Transferencia de DNA ocurrida durante el contacto celular del

factor sexual F mediante conjugacin bacteriana

Bacteria donante que contienen JCFL39, un mutante del gen traD sensible a la temperatura del factor sexual F, fueron
utilizados en una temperatura no permisiva para acumular pares de acoplamiento estables con las clulas receptoras. En
esta etapa en la conjugacin, el pili extracelular F fue quitado por el tratamiento con 0.01% Dodecil sulfato de sodio.
Entonces al cambiar la temperatura permisiva para JCFL39, la transferencia del plsmido F fue observada. Los pares de
acoplamiento que fueron acumulados con JCFL39 en la temperatura no permisiva fue observada fcilmente por
microscopia electrnica en contacto de pared a pared con las bacterias receptoras. Estos resultados demuestran que el
producto del gen traD, es requerido para la transferencia del DNA a una bacteria receptora, acta despus de la etapa en la
que se requiere el pili extracelular F. Adems, concluimos que ocurre la transferencia de DNA mientras que las clulas
donantes y receptoras estn en contacto y no necesariamente se necesita el canal extendido del pilus F segn lo previsto en
algunos modelos de la conjugacin bacteriana.

La conjugacin es el proceso por el cual el DNA se
transfiere de un donante a una bacteria receptora por un
mecanismo que implique el contacto entre las clulas. La
mayora de los estudios sobre la conjugacin se han
realizado con bacterias Gram (-) y particularmente se han
centrado en Escherichia coli y el factor sexual F. Una
caracterstica central de F medida en la conjugacin es la
funcin del pili F, un filamento extracelular largo y
delgado que es producida una o muchas copias por el
plsmido F que contiene la bacteria donante (9). Aunque
haya prueba evidente de que el pilus F es esencial para la
formacin del contacto inicial entre la bacteria receptora y
la donante (4, 7), sigue existiendo un grado de
incertidumbre en cuanto al papel que este organelo
desempea en la transferencia conjugativa del DNA. Las
Observaciones ms tempranas (5, 16) indicaron la
posibilidad del contacto directo de la superficie celular de
las bacterias en conjugacin, pero puesto que estos estudios
precedieron el estudio del pili F, ningn experimento
crtico fue realizado en aquel momento para distinguir los
papeles posibles del pilus sexual. Los estudios de Brinton
en el pili F lo llevo a proponer una clase de modelos en los
cuales el pilus F est implicado directamente en la
transferencia conjugativa del DNA (6). Sin embargo, no se
ha vislumbrado ninguna evidencia directa que muestre una
asociacin entre el pili F y el DNA que se est
transfiriendo conjugativamente en la literatura. Como
alternativa, Curtiss (10), Marvin y Hohn (18) han sugerido
que el pili F puede funcionar contrayendo y de tal modo
dibujando las superficies de las clulas donante y receptora
juntas, en las cuales puede ocurrir el punto de transferencia
del DNA. Esta idea es central al modelo actualmente
favorecido para la transferencia conjugativa por F como
plsmidos. Las caractersticas centrales de este modelo han
sido repasadas recientemente por Willets y Skurray (26) y
se presentan en la FIG. 1.
El modelo prev la conjugacin procediendo como
una serie de etapas ordenadas de los acontecimientos de la
superficie celular y del metabolismo del DNA. Mucha de la
evidencia de este modelo se basa en los fenotipos de los
mutantes del plsmido F que son deficientes en la
transferencia (tra) (26). Los mutantes en los genes traA, L,
E, K, B, V, C, U, F, G, o la primera parte del gen traG no
sintetizan pili F y son defectuosos en todas las etapas de la
conjugacin. Los mutantes en el gen traN y la segunda
parte del gen traG sintetizan pili F y lo hacen inestable,
pero no estable (resistente a ser cortado), contacto en la
superficie celular (17).
Las bacterias receptoras que carecen de la protena
membranal externa ompA tambin no pueden formar pares
de acoplamiento estables (21). Los mutantes en los genes
traM, D, I, Z, (y probablemente traY) estn cubiertas por
pilis y pueden formar los pares de acoplamiento estables
(26); los productos del gene se han implicado en la sntesis
y transferencia conjugativa del DNA en la clula donante
(15).
Un defecto de estos estudios es que no permiten
ordenar definitivamente las etapas deducidas de la
conjugacin. Segn lo descrito anteriormente, un rea de
preocupacin especial es la colocacin del paso de la
transferencia del DNA en un momento en el que las clulas
donante y receptora estn en contacto, y en que amplio
punto el pili F probablemente no se requiere ms. Quizs la
mejor tentativa de demostrar este punto implico el tratar
mezclas de acoplamiento con concentraciones bajas de
detergente Dodecil sulfato de sodio (SDS), que des
polimeriza filamentos del pilus F (24) Achtman y otros (3)
encontraron que el tratamiento con SDS no causo la
desagregacin de los pares de acoplamiento realizados
incluyendo al donante Hfr, y que el numero de
recombinantes continuo aumentando durante la incubacin
adicional en presencia de SDS. Este resultado es
claramente constante con la nocin de que el pili F no es
esencial para la transferencia del DNA, una vez que se
establece el contacto de la superficie celular. Sin embargo,
los pares de acoplamiento estables no fueron aislados como
intermedio, ni era demostrada la transferencia subsecuente
de DNA. El uso de la formacin recombinante como el
anlisis para la transferencia del DNA mas futura introdujo
una complicacin no presente en un acoplamiento del
plsmido F.
Desde un punto de vista gentico, el mtodo de
mayor alcance para analizar el orden de acontecimientos en
la va biolgica es el ideado por Jarvik y Botstein (13). Su
prueba emplea un par de mutantes condicionales, uno
sensible a altas temperaturas y otro sensible al frio; con
cambio en la temperatura apropiada es posible que se
experimente un cambio para determinar inequvocamente
los tiempos relativos en los cuales se requieren las
funciones correspondientes del gene. Para aplicar esta
teora en la conjugacin bacteriana de F, se ah empleado
SDS y el mutante lac traD (Ts) de F como los pares
indispensables de bloques condicionales. Como en los
experimentos de Achtman y otros (3), el SDS fue empleado
para eliminar los filamentos extendidos del pili F. El
anlisis de los fenotipos de varios mutantes del gene tra
que afectan el metabolismo conjugativo del DNA sugiere
que el producto de traD desempea un papel directo en la
transferencia del DNA (15). Hemos utilizado SDS y el
mutante traD (Ts) para demostrar que el producto del gene
traD puede actuar en la conjugacin en una etapa despus
de que se requiera la funcin del pili extendido F. Los
resultados futuros consolidan la sugerencia (3, 26) de que
la transferencia de DNA ocurre normalmente durante una
etapa de la conjugacin en la cual las superficies de las
clulas donante y receptora estn en contacto real.


