Sunteți pe pagina 1din 32

Universitatea Stefan cel Mare Suceava

Facultatea de Inginerie Alimentara


Program de studii: Ingineria Produselor Alimentare

ndrumator:

Studeni:
Moldovanu Ramona

Prof.univ.dr.Leahu Ana

Pleca Mihaela
Strugariu Cristina

Metoda rapida HPLC pentru determinarea

resveratrolului de vin

Definitia data vinului de Oficiul International al Viei si Vinului este urmatoarea:


Bautura obtinuta pe calea fermentarii spirtoase integrale sau partiale a mustului de
struguri".

Prile
ale

componente% fa de greutatea % fa de greutatea


strugurilor

istrugurelui

boabelor

boabelor
Ciorchini

3-7

Pieli

93-97

9 -11

Miez

93-97

85-90

Semine

93-97

2-6

Principalele soiuri de vin cultivate


Soiurile nobile pentru vinuri albe: Feteasca regala, Feteasca alba, Riesling italian,
Aligot, Pinot gris, Muscat Ottonel, Tamaioasa romaneasca, Grasa de Cotnari, Chardonnay,
Sauvignon, Traminerroz.
Soiurile nobile pentru vinuri rosii: Merlot, Feteasca neagra, Babeasca neagra, Cabernet
Sauvignon, Pinot noir, Cadarca, Burgund mare, Busuioaca de Bohotin si alte soiuri.
Arealele viticole din Romania ncadrate n zonele viticole B, CI si CII si cuprind : 8
regiuni viticole
37 podgorii
171 centre viticole

Fig.1.Schema tehnologica de prodecere a vinurilor de calitate superioara

Drojdii
selecionate

Struguri roii

SO2

Recepie
ZdrobireDezbrobonire
Mustuial

Fermentarea pe botin
Vin Ravac
Terminarea fermentaiei

Botin

Presare

Vin de pres

Vin nou
Formare
Maturare
Pritocire
Cleire
Filtrare

Vin rou superior

Vin rou curent

Drojdie

Tescovin

Ciorchini

Fig2.Schema tehnologic de obinere a vinurilor roii

Componenii chimici principali ai strugurilor sunt:


Apa este componenta principal din punct de vedere cantitativ, a mustului, ocupnd n
medie 70-80% din masa sa.
Glucidele sunt reprezentate de glucoz i fructoz, care se acumuleaz n bob fiind
formate prin fotosintez.Cnd strugurii sunt copi n totalitate se acumuleaz o cantitate
maxim de glucide n bob, ce difer de la un soi la altul. n unele soiuri se gsesc i cantiti
mici de zaharoz i pentozani.
Acizii organici se gsesc liberi i sub form de sruri de Ca i K. Acidul tartric se
gsete in proporii de 0,02 ... 0,13 g % i sub forma de bitartrat de potasiu 0,4 ... 0,8%,
precum i tartrat de calciu. Acidul tartric e specific mustului i vinului i e prezent mai mult

n strugurii verzi avnd gust acru ierbos,. Pe msur ce coacerea se realizeaz acidul tartric
arde prin procesul de respiraie.
Substanele azotoase se gsesc n must sub form de albumoze, peptone, peptide,
aminoacizi, amide, sruri amoniacale i azotai. Aminoacizii, amidele i srurile amoniacale
sunt asimilate de drojdii la fermentarea mustului.
Substanele pectice se gsesc n cantiti mari n pieli i semine i au proprietatea
de a reine substane coloidale.
Pigmenii sunt localizai n pieli astfel:
roii : antociane
verzi : clorofil
galbeni : caroten i xantofil
galbeni-bruni : flavone
Substanele tanante sunt prezente n semine i ciorchini, acestea n contact cu mustul
n cazul n care au fost zdrobite n timpul presrii imprim un gust astringent.
Substanele de arom sunt localizate n pieli i n zona periferic a miezului i
pentru diferitele soiuri de struguri predomin grupuri diferite de substane aromate.
Vitaminele se gsesc n must 2-4 mg/l mrind valoarea dietetic i alimentar a
mustului i vinului.
Enzimele se gsesc mai mult n must, interesul fiind ndreptat spre enoxidaz, cea
care catalizeaz procesele de oxidare, n afar de aceasta se mai gsesc i invertaza,
glucosidaza i lipaze.
Substana radioactiv prezent n must i vin este potasiul, ns puterea radioactiv
este mic.
Bolile i defectele vinurilor
Boli ale vinurilor:
Floarea vinurilor
Oetire vinurilor
Borire vinurilor
Bloire vinurilor
Boala ntoarcerii vinurilor
Amreala vinurilor
Fermentaia malolactic

