0%(2)0% au considerat acest document util (2 voturi)
712 vizualizări5 pagini
Este documento describe el método de exclusión del azul de trypan para evaluar la viabilidad celular. El azul de trypan es un colorante que se utiliza para diferenciar células vivas de células muertas, ya que las células vivas con membrana intacta excluyen el colorante y no se tiñen, mientras que las células muertas se tiñen de azul. El documento explica el procedimiento de mezclar una suspensión celular con azul de trypan y contar las células viables y no viables usando
Descriere originală:
practica de laboratorio para determinar la viabilidad celular utilizando medo de azul de tripan.
Este documento describe el método de exclusión del azul de trypan para evaluar la viabilidad celular. El azul de trypan es un colorante que se utiliza para diferenciar células vivas de células muertas, ya que las células vivas con membrana intacta excluyen el colorante y no se tiñen, mientras que las células muertas se tiñen de azul. El documento explica el procedimiento de mezclar una suspensión celular con azul de trypan y contar las células viables y no viables usando
Este documento describe el método de exclusión del azul de trypan para evaluar la viabilidad celular. El azul de trypan es un colorante que se utiliza para diferenciar células vivas de células muertas, ya que las células vivas con membrana intacta excluyen el colorante y no se tiñen, mientras que las células muertas se tiñen de azul. El documento explica el procedimiento de mezclar una suspensión celular con azul de trypan y contar las células viables y no viables usando
Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara
EVALUACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: METODO DE EXCLUSION DEL AZUL DE TRYPAN Midwar R. Ancco Mamani Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Programa Profesional de Ingeniera Biotecnolgica, Universidad Catlica de Santa Mara, Urb. San Jos s/n, Yanahuara, Arequipa, Per. e-mail: midwar.ancco@hotmail.com Resumen En la prctica se utiliz azul de tripn que es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histolgicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar clulas vivas de clulas muertas. Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos pueden atravesarla. En las clulas viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, s atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por lo tanto, las clulas muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio empleando una cmara de Neubauer para contarlas. Debido a que las clulas vivas excluyen al colorante y no se tien. Palabras clave: azul de tripan, viabilidad celular, membrana, cmara de Neubauer. Abstract In practice trypan blue azo dye which is used in histological staining for viability assays that distinguish live cells from dead cells are used. Live cells or tissues with intact cell membranes are not colored because the cell membrane is selective as to which compounds can penetrate. Viable cells have an intact membrane, trypan blue is incorporated; on the contrary, does cross the membrane of dead cells. Hence, dead cells are shown in a distinctive blue color under a microscope using a Neubauer counting chamber. Since living cells exclude the dye and not dyed. Keywords: trypan blue, cell viability, membrane Neubauer chamber.
Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara
INTRODUCCION
El azul trypan es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histolgicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar clulas vivas de clulas muertas.
Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos pueden atravesarla.
En las clulas viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, s atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por lo tanto, las clulas muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio (tpicamente, empleando una cmara de Newbauer para contarlas).3 Debido a que las clulas vivas excluyen al colorante y no se tien, este mtodo tambin se llama mtodo de tincin por exclusin.
El azul de trypan se usa comnmente en microscopa (para el recuento de clulas) y en ratones de laboratorio para la evaluacin de la viabilidad de tejidos. El mtodo no puede distinguir entre clulas necrticas y clulas muertas por apoptosis.
1.1. Colorantes
Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo. Segn su origen pueden ser: Naturales Sintticos o Artificiales Segn sus propiedades qumicas: cidos Bsicos Neutros Indiferentes
1.2. Ventajas de colorantes
Facilita la identificacin de clulas, bacterias o en general de objetos microscpicos. Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara
Los colorantes tien de forma parcial, total o gradual las diferentes estructuras que integran los objetos y principalmente los productos que se desean observar.
1.3. Desventajas de colorantes
Despus de su empleo difcilmente se puede utilizar sobre las preparaciones teidas otro colorante, en consecuencia, despus de emplear las tinciones se ha modificado las propiedades fisicoqumicas del contenido de la preparacin ya que el empleo de colorantes est basado en caractersticas fsicas y qumicas.