FIG. 1. Modelo para la transferencia conjugativa de
plsmidos como el F. La figura se modifica de Willets y
Skurray (26) y los puntos culminantes son el contacto del
pili F en la superficie de la clula del ciclo de acoplamiento
y el requisito de la funcin del gen traD para la
transferencia del DNA. El pili F es extremadamente
sensible a bajas concentraciones de SDS (24), y el
filamento extendido del pili F desaparece rpidamente de la
superficie de la clula bacteriana tratada con detergente,
destruyendo de tal manera la eficacia de la actividad de la
clula donante (3). Los detalles del metabolismo
conjugativo del DNA se han simplificado
considerablemente en la figura, y los lectores interesados
deben consultar la revisin de Willets y Wilkins (27). Para
simplificarlo, se indica la bacteria donante como una barra
mientras que la receptora es esfrica. El factor sexual F se
indica como un crculo en la bacteria donante y el DNA
cromosmico no se muestra para ninguna bacteria.

MATERIALES Y METODOS
Plsmidos y cepas. Los plsmidos usados sern JCFLO (F
lac tra
+
) JCFL8 [F lac traD8 (Am)], y JCFL39 [F lac
traD39 (Ts)] de la coleccin de Achtman y otros (4). Estos
fueron usados en un fondo de JC3272 (F
-
lactosa galactosa
histidina triptfano lisina
r
dtr) para dar al donante cepas
JC3273, JC6129 y JC6140 respectivamente (4). La cepa
receptora usada es XK1502 (F
-
lacU169 nalA) (19).
Determinacin de la eficacia del acoplamiento a
32 y 42 C. JC6140, JC3273, y XK1502 fueron crecidos
por duplicado en 32 y 42C colocndose durante toda la
noche en cultivo de 10 mL de caldo LB en matraces
Erlenmeyer de 125 mL. Las muestras (0.1 mL) del cultivo
del donante (JC6140 o JC3273) fueron subcultivadas en
2.4 mL de caldo LB y se le permiti acoplarse por 2 hrs. a
cualquier temperatura. Luego 0.4 mL de las muestras de
cultivo de clulas donantes fueron mezcladas suavemente
con 0.4 mL de los cultivos que estuvieron incubndose
durante toda la noche de XK1502 (creciendo en 32 o 42
C), y la mezcla de acoplamiento se le permiti acoplarse
por 2 hrs. a 32 o 42C. Al principio del acoplamiento, las
muestras fueron diluidas y sembradas sobre placas de agra
MacConkey lactosa que contenan 100 g/mL de
estreptomicina sulfato para las cuentas de clulas donantes.
En el final del acoplamiento, las muestras de la mezcla de
acoplamiento fueron diluidas y sembradas sobre placas de
agar lactosa mnimo que contenan 20 g/mL de acido
naldixico para determinar el nmero de transconjugantes.
Cintica de la inactivacin y reactivacin del
gene traD39. Para seguir el curso del tiempo de
inactivacin del producto del gen traD39 en trminos de
capacidad para transferir, un cultivo de los que se dejaron
toda la noche de las bacterias donantes JC6140 fue crecido
a 32C, diluido 25 veces en 10 mL de caldo LB en un
matraz Erlenmeyer de 125 mL, y sacudido suavemente en
un bao de agua a 32C. Cuando la densidad ptica a 550
nm (OD
550
) del cultivo alcanzo 0.4, una muestra de 0.4 mL
fue mezclada con 0.4 mL de un cultivo de toda la noche de
receptoras XK1502 que haban sido crecidos a 32C, y a
las bacterias se les permiti acoplarse por 30 min a 32C
con agitacin suave. Mientras tanto, el resto del cultivo de
donantes fue cambiado y puesto a 42C, y una segunda
muestra de 0.4 mL fue agregada inmediatamente a 0.4 mL
de un cultivo de XK1502 que haba sido crecido a 42C
durante toda la noche; a estos se les permiti acoplarse
durante 30 min a 42 C. En varios de los intervalos despus
del cambio de la temperatura, muestras de JC6140 fueron
tomadas y el procedimiento de acoplamiento fue repetido.
Siempre que el OD
550
del cultivo de donantes alcanzara
0.8, se dilua dos veces en caldo LB precalentado para
mantener el crecimiento exponencial. Los acoplamientos
fueron detenidos despus del minuto 30 de flujo turbulento
y enfriados en hielo. Las mezclas fueron diluidas y
sembradas en placas de agar lactosa minimo que contenan
acido naldixico para probar los transconjugantes y sobre
placas de agar MacConkey lactosa que contenan
estreptomicina sulfato para las cuentas de donantes.
La reactivacin de traD39 fue seguida de una
manera similar, usando un cultivo de JC6140 crecida
durante la noche a 42C y despus cambiada de puesto a
32C.
Experimentos de cambio de temperatura. Las
