Universidad Simn Bolvar

Departamento de Biologa de
Organismos

GUA ACTUALIZADA 2010

Nombre:

TABLA DE CONTENIDO

Pag.
Objetivo

Organizacin del curso

Estructura del informe

Evaluacin

LABORATORIO No. 1: Relaciones hdricas I. Potencial hdrico y sus componentes

LABORATORIO No. 2: Relaciones hdricas II. Transpiracin

12

LABORATORIO No. 3: Nutricin mineral

20

LABORATORIO No. 4: Fotosntesis I. Reaccin de Hill

27

LABORATORIO No. 5: Fotosntesis II. Asimilacin de CO2

34

LABORATORIO No. 6:Reguladores del crecimiento vegetal: fitocromo y hormonas

44

LABORATORIO DE FISIOLOGA VEGETAL

3
Objetivo
Que el estudiante conozca, comprenda y se capacite para enfocar los problemas relacionados con la fisiologa
en plantas a travs del aprendizaje de tcnicas de trabajo

Organizacin del curso

El curso comprender las actividades detalladas a continuacin:
a.

Pre-laboratorio:

b.

c.

Introduccin al tema de la prctica

Laboratorios:

Examen corto al inicio de la prctica (30 minutos)

Suministro de materiales y reactivos y organizacin del trabajo a realizar

Demostracin de montajes y funcionamiento de equipos

Desarrollo de la prctica

Lavado del material y limpieza del laboratorio

Discusin:

Para cada experimento un equipo de estudiantes presentar los resultados obtenidos y se

proceder a una discusin en conjunto

Proposicin y discusin de metodologas alternas

Sugerencias para mejorar la prctica

Formato y estructura del informe

El informe debe ser entregado por cada alumno en forma individual o en equipo una semana despus de
realizada la prctica y antes de comenzar la actividad siguiente. Solamente entregarn informe los alumnos
que hayan asistido al perodo correspondiente a la adquisicin de la data. No se aceptarn informes
incompletos.
Formato:
Letra: Arial nmero 11. Espaciado: doble excepto para resultados que puede utilizarse 1.5. Mrgenes: superior
e inferior 2.5; derecho e izquierdo 3.0. Longitud: mximo 6 pginas sin incluir la seccin de Tablas y Grficos.
Las lneas y las pginas deben estar enumeradas.
Usted puede encontrar en http//five.dsm.usb.ve un archivo pdf donde se ejemplifica el formato sugerido del
informe.

Estructura:

4
Un informe es un reporte completo de cada prctica y debe constar de todas y cada una de las siguientes
partes:
1.

Introduccin: Se definen los conceptos importantes para la comprensin del informe y se describen los

2.
3.

fundamentos tericos de la prctica. Citar cada una de las referencias consultadas

Objetivos generales y especficos
Materiales y mtodos: se citan las pginas de la gua donde se indican los pasos a seguir en la prctica.

4.

Si se realiz alguna modificacin debe sealarse

Resultados: Se describen los resultados obtenidos haciendo nfasis en los ms resaltantes. Las

5.

observaciones experimentales se retomarn posteriormente en la seccin de discusin

Grficos y tablas: No deben insertarse en el texto de los resultados. Deben mostrarse en pginas apartes
despus de los resultados y antes de la discusin. Las tablas y/o grficos deben contener una leyenda

6.

completa auto-explicativa y sealar las unidades utilizadas

Discusin: se discuten los resultados y se sustentan con la literatura. Los resultados deben compararse
con los obtenidos en otros trabajos. Tambin se discuten la metodologa empleada comparando con

7.

otros mtodos y sealando posibles fuentes de error.

Conclusiones: Deben derivar directamente de los resultados obtenidos en la prctica. Deben destacarse
las conclusiones ms importantes a la que Ud. puede llegar despus de realizar el informe. Sealar la
validez y/o limitaciones del diseo experimental y metodologas empleadas para el cumplimiento de los

8.

objetivos planteados Deben estar enumeradas.

Referencias: Debe haber uniformidad en la forma de citar en el texto y en el formato de las referencias

Evaluacin
Cada prctica tendr un valor de 5.0 puntos repartidos de la siguiente manera:

Puntos
a. Examen corto

1.60

b. Trabajo de laboratorio

Disciplina de trabajo

Limpieza y mantenimiento de equipos

0.30

b. Informe

2.60

c. Participacin y aporte en las discusiones

0.50
TOTAL

5.00

PRCTICA DE LABORATORIO 1
Relaciones hdricas I. Potencial hdrico y sus componentes

5
El potencial hdrico () es una medida de la energa libre total del agua en un sistema dado. Esto es, es una
estimacin de la capacidad del agua para realizar trabajo. Por tanto, las diferencias en potencial hdrico
representan la fuerza motriz del movimiento de agua a travs de todas las partes de la planta. El potencial
hdrico consiste de por lo menos tres componentes independientes:

p m
Donde , es el potencial osmtico, p es la presin de turgencia, y m es el potencial matricial. El potencial
osmtico () est representado por la presin osmtica de la solucin acuosa y disminuye . La presin de
turgencia (p) es generada por la presin hidrosttica generada dentro de las clulas. Esta presin hidrosttica
es generalmente positiva y como resultado incrementa . En el caso del xilema, p es negativo pues el agua
est a presiones debajo de la atmosfrica. El potencial matricial (m) represente el estado del agua asociada a
la estructura coloidal del citoplasma y micelar de la pared celular. Este valor es menor que el del agua pura y
por tanto disminuye .

OBJETIVOS

En tejidos vegetales aislados, comparar clulas vegetales con diferentes grados deshidratacin y obtener su
potencial hdrico, potencial osmtico y presin de turgencia:

1.

Obtener diversos estados hdricos en clulas vegetales, mediante tratamientos con soluciones

2.

Determinar el valor del potencial hdrico, potencial osmtico y presin de turgencia en un tejido
vegetal

TEMA DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

Concepto de: potencial hdrico, potencial osmtico, potencial matricial y presin de turgencia

2.

Componentes osmticos, matriciales y de turgencia en los potenciales hdricos de la pared, citoplasma

y vacuola

3.

Concepto de plasmlisis, causas y tipos

4.

Fundamentos del mtodo crioscpico para la determinacin de potencial osmtico. Errores

involucrados

5.

Fundamentos del mtodo gravimtrico para la determinacin de potencial hdrico. Errores

involucrados

6.

Clculo de presin de turgencia en la prctica. Posibles errores

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Sal comn: 2 paquetes (1Kg) por seccin

1.

Pinza gruesa: 1 por alumno

2.

Papa grande: 4 por seccin

3.

Cebollas moradas: 1 Kg por saln. NO

eliminar las cubiertas exteriores de
apariencia seca. Buscar en mercados libres

2.

Lupa de mano: 1 por seccin

3.

Pincel fino: 1 por alumno

4.

Cuchillo: 2 por seccin

5.

Tijera: 1 por alumno

6.

Regla pequea

MATERIALES Y REACTIVOS A SER SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO

1.

Solucin de sacarosa 1M

9.

2.

Placas de Petri pequea

Tubos de ensayo de 10mm y 20mm

10. Termmetro de -10 a +30C

3.

Cilindro graduadas de 25 y 50ml

11. Tapn perforado

4.

Pipetas graduadas de 5 ml

12. Vaso de precipitado de 800ml (plstico)

5.

Sacabocado (35 mm )

13. Hielo picado

6.

Vaso de precipitado de 250ml

14. Soporte Universal

7.

Mortero

15. Pinzas con nuez

8.

Tubos de centrfuga de 12ml

16. Agitador plstico

PROCEDIMIENTOS
Determinacin de potencial osmtico con el mtodo de la plasmlisis incipiente
a.

Vierta en cpsulas de Petri pequeas 10ml de cada una de las siguientes soluciones de sacarosa 0.00,
0.10. 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55 y 0.60 M

b.

Con la ayuda de pinzas y hojillas, separe cuidadosamente porciones delgadas de las escamas de bulbos
de cebolla morada

c.

Coloque varias secciones de cebollas en cada cpsula de Petri, con los diferentes tratamientos

d.

Luego de 30 min. transfiera el material tratado a una lmina portaobjetos

e.

Observe al microscopio con un aumento que permita localizar un campo de clulas morfolgicamente
homogneas (nmero mnimo de clulas por campo: 30)

f.

Cuente el nmero de clulas plasmolizadas y no plasmolizadas que observe en el campo. Cuente en, al
menos, 3 campos

Determinacin del potencial osmtico en bulbo de cebolla por plasmlisis incipiente

[]
Sacarosa
M

Campo 1
No. de
Clulas

Plasmol

Campo 2
Turgentes

No. de
Clulas

Plasmol

Campo 3
Turgentes

No. de
Clulas

Plasmol

Turgentes

0.00
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60

Determinacin del potencial hdrico con el mtodo gravimtrico

a.

Vierta en cpsulas de Petri pequeas 50ml de cada una de las siguientes soluciones de sacarosa 0.00,
0,10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55 y 0.60 M

b.

