm de GHS, o crescimento hormnio liberador do hormnio (GHRH) e seus anlogos sintticos modificados receberam um enorme estmulo para as vendas ilcitas e, principalmente, com base na Internet [77,87,88]. Em contraste com o GHS, GHRHs agem atravs de receptores na hipfise anterior, e representantes clinicamente aprovados de GHRHs so tesamorelin e Sermorelin. Alm disso, pesquisas sobre novos anlogos de GHRH potentes como agentes teraputicos tem sido ininterruptamente durante dcadas [89]. Isso resultou em uma srie de potenciais candidatos a frmacos, um dos compostos mais frequentemente mencionado de que tem sido CJC-1295 (Tabela 2). Tendo modificaes da sequncia em 5 posies, bem como um cido 3-maleimido- propinico para bioconjugao in vivo para a albumina [90], a sua eficcia em ratos com semi-vida prolongado no plasma foi relatada. Por isso, complementares aos mtodos de teste do GHS, o rastreio protocolos para GHRHs como CJC-1288, CJC- 1293, e CJC-1295 ter sido desejvel ainda que, semelhante maioria dos GHRPs, dados DMPK em humanos e informaes sobre a eliminao renal da droga intacta e do metabolito (s) em causa so largamente em falta. Uma metodologia empregando purificao por imunoafinidade seguida de anlise nanoLC-MS / MS foi apresentada em 2012 [91]. Por meio de pr-concentrao de 5 ml de urina utilizando SPE e extraco subsequente do alvo analitos GHRH (1-29, Sermorelin) e CJC-1295 (sem a parte de cido maleimidopropinico), a anlise altamente sensvel e especfico dos compostos foi realizada permitindo para os limites de deteco de 5 e 1 pg / ml, respectivamente. Ele continua a ser esclarecido, no entanto, se os peptdeos intactos ou metabolitos correspondentes sero mais eficientes quanto analitos alvo em controles de dopagem de rotina quando se usa urina como matriz de controle de doping primrio. Alternativamente, sangue / soro pode ser uma opo vivel para testar as drogas intactas. 2.2.2. Fatores de crescimento mecnico (MGFs) Hormnios peptdicos categorizados como fatores de crescimento mecnico (MGFs) foram explicitamente mencionados como substncias proibidas em regulamentos da AMA relevantes desde 2005. O uso do termo MGF tem sido ambgua na literatura, ou seja, referentes ao IGF-1Eb (ou Ec em humanos) mRNA , pr-IGF-1Eb, bem como o pptido sinttico MGF, e , portanto, recomendado para utilizar o nome "FCL" unicamente para mecano de crescimento do factor de peptdeos sintticos [92]. Embora o IGF-1Ec ARNm derivado por splicing alternativo do gene de IGF-1, a formao e na existncia in vivo de FCL em seres humanos que compreende 24 resduos de aminocidos (Tabela 2), bem como os efeitos atribudos ao prprio FGM so objecto de substancial controvrsia. Relatrios anteriores descritos capacidade MGFs para estimular o msculo (caule) proliferao celular e, assim, para aumentar a fora muscular e regenerao, sugerindo que o seu abuso no esporte no pode ser excludo, apesar de ter perdido a aprovao clnica [93]. No entanto, os testes abrangentes com MGF sinttico no conseguiu reproduzir a efeitos anablicos e de promoo da regenerao de MGF e um receptor dedicado MGF ainda tem de ser identificado para apoiar e corroboram a hiptese de MGF comummente aceite [94]. At o momento, nenhum ensaio de deteco dedicado para fins de controle de doping foi relatado, mas achados de MGF em frascos do mercado negro foram relatados em 2012 [95], salientando o abuso potencial de tais compostos no esporte amador e / ou elite, apesar do acima mencionado questionvel eficcia. O produto para o mercado negro foi demonstrado que constitudo pelos resduos de cidos apropriados 24 aminocidos, conforme listado na Tabela 2, mas um composto de amidao C-terminal, que no tem sido postulado para o FGM humana que ocorre naturalmente potencialmente. 