bacterias JC6140 (donante) y XK1502 (receptora) fueron
crecidas en 2.5 mL de cultivos que se colocaron toda la
noche a 42C en 18 tubos de cultivo de 150 mm. Una
muestra de 0.1 mL del cultivo de JC6140 fue subcultivada
en 2.5 mL de caldo LB en un tubo similar al del cultivo e
incubada a 42C por 1 hr. Una muestra de 0.25 mL de este
cultivo de donantes fue agregada a 0.25 mL del cultivo de
XK1502 de toda la noche, mezclada suavemente, e
incubada a 42C por 30 min sin agitacin. En este tiempo,
los cultivos fueron diluidos diez veces en caldo LB que
contena SDS 0.01% y 20 g/mL de acido naldixico fue
agregado a algunas de las mezclas de acoplamiento. Los
cultivos eran incubados a 32 o 42C durante 2 hrs. Los
nmeros de transconjugantes fueron obtenidos sembrando
varias diluciones sobre las placas de agar lactosa mnimo
que contenan 20 g/mL de acido naldixico.
Microscopia Electrnica. Las cepas de JC6140 y
XK1502 fueron crecidas en 2.5 mL de caldo LB que se
colocaba en 18 tubos de 150 mm a 42C durante toda la
noche. Cada uno de estos era diluido 25 veces en caldo LB
y crecido a 42C durante 1 hr. Muestras del donante,
receptora o una mezcla igual de donante y recipiente fue
incubada a 42C durante 20 min, despus del cual 9
volmenes de caldo LB que contenan SDS 0.01% y 1% de
glutaraldehido (recin preparado) fueron agregados a cada
tubo con agitacin suave. Los cultivos fueron incubados a
42C por 20 min adicionales y centrifugados a 5100 x g
por 10 min, y las pastillas celulares fueron suspendidas en
0.5 mL de solucin salina. Las clulas eran preparadas para
microscopia electrnica manchando una muestra sobre los
300 acoplamientos, 0.2% de rejilla de carbn revestida de
Formvar. Las rejillas fueron manchadas con el acetato
acuoso de uranilo al 1% y examinadas en un microscopio
electrnico de Philips 300 a 60 kV. Se utilizaron dos
rejillas por muestra, y ms de 200 clulas fueron
examinadas para determinar el grado de agregacin.
Anlisis Immunoblot. Anti protena traD (traDp)
el suero inmune fue criado en conejos blancos femeninos
de Nueva Zelanda usando traDp purificado (descrito en la
preparacin): las cepa individuales para el immunoblot
fueron crecidas colocando los cultivos en caldo LB y
despus diluidas 50 veces en caldo LB para obtener las
clulas en crecimiento exponencial. Se recogieron muestras
de 3 mL cuando la OD
550
alcanzo 0.6 a 0.8. Las clulas
eran recogidas por centrifugacin y suspendidas en gel
SDS amortiguador e incubados en agua hirviendo por 3
minutos. Cantidades equivalentes de material fueron
cargadas sobre 11 a 14 cm de SDS poliacrilamida al 9.5%
y se realizo electroforesis segn lo descrito anteriormente
(19). El immunoblot fue realizado por una modificacin
del procedimiento de Burnette (8). Las protenas fueron
transferidas electroforticamente a 11.5 por 14.5 cm en
hoja de nitrocelulosa a 50mA durante toda la noche en un
aparato Hoeffer Transphor con un amortiguador de la
transferencia de 25 mM de clorhidrato de Tris (pH 8.4) 192
mM metanol glicina 20%. La hoja de nitrocelulosa fue
lavada con agua destilada e incubada por 1 hr con 50 mL
de albumina de suero vacuno con 3% de PBSa (10 g de
NaCl, 0.25g de KCl, 2.71g de Na
2
HPO
4
por litro de agua
destilada con un pH final de 7.6), seguido de otra
incubacin de 1 hr con suero normal vacuno y 1% de
albumina normal de cabra en PBSa. Inmunoglobulina G
(IgG) enriquecida con el suero anti traDp fue utilizada en
una dilucin 1:50 para eliminar el amortiguador (vase
abajo) y 2 mL de suero por cada cm de anchura del carril
en el gel, se les permiti incubarse durante 2 hrs. Esto fue
seguido por 4 lavados en el minuto 15 cada uno para
eliminar el amortiguador. El anticuerpo del conejo Fc el de
la cabra conjugado con la peroxidasa de rbano picante fue
diluido 1:200 para eliminar el amortiguador y 2 mL por
carril en el gel fueron incubados en el papel por 2 hrs. La
hoja de nitrocelulosa entonces fue lavada 3 veces para
borrar el amortiguador a los 15 min cada uno seguido con 5
lavadas mnimo con PBSa. El amortiguador de la
peroxidasa contena el sustrato cromogenico 4-cloro-
1naphtol (vase abajo) entonces fue agregado sobre la
nitrocelulosa. Despus de que las bandas corrieran el papel
fue aclarado en agua destilada permitindole secarse a
temperatura ambiente.

