ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA

WESTERN BLOT
Lic. TM Henry A. Campos Pajuelo
24/05/2014
WESTERN BLOT
Deteccin de protenas especficas en una muestra (mezcla
compleja de protenas, extracto tisular).
Fue desarrollado en la Universidad de Stanford.
Southern blot: desarrollado por Edwin Southern, separa e
identifica ADN.
Northern blot: separa e identifica RNA
Southwestern blot: permite la identificacin y caracterizacin
de protenas por su capacidad de unin a fragmentos
especficos de ADN.
WESTERN BLOT
Tcnicas previas capaces de detectar Ags:
Inmunodifusin doble
Inmunodifusin radial
Inmunoelectroforesis
Aparicin de las membranas de nitrocelulosa que permiten la
captura de molculas de ADN.
Ms tarde se demostr que podan unirse a protenas.
1986 Millipore desarroll la membrana de PVDF (Di-fluoruro de
polivinilideno) diseada para la transferencia de protenas.
INMUNODIFUSIN DOBLE
INMUNOELECTROFORESIS
INMUNODIFUSIN RADIAL
WESTERN BLOT
Se puede dividir en cinco etapas fundamentales:
Preparacin de la muestra
Separacin de protenas por electroforesis
Transferencia a membrana adsorbente (tpicamente
nitrocelulosa).
Incubacin de protenas con Acs especficos (hibridacin).
Deteccin de la unin Ag-Ac por actividad enzimtica o
fluorescencia.
WESTERN BLOT
Bandas
(antgenos)
Ac. Primario
(muestra)
Ac. Secundario
(conjugado)
Sustrato
Membrana de
nitrocelulosa
Antgenos
PREPARACIN DE LA MUESTRA
En la mayora de ensayos, las protenas se extraen mediante
procesos qumicos y/o mecnicos.
Tipo de muestra de partida (planta, tejidos animales, clulas
cultivadas, levaduras, bacterias).
Localizacin subcelular de la protena.
Condiciones ptimas que requiera el anticuerpo para reconocer
el eptopo proteico.
Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular
MTODOS PARA OBTENCIN DE PROTENAS PARA WESTERN BLOT
MTODO DESCRIPCIN TIPO DE MUESTRA
LICUADORA
LA MUESTRA SE TRITURA MEDIANTE
CUCHILLAS ROTATORIAS
GRAN CANTIDAD DE TEJIDO
HOMOGENIZADOR DOUNCE
TUBO DE VIDRIO CON PISTN
AJUSTADO, ROMPE LAS CLULAS
POR ACCIN DE CORTE.
CLULAS TISULARES; TIL PARA
PROTOCOLOS DE
ENRIQUECIMIENTO DE PROTENAS
MITOCONDRIALES O NUCLEARES
HOMOGENIZADOR POR
ULTRASONIDOS
ONDAS DE SONIDO EMITIDAS POR
UNA SONDA PARA ROMPER LAS
MEMBRANAS CELULARES
CLULAS, TEJIDOS, BACTERIAS
PULVERIZACIN EN
NITRGENO LQUIDO
LA MUESTRA SE PULVERIZA
UTILIZANDO UN MORTERO
REFRIGERADO
TEJIDO ANIMAL O VEGETAL
PERLAS DE VIDRIO
LA RUPTURA CELULAR SE PRODUCE
POR AGITACIN CON LAS PERLAS DE
VIDRIO
LEVADURAS
SOLUCIONES TAMPN Y DETERGENTES, SEGN EL TIPO DE PROTENA DE
INTERS Y LA LOCALIZACIN SUBCELULAR
TIPO/LOCALIZACIN
PROTENA DE INTERS
DETERGENTE O SOLUCIN
TAMPN
COMENTARIO
NATIVA (NO
DESNATURALIZADA)
DETERGENTE SUAVE NO INICO
EVITAR DETERGENTES
DESNATURALIZANTES (SDS,
DESOXICOLATOS)
CITOPLASMTICOS
(SOLUBLES)
TRIS-HCL
PUEDE COMBINARSE CON
MTODOS MECNICOS, TALES
COMO EL HOMOGENIZADOR
DOUNCE
CITOPLASMTICO (UNIDA A
CITOESQUELETO)
TRIS-TRITON
LOS DETERGENTES TRITON SON
SUAVES Y NO INICOS
MEMBRANA MITOCONDRIAL O
NUCLEAR
NP-40, RIPA (MULTIPLES DETERGEN-
TES), TRITON X-100
PARA ANTGENOS CON NIVELES
BAJOS DE EXPRESIN PUEDEN
SER NECESARIOS PROCESOS DE
ENRIQUECIMIENTO
LISADO TOTAL DE CLULAS
NP-40, RIPA,
TRITON X-100
PREPARACIN DE LA MUESTRA
En la rotura celular, importante evitar la actividad de las
proteasas liberadas.
