BIORREACTORES

En la actualidad se encuentran desarrollados a

escala industrial de produccin los procesos para
obtencin de shikonina por cultivo de clulas de
Lithospermun erythrohizon, puesto a punto por la
Industrias Petroqumicas Mitsui,
as como la produccin de berberina
y biomasa de ginseng en otras industrias.
O
O
OCH
3
OCH
3
Glc-Glc-O
O-Glc-Glc
OH
In order to cultivate
plant cells in a large-
scale, fermentors with
different sizes are
useful.
Pero no siempre ha sido fcil
Various types of fermentors
have been designed by many
researchers since the end of
1950's.
Los procesos industriales requieren de tres puntos
fundamentales:
Crecimiento eficiente en grandes volmenes
Acumulacin de metabolitos secundarios en el cultivo
Si el proceso implica bioconversin o produccin de
enzimas, que esto ocurra en las condiciones de
operacin del proceso
Es necesario ajustar algunos parmetros :
tensin de oxgeno
dixido de carbono
pH
Agitacin
Mezclado
densidad del cultivo
Caractersticas clulas
microbianas
clulas vegetales
dediferenciadas
consecuencias en el
biorreactor
Tamao 2-10 m 10-200 m Rpida sedimentacin,
mayor sensibilidad al corte
Clulas
individuales
pueden
obtenerse
forman agregados Rpida sedimentacin
Velocidad de
crecimiento
Alta
t
d
1-2 horas
Baja
t
d
2-5 das
Largos procesos,
problemas para mantener
esterilidad
Densidad del
inculo
pequeo 5-20 % Problemas de manipuleo.
Dificulta la posibilidad de
escalado
Sensibilidad al
esfuerzo de
corte
no sensitivo sensitivo/tolerante Disminucin de la
velocidad de agitacin
Aireacin alta baja Baja demanda de oxgeno,
bajo K
L
a
Diseos bsicos de biorreactores para mltiples
propsitos
aire aire aire
Tanque agitado Columna de air lift
burbujas
Factores fundamentales que afectan el diseo:
transferencia de oxgeno
bajos requerimientos de oxgeno ( 1-10 mmol.h-1l-1)
(microorganismos 5-200 mmol.h-1l-1)
baja solubilidad de O
2
(sustrato limitante)
La medida de transferencia de O
2
es el K
L
a (coeficiente
volumtrico de transferencia de oxgeno)
transferencia de oxgeno agitacin
Aumenta el rea de transferencia de oxgeno por la
formacin de pequeas burbujas
Retarda el escape de burbujas desde el lquido
Previene la coalescencia de las burbujas de aire
Disminuye el grosor de la interface gas/lquido al crear
un flujo turbulento
Asegurar el suministro de nutrientes a nivel celular
Prevenir la sedimentacin
Asegurar la transferencia de callos
Solubilizar componentes menos solubles de los medios
La agitacin como factor de transferencia de masa
Una parte importante es el sistema de muestreo: su
construccin debe asegurar la minimizacin de riesgos de
contaminacin
The most simple vessel is a carboy system
described by Tulecke and Nickell in 1959
A rubber-stoppered 20 L carboy
Filtered compressed air is
employed for oxygen supply,
aeration and agitation of the
medium.
fitted with four tubes:
air-in
air-out
medium-in
sample-out/Inocula in
A roller-bottled system using a round flask was
used by Lamport in 1964.
It is an inverted flask carrying
two teflon-coated stirring bars
on a glass pin situated at the
bottom of the flask.
A V-shape fermentor was proposed by Veliky and Martin
A sample port is also located
at the bottom.
The top of the flask is fitted
with three tubes:
air-in
air-out
medium-in
the most common types of system is a stirred-jar fermentor
Kato et al. suggested that an agitation
speed of 50 to 100 r.p.m. was most
appropriate for the growth of tobacco
cells in stirred-jar fermentors.