Utilizando un sacabocado de 3-5 mm obtenga cilindros de la papa y divdalos en 12 secciones de 20

mm y 12 secciones de 25 mm de longitud. Gurdelas en un vaso de precipitacin cubierto

c.

Pese cada seccin y coloque dos en cada cpsula de Petri, una de 20 mm y otra de 25 mm

d.

Al cabo de dos horas saque las secciones de la solucin tratamiento y squelas rodndolas sobre papel
absorbente sin presionarlas. IMPORTANTE: Preguntar al Profesor antes de comenzar el secado

e.

Pese nuevamente cada seccin

8
Determinacin del potencial hdrico en tubrculo de para por el mtodo
gravimtrico
[]
Sacarosa
M

Muestra 1
Peso
Inicial

Peso
Final

Muestra 2
Peso
Inicial

Peso
Final

Muestra 3
Peso
Inicial

Peso
Final

0.00
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60

Determinacin del potencial osmtico con el mtodo crioscpico

a.

Corte en pequeos pedazos la otra mitad de la papa que utiliz en la parte anterior

b.

Colquelos en un mortero y macere rpidamente (sin aadir agua)

c.

Vierta el macerado en dos tubos de centrfuga de 12ml y tpelos. Centrifugue durante 2 minutos

d.

Guarde el sobrenadante en un tubo de ensayo tapado

e.

Monte el aparato crioscpico (Fig. 1)

f.

Coloque 3ml del extracto de papa en el tubo interno. Introduzca el termmetro hasta que el bulbo de
ste quede totalmente cubierto con el extracto, pero evitando que el termmetro toque el fondo del
tubo de ensayo

g.

Coloque el tubo interno dentro del tubo externo evitando cualquier contacto entre ellos

h.

Monte el bao de hielo y sal. Agite constantemente el bao para evitar sobreenfriamiento

i.

Cuando la temperatura del extracto alcance 1C. anote los valores cada 15 segundos hasta que sta
permanezca constante

j.

Realice un experimento similar con agua destilada para calibrar el termmetro al punto de
congelacin del agua lo ms exactamente posible

9
Determinacin del potencial osmtico en extracto de papa por
el mtodo crioscpico

Tiempo

Temperatura 0C
Ext.1

Agua 1

Ext.2

Agua 2

Ext.3

Agua 3

Determinacin del potencial osmtico en extracto de papa por

el mtodo crioscpico

Tiempo

Temperatura 0C
Ext.1

Agua 1

Ext.2

Agua 2

Ext.3

NOTA: Realice ambos experimentos (extracto y agua destilada) dos veces por lo menos
Determinacin del potencial hdrico con cmara de Scholander
Muestra

a.

Tome una hoja de una planta

b.

Coloque el pecolo en la cmara de presin

c.

Observe con una lupa y determine la presin a la cual se humedece

el corte del pecolo.

NOTA: Consulte con el profesor para hacer la medicin

(Bar)

Agua 3

10
PRESENTACION DE LOS RESULTADOS
a.

Haga un dibujo esquemtico de clulas trgidas y plasmolizadas de bulbo de cebolla

b.

Grafique el porcentaje de clulas plasmolizadas vs. la concentracin molar de la solucin y el

potencial osmtico (MPa) de la solucin

c.

Indique cul es la concentracin molar (M) y el potencial osmtico (MPa) de las clulas (en las
vacuolas) de bulbo de cebolla

d.

Grafique el porcentaje de cambio de peso vs. el potencial osmtico (MPa) de la solucin tratamiento

e.

Indique cul es el potencial hdrico (MPa) del tubrculo de papa

f.

Grafique los valores de temperatura (C) vs. tiempo (min.), para el agua destilada y el extracto tisular

g.

Calcule el potencial osmtico (MPa) del extracto de tubrculo de papa

h.

Calcule el potencial o presin de turgencia (MPa) de las clulas en el tubrculo de papa

Nota: Presente, adems otras tablas, grficos u observaciones que considere pertinentes

BIBLIOGRAFIA
Kramer P (1974) Relaciones hdricas de suelo y plantas. Edutex, Mxico
Slavik B (1974) Methods of studying plant-water relations. Sringer-Verlag. Germany
Sutcliffe J (1968) Plants and water. Studies in Biology No. 14 Edward Arnold Publ. Great Britain
Turner N (1981) Techniques and experimental approaches for the measurement of plant water status. Plant
and Soil 5:339-366

11
ANEXOS

Potenciales osmticos de soluciones de

Frmula para el clculo de por el mtodo crioscpico

sacarosa (20C)
Molaridad

Potencial Osmtico
(MPa)

0,10

-0,26

0,15

-0,41

0,20

-0,54

0,25

-0,68

0,30

-0,82

0,35

-0,97

0,40

-1,12

0,45

-1,29

0,50

-1,45

0,55

-1,62

0,60

-1,79

T
x 2.27 (MPa)
1.86

Figura 1
APARATO CRIOSCOPICO

12

PRCTICA DE LABORATORIO 2
Relaciones hdricas II. Transpiracin

La transpiracin es la prdida de agua en forma de vapor desde la parte area de las plantas hacia la atmsfera
circundante. Esta es causada por el gradiente de potencial hdrico entre la superficie transpiratoria y la capa
de aire adyacente. Es un proceso de evaporacin complejo, modulado por procesos y estructuras biolgicas.
Por tanto esta regulado por leyes fsicas que determinan la tasa de evaporacin y por el estado biolgico del
tejido transpiratoria. Por otra parte, la accesibilidad de humedad en el suelo es el principal determinante de la
tasa de toma de agua por la planta. Todo esto conlleva a que la tasa de transpiracin vare considerablemente
en el tiempo.

OBJETIVOS
Utilizando plantas completas determinar las tasas de transpiracin y la conductancia estomtica en condiciones
ambientales diferentes:

1.

Determinar experimentalmente el efecto de condiciones de alta y baja radiacin en la conductancia

estomtica y tasa transpiratoria

2.

Determinar experimentalmente el efecto del viento en la tasa de transpiracin

3.

Analizar la relacin entre el gradiente de presin de vapor, entre las hojas y el aire, la resistencia
difusiva foliar, la transpiracin y el potencial hdrico

4.

Comparar las tasas de transpiracin medidas con las calculadas

TEMAS DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

Ecuacin de balance energtico

2.

Concepto: Calor latente de vaporizacin, capa limitante, gradiente de presin de difusin, resistencia
foliar y sus componentes

3.

Efecto de los factores ambientales en cada uno de los determinantes de la tasa de transpiracin por
unidad de rea foliar: radiacin, temperatura, velocidad del viento y humedad relativa

4.

Principios bsicos de la metodologa de la prctica

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Bolsa plstica 22 x 27cm: 12 por seccin

4.

Papel blanco: 10 hojas por seccin

2.

Pabilo: rollo por seccin

5.

Lupa de mano: 2 por seccin

3.

Tijera: 1 por alumno

13
MATERIALES Y EQUIPOS A SER SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO
1.

Banco de luces

8.

Cmara de presin de Scholander

2.

Balanza de plato superior (2 Kg)

9.

Ventilador

3.

Placas de vidrio

10. Radimetro

4.

Pormetro de difusin

11. Material vegetal: plntulas de Helianthus

5.

Psicrmetro de Assman

annus (girasol) o Bellis sylvestris (margarita)

6.

Evapormetro

sembradas en potes

7.

Anemmetro

PROCEDIMIENTO
a.

Envuelva cada pote con una bolsa plstica, y tela con pabilo alrededor del tallo de la plntula (en su
parte inferior). NO apriete demasiado el pabilo

b.

c.

Monte los siguientes tratamientos (2 plntulas en cada uno):

Oscuridad

Luz alta con ventilacin

Luz alta sin ventilacin

Luz baja sin ventilacin

Al inicio de cada tratamiento pese las plantas con los potes, realice una lectura del nivel del
evapormetro

d.

Realice dos mediciones de cada una de las siguientes variables en un lapso de una hora cada 30
minutos:

Nivel del evapormetro

Temperatura del aire; bulbo hmedo y bulbo seco (psicrmetro)

Velocidad del viento (anemmetro)

Radiacin total (radimetro)

Conductancia estomtica y temperatura foliar medidas por la superficie abaxial y

adaxial si la hoja tiene estomas por ambas superficies. En caso de tener estomas por
una sola superficie mida solamente en ese lado de la hoja

e.