1.4. Tipos de coloraciones:
Directas: se producen por inmersin en el bao colorante. Indirectas: en este tipo de coloracin, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el colorante, esta se llama mordiente.
II. OBJETIVOS
Evaluar la viabilidad de una suspensin celular. Determinar el nmero de clulas viables en una suspensin celular.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
- PBS - Azul de Trypan (0.2%) - Suspensin Celular - Micropipetas 0 - 20l 200 - 100l - Microscopio Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara
- Cmara de Newbauer (hemocitometro)
IV. PROCEDIMIENTO
1. Se centrifugo una alcuota de una suspensin celular de la cual se desea determinar la viabilidad durante 2 minutos a 4000 rpm y luego se descarto el sobrenadante. 2. Se resuspendi el pellet en 1ml de PBS o medio de cultivo libre de suero. 3. Se mezclo 1 parte de la suspensin celular (diluida en PBS) con una parte del azul de trypan (0.4%). Se incubo la mezcla por 3 minutos a temperatura ambiente. 4. Se aplico una gota de la mezcla clulas azul trypan en una cmara de Newbauer. Se coloco el hemocitometro en la platina del microscopio y se enfoco las clulas con el objetivo de 40x. 5. Se contaron las clulas viables (no teidas) y las clulas no viables (teidas).
V. RESULTADOS
1. Haga los clculos para determinar el nmero de clulas por ml
- Se contabilizaron 836560 cel/ml
2. Determinar el porcentaje de viabilidad celular
()
- Se obtuvo un 92.78% de clulas viables
VI. CUESTIONARIO 1. Cul es el fundamento del Mtodo de Exclusin del Azul de Trypan? - El azul de trypan es un colorante utilizado para el recuento de clulas ntegras por exclusin de dicho colorante. Este mtodo est basado en que las clulas vivas (viables) no captan el azul de trypan mientras que las clulas muertas (no viables) si lo hacen. Se cuentan como muertas las clulas teidas de azul y como vivas las refringentes. 2. Por qu se debe evitar utilizar un medio de cultivo con suero, en la evaluacin de la viabilidad celular por el mtodo de azul de trypan? - Esto se debe a que el azul de trypan tiene alta afinidad por las protenas.
3. Cules serian las ventajas y desventajas del mtodo de exclusin del azul de trypan? Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara
- Ventajas Permite obtener informacin del dao inducido a clulas aisladas. No es necesario trabajar con clulas en proliferacin. Fcil aplicacin (en cualquier tipo celular). Puede aplicarse en estudios tanto in vitro con in vivo. Alta sensibilidad (detecta muy bajos niveles de dao al ADN) Se requieren bajas cantidades de clulas (<200000). Relativamente poco tiempo para la obtencin de resultados.
- Desventajas Despus de su empleo difcilmente se puede utilizar sobre las preparaciones teidas otro colorante. Despus de emplear las tinciones se ha modificado las propiedades fisicoqumicas del contenido de la preparacin ya que el empleo de colorantes est basado en caractersticas fsicas y qumicas. 4. Qu otros colorantes se puede usar en la determinacin de la viabilidad celular? - Existen cinco mtodos principales para determinar la viabilidad celular. Tres se basan en la exclusin de pigmentos por las clulas vivas y se pueden evaluar con el microscopio ptico. Los pigmentos utilizados son el azul de trypan, la eosina y la nigrosina (las clulas muertas aparecen teidas de azul, rojo o negro; respectivamente). Los otros dos mtodos se basan en el acetato de fluorescena y el naranja de acridina/bromuro de etidio y se valoran con un microscopio de fluorescencia o por citofluorometria de flujo. Solo las clulas vivas hidrolizan el acetato de fluorescena produciendo una fluorescencia verde. La acridina tie las clulas vivas de verde mientras que el bromuro de etidio solo impregna las clulas muertas que aparecen rojas a la fluorescencia.