It is true that cultured plant cells are
more fragile than microbial cells,
however, Martin noted: "it seems
obvious that cell lines differ in their
resistance to shear effects and that a
single optimum agitation speed
cannot be designed for all lines"
ancla espiral paletas planas celulas ascendentes
The mixer's diameter is normally 1/3 - 1/2 from the diameter
of the reactor vessel
The location of the mixer's axis depends on the fact whether
the bioreactor has the upper or lower drive
Agitador de paletas inclinadas Agitador de paletas planas o Rushton
La turbina de Rushton es el modelo mas difundido
Su dimetro es de1/3 del dimetro del reactor
Genera un tpico flujo radial
mechanical mixing and air-sparged
Sparger
The supply of compressed air is realized
The most widespread constructive is a loop pipe with small holes
in the lower part (d = 0.05 - 0.15 mm).
Dalton en 1978 dise un reactor de bajo esfuerzo
de corte denominado air lift
Hibrido CSTR- air lift Air lift de loop externo
Tanaka, H., et al., Biotechnol. Bioeng., 24 2359 (1983)
Tanaka et al. designed a rotary-drum type fermentor having an
in-let and an out-let at the side of the fermentor
bIORREACTORES
The fermentor itself rotates slowly like as a rotary bottle.
Bolsas descartables
A DEVICE FOR CULTIVATION OF PLANT
AND ANIMAL CELLS
Biotechnology Letters Vol 7 No 7 467-470
(1985)
Wagner, F. In "Plant Tissue Culture and Its Bio-technological application"
Ed. Barz, W. et al., p. 250 (1977). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.t reactor
Comparison of Yield and Productivity for Cell Mass and Anthraquinones in
Varoius Reactor Systems
1. Shake flask
2. flat blade turbine
3. perforated disk impeller
4. draft tube reactor
5. air-lift reactor
PROCESS MONITORING AND CONTROL
Que parmetros controlar?
Temperatura
pH
Presin parcial de O
2
Formacin de espuma
Temperature
Temperature is an important parameter of fermentation, since, a
deviation by a couple of degrees can diminish dramatically the
growth and biosynthesis productivity.
The cultivation temperature is commonly monitored with an accuracy
not less than 0.5C.
The temperature in laboratory bioreactors is controlled by one of the
following ways:
A heater is located inside the bioreactor vessel, and cooling is
ensured by thin-wall pipes located in the upper cover, which are
connected with an electromagnetic valve with the cooling water.
Heating and cooling proceed in a thermostat, and this
thermostatted water, with the help of a pump, circulates through
the bioreactor jacket.
pH
pH control is based on the comparison of the adjusted "set point"
and pH real values.
Only sterilisable electrodes ("Mettler-Tolede" electrodes) are used.
The control of pH values is ensured with the help of peristaltic
pumps (silicone tubes are commonly used), correspondingly
metering out the acid and the alkali.
pH measurements should be accurate ( 0.02 pH units), since the
dynamics of pH values' changes provides valuable information on
the process kinetics.
pO
2
(partial pressure of dissolved oxygen)
There are different pO2 control principles:
Varying the mixer's rotational speed n, assuming that pO
2
~ n.
Combining the change of the mixer's rotation speed n and the
amount of the inlet compressed air Q. It is assumed that
pO
2
~ n,
pO
2
~ Q.
Foam
The appearance of foam is a very undesirable phenomenon
there is a risk to loose part of the fermentation broth
It is not possible to perform high-quality analyses and
measurements.
Elimination of foam
Additional metering of an antifoam (overdose can decrease dramatically
the mass exchange parameters)
Mechanical metering of foam. (Special device installed in the bioreactor's
upper cover. If an intensive foaming begins, then the mechanical breaking of
foamwill not help any more).
An optimal solution is the combination of both the methods.
The application of Variant 1 is more widely used in laboratory
bioreactors.
Ej. Produccin de alcaloides monoterpenoindlicos con cultivos celulares de
Uncaria Tomentosa ua de gato en tanque agitado
Batch
Reactor
Bioreactor de lecho de goteo
con malla para inmovilizar a las races
Biorreactores para el cultivo de races
Adicin de nutrientes
Bomba
Salida de aire
Aire Aire
Entrada de medio
Reservorio
Malla de
inmovilizacin
Bioreactor de lecho de niebla
(nutrient mist reactor)
Biorreactores para el cultivo de races
Bomba de aire
B
o
m
b
a
p
e
r
i
s
t

l
t
i
c
a
Generador de niebla
Cmara
de cultivo
Controlador Controlador
On Off
Intensidad
Filtro de aire
Condensador
de niebla
Biorreactor de lecho de niebla para cultivode races
The nutrient mist bioreactor (NMB) has proven to
have definite advantages:
low shear stress to the cultivated roots
high nutrient transfer rate due to a large mass
transfer area
rapid replenishment of nutrients
removal of toxic metabolites
Mist trickling reactor
A nutrient mist reactor is substantially the same as
aeroponic growth of plants as proposed by botanists
Growth of hairy roots in the 3 L
MTR on the 16th day
Biorreactores para cultivo de otros rganos
Para cultivo de rganos
Centaurium erythraea shoot culture in mist trickling bioreactor after 21 days.