Peso de cada pote (balanza de plato superior)

Al final del tratamiento mida el potencial hdrico (cmara de presin) de cada planta y saque
impresiones de las hojas en papel para determinar el rea foliar. Debe conocer adems el rea de la
superficie evaporadora del evapormetro

Tratamiento

LUZ ALTA

Planta
Tiempo
Peso (g)
Nivel del
evapormetro (ml)
Temp. Bulbo seco
(oC)
Temp. Bulbo
hmedo (oC)
Velocidad del Viento
(m s-1)
Radiacin Total
(W m-2)
No. Cuentas abaxial
Temp. Hoja abaxial
(oC)
No. Cuentas adaxial
Temp. Hoja adaxial
(oC)
Peso del Papel
g
Area foliar (cm2)
Potencial hdrico
(Bar)

1
0 min

30 min

LUZ BAJA
2

60 min

0 min

30 min

1
60 min

0 min

30 min

2
60 min

0 min

30 min

60 min

15
Tratamiento

LUZ ALTA CON VENTILACIN

Planta
Tiempo
Peso (g)

1
0 min

30 min

OSCURIDAD
2

60 min

0 min

30 min

1
60 min

0 min

30 min

2
60 min

0 min

Nivel del
evapormetro (ml)
Temp. Bulbo seco
(oC)
Temp. Bulbo
hmedo (oC)
Velocidad del Viento
(m s-1)
Radiacin Total
(W m-2)
No. Cuentas abaxial
Temp. Hoja abaxial
(oC)
No. Cuentas adaxial
Temp. Hoja adaxial
(oC)
Peso del papel
g
Area foliar (cm2)
Potencial hdrico
(Bar)

Curva de calibracin del pormetro:______________________

rea/Peso del papel:______________________

rea del Evapormetro: _________________

1/rshoja = 1/rsabaxial + 1/rsadaxial

30 min

60 min

PRESENTACION DE LOS RESULTADOS

a.

b.

Elabore una tabla donde se indique para cada tratamiento los valores promedios de:

Temperatura foliar (Tf C)

Temperatura del aire (Ta C)

Humedad relativa (HR %)

Evaporacin (Ev, mol H2O m-2 s-1)

Resistencia estomtica (rs, m2 s mol-1)

Tasa transpiratoria medida y calculada (E, mol H2O m-2 s-1)

Potencial hdrico (, MPa)

Radiacin neta (W m-2)

Con todos los valores disponibles realice los siguientes grficos:

Tasa transpiratoria vs. resistencia estomtica

Potencial hdrico vs. tasa transpiratoria

Tasa transpiratoria vs. DPV

c.

Compare los resultados de oscuridad, luz baja y luz alta

d.

Compare los resultados de luz alta con y sin ventilacin

Nota: Presente, adems otras tablas, grficos u observaciones que considere pertinentes

BIBLIOGRAFIA
Coombs JD (1982) Techniques in bioproductivity & Photosynthesis. Pergamon Press. Great Britain
Gates DM (1968) Transpiration and leaf temperature. Ann. Rev. Plant Physiol. 19: 211-238
Monteith JL, M Unsworth (1989) Principles of Environmental Physics. Edward Arnold, London
Pearcy RW, J Ehleringer, HA Money, PW Rundel (1989) Plant physiological Ecology. Field methods and
instrumentation. Chapman and Hall, London
Sutcliffe J (1968) Plants and Water. Studies in Biology No. 14. Edwars Arnold Pub. Great Britain
Ting I (1982) Plant Physiology. Addison-Wesley Publ. Co. Inc. U.S.A.
Zeiger E (1987) Stomatal Function Stanford University Press, U.S.A.

17

ANEXOS

EVAPORACION (Ev, mol H2O m-2 s-1)

Vf Vi

1
2 1
18 g mol (mol H2 O m s )
4 2
30.68x10
m
x
tiempo
(s)

Ev

donde: Ev es igual al volumen de agua evaporada en el evapormetro expresado en moles de H 2O, por unidad
rea de evaporacin y por unidad de tiempo. 30.68 x 10-4 m2 corresponde al rea de evaporacin y

18

-1

g mol al peso molecular del H2O.

DEFICIT DE PRESION DE VAPOR (DPV, KPa)

DPV ehoja eaire

Donde: ehoja es la presin de vapor de agua en la hoja calculada utilizando la temperatura de la hoja
(Pormetro) y la Tabla II. Se asume que la presin de agua en la hoja es saturante a la temperatura de la
misma. eaire es la presin de vapor de agua en el aire calculada con la temperatura del bulbo seco
(temperatura del aire) del psicrmetro, y la Tabla II. Este valor debe ser multiplicado por la humedad relativa
del aire (p.e. si la humedad relativa es de 72% multiplique por 0.72) medida con el psicrmetro.

La presin de vapor de agua a saturacin (esat, mbar) puede ser obtenida de la tabla II o a travs de la
ecuacin:

donde T es la temperatura en C

e sat 6.13753xe

T
Tx 18.564

254.4

255.57 T

TRANSPIRACION CALCULADA (E, mol H2O m-2 s-1)

DPV
(mol H2 O m-2 s-1)
P x rs

Donde: DPV es el dficit de presin de vapor de agua entre la hoja y el aire en KPa. rs es la resistencia
estomtica en m2 s mol-1 medida con el pormetro de difusin y la curva de calibracin. P es la presin
atmosfrica en KPa. Para Sartenejas (USB) P es aproximadamente 86,65 KPa.

TRANSPIRACION MEDIDA
Se obtiene a partir de la diferencia de peso en las plantas (inicial - final) expresada en moles de agua por
unidad de rea foliar y tiempo.

18

TABLA I
Humedad Relativa, %

bs - bh

Temperatura del bulbo seco (C)

15

20

25

30

35

40

0.0

100

100

100

100

100

100

0.5

95

96

96

96

97

97

1.0

90

91

92

93

94

94

1.5

85

87

88

89

90

91

2.0

80

83

84

86

87

88

2.5

75

78

81

83

84

85

3.0

71

74

77

79

81

82

3.5

66

70

74

76

78

80

4.0

61

66

70

73

75

77

4.5

57

62

67

70

72

74

5.0

52

59

63

67

69

72

5.5

48

55

60

64

67

69

6.0

44

51

57

61

64

67

6.5

40

48

54

58

61

64

7.0

36

44

50

55

59

62

7.5

32

41

47

52

56

59

8.0

27

37

44

50

54

57

8.5

23

34

41

47

51

54

9.0

20

30

38

44

49

53

9.5

16

27

36

42

47

51

10.0

12

24

33

39

44

48

11.0

18

27

35

40

44

12.0

---

12

22

30

36

40

bs-bh = temperatura del bulbo seco - temperatura del bulbo hmedo

Nota: extrapole para los datos intermedios

19

TABLA II
Presin de vapor de agua a saturacin, mbar
Temp 0C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

.0
6.110
6.569
7.059
7.579
8.135
8.719
9.353
10.02
10.73
11.48
12.28
13.13
14.03
14.99
16.00
17.06
18.19
19.39
20.65
21.99
23.41
24.90
26.47
28.13
29.87
31.72
33.66
35.77
37.86
40.13
42.50
45.02
47.64
50.41
53.31
56.36
59.57
62.92
66.43
70.12
73.98
78.03
82.27
86.68
91.32
96.18
101.24
106.53
112.07
117.84
123.88

.1
6.155
6.617
7.110
7.633
8.192
8.786
9.417
10.09
10.80
11.56
12.37
13.22
14.13
15.09
16.09
17.17
18.32
19.52
20.76
22.13
23.55
25.04
26.63
28.30
30.06
31.91
33.86
35.92
38.08
40.36
42.76
45.27
47.91
50.70
53.62
56.68
59.89
63.26
66.80
70.50
74.38
78.45
82.70
87.14
91.80
96.66
101.75
107.08
112.62
118.43
124.50

.2
6.201
6.665
7.161
7.688
8.250
8.847
9.482
10.16
10.88
11.64
12.45
13.31
14.21
15.18
16.21
17.29
18.43
19.63
20.91
22.26
23.69
25.20
26.78
28.46
30.23
32.10
34.07
36.12
38.30
40.59
42.99
45.52
48.18
50.98
53.92
57.00
60.22
63.61
67.16
70.88
74.77
78.86
83.13
87.60
92.27
97.16
102.27
107.62
113.20
119.03
125.12

.3
6.245
6.713
7.212
7.742
8.308
8.910
9.549
10.23
10.95
11.72
12.53
13.39
14.31
15.28
16.30
17.40
18.54
19.76
21.05
22.41
23.84
25.36
26.96
28.64
30.42
32.29
34.26
36.34
38.52
40.83
43.25
45.79
48.47
51.29
54.22
57.31
60.55
63.96
67.51
71.26
75.17
79.28
83.57
88.05
92.76
97.66
102.80
108.15
113.77
119.62
125.74

.4
6.291
6.761
7.263
7.797
8.366
8.972
9.614
10.30
11.03
11.80
12.62
13.49
14.40
15.38
16.42
17.50
18.67
19.89
21.18
22.55
23.99
25.52
27.12
28.81
30.60
32.49
34.47
36.55
38.76
41.07
43.50
46.05
48.74
51.55
54.52
57.63
60.89
64.31
67.88
71.63
75.57
79.70
84.00
88.52
93.24
98.16
103.32
108.72
114.34
120.22
126.36

.5
6.336
6.811
7.315
7.852
8.425
9.034
9.681
10.37
11.10
11.88
12.70
13.57
14.50
15.48
16.51
17.62
18.78
20.01
21.31
22.69
24.14
25.67
27.29
28.98
30.78
32.68
34.67
36.77
38.98
41.30
43.75
46.31
49.01
51.84
54.82
57.95
61.22
64.65
68.25
72.03
75.98
80.12
84.45
88.97
93.71
98.68
103.86
109.27
114.91
120.83
126.98