Defectele vinurilor
Casarea brun
Casarea feric neagr
Casarea cuproas
Gust i miros de hidrogen sulfurat
Gustul i mirosul de mucegai
Amreala vinului este provocat de Bacillus amaracrylus deteriornd proprietile
organoleptice, astfel c vinul devine amar, prezint un miros iritant de acizi volatili, capt o
culoare nchis, brun. Aceast boal intervine la vinuri roii nvechite n sticle i la vinuri
nematurate i nesulfitate la timp. Se poate preveni prin pitrociri regulate, prin sulfitare SO2
100mg/l i prin corijarea aciditii. Aceast boal se poate trata prin pasteurizare, filtrare,
cleire cu gelatin, prin corijarea taninului i prin cupajare la consum.
Gustul i mirosul de mucegai se ntlnesc la vinurile pstrate n vase mucegite. Pentru
ndeprtarea acestor defecte, vinurile se trateaz prin administrarea de bioxid de sulf n doze
de 40-50 mg/l de vin sau prin tratarea vinurilor cu fin de mutar alb, nedegradat sau cu ulei
de vaselin.
Control tehnic de calitate al vinului
Aspectul, limpezimea i culoarea vinului
Limpezimea este o condiie de baz a vinurilor finite evoluante. Aprecierea ei
trebuie s se fac att la lumin transparent, ct i n lumin reflectat, aeznd paharul cu
vin ntre ochii privitorului i sursa de lumin. n cazurile deosebit de importante limpezimea
se apreciaz n locuri ntunecoase, aeznd proba de vin n dreptul unei lmpi electrice. Pe un
fond ntunecat se pot observa cele mai mici defecte de limpezime.
Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizeaz o scar de
termeni.Conform acestei scri un vin poate fi : limpede cristalin, limpede cu luciu, foarte
limpede, suficent de limpede, puin limpede.
Mirosul vinului se examineaz n scopul aprecierii aromei sau buchetului, precum i
a prezenei unor mirosuri strine.
Prin aroma unui vin se nelege un complex de diferite mirosuri, din care unele
provin din struguri, i altele se formeaz n timpul fermentaiei. Se disting tipuri de arom :
arom primar, cu miros specific de fruct, ce provine din struguri i este caracteristica soiului;
arom secundar, aroma ce se suprapune peste cea primar ca efect al fementaiei alcoolice.
7

Aadar, aroma indic mirosul unui vin tnr. Buchetul este un amestec de arome
complexe caracteristice vinului maturizat n butoaie i nvechit n sticl.
Resveratrolul, antioxidantul din vinul rosu
Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un medicament bun
pentru organism in general si pentru aparatul cardiovascular in special. Cercetatorii au
incercat sa verifice aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit resveratrol despre
care se crede ca este responsabil de efectele benefice ale vinului rosu.
Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja strugurilor negrii si un
ingredient al multor produse naturiste destinate tratarii unor boli de sange, inima sau ficat.
Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani, drept o posibila
explicatie a incidentei scazute a bolilor cardiovasculare in randul francezilor, care au diete
relativ bogate in grasimi, dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin.
Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori un puternic agent
antioxidant, anticancerigen si un fitoestrogen
Importana resveratrolului deriv din trei domenii de interes
oenologic este un nou compus fenolic, provenit din struguri, care participa la
culoare, la caracterul gustativ, la invechirea vinului, intervine in reactiile de oxidare,
interactioneaza cu proteinele, etc.
fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea
apararii naturale a plantei;
farmacologic face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de
radicali liberi in organism; protector impotriva bolilor cardiovasculare; proprietati
chimiopreventive impotriva cancerului; previne inflamatiile asociate cu artrita si
reumatismul; creste cantitatea de colesterol bun(HDL) si scade pe cel rau(LDL).
Resveratrolul (trans3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta
vitei de vie la putregaiul cenusiu i este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor
UV. Sinteza resveratrolului a fost localizata in pielita bobului, ceea ce indica ca rezistenta
principala a strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R,-1998) Ciclul
infectiei i dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2

Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta, in stare
latenta, o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea
strugurilor.