Evitar excesivos ciclos de congelacin/descongelacin.
Trabajar rpido y mantener las muestras en fro durante todo el
proceso.
Aadir inhibidores de la proteasas en el tampn de lisis.
INHIBIDORES DE PROTEASAS
INHIBIDORES
PROTEASAS
CONCENTRACIN EN EL
TAMPN DE LISIS
ENZIMAS DIANA
APROTININA 1 2 g/ml PROTEASAS DE SERINA
EDTA 1 10 mM
Mg
++
/Mn
++
METALOPROTEASAS
EGTA 1 10 mM Ca
++
METALOPROTEASAS
LEUPEPTIN 1 2 g/ml
PROTEASAS DE SERINAS,
CISTEINAS
PEPSTATINA A 1 g/ml PROTEASAS DE ASPARTICO
PMSF (17-170 g/ml) O,1 - 1 mM PROTEASAS DE SERINA
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
(PAGE)
Las muestras de protena se pueden conservar congeladas.
Se pueden utilizar inmediatamente, combinndolas con un
tampn de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis.
Si se necesitan condiciones desnaturalizantes/reductoras, se
utilizarn: Dodecilsulfato Sdico (SDS), beta mercaptoetanol (-
ME) o ditiotreitol (DTT).
Se someten previamente a incubacin a 95C durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalizacin/reduccin es
total.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
(PAGE)
Dodecilsulfato Sdico (SDS):
Detergente desnaturalizante.
Cola hidrofbica que rodea el esqueleto peptdico.
Unin a la protena de forma regular, aportando carga negativa
de forma proporcional al tamao de la protena.
Evita las interacciones hidrofbicas y rompe los enlaces de
hidrgeno.
Destruye la estructura secundaria/terciaria y lineariza la
protena.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
(PAGE)
Beta Mercaptoetanol (-ME) o ditiotreitol (DTT):
Completan la linearizacin de la protena al romper los puentes
disulfuro.
Demasiada carga eleva el ruido de fondo.
El tampn de carga puede contener un colorante para el frente
de corrida.
MECANISMO DE
DESNATURALIZACIN POR
SDS DE LAS PROTENAS
EL GEL DE ELECTROFORESIS
Gel de poliacrilamida.
Si se requieren condiciones naturales no se aadir SDS ni en el
gel ni en el tampn de corrida (PAGE nativo).
La mayora en condiciones desnaturalizantes.
La migracin depender del peso molecular.
El espesor y tamao de poro del gel dependen de la protena de
inters.
RANGO DE SEPARACIN DE PROTENAS SEGN EL
% DE ACRILAMIDA
PORCENTAJE RANGO PESO MOLECULAR (kDa)
7,5 25 500
10 15 300
12 10 200
15 10 45
20 5 40
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
(PAGE)
Se realiza la carga de las muestras en los pocillos.
En la carga del gel se deben incorporar controles y estndares.
Se somete a un campo elctrico generado por una fuente de
alimentacin.
Tampn de corrida:
Tris (mantiene el pH)
Glicina (conductor electricidad)
SDS (mantiene las protenas cargadas negativamente)

+
MARCADORES DE PESO MOLECULAR
En la carga del gel se deben incorporar controles y estndares.