.6
6.383
6.859
7.367
7.909
8.485
9.097
9.748
10.44
11.18
11.96
12.79
13.67
14.60
15.58
16.63
17.74
18.91
20.14
21.45
22.83
24.28
25.83
27.45
29.16
30.97
32.87
34.88
36.99
39.20
41.54
43.99
46.57
49.29
52.14
55.12
58.27
61.56
65.01
68.62
72.42
76.38
80.53
84.88
89.44
94.19
99.18
104.38
109.81
115.48
121.43
127.62

.7
6.429
6.908
7.420
7.964
8.544
9.160
9.816
10.51
11.25
12.04
12.87
13.75
14.70
15.69
16.74
17.85
19.02
20.27
21.58
22.98
24.44
25.99
27.62
29.35
31.15
33.06
35.08
37.20
39.44
41.78
44.24
46.84
49.25
52.43
55.42
58.58
61.89
65.36
69.00
72.80
76.78
80.97
85.33
89.90
94.69
99.68
104.91
110.36
116.07
122.03
128.25

.8
6.476
6.958
7.473
8.021
8.604
9.224
9.883
10.58
11.33
12.12
12.96
13.85
14.79
15.79
16.84
17.96
19.15
20.40
21.72
23.12
24.58
26.15
27.78
29.52
31.34
33.26
35.29
37.42
39.66
42.02
44.50
47.11
49.84
52.73
55.74
58.90
62.23
65.71
69.37
73.18
77.20
81.40
85.78
90.37
95.18
100.20
105.45
110.93
116.66
122.64
128.88

.9
6.523
7.008
7.526
8.077
8.665
9.288
9.951
10.65
11.41
12.20
13.04
13.93
14.88
15.88
16.95
18.08
19.26
20.52
21.85
23.26
24.74
26.31
27.96
29.69
31.53
33.46
35.49
37.64
39.90
42.27
44.75
47.37
50.13
53.01
56.04
59.24
62.28
66.06
69.73
73.58
77.60
81.82
86.23
90.84
95.66
100.72
105.98
111.50
117.27
123.26
129.52

20
Nota: Divida entre 10 los valores de esta tabla para obtener la presin de vapor en KPa

PRCTICA DE LABORATORIO 3
Nutricin mineral

Las plantas poseen mecanismos de toma de iones que permiten la movilidad de los mismos a travs de las
membranas celulares. Esta toma es selectiva y las concentraciones de iones dentro de la planta pueden ser
mucho ms altas que la de esos mismos iones en la solucin de suelo. La toma de iones por las plantas depende
tanto de la disponibilidad del medio donde crecen como de diferencias especficas en la demanda.
Actualmente, est bien establecido el carcter esencial de 14 elementos minerales para las plantas superiores.
Estos son los macronutrientes: N, P, S, K, Mg, Ca, y los micronutrientes: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Mo, Cl, Ni.

OBJETIVOS
Estudiar algunos efectos de la deficiencia de nitrgeno (macronutriente esencial) en el crecimiento de las
plantas
1.

Efecto sobre la distribucin de materia seca en races, tallos y hojas

2.

Efecto sobre el rea, cantidad de clorofila y de protena foliar

TEMAS DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

Mecanismos de toma de nitrgeno por las plantas

2.

Sntomas visibles de la carencia de nitrgeno

3.

Consecuencias fisiolgicas de la deficiencia de nitrgeno

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Tijera: 1 por alumno

4.

Papel de aluminio: 1 rollo por seccin

2.

Hojas de papel blanco: resma por seccin

5.

Bolsa de papel de 250g: 30 por seccin

3.

Tirro: 1/2 rollo por seccin

21
MATERIALES Y REACTIVOS A SER SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO
1.

Plntulas de caraota de 15 das de edad

5.

Centrfuga de mesn

2.

Acetona

6.

Estufa

3.

Soluciones para preparar medio Hoagland

7.

Balanza analtica

con y sin nitrgeno

8.

Poncheras plsticas con tapa de anime para

4.

Soluciones para determinacin de protenas

por Lowry et al. y reactivo de Folin-

instalacin de cultivos hidropnicos

9.

Bombas de acuario para aireacin

Ciocalteau

PROCEDIMIENTO
Siembra y tratamiento
La primera semana del inicio del curso se proceder al montaje de esta prctica. El ensayo se realizar en el
invernadero con plantas creciendo hidropnicamente con aireacin. Se utilizarn plantas de caraota de 15 das
de germinadas a razn de 24 por recipiente. Colocando una planta en cada perforacin del anime. Se tendrn
dos tipos de experimentos:

Plantas en solucin Hoagland completo

Plantas en solucin Hoagland sin nitrgeno

Nota: El momento del montaje es el punto "cero" del experimento

Cosecha
Cada semana, (inclusive para tiempo cero) se realizar la cosecha en cada lote de plantas, tomando tres
plantas por tratamiento y separndolas en races, tallos (incluyendo los pecolos) y hojas
a.

Determine el rea foliar total por planta mediante el calcado de hojas individuales

b.

Guarde el material vegetal separado por compartimientos, en bolsas de papel debidamente rotuladas:
fecha, no. de la planta, parte de la planta, seccin, tratamiento

c.

Llvelas a la estufa, deje secar por 24-48 horas a 80 C y luego pselas

d.

Al finalizar la cosecha, complete el volumen de solucin en los recipientes si fuese necesario,

agregando lo que haga falta de la solucin correspondiente

La ltima semana despus de realizar la cosecha correspondiente utilice el resto de las plantas para las
determinaciones de clorofila, protena y relacin rea peso fresco de la hoja.

Determinacin de la tasa de crecimiento relativa y productividad

Cosecha T0
Fecha:

Peso Raz

CON NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Cosecha T0
Fecha:

3
Cosecha T1
Fecha:

Peso Raz

Peso papel

Cosecha T1
Fecha:
1

3
Peso Raz

Peso papel

Cosecha T2
Fecha:
1

Peso Raz

SIN NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Peso Raz

SIN NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Peso Raz

SIN NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Peso Raz

SIN NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

3
Peso Raz

CON NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Cosecha T3
Fecha:

3
Cosecha T4
Fecha:

Peso papel

3
CON NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Cosecha T3
Fecha:

SIN NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

3
CON NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Cosecha T2
Fecha:

Peso Raz

3
Peso Raz

CON NITROGENO
Peso Tallo
Peso Hoja

Peso papel

Cosecha T4
Fecha:

Relacin rea / peso del papel:__________________________________

Determinacin del rea/peso fresco de una sub-muestra del material foliar de plantas +N y N
a.

Obtenga 15 discos de hoja con un sacabocado

b.

Determine el peso fresco de 15 discos

c.

Determinar el rea de los 15 discos

d.

Calcular la relacin rea/peso fresco

Dimetro de los discos: 0.61 mm

Con Nitrgeno
No. de discos

Peso fresco
de los discos

Sin Nitrgeno
rea de los
discos

No. de discos

Peso fresco
de los discos

rea de los
discos

Nota: Estos resultados sern utilizados para expresar la cantidad de clorofila y protena por unidad de rea y
de pesa fresco de la hoja, para cada tratamiento

Determinacin de clorofila. Emplee cuatro plantas de cada tratamiento

a.

Saque 15 discos de rea conocida de tejido foliar eliminando nervaduras

b.

Macere con acetona pura fra (2ml)

c.

Vierta el macerado en un tubo de centrfuga y centrifugue en la escala 3 por 4 min

d.

Vierta el sobrenadante en un cilindro y complete a 10ml con acetona 85%

e.

Lea la absorbancia a 652nm. Utilice acetona al 85% como blanco

Con Nitrogeno
No. de discos

Absorbancia
652 nm

Sin Nitrgeno
Clorofila
mg l-1

No. de discos

Absorbancia
652 nm

Clorofila
mg l-1

24
Determinacin de protenas
a.

Pese 500mg de tejido foliar eliminando nervaduras

b.

Macere rpidamente en seco hasta formar una pasta homognea. Aada 5ml de "buffer" fosfato 0.1M,
pH= 7.0 en el mortero y termine de macerar.

c.

Vierta el macerado en un tubo de centrfuga de 15ml. Lave el mortero con 3ml de "buffer" fosfato

d.

Centrifugue por 10 minutos en la escala 3

e.

Tome 2ml del sobra-nadante y chelo en un tubo de centrfuga de 15ml

f.

Agregue 2ml de TCA 15%

g.

Guarde 10 min. en la nevera

h.

Centrifugue por 10 minutos en la escala 3.

i.

Descarte el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 2ml de NaOH (0.1N). Guarde en la nevera

j.

Para la curva de calibracin emplee una solucin patrn de BSA 1 mg ml -1. Haga la curva patrn con 0,
20, 40, 60, 80, 120, 160 y 200g de BSA

Curva de calibracin para la determinacin de protenas por el mtodo de Lowry

Reactivos y procedimiento:
1.

Solucin de albmina srico u ovoalbmina (BSA) diluida 1mg por ml

2.

Solucin D (C, B y A 1:1:8; seguir el orden)

3.

Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido en agua destilada en proporcin 1:2

4.

Preparacin de los tubos por duplicado

BSA

H2O destilada

Sol D

Folin

Protena

Abs. 1

Abs. 2

ml

ml

750nm

750nm

300

0.9

20

280

0.9

20

40

260

0.9

40

60

240

0.9

60

80

220

0.9

80

120

180

0.9

120

160

140

0.9

160

200

100

0.9

200

Tubo

25

Determine el contenido de protenas en las muestras utilizando el mtodo de Lowry

a.

Colocar 0.3ml de muestra diluida adecuadamente en un tubo de ensayos limpios y secos

b.

Aadir 9ml de Solucin D. Agitar en vrtex de inmediato

c.

Incubar en un bao a 37-40C por 10 minutos

d.

Aadir 0.9ml de reactivo de Folin-Ciocalteau (diluido 1:2 en H2O destilada). Agitar inmediatamente

e.

Incubar por 10 minutos en bao a 37-40C. Luego dejar 15 min. a temperatura ambiente

f.

Leer Absorbancia a 750nm utilizando la muestra sin BSA como blanco

CON NITRGENO

SIN NITROGENO

Peso de la muestra de hojas + N: _____________

Peso de la muestra de hojas N: _____________

Muestra

Dilucin

Absorbancia Absorbancia
1
2
750nm
750nm

Muestra

Dilucin

Absorbancia Absorbancia
1
2
750nm
750nm

PRESENTACION DE RESULTADOS
a.

Reporte en una tabla, para cada tratamiento y cada cosecha, el rea foliar total por planta y los pesos
secos por compartimiento (promedios)

b.

Calcule la tasa de crecimiento relativo (R) y la relacin rea foliar/peso seco de la planta (A/P)

c.

Calcule la productividad neta

d.

Reporte en una tabla los valores obtenidos de R, A/P, productividad neta y la distribucin porcentual
de materia seca en cada compartimiento para cada tratamiento, a lo largo del perodo de
experimentacin

e.

Reporte en una tabla el contenido de clorofila y el de protena por unidad de rea (g cm-2) y por
unidad de peso fresco (mg g-1). Utilice los resultados de rea/Peso fresco de los discos

Nota: Puede presentar adems otras tablas, grficos u observaciones que considere pertinentes

26
BIBLIOGRAFIA
Bruisma J (1963) The quantitative analysis of chlorophylls a and b in plant extracts. Photochem & Photobiol
2:241-245
Epstein E (1972) Mineral nutrition of plants: principles and perspectives. John Wiley and Sons, Inc.
Ting IP (1982) Plant Physiology. Addison Wesley Publishing Company

ANEXOS

PRODUCTIVIDAD (P, g m-2 d-1)

P=

Bfinal (g) - Binicial (g)

x No plantas (g m-2 d-1)
0.1394 m2 x tiempo (d)

Donde: Bfinal es la biomasa final y B inicial es la biomasa inicial. 0.133 m2 corresponde al rea de siembra
(bandejas). El nmero de plantas es de 30.

TASA DE CRECIMIENTO RELATIVO (R, g d-1)

ln (Bfinal ) ln (Binicial )
(g d-1)
t 2 t1

Donde: Bfinal es la biomasa final al tiempo 2 (t2) y Binicial es la biomasa inicial al tiempo 1 (t1)

CLOROFILA EN EL EXTRACTO ACETONICO (mg Chl 1-1)

Chl Absorbancia 652nm x 27.8 (mg l-1)

Corrija por volumen del extracto en acetona y determine la cantidad de clorofila por unidad de rea ( g cm-2)
y por unidad de peso fresco (mg g-1). Utilice los resultados de rea/Peso fresco de los discos y por unidad de
peso fresco. Utilice la relacin rea/Peso fresco de los discos. Dimetro de los disco 6.1 mm

PROTENA EN EL TEJIDO FOLIAR

Corrija por el factor de dilucin y por las diluciones durante la extraccin. Exprese los resultados en cantidad
de protena por unidad de peso fresco unidad de rea (g cm-2) y por unidad de peso fresco (mg g-1). Utilice los
resultados de rea/Peso fresco de los discos y por unidad de rea para expresar por unidad de rea.

27

PRCTICA DE LABORATORIO 4
Fotosntesis I. Reaccin de Hill

La absorcin de fotones durante la fase lumnica de la fotosntesis provee a los fotosistemas I y II con la energa
necesaria para el movimiento de electrones utilizados en la sntesis de ATP y NADPH. Cuando el centro de
reaccin del fotosistema II es excitado libera un electrn, el cual se mueve a lo largo de una cadena de
componentes redox. Algunos compuestos redox artificiales donan o aceptan electrones interceptando las
cadenas de transporte electrnico. Uno de esto aceptores de electrones es el colorante DCPIP. Los cambios en
intensidad y velocidad del espectro de absorbancia de este colorante son indicadores del flujo electrnico.

OBJETIVOS
Estudiar las reacciones de luz del proceso fotosinttico en cloroplastos aislados
1.

Medir la actividad fotoqumica en cloroplastos aislados, bajo diversas condiciones de radiacin

lumnica (cantidad) utilizando el DCPIP como aceptor artificial de electrones

2.

Estudiar el efecto del DCMU sobre la reaccin de Hill

TEMAS DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

2.

Conceptos:

aceptador de electrones

donador de electrones

transportador de electrones

pigmento accesorio

unidad fotosinttica y herbicida

En qu consisten las reacciones de luz (fotoqumicas) en el proceso de asimilacin de CO 2 por las

plantas verdes?

3.

Cul es el efecto de la intensidad lumnica sobre las reacciones fotoqumicas del proceso
fotosinttico?

28
4.

Qu se entiende por punto de compensacin de luz? Qu se entiende por punto de saturacin de luz?

5.

Por qu hay un flujo neto negativo de CO2 en las plantas en condiciones de oscuridad?

6.

Por qu es importante determinar la concentracin ptima de cloroplastos en el medio de reaccin,

cuando se realizan experimentos como los que Ud. realizar en esta prctica de fisiologa?

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Espinacas frescas (no congelada): 2

paquetes grandes por seccin

2.

Papel de aluminio: rollo por seccin

3.

Gasa: 2 paquetes por seccin

4.

Tijera: 1 por alumno

5.

Cronmetro: 5 por seccin

6.

Marcador: 5 por seccin

MATERIALES Y REACTIVOS A SER SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO

1.

Acetona a 85%

10. Tubo de centrfuga de 50ml

2.

Pipetas de 0.5, 1, 2, 5 y 10ml

11. Medio de maceramiento (NaCl 0.35M; Tris

3.

Placas de Petri de 15 cm

4.

Fiolas de 50ml

5.

Cilindros graduados de 25ml

6.

Tubos de ensayos

13. Embudos

7.

Buffer fosfato 0.1M, pH= 6.5

14. Lminas portaobjeto y cubre objeto

8.

DCPIP 0.25 mM

15. Aceite de inmersin

9.

DCMU (Diurn) a 0.05, 0.2 y 2ppm

HCl 0.04M, pH 8.0)

12. Medio de resuspensin (NaCl 0.35M; Tris HCl
0.04M, pH 6.8)

PROCEDIMIENTO
Aislamiento de cloroplastos
a.

Corte 75 g de hojas de espinaca, sin nervadura, en pedazos pequeos

b.

Licue con 150ml de medio de maceramiento (10 s a baja velocidad y 20 s a alta velocidad. Licue en la
cava o con el envase de la licuadora fro

c.

Filtre el homogeneizado a travs de cuatro capas de gasa en una fiola previamente forrada con papel
de aluminio

d.

Transfiera el filtrado a tubos de 10ml y Centrifugue en la escala 3, durante cuatro minutos

e.

Descarte el sobrenadante

29
f.

Resuspenda el precipitado de 4 tubos de centrfuga en 50ml de medio de resuspensin. Reserve el

resto de los tubos de centrfuga con su precipitado

g.

Guarde (en hielo) su preparacin de cloroplastos en una fiola cubierta con papel de aluminio

h.

Observe al microscopio una gota de la suspensin de cloroplastos

Determinacin de la concentracin ptima de cloroplastos en el medio de reaccin

a.

Monte el siguiente ensayo en el banco de luces con una densidad de flujo cuntico de 400 mol m-2 s-1.
Prepare un control para cada punto del ensayo reemplazando la suspensin de cloroplastos con agua
destilada

Buffer

H2O dest.

DCPIP

Cloroplastos

ml

ml

ml

ml

1.0

2.5

0.5

2.0

1.0

3.0

0.5

1.5

1.0

3.5

0.5

1.0

1.0

4.0

0.5

0.5

1.0

4.4

0.5

0.1

b.

Mida la absorbancia a 600nm a los tiempos: 0, 2, 5 y 10 minutos, utilizando agua como blanco

c.