RESULTADOS
Futura caracterizacin de JCFL39. El plsmido JCFL39
fue aislado por Achtman y otros (4) es un derivado no
suprimible que transfiere el derivado de un tipo de F lac
(JCFL0) silvestre, y el defecto de la mutacin fue trazado
en el gene traD (traD39) de F. En su acoplamiento mnimo
de los 40 min estndar, JCFL39 tena una eficacia de
transferencia de 10 a 2 a 42C y de 100 a 32C,
concerniente a JCFL0 como 100 (4). En primer lugar al
usar su mutante, determinamos la eficacia de la
transferencia de JCFL39 bajo condiciones que serian
utilizadas en los experimentos del cambio de temperatura.
Los datos demostraron que en la transferencia de un
JC3272 anfitrin a una receptora de XK1502, JCFL39 era
6 veces menos eficiente que JCFL0 a 32C y 7.8 x 10
4

veces menos eficiente que JCFL0 a 42C. As existe una
diferencia de 3.2 x 10
4
veces en la capacidad de
transferencia de JCFL39 a 32 y 42C.
Para realizar los experimentos de cambio de
temperatura, era tambin necesario determinar el tiempo en
el cual un JCFL39 donante contena actividad cuando es
cambiado de lugar de 42C a 32C. Para aumentar la
sensibilidad de este experimento cintico, un tiempo de
acoplamiento de 30 min fue utilizado. La eficiencia de
acoplamiento de JCFL39 aumento exponencialmente sobre
el desplazamiento a la temperatura permisiva, levantndose
aproximadamente 100 veces en 4 hrs. (FIG. 2A). En este
punto todava no haba alcanzado el valor para las clulas
crecidas continuamente a 32C. El ndice de aumento
inicial correspondi a doblar cada53 minutos, comparado
con el doble de tiempo de 50 a 60 minutos de crecimiento
de las clulas. De acuerdo con este resultado, elegimos 2
hrs. como el periodo de acoplamiento para el experimento
de cambio de temperatura descrito ms abajo (y el
experimento de la tabla 1).

a
JCFL0 es F lac tra. JCFL39 es F lac traD39 (Ts).
b
El recipiente fue XK1502. anotaron a las colonias como
transconjugantes despus de acoplar por 2 horas en la
temperatura indicada.
c
La Eficacia del acoplamiento fue calculada como nmero
de transconjugantes obtenidos por 100 donantes.
Como corolario a este experimento, determinamos
el ndice de inactivacin de la actividad traD39 cuando se
cambio de lugar a un donante JCFL39 de 32 a 42C. La
cintica diferencia substancialmente de la activacin (FIG.
2B). El incremento inicial de la eficacia del acoplamiento
era reproductivo y poda ser debido a la transferencia
conjugativa que es intrnsecamente ms eficiente a 42C.
Esto fue seguido por un rpido declina miento en la
actividad exponencial durante la primera hora (t
1/2
del
minuto 8 al 10) y quizs una declinacin ms lenta despus
de eso. El valor alcanzado despus de 2 a 4 hrs de acuerdo
con la eficacia del acoplamiento para el donante JCFL39
crecido continuamente a 42C. As del 95 al 99% del
producto traD39 parece ser inactivado rpidamente como
una solo especie con el cambio de temperatura; puede ser
una fraccin activa residual que se diluye hacia fuera ms
lentamente.
Etapa especifica de la implicacin de traD en la
conjugacin bacteriana. Ahora nos encontrbamos en una
posicin para preguntar si la etapa de la conjugacin en la
cual la funcin extendida del pili F se poda separar