Marcadores de Peso Molecular:
Mezcla de protenas purificadas de peso molecular conocido.
Se utilizan para verificar si la protena de inters est dentro del
rango de tamao apropiado.
Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares, as como
teidos o incoloros. Las versiones pre teidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia
de la posterior transferencia.
Pueden estar marcadas por la deteccin por fluorescencia o
quimioluminiscencia.
CONTROLES POSITIVOS
Controles positivos:
Para verificar si el anticuerpo primario se une a la protena
correcta.
Solucin de la protena de inters purificada.
Puede ser una lnea celular que sobre exprese la protena de inters.
Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles
de la protena de inters.
TRANSFERENCIA A MEMBRANA
Membrana de nitrocelulosa.
Soporte slido que une e inmoviliza las protenas.
Se utiliza generacin de campo elctrico para conducir a las
protenas desde el electrodo (-) al (+).
Hay formatos semisecos y hmedos.
TRANSFERENCIA DE PROTENAS A LA MEMBRANA
TRANSFERENCIA A MEMBRANA
Consideraciones:
Evitar manipulacin de membranas con manos desnudas
Evitar burbujas de aire entre gel y membrana
No permitir sobrecalentamiento durante transferencia
Ajustar condiciones de transferencia al tamao de la protena.
Pueden teirse membrana o gel para ver eficacia de
transferencia.
BLOQUEO DE LA MEMBRANA
Reduccin de los lugares de unin no especficos del anticuerpo.
Soluciones a base de protenas: leche descremada en polvo o la
albmina srica bovina (BSA).
Incubacin durante una hora a temperatura ambiente.
HIBRIDACIN DEL ANTICUERPO
Incubacin de la membrana con el anticuerpo primario.
Los Acs reconocen una secuencia de aminocidos pequea
(eptopo) expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la
protena en condiciones desnaturalizantes.
Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos
requieren de la protena plegada para el reconocimiento del
antgeno.
Incubacin durante una hora a temperatura ambiente o toda la
noche a 4C, en agitacin constante.
HIBRIDACIN DEL ANTICUERPO
Se procede luego a la eliminacin del excedente mediante
tampones de lavado.
En mtodos de deteccin indirectos es necesario un anticuerpo
secundario (debe ser producido en otra especie distinta a la que
produce el primario).
DETECCIN
Tcnicas directas: utilizan Ac primario marcado con enzima,
biotina o molcula fluorescente.
Tcnicas indirectas: utilizan Ac primario y Ac secundario
marcado.
Mtodos mas comnmente utilizados:
Quimioluminiscencia
Fluorescencia
Colorimetra.
DETECCIN DIRECTA E INDIRECTA DE PROTENAS
VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS TCNICAS DE
DETECCIN
PATRN INTERPRETACIN
Ninguna banda vrica especfica presente NEGATIVO
Deteccin de anticuerpos anti p17 nicamente, sin
ninguna otra banda
NEGATIVO
Deteccin de 2 ENV (gp160/gp41 y gp120) y 1
GAG (p17, p24, p55) o 1 POL (p31, p51, p66)
HIV-1 POSITIVO
Deteccin de 2 ENV (gp160/gp41 y gp120) y 1
GAG (p17, p24, p55) o 1 POL (p31, p51, p66) y
banda especfica del VIH-2 visible
HIV-1 POSITIVO con HIV-2
SEALADO
Cualquier banda vrica especfica presente, pero el
patrn no cumple los criterios para POSITIVO
DUDOSO
Cualquier banda vrica especfica presente, pero el
patrn no cumple los criterios para POSITIVO con
una banda especfica del VIH-2 visible.
DUDOSO CON HIV-2
SEALADO
a) CONTROL REACTIVO FUERTE (REACTIVO
PARA EL VIH-1 Y EL VIH-2)
b) CONTROL REACTIVO DBIL (REACTIVO
SLO PARA EL VIH-1)
c) CONTROL NO REACTIVO
d) UN EJEMPLO TPICO DE SUERO POSITIVO
PARA EL VIH-2