La concentracin ptima de cloroplastos es aquella en que la reduccin del DCPIP es de rapidez

intermedia

Absorbancia 600nm
Tiempo (min)
Control para 2.0 ml
2 ml de cloroplasto
Control para 1.5 ml
1.5 ml de cloroplasto
Control para 1.0 ml
1.0 ml de cloroplasto
Control para 0.5 ml
0.5 ml de cloroplasto
Control para 0.1 ml
0.1 ml de cloroplasto

10

30

Efecto de la intensidad de la radiacin lumnica en la actividad fotoqumica de los cloroplastos

a.

Monte los siguientes tratamientos (dos cada vez)

Tratamiento
Oscuridad

Buffer

H2O

DCPIP

Cloroplastos

ml

ml

ml

ml

1.0

**

0.5

**

-1

400 mol m s

1.0

**

0.5

**

250 mol m-2 s-1

1.0

**

0.5

**

100 mol m-2 s-1

1.0

**

0.5

**

50 mol m s

1.0

**

0.5

**

Control

1.0

4.5

0.5

NO

-2

-2

-1

Oscuridad: forrado con papel aluminio y con una DFC: 400 mol m-2 s-1

Control: Sin cloroplastos y con una DFC: 400 mol m-2 s-1

** Volmenes de acuerdo a los resultados del ensayo anterior (concentracin ptima de

cloroplastos)

b.

Lea la absorbancia a 600nm a los tiempos: 0, 1, 2, 5, 10 minutos

Absorbancia 600 nm
Tiempo (min)
Oscuridad a
Oscuridad b
400 mol m-2 s-1 a
400 mol m-2 s-1 b
250 mol m-2 s-1 a
250 mol m-2 s-1 b
100 mol m-2 s-1 a
100 mol m-2 s-1 b
50 mol m-2 s-1 a
50 mol m-2 s-1 b
Control a
Control b

10

31

Efecto del DCMU en la Actividad Fotoqumica de los cloroplastos

a.

Monte los siguientes tratamientos por duplicado (DFC = 400 mol m-2 s-1)

Tratamiento*

b.

Buffer

DCMU

DCPIP

Cloroplastos

H2O

[DCMU] (ppm)

ml

Control

1.0

ml

ml

ml

ml

0.5

**

0.05

1.0

0.5

0.5

**

0.20

1.0

0.5

0.5

**

0.50

1.0

0.5

0.5

**

1.00

1.0

0.5

0.5

**

2.00

1.0

0.5

0.5

**

** Volumen de acuerdo a los resultados del ensayo anterior (concentracin ptima de cloroplastos)

Complete con H2O hasta llegar a 6.0ml en el medio de reaccin

Lea la absorbancia a 600nm a los tiempos: 0, 5, 10 minutos

Absorbancia 600nm
Tiempo (min)
Control* a
Control* b
0.05 ppm a
0.05 ppm b
0.20 ppm a
0.20 ppm b
0.50 ppm a
0.50 ppm b
1.00 ppm a
1.00 ppm b
2.00 ppm a
2.00 ppm b

10

32

Determinacin de la concentracin de clorofila en la suspensin de cloroplastos

a.

Tome 0.5ml de la suspensin de

Volumen

Abs. 652
nm

Clorofila
mg l-1

cloroplastos
b.

Concentracin
de clorofila
mg ml-1

Adale 9,5ml de acetona al 85% y

agite vigorosamente

c.

Lea la absorbancia del filtrado a

652nm utilizando acetona al 85% como
blanco

PRESENTACION DE RESULTADOS
a.

Haga un grfico de % Absorbancia vs. tiempo (min.) para cada una de las concentraciones de
cloroplastos utilizadas en la actividad: Determinacin de la concentracin ptima de cloroplastos en
el medio de reaccin

b.

Haga un grfico de % Absorbancia vs. tiempo (min.) para cada tratamiento del experimento: Efecto de
la intensidad de la radiacin lumnica en la actividad fotoqumica de los cloroplastos

c.

Realice un grfico de tasa mxima de reduccin del DCPIP vs. densidad de flujo cuntico

d.

Grafique % Absorbancia vs. tiempo (min.) para los tratamientos del experimento Efecto del DCMU en
la Actividad Fotoqumica de los cloroplastos. Use el control 400 mol m-2 s-1 + cloroplastos

e.

Presente en un apndice un ejemplo numrico de los clculos realizados para determinar contenido de
clorofila en la suspensin de cloroplastos, porcentaje de absorbancia (% absorbancia) y tasa mxima
de reduccin del DCPIP

Nota: Puede presentar adems otras tablas, grficos u observaciones que considere pertinentes

BIBLIOGRAFIA
Bonner J, J Varner (Ed.) (1968) Plant Biochemistry. 3er ed. Academic Press, U.S.A.
Coombs JD, JD Hall (1982) Techniques in Bioproductivity & Photosynthesis. Pergamon Press, Great Britain
Hall D, K Rao (1981) Photosyntesis. 3 Ed. Studies in Biology No. 37. Edward Arnold Publ. Ltd. London

33

Lawlor DW (1987) Photosynthesis: metabolism, control and physiology. Longman Scientific & Technical.
Longman House. England

ANEXOS

PORCENTAJE DE ABSORBANCIA (% Abs)

% Abs

Absorbarcia (t final )
x 100
Absorbancia (t inicial )

Calcule el % de absorbancia para cada uno de los perodos de tiempo donde se midi la absorbancia. Use
siempre el tiempo 0min como absorbancia inicial.

TASA DE REDUCCION DE DCPIP (% Abs mg-1clorofila min-1)

Tasa mxima de reduccin del DCPIP

% Absorbancia (ta) - % Absorbancia (tb)

mg de clorofila x (ta - tb)

tb y ta: corresponde al intervalo de tiempo donde el valor absoluto de la pendiente es mximo. Para
determinar esto, en la grfica % absorbancia vs tiempo escoja el intervalo de mayor pendiente y tome los
valores de % de absorbancia en ese intervalo.
Los mg de clorofila corresponden a la cantidad de clorofila en el volumen de suspensin de cloroplastos
utilizados durante este experimento.

CLOROFILA EN EL EXTRATO ACETONICO (mg Chl l-1)

Chl Absorbancia 652nm x 27.8 (mg l-1)

Corrija por el factor de dilucin y luego calcule la concentracin de cloroplastos en el volumen de

suspensin de cloroplastos utilizado.

34

PRCTICA DE LABORATORIO 5
Fotosntesis II. Asimilacin de CO2

El proceso de asimilacin del CO 2 es el principal sumidero energtico del proceso fotosinttico. Se reconocen
tres rutas de fijacin del CO 2 (C-3, C-4 y CAM). Sin embargo, las tres rutas depende del ciclo de reduccin
fotosinttica asociado a la ribulosa bifosfato carboxilasa-oxigenesa (Rubisco). La dualidad carboxilasaoxigenasa de esta enzima se ve favorecida en la atmsfera actual donde la presin parcial del oxgeno es de
210 mbares y la del CO2 de solo 350 bares. Las rutas fotosintticas CAM y C4 representan alternativas evolutivas
para minimizar la actividad oxigenasa de la Rubisco. Esto es, incrementando la presin parcial del CO 2 en el
sitio de accin de la Rubisco (vaina vascular, C4) o en el perodo del da (perodo de luz, CAM), en el cual la
Rubisco opera como enzima carboxilante.

OBJETIVOS

1.

Dilucidar los patrones de asimilacin de CO2 diferencial en plantas con diferentes rutas fotosintticas

2.

Determinar el punto de compensacin de CO 2 en especies con diferentes mecanismos de fijacin de

CO2 (C3 y C4).

3.

Analizar el efecto de factores ambientales en la fijacin de CO 2

4.

Relacionar los diferentes mecanismos de fijacin de CO2 con la anatoma foliar

5.

Detectar la fijacin nocturna de CO 2 y las variaciones en la acidez titulable en plantas con

metabolismo CAM y C4

Nota Importante: Hay que tomar muestras de Kalanchoe sp. y maz la tarde anterior a la prctica

TEMAS DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

En qu consisten las reacciones de la oscuridad en el proceso de asimilacin de CO 2?

2.

Punto de compensacin de CO2 en plantas C3, C4 y CAM

3.

Punto de saturacin de CO2 en plantas con diferentes mecanismos fotosintticos

4.

Caractersticas de la anatoma foliar relacionadas con los diferentes tipos de mecanismos

fotosintticos

5.

Por qu se detectan variaciones diurnas y nocturnas en la acidez titulable del tejido foliar en plantas
CAM?

35

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Hojilla: 1 paquete por alumno

5.

Tijera: 1 por alumno

2.

Vaselina: 1 pote pequeo por seccin

6.

Pabilo: rollo por seccin

3.

Pincel fino: 1 por alumno

7.

Anime

4.

Pinza fina: 1 por alumno

8.

Cmara fotogrfica digital

Plantas de Kalanchoe daigremontiana

7.

NaOH 0.001N

(CAM), Zea mays (C4) y Schefflera

8.

Buretas

arboricola (C3)

9.

Solucin de fenolftaleina

2.

Solucin fijadora de CO2

10.

Mortero y mazo

3.

Juego de soluciones indicadoras a

11.

Pipetas de 1, 5 y 10ml

diferentes pH

12.

Cilindros graduados de 10, 25 y 50ml

4.