fsicamente de la etapa en la cual ocurre la transferencia
conjugativa del DNA. Usando la adicin de SDS y el alelo
termo sensible traD39 como el aire indispensable de
bloques condicionales. Para hacer esto, JCFL39 que
contenan donantes y a Lac
-
, receptora resistente al acido
naldixico, ambos crecidos continuamente a 42C, eran

FIG. 2. (A) Cintica de la reactivacin de la actividad traD39 (Ts) en un cultivo en crecimiento exponencial de JC6140
que se cambio de 42 a 32C.
(B) Cintica de la inactivacin de la actividad traD39 (Ts) de un cultivo en crecimiento exponencial de los donantes
JC6140 cambiados de 32 a 42C. Los cultivos fueron crecidos y los transconjugantes fueron probados segn lo descrito en
el texto. El cuadrado en el panel B es el valor obtenido por 30 minutos que se acopla entre JC6140 y XK1502 crecido
continuamente y acoplado a 32C.

mezclados e incubados a 42C por 30 minutos. Entonces
fue agregado SDS 0.01% para quitar el pili extracelular F
(3) y para prevenir la formacin posterior de pares de
acoplamiento estables. Una porcin del cultivo fue
cambiada a 32C y otra mantenida en 42C. Despus de 2
hrs estos cultivos fueron probados para transconjugantes de
Lac
+
y Nal
r
. El producto traD se puede reactivar y puede
funcionar despus de la adicin de SDS; Los
transconjugantes aumentan 100 veces en la incubacin
continua en relacin la temperatura permisiva con la
temperatura no permisiva (Tabla 2). En un experimento de
control, el SDS estaba presente a travs del periodo inicial
de 30 min (tabla 2). Esto demostr la importancia del paso
de pre incubacin y confirmo la sensibilidad al SDS de una
etapa en la conjugacin en la cual el pili extracelular F
acta en la formacin de un par de acoplamiento estable. El
acido naldixico inhibe la DNA girasa (22) y se sabe parar
para la transferencia de DNA inmediatamente cuando esta
agregado a una mezcla de acoplamiento (12), pero no
afectara a la receptora que es resistente al acido naldixico.
Constante con el papel de traD en la transferencia de DNA,
cuando el acido naldixico fue agregado en el momento en
que se cambio la temperatura, no se observo un aumento en
los transconjugantes en presencia de SDS en 32 o 42C
(Tabla 2). Esto indica que la transferencia de DNA todava
no haba ocurrido durante la pre incubacin a 42C y debe
haber ocurrido a 32C cuando la actividad de traD fue
recuperada.
La eficacia de la transferencia de JCFL39 en este
experimento (Tabla 2) era cerca de 4. Aunque este valor no
se pueda relacionar directamente con la Tabla 1 o FIG. 2,
indica que un alto porcentaje de los donantes de JCFL39
tienen actividad traD potencialmente recuperada a 32C
puede, de hecho, transferir DNA a una bacteria receptora.
Esta formacin sugerida de que el acoplamiento estable se
aparea durante el periodo de pre incubacin a 42C y la
resistencia de estos pares de acoplamiento a la disociacin
por el SDS (3). Puesto que con el SDS se poda esperar una
disminucin en el nivel de agregacin no especifica de las
clulas donantes y receptoras (3), decidimos mirar en el
microscopio electrnico las bacterias en acoplamiento que
fueron acumuladas por el procedimiento en la Tabla 2.