2.2.3. Anti-miostatina -029 anticorpo MYO A miostatina, tambm conhecida como factor de diferenciao e crescimento-8 (GFD- 8), um membro altamente conservada do factor de crescimento transformador beta (TGF ~) superfamlia que actua como um regulador negativo da massa muscular esqueltica [96,97]. Em miostatina ratinhos knock-out (MSTN - / -), foi observado um aumento substancial da massa muscular resultante de ambos um volume elevado (hipertrofia) e nmero (hiperplasia) de fibras musculares esquelticas [97-99]. Assim, o bloqueio seletivo da via de sinalizao da miostatina tem sido considerada como um meio teraputico para combater ou curar doenas graves, como distrofias musculares, mas tambm outras arenas como a melhoria da produo de gado foram mencionados como metas desejveis [98,100-102]. Abordagens destinadas especificamente s miostatina incluem protenas de ligao a miostatina injectveis, tais como o GDF-8 pr-pptido [103,104], bem como anticorpos recombinantes [104-106]. Em um modelo de ratinho de distrofia muscular, a inibio da miostatina endgena por anticorpos especficos melhorou consideravelmente o fentipo distrfica dos animais como a sua massa muscular, o tamanho do msculo, fora muscular e do peso corporal foram significativamente aumentados [105]. Por conseguinte, com base em anticorpos candidatos a frmacos para seres humanos foram desenvolvidos com MYO-029, tambm referida como stamulumab, sendo o primeiro da classe em 2005 [107-109]. Apesar de interrupo de desenvolvimento clnico, um potencial mau uso considervel eminente e mtodos de ensaio em plataformas de espectrometria de massa ou imunolgicos so desejveis. Com a capacidade de melhoria de alta resoluo / espectrometria de massa de alta preciso tambm a anlise direta do (purificada) anticorpo poderia ser uma opo para o futuro (Fig. 5c). 2.2.4. RNA de interferncia Considerando o nmero de artigos de pesquisa, cido ribonuclico (RNA) de interferncia (RNAi) continuou a ser uma das arenas mais dinmicos da pesquisa biotecnolgica (junto com protemica e epigentica) [110]. O enorme potencial teraputico de silenciamento gnico ps-transcricional foi reconhecido em inmeros campos de tratamento medicinal, particularmente quando o temporrio knock-down de reguladores negativos desejvel. Aqui, um exemplo frequentemente referenciada a inibio da miostatina, o regulador negativo proeminente da miognese, a eliminao de o que resultou em aumentos significativos de fora e massa muscular em modelos animais e, portanto, o que sugere um meio vivel para curar miopatias como Duchenne A distrofia muscular de Duchenne (DMD) [111-113]. Estratgias empregando oligonucletidos anti-sentido ou ARN interferentes pequenos (siRNA) foram descritos como meio bem sucedido, mas um pr-requisito principal de ARNi tem sido a estabilidade do frmaco candidato. Devido rpida degradao do ARN em geral, cidos ribonucleicos modificados foram introduzidas, tais como 2, 2 ~ - fluoronucleotides ~ nucletidos -O-metilados, nucletidos fosforotioato, ou cidos nucleicos trancados, proteger eficazmente o siRNA de hidrlise e eliminao precoce do sistema [114]. Devido disponibilidade de software que permite prever motivos RNAi viveis eo rpido ea opo de compra de siRNA adaptados sintetizado totalmente automatizado, estratgias de deteco para esta nova abordagem teraputica tendo o abuso de risco no esporte foram iniciadas [115,116]. Um passo importante para demonstrar a aptido para a finalidade de mtodos anti- doping desenvolvidos foi fornecido em 2013, quando os estudos em animais foram realizados com o modelo de siRNA [117]. Aps a administrao intravenosa de quantidades teraputicas de siRNA, as amostras de urina foram colhidas e submetidas a duas plataformas de anlise que consistem em metodologias bioqumicas e LC-HRMS. A preparao da amostra incluiu o enriquecimento especfico de siRNA urinria utilizando-colunas de extraco em fase slida de spin, o extracto de que foi aplicada a electroforese em gel, LC-HRMS de analitos alvo intactas (isto , siRNA intacta ou produtos metablicos truncadas), ou hidrlise qumica e LC- HRMS (/ MS) determinao da forma sinttica mono e oligonucleotdeos. Para alm destes, uma combinao de electroforese em gel seguido de anlise por espectrometria de massa em uma abordagem de baixo para cima foi demonstrado proporcionar a informao desejada se ARN modificados quimicamente estava presente numa amostra de urina ou no. No geral, o rastreio para siRNA por electroforese em gel seguida de medies de confirmao que empregam LC-HRMS foi encontrado para ser adequado para fins de controlo que oferecem limites de deteco de 25 pmol / ml de urina e janelas de deteco de 24 h dopagem quando a administrao de uma dose nica para roedores de laboratrio foi realizada .