Fiolas de 125ml

13.

Tubos de centrfuga de 20ml

5.

Tapones de goma

14.

Cubreobjetos y portaobjetos

6.

Viales pequeos

MATERIALES A SER SUMINISTRADOS EN EL LABORATORIO

1.

PROCEDIMIENTO
Punto de compensacin de CO2 y efecto de la radiacin lumnica
a.

Prepare 12 fiolas de 125ml con 10ml de solucin fijadora equilibrada para montar ensayos por
duplicados y bajo dos tratamientos de radiacin lumnica (50 y 250 mol m-2 s-1)

b.

Monte 2 hojas de maz y 2 de schefflera en viales con agua, teniendo cuidado de cortar el pecolo o
vaina foliar debajo del agua (utilice una ponchera)

c.

Coloque los viales atados con pabilo dentro de las fiolas y tpelas con un tapn (Fig. 1). Selle los
bordes con vaselina y coloque parafilm alrededor del tapn

d.

Monte dos blancos sin hoja

e.

Determine el pH de la solucin fijadora comparando con el juego de indicadores de pH y coloque las

fiolas bajo las luces de ambos tratamientos lumnicos

f.

Determine el pH de las soluciones fijadoras cada hora durante tres a cuatro horas

g.

Lea la temperatura de cada tratamiento utilizando un termmetro sumergido en la solucin fijadora

BAJA RADIACIN LUMNICA 50 mol m-2 s-1

pH

Hora 0
Temp. 0C

pH

Hora 1
Temp. 0C

pH

Hora 2
Temp. oC

pH

Hora 3
Temp. 0C

pH

Hora 4
Temp. 0C

Hora 3
Temp. 0C

pH

Hora 4
Temp. 0C

Control 1
Control 2
C3 1
C3 2
C4 1
C4 2

ALTA RADIACIN LUMNICA 250 mol m-2 s-1

pH
Control 1
Control 2
C3 1
C3 2
C4 1
C4 2

Hora 0
Temp. 0C

pH

Hora 1
Temp. 0C

pH

Hora 2
Temp. oC

pH

Fijacin nocturna de CO2 (metabolismo CAM)

a.

A las 16:00 horas del da anterior a la prctica monte por duplicado en el invernadero hojas de
Kalanchoe sp. y maz de la manera descrita en la actividad anterior, incluyendo un control

b.

Mida el pH inicial y la temperatura de la solucin fijadora

c.

Determine el pH y la temperatura final de la solucin fijadora a las 7:00 horas del da de la prctica

d.

Monte a esta hora otro par de hojas de Kalanchoe sp. y maz, y control

e.

Mida el pH inicial y la temperatura de la solucin fijadora y colquelas en el invernadero

f.

Determine el pH y la temperatura de la solucin al medioda (12:00 horas) y en la tarde (16:00 horas)

Final de la tarde (6:00 pm)

pH
Temperatura
o
C

Final de la noche (7:00 am)

pH
Temperatura
o
C

Control 1
Control 2
C4 (maz) 1
C4 (maz) 2
CAM (Kalanchoe) 1
CAM (Kalanchoe) 2

Maana (7:00 am)

pH
Temperatura
o
C
Control 1
Control 2
C4 (maz) 1
C4 (maz) 2
CAM (Kalanchoe) 1
CAM (Kalanchoe) 2

Medioda (12:00 pm)

pH
Temperatura
o
C

Tarde (6:00 pm)

pH
Temperatura
o
C

38
Determinacin de la acidez titulable en Kalanchoe sp. y de maz
a.

Guarde en el congelador hojas de Kalanchoe sp. y de maz recogidas en la maana (7:00 horas) y en la
tarde del da anterior (16:00 horas)

b.

Macere 0.5 g. de hoja en un mortero con 3ml de agua destilada

c.

Pase el macerado a un tubo de centrfuga y lave varias veces el mortero

d.

Centrifugue en la escala 3 por 5 minutos

e.

Complete el volumen del sobrenadante hasta 25ml

f.

Tome una alcuota (10ml) y agregue 3 gotas de solucin de fenolftaleina

g.

Titule con NaOH 0.001 N hasta el cambio de color del indicador. El color final es ligeramente rosado

h.

Titule un volumen igual de agua destilada

Final del da (pm)

Peso
ml de NaOH 0.001N
Fresco (g)
Inicial
Final
Total

Final de la noche (am)

Peso
ml de NaOH 0.001N
fresco (g)
Inicial
Final
Total

C4 1

C4 1

C4 2

C4 2

C4 3

C4 3

CAM 1

CAM 1

CAM 2

CAM 2

CAM 3

CAM 3

Agua

Agua

Anatoma foliar
a.

Haga cortes transversales finos de hojas de las especies estudiadas

b.

Con la ayuda de un pincel fino monte los cortes en lminas portaobjetos

c.

Observe al microscopio y haga un dibujo esquemtico

39

40
PRESENTACION DE RESULTADOS
a.

Haga un grfico de pH vs. tiempo (t) para cada especie (C3 y C4) y tratamiento de radiacin lumnica
(50 y 250 mol m-2 s-1)

b.

Haga una tabla donde reporte la concentracin final de CO 2 (punto de compensacin de CO 2) para
cada especie (C3 y C4) y tratamiento de radiacin lumnica (50 y 250 mol m-2 s-1)

c.

Reporte en una tabla los valores diurnos y nocturnos de pH de la solucin fijadora, concentracin de
CO2 en el aire, y acidez titulable del tejido foliar para las plantas Kalanchoe sp (CAM) y maz (C4), y el
control

d.

Haga un dibujo esquemtico de las observaciones microscpicas sealando en cada dibujo: la vaina
vascular, las clulas del mesfilo, los cloroplastos, estomas, e indique el tipo de mecanismo de
fijacin de CO2 de cada una de las especies estudiadas

BIBLIOGRAFIA
Coombs J, D Hall (1982) Techniques in Bioproductivity & Photosynthesis. Pergamon Press. Great Britain
Hall D, K Rao (1981) Photosynthesis, Studies in Biology No. 37 Edward Arnold Publ. Ltd. Great Britain
Kluge M, J Ting (1978) Crassulacean acid metabolism. Ecological Studies Vol. 30. Springer- Verlag. Berlin
Lawlor DW (1997) Photosynthesis: metabolism, control and physiology. Longman Scientific & Technical.
Longman House. England
Medina E (1977) Introduccin a la Ecofisiologa Vegetal. Programa Regional de Desarrollo Cientfico y
Tecnolgico. O.E.A, Washington
Medina E (1984) Ecofisiologa de plantas CAM. CIET. (IVIC-UNESCO), Caracas
Medina E, T de Bifano, M Delgado (1976) Diferenciacin fotosinttica en plantas superiores. Interciencia 1
(2): 95-104
Pearcy RW, J Ehleringer, HA Mooney, PW Rundel (1989) Plant Physiological Ecology. Field Methods and
Instrumentation. Chapman & Hall, London
Schulze E-D, M Caldwell (1994) Ecophysiology of photosyntesis. Ecological Studies 100. Sringer-Verlag, Berlin
Ting I (1982) Plant Physiology. Addison-Wesley Pub. Co. U.S.A.

41
ANEXOS

Fundamentos tericos de la metodologa

El sistema que se emplear en esta prctica consiste de una fiola de 125ml con un tapn de goma al cual se le
colocar parafina en los bordes (cmara sellada). Dentro de la fiola y sostenido por el tapn cuelga un vial
"eppedorf" con agua, donde se coloca el tejido (Fig. 1). El agua en el vial es para evitar efectos de estrs hdrico en
el tejido transpirante y no deber cubrir la superficie de intercambio de CO 2 de dicho tejido.

Figura 1
Montaje para detectar la fijacin de CO2

El sistema de deteccin de los cambios de concentracin de CO 2 dentro de la cmara se har a travs 10ml de
solucin de NaHCO3 10-3 M con indicador de cambios de pH. Esta solucin tiene la propiedad de intercambiar CO 2 con
el aire a medida que la hoja asimila el CO 2 de la cmara hasta alcanzar un punto de equilibrio con ste donde las
salidas de CO2 de la solucin, igualan a las entradas por disolucin del CO 2 del aire (Punto de compensacin de CO 2
de la hoja). El pH de la solucin cambiara por efecto de la siguiente reaccin.