a
Toda la segunda incubacin se efectu por 2 hrs.
b
Todos los acoplamientos usados son JC6140 donantes y
XK1502 receptoras y fueron realizados segn lo descrito
en el texto. El nmero de donantes introducidos fue 1.0 X
10
7
por mL.
c
El SDS fue agregada a la mezcla de acoplamiento durante
la incubacin inicial.
Microscopia electrnica de pares de
acoplamiento. Las bacterias donantes JCFL39 se les
permiti formar el agregado de acoplamiento con las
bacterias receptoras en la temperatura no permisiva.
Despus del minuto 30 de incubacin a 42C, el SDS y el
glutaraldehido fueron agregados, y el cultivo fue
examinado en el microscopio electrnico. Las clulas
tratadas de este modo eran consideradas raramente en
contacto en los cultivos individuales de donantes y
receptoras, mientras que en la poblacin de acoplamiento
mezclada virtualmente todas las bacterias fueron
encontradas en una cierta clase de agregado con la
superficie celular en contacto (FIG. 3). En este
experimento, no era posible identificar las bacterias
donantes y receptoras en los agregados de acoplamiento,
puesto que son morfolgicamente similares. As la
correlacin de clulas agregadas a las bacterias en
acoplamiento se basa sobre la distribucin estadstica
observada. Los agregados de acoplamiento observados de
este modo eran similares en aspecto a los divulgados por
Atchman y otros (3). Aunque la coloracin negativa de
clulas enteras demostraba fcilmente la existencia de tales
pares, no poda proporcionar el detalle adicional sobre la
naturaleza exacta de la regin en contacto de pared a pared.
Que el anlisis requera cuidadosamente preparo esto las
secciones de pares de acoplamiento, tales como estos, para
ser visto en el microscopio electrnico. Tal anlisis est en
curso a otra parte.
Anlisis de los niveles de protena traD en
donantes JCFL39. La rpida declinacin en la actividad
detectada en el experimento de la FIG. 2B es constante con
la funcin termo sensible. Sin embargo, El coeficiente de
incremento en eficacia de acoplamiento durante la
activacin de traD39 fue paralelo al crecimiento de la
clula (FIG. 2A) y sugiere que el producto funcional de
traD39 puede tener que ser sintetizado nuevamente. El
nivel de producto traD39 en clulas de F
+
es muy bajo, y la
protena ah sido observada previamente solamente usando
un alto nmero de copias del plsmido o transduciendo el
bacterifago llevando el gene conjuntamente con un
protocolo de etiquetado especifico (14, 20). Puesto que
ahora tenemos disponible antisuero de conejo contra la
protena traD purificada, podamos determinar
directamente el nivel de traDp en el donante JCFL39 en
temperaturas permisivas y las no permisivas, usando
Immunoblot como anlisis altamente sensible. Los
resultados con JCFL39 que contiene las clulas crecidas
exponencialmente a 32 y 42C se demuestran en la FIG. 4,
junto con F
-
, F lac tra
+
y las manchas de control de F lac
traD8 (Am). Los resultados indicaron que los niveles de
traDp en las clulas de traD y traD39 eran esencialmente
idnticos en ambos tipos crecidos a 42C. Esto indica que
el defecto se asocio a los resultados del alelo traD39 de una
perdida de funcin en la temperatura no permisiva, y la
sntesis no termo sensible de la protena.