MTB
Modelos para clulas inmovilizadas
Operacin de Biorreactores
1.Batch:
Son sistemas cerrados que se caracterizan por cambiar las
condiciones fisiolgicas y ambientales.
No hay entrada ni salida de medio de cultivo.
Operacin de Biorreactores
2.Batch alimentado:
Estos sistemas operan adicionando medio fresco,
pero sin remocin del existente.
Son muy tiles cuando se requiere una elevada
densidad celular en la etapa de iniciacin del
proceso que implica un alto consumo de nutrientes,
especialmente de fuente hidrocarbonada que suele
funcionar como sustrato limitante.
2.1-Draw-fill o semicontnuo:
Consiste en remover, al final de la operacin entre
un 80 y un 90 % del cultivo y reemplazarlo por
medio fresco.
De esta manera puede eliminarse el perodo lag,
satisfacerse sencillamente la necesidad de
contar con inculos de gran tamao y a su vez
evitar la esterilizacin del reactor entre dos ciclos.
Variante del batch alimentado:
Operacin de Biorreactores
3.Continuo:
el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida de medio
utilizado.
Son utilizados en cultivos donde la velocidad de crecimiento celular es
constante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o para
la remocin permanente de producto sobre todo en sistemas
inmovilizados.
Este tipo de operacin presenta grandes inconvenientes con respecto al
mantenimiento de las condiciones de asepsia del proceso, y se dificulta
debido a la tendencia a formar agregados de las clulas vegetales en
cultivo, la formacin de merengue y el lento crecimiento celular.
Para su buena aplicacin se requiere del diseo de sistemas que
permitan suplementar continuamente el medio de cultivo evitando la
remocin de las clulas y as minimizar lo que se denomina lavado del
cultivo.
Una variante es la Perfusin que implica la remocin y suministro de
medio dejando la biomasa ocluda en una malla.
Continuous Culture
Batch Culture
Time (days)
Growth

0 5 10 15 20 25
Lquido-lquido:
Compuestos inmiscibles en agua, como solventes
orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico).
Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros
absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
Requerimientos:
- Autoclavables
- No txicos
- Fcil separacin del producto de inters
de la segunda fase
- No modificacin del medio de cultivo
- Permanencia de las clulas en la fase acuosa
Remocin
de producto
in situ
Diagrama de un tanque de agitacin mecnica
modificado para operar con remocin in situ
del producto.
1: tanque;
2: malla de acero inoxidable para inmovilizar
races;
3: sensor de oxgeno;
4: malla acero inoxidable;
5: medidor DO; 6: agitador;
7: lana de vidrio;
8: resina XAD-2;
9: filtro de vidrio;
10: generador de aire;
11: condensador;
12: marco de la malla
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Un bioreactor de agitacin por lquido
con loop externo
Adaptaciones para la extraccin in situ del producto
Ejemplo integrado
Ejemplo integrado
Shikonina
Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.
Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin.
- Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen
la produccin de shikonina.
- Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio.
- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Produccin de shikonina por suspensiones celulares
de Lithospermum erythrorhizon
Yamasaki Plant Photo Gallery
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas
de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Secuencia en la
optimizacin de
un proceso para
la produccin
de metabolitos
secundarios
Seleccin de la planta por su contenido de
metabolitos secundarios para iniciar cultivos in
vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilizacin y seleccin de cultivos
in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de
producto, liberacin al medio
Optimizacin de medio de cultivo para produccin
por diseo factorial: nutrientes, precursores,
elicitacin, liberacin y remocin in situ
Optimizacin en bioreactores: escalado
Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch,
perfusin, en dos etapas.
Extraccin y purificacin del producto