CO2
H2 CO3 H HCO3

Aire de la cmara
Solucin

En este sistema se cumplen las siguientes relaciones estequiomtricas. Por definicin la constante de equilibrio de
disociacin (K) para esta reaccin es:

H HCO 3
K1
H2CO3

(1)

42

Se sabe que slo menos de 1% del CO2 disuelto se transforma en H2CO3, luego puede escribirse:

K2

HCO 3
CO2

K2

CO2

HCO3

(2)

Como:

pH log10 H

y pK -log10 K 2

Sacando el log10 de la ecuacin (2) se obtiene:

log10 H log10

K 2 CO2
HCO3-

Re-arreglando,

pH pK 2 log10

CO2

HCO3-

pH pK 2 - log10 CO2 log10 HCO3

Despejando:

log10 CO2 pK 2 log10 HCO3

-pH

De esta ecuacin puede calcularse la concentracin de CO 2 en la solucin, tomando en cuenta que pK 2 = 6,37 para la
disociacin del cido carbnico y asumiendo que la variacin en HCO 3- de la solucin es despreciable y por lo tanto,
puede emplearse el valor calculado de 10-3 M (1). La concentracin de CO2 en el aire (C) puede calcularse de la
ecuacin:

22.4 x CO2
x 10 6

Donde: C es la concentracin de CO 2 en el aire (mol mol-1); 22,4 es el factor de conversin molar (gas ideal); [CO2]
es la concentracin molar de CO2 en la solucin; es la solubilidad del CO 2 (m3 de agua) a una temperatura
determinada

43

CLCULO DE LA CONCENTRACIN DE CO2 EN EL AIRE (C, mol CO2 mol-1)

22.4 x CO2
x 106 ( mol CO2 mol-1)

Donde: 22,4 es el factor de conversin molar (gas ideal), [CO2] es la concentracin molar de CO 2 en la
solucin; es la solubilidad del CO2 (m3 CO2 m-3 H2O) a una temperatura determinada.

La concentracin molar de CO 2 en la solucin ([CO2]) debe calcularse de la siguiente ecuacin (ver

fundamento terico de la metodologa):

log10 CO2 pK 2 log10 HCO3

- pH

Para la disociacin del cido carbnico, pK 2 = 6,37. Se asume que la variacin en HCO 3- de la solucin es
despreciable y por lo tanto, puede emplearse el valor calculado de 10-3 M

SOLUBILIDAD DEL CO2 EN EL AGUA A DIFERENTES TEMPERATURAS (, m3 CO2 m-3 H2O)

Temperatura (C)

(m3 CO2 m-3 H2O)

15
20
25
30
35

0.988
0.848
0.730
0.652
0.570

Para temperaturas intermedias, mayores de 40C y menores de 15oC utilizar la siguiente relacin:

0.02064 x Temperatura 1.2736

CLCULO DE LA ACIDEZ TITULABLE (Ac. titulable, eq gPF-1)

0.001 x 10 6 eq
x volumen de titulacin (ml)
1000ml
x 25ml (volumen total)
10ml (alcuota)
Ac. Titulable
( eq g-1)
Peso fresco de la muestra de tejido vegetal (g)

PRCTICA DE LABORATORIO 6
Reguladores del crecimiento vegetal: fitocromo y hormonas

44

El crecimiento y la diferenciacin de las plantas estn controlados internamente por hormonas. Por otra parte,
tanto la importancia de la calidad de luz en la foto-conversin del fitocromo, como el efecto del fitocromo en
la regulacin de aspectos del ciclo de vida de las plantas ha sido claramente demostrada. Las respuestas
fisiolgicas controladas por el fitocromo involucran la accin de genes no expresados antes de la estimulacin
por luz roja (sntesis y activacin de enzimas pre-existentes). Un incremento de las hormonas vegetales
estimuladoras del crecimiento (giberelinas y citocininas) ha sido detectado despus de la estimulacin con luz
roja. Por tanto, la interaccin con hormonas parece ser un vnculo entre los eventos primarios y secundarios de
la conversin del fitocromo.

OBJETIVOS
1.

Evaluar el papel del fitocromo y las hormonas vegetales en la germinacin de semillas

2.

Estudiar los efectos de calidad lumnica en la germinacin de semillas

3.

Evaluar el efecto de las sustancias reguladoras del crecimiento vegetal en la germinacin de semillas

TEMAS DE ESTUDIO PARA EL QUIZ

1.

Fenmeno "rojo-rojo lejano" en la germinacin de semillas fotosensibles

2.

Tiempo de escape

3.

Hormonas y germinacin

MATERIALES QUE DEBEN SER TRAIDOS POR EL ALUMNO

1.

Reloj: 4 por seccin

2.

Pincel fino: 1 por alumno

MATERIALES Y REACTIVOS A SER SUMINISTRADOS POR EL LABORATORIO

1.

Cpsulas Petri 9 cm

4.

cido giberlico (AG3)

2.

Papel filtro 9 cm

5.

Pipetas de 1, 5 y 10ml

3.

cido abscsico (ABA)

6.

Material vegetal: semillas de lechuga

fotosensibles

PROCEDIMIENTO

45
Fitocromo
a.

Prepare 12 cpsulas de Petri con papel filtro sin humedecer y coloque en cada cpsula 50 semillas de
lechuga

b.

Encienda la luz verde y evite cualquier otra fuente de luz (trabaje en cuarto oscuro)

c.

Humedezca cada cpsula con 3ml de agua destilada y deje embeber en completa oscuridad por 1 hora

d.

Separe las cpsulas en dos grupos de 7 y 5 y proceda a suministrar los tratamientos siguientes:

Efecto de la calidad lumnica sobre la germinacin

Cpsula de Petri No.

Tratamiento

Oscuridad

5 min. luz roja (R)

5 min. luz roja lejana (RL)

5 min. R + 5 min. RL

5 min. R + 5 min. RL + 5 min. R

5 min. R + 5 min. RL + 5 min. R + 5 min. RL

5 min. R + 5 min. RL + 5 min. R + 5 min. RL + 5 min. R

Cpsula

TRATAMIENTO

Oscuridad

5R

5RL

5R + 5RL

5R + 5RL + 5R

5R + 5RL + 5R + 5RL

5R + 5RL + 5R + 5RL + 5R

Total de
semillas

No.
germinadas

Determinacin del "tiempo de escape"

Cpsula de Petri No.

Tratamiento

5 min. R + 10 min. oscuridad + 5 min. RL

5 min. R + 30 min. oscuridad + 5 min. RL

10

5 min. R + 1 hora oscuridad + 5 min. RL

11

5 min. R + 2 horas oscuridad + 5 min. RL

No. NO
germinadas

46

12

Cpsula

5 min. R + 3 horas oscuridad + 5 min. RL

TRATAMIENTO

4 exp. anterior

5R + 0min oscuridad + 5RL

5R + 10min oscuridad + 5RL

5R + 30min oscuridad + 5RL

10

5R + 1h oscuridad + 5RL

11

5R + 2h oscuridad + 5RL

12

5R + 3h oscuridad + 5RL

Total de
semillas

No.
germinadas

No. NO
germinadas

Hormonas
a.

Prepare 6 cpsulas de Petri con papel de filtro sin humedecer y coloque en cada una de ellas 50
semillas de lechuga variedad Dandie

b.

Encienda la luz verde y evite cualquier otra fuente de luz en el cuarto oscuro

c.

Humedezca cada cpsula con aproximadamente 3ml de agua destilada y deje embeber en completa
oscuridad por 1 hora

d.

Encienda la luz verde y monte los siguientes tratamientos:

cido giberlico (50 g ml-1)

cido abscsico (50 g ml-1)

Cpsula de Petri No.

Tratamiento

Cpsula de Petri No.

Tratamiento

13

Oscuridad + AG3

16

Oscuridad + ABA

14

5 min. R + AG3

17

5 min. R + ABA 50

15

5 min. RL + AG3

18

5 min. RL + ABA 50

Nota: Use como controles los siguientes tratamientos de los experimentos anteriores:

Cpsula No.

Tratamiento

Oscuridad + H2O

5 min. R + H2O

5 min. RL + H2O

e.

Despus de cada tratamiento coloque las cpsulas en un sitio oscuro

f.

Cuente el nmero de semillas germinadas (determinadas por la protrusin de la raz) a las 48 h

47

Cpsula No.

TRATAMIENTO

13

oscuridad + AG3

14

5R + AG3

15

5RL + AG3

oscuridad + H2O *

5R + H2O *

5RL + H2O *

Cpsula No.

TRATAMIENTO

16

oscuridad + ABA

17

5R + ABA

18

5RL + ABA

oscuridad + H2O *

5R + H2O *

5RL + H2O *

Total de
semillas

No.
No. NO
germinadas germinadas

Total de
semillas

No.
No. NO
germinadas germinadas

* Utilice para los controles con agua los datos del experimento anterior (fitocromo)

PRESENTACION DE LOS RESULTADOS

a.

Elabore tablas en las que presente el porcentaje de germinacin en cada tratamiento

BIBLIOGRAFIA
Attridge TH (1990) Light and Plant Responses. Edward Arnold. London, New York, Melbourne
Bonner J, J Varner (1976) Plant Biochemistry. Academic Press, U.S.A.
Galston A, P Davies (1970) Control mechanisms in plant development. Prentice-Hall. Englewood Cliffs.
U.S.A.

48

Hill T (1977) Hormonas reguladoras del crecimiento vegetal. Cuadernos de biologa. Edic. Omega. Espaa
Kendrick R (1978) Phytochrome and plant growth. Studies in Biology No. 68. Edward Arnold Publ. Ltd. Great
Britain
Mayer A, A Poliakoff-Mayber (1975) The germination of seeds. Pergamon Press. U.S.A.
Wareing PF, IDO Phillips (1982) Growth and differentiation in plants. Pergamon Press. U.S.A.