DISCUSION
Estos resultados proporcionan evidencia directa para
ordenar dos acontecimientos en la conjugacin bacteriana
mediada por el factor sexual F. Con la adicin del SDS y
un mutante de F lac traD (Ts) era posible determinar que el
paso de sensibilidad al SDS en la conjugacin (La funcin
del pili extendido F) precede el paso en el cual la funcin
de traD es coincidente con la sensibilidad al acido naldixic,
proporcionar la evidencia adicional para el papel directo
del producto de traD en la transferencia de DNA.
Combinando estos resultados con la microscopia
electrnica de acoplamiento de pares, concluimos, segn lo
tambin propuesto por otros que el papel del pili F en la
conjugacin sea la generacin de pares de acoplamiento
estables que estn en contacto mediante la superficie
celular, y que una vez que estos se forman no es necesaria
mas el filamento extendido del pilus F. La transferencia del
DNA ocurre de la bacteria donante a la bacteria receptora
mientras que las superficies de las clulas estn en
contacto. Aunque sea obvio que el juego del pili F es el
papel esencial para establecer el primer contacto entre las
clulas bacterianas en acoplamiento, los acontecimientos
subsecuentes de la superficie celular de la transferencia de
DNA.

FIG. 3. Histogramas de los estados de agregacin de las
bacterias donantes JC6140, las bacterias receptoras
XK1502, o una mezcla de ambas, despus de la incubacin
a 42C por 30 minutos. Las clulas fueron preparadas y
observadas al microscopio electrnico segn lo descrito en
el texto. Por lo menos 200 clulas fueron examinadas para
obtener cada histograma. Las barras verticales representan
el nmero de clulas de cada tipo de agregado contra el
porcentaje total de clulas examinadas.

FIG. 4. Anlisis Immunoblot de los niveles de protena
traD en clulas con crecimiento exponencial a 32C y
42C. Anti traDp IgG de conejo y peroxidasa de rbano
picante conjugado esto como segundo anticuerpo fueron
utilizados para visualizar la protena traDp entera de la
clula en un gel de losa de poliacrilamida SDS (vase el
texto). Carriles; a y b, JC3273 (F lac tra+) a 32 y 42C,
respectivamente, c y d, JC3272 (F-) a 32 y 42C,
respectivamente; e y f, JC6140 [F lac traD39 (Ts)] a 32 y
42C, respectivamente; g ay h, JC6190 [F lac traD8 (Am)]
a 32 y 42C, respectivamente. Cada carril obtuvo la
protena en aproximadamente 3 x 10
8
clulas.

La comparacin de estos resultados con los
experimentos anteriores destaca las ventajas inherentes en
el acercamiento de Jarvik y Boenstein a los
acontecimientos que ordenan la ruta biolgica (13). Para
obtener un alto porcentaje de los agregados de
acoplamiento (el 70% de todas las clulas), Achtman y
otros (3) utilizaron un periodo de incubacin de 20 minutos
antes de agregar el SDS. Sin embargo, para obtener
razonablemente niveles de la formacin recombinante,
emplearon a un donante de HfrC y probados para los genes
lac que se transfirieron en el minuto 7 (23). El uso de un
ltimo marcador habra podido proporcionar evidencia ms
convincente, pero el gradiente de HfrC de la transmisin
habra reducido perceptiblemente el nmero de
recombinantes. Incluso entonces, la base de su experimento
es cintica, y no haba as una discusin concluyente para
una etapa discreta en la conjugacin donde el pili
extendido F no se requiera. Ponemos mayor confianza en el
uso del mutante de traD (Ts), donde se acumula un
intermedio que se puede aislar y caracterizar y despus
demostrar para proceder a travez de las etapas subsecuentes
de la transferencia conjugativa.
La caracterizacin anterior de mutantes traD puso
la etapa de accin de traD despus de la formacin de un
par de acoplamiento estable, sin embargo, la demostracin
de que un mutante traD puede formar un par de
acoplamiento estable no elimina la posibilidad de que la
funcin traD requerida realmente en un primer tiempo en la
conjugacin y que los pares de acoplamiento estables
observados representan realmente una etapa abortada o sin
salida en la transferencia conjugativa. De hecho, se ah
divulgado que el mutante lac F de JCFL60, que lleva una
mutacin sin sentido de traD, hace 2.5 veces tanto pili F al
igual que la cepa tipo lac F (2). Tambin, las clulas que
llevan un mutante lac F traD son resistentes a la infeccin
del bacterifago F2. Las partculas bacterifagas fijan por
adsorcin a los lados del pili F, pero ningn RNA penetra
en la clula (4). Estos fenotipos traD adicionales sugieren
la validez de preguntar si la sincronizacin de la funcin de
traD bien puede estar en un primer tiempo en la
conjugacin, por ejemplo cuando un pili extendido F este
presente. Sin embargo, por lo que la conjugacin, nuestro
experimento elimina explcitamente esta posibilidad.
El producto de traD es una protena interna de la
membrana de peso molecular cercano a 78 000 (14, 20;
observaciones inditas). Puesto que es una protena de la
membrana, la respuesta de la protena traD39 (Ts) a la
temperatura es potencialmente interesante. El immunoblot
demostr que la protena no est conforme a sntesis termo
sensible. En el experimento de cambio de temperatura la
protena mutante de traD39 demostr una rpida
inactivacin en la temperatura no permisiva, pero la
recuperacin extremadamente lenta de la actividad cuando
fue cambiada a la temperatura permisiva. El tiempo de
recuperacin de la protena traD39 (mas de 4 hrs para
recuperar su actividad mxima) es especialmente notable
en comparacin con el intervalo de 30 minutos durante el
cual toda una poblacin de receptoras nuevamente
acopladas hace competente como bacterias donantes
(observacin indita). Una posibilidad de esta discrepancia
es que la protena traD39 sintetizada en 42C se inactivo
irreversiblemente y que la regulacin aprieta el nivel de
resultados de la expresin de la protena tra en una bacteria
donante existente puesta a 32C. Una segunda posibilidad
es que la protena traD39 inactiva est incorporada en una
estructura celular (por ejemplo, el cuerpo basal del pili F),
y toma varias generaciones de crecimiento a 32C para
diluir hacia el exterior las molculas de traD inactivas
presentes en estos sitios. Una tercera posibilidad es que
incluso en la temperatura permisiva la mayor parte del
producto de traD39 sintetizado es inactivo; puede entonces
tomar muchas generaciones para acumular un nivel
suficiente de la forma activa de la protena para que ocurra
la transferencia conjugativa. Esta ltima sugerencia es
constante con que la eficacia de la transferencia de los
donantes de JCFL39 en la temperatura permisiva.
Los experimentos en curso actualmente en este
laboratorio sugieren actualmente que la funcin de la
protena traD en la conjugacin puede ser, servir como un
ancla en la membrana para la DNA helicasa 1, el producto
del gen F lac (1). De esta manera, la energa de la hidrlisis
del ATP es usada para desenrollar el crculo del plsmido F
y para desplazar la enzima, el desenrollar con respecto a la
DNA que es enrollada seria convertida directamente en la
fuerza motiva para el transporte de un soporte del DNA de
los plsmidos en la bacteria receptora. El hecho de que
hayamos demostrado que la funcin de traD es requerida
cuando las bacterias de acoplamiento estn en contacto con
su superficie celular es constante con los requisitos de este
modelo.
Aunque estos experimentos ayuden a aclarar
ciertos aspectos de las etapas implicadas en la conjugacin
bacteriana, todava sigue siendo un nmero de pasos (FIG.
1) para los cuales hay menos que evidencia definitiva.
Primero, no hay ninguna evidencia convincentemente de
que la funcin del pili F sea la contraccin para traer las
clulas de acoplamiento y ponerlas en contacto superficial.
En segundo lugar, poco se sabe sobre la naturaleza de
conversin de un par de acoplamiento inestable en un par
de acoplamiento estable. Y tercero, segn lo observado
acentuando en una revisin reciente, mucho queda
aprender sobre la bioqumica de los productos de tra
implicados en el metabolismo conjugativo del DNA (27).
Finalmente, los experimentos hacen posible una
comparacin interesante de la conjugacin mediada por F a
la transferencia conjugativa de plsmidos que ocurre en
bacterias Gram (+), tales como Streptococcus faecalis,
donde no se ah encontrado pili sexual. En el S. faecalis,
hay evidencia de que una feromona sexual induce que la
clula se agrupe y transfiera el DNA del plsmido,
mientras que las bacterias estn en contacto superficial
(11). Puesto que no creemos que el pili F no desempee un
papel directo en la transferencia del DNA, una
comparacin se puede hacer entre la funcin del pili sexual
encontrado en las bacterias Gram (-) y la de las clulas
agrupadas inducidas por la feromona sexual en bacterias
Gram (+). Es posible que los acontecimientos subsecuentes
de la transferencia del DNA que ocurren se puedan
relacionar ms directamente el uno con el otro.