Fig. 3. Ciclul infectiei i dezvoltarii Botrytis cinereea

10

Fenomenul de latenta, timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa, nu a fost


explicata. Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi: umiditatea, temperatura,
tesuturile moarte, leziunile plantelor, lumina, etc.
Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir. Ipoteza
acumularii rapide a compusilor antifungici resveratrol, resveratrol trans- de- hidrodimer i
- viniferina in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinereea, a fost pusa pe seama latentei
acesteia.
Biosinteza stilbenilor, flavonoizilor i taninurilor, decurge din metabolismul secundar al
aminoacizilor metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric.
Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina, un aminoacid
aflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintaza
sufera o deviere cu formare de resveratrol (fig.4)

Fig.4. Ciclul de sintez al resveratrolului

11

Sursele de resveratrol
Resveratrolul se gaseste in struguri, vin, must de struguri, fructe afine din specia
(Vaccinum), mure, si merisorul (cranberrie)
Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea geografica si expunerea
la infectii de fungi. Un important factor in continutul de resveratrol consta in timpul de
fermentare:
Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol
Vinul rosu contine mai mult resveratrol
Desi este prezent si in plante precum eucaliptul, molid, sau alimente ca dudele si
alunele, cea mai abundenta sursa naturala de resveratrol o reprezinta strugurii, in special
soiurile destinate obtinerii vinului. Substanta se gaseste in radacini, ramuri, seminte, dar mai
ales in coaja boabelor care contine 50 100 micrograme la gram.
Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte antibiotice, componente a
sistemului de aparare a plantei impotriva unor boli, in special a unor infectii fungice. Pentru
ca acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci, strugurii din aceste regiuni au un continut
mai ridicat de resveratrol.
Proprietati
Puncte de topire: 265-266 grade Celsius
Solubilitate in apa: mai mare de 100g/ml la 25 grade Celsius
Formula chimica C14H12O3
Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis
Solubilitate in etanol: 50g/l
Masa molara: 228,25
Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc
Scade nivelul colesterolului total din sange
Combate osteoporoza
Administrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce prelungeste viata
cu 70-80%.
Resveratrol face parte din clasa de: Polifenoli,
Subclasa Stilbene (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)
Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoA
12

Recunoscut ca antioxidant care raspunde la: Stres, infectii de fungi, si radiatii


ultraviolete (UV)
Resveratrol este solubil in grasimi, compusii apar in configuratia trans si cis
Resveratrol
Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum cuspidatum
Sieb. et Zucc. contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol
Resveratrol este o fitoalexina:
O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectiei.
De examplu: Raspunde la invadarea fungiilor, Infectiile cu fungi apar mai mult in zona
cu climat rece, strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de
Resveratrol. S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ mica in
Franta, deosebit la un nivel-relativ inalt, datorita fumatului si consumului de acizi grasi
saturati.
Aceasta a adus idea, consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovasculare.
Acesti polifenoli contin antioxidanti, anti-inflamatori, si alti potentiali cu efect antiaterogenic.
Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 2030%, polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte
incidente, promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimer,efect la
osteoartrita,inhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A.
Reversia fenotipului malign cu flavonoizi: Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu, Acid
Elagic, EGCG - Galatul de epigalocatechina, Quercitina, Extract din Samburi de
Struguri,Isoflavone din Pueraria, I-P6 Inozitol Hexafosfat.
Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor ,N-Acetilcisteina, Vitamina C,
Vitamina D3Graviola, Indol-3-Carbinol, Diindolylmethane,Echilibru Hormonal, AnticancerOncoxin.
Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului
malign prin inhibarea celulelor de cancer .
Remisia completa de celule de cancer cu: Germaniu Organic (Ge 132).

Efectele cardiovasculare:

13

Numeroase studii au demonstrat ca vinul, in special vinul rosu, poate reduce incidenta
bolii coronariene. Fiind un puternic antioxidant, resveratrolul inhiba peroxidarea lipidelor cu
densitate joasa (LDL), previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza celulele.
Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E
datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile. Pe de alta parte, resveratrolul este mai putin
efiecient decat quercitina sau epicatechina, ce se gasesc de asemenea in vinul rosu. Datorita
faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne ateroscleroza si protejeaza
aparatul cardiovascular.
Efectele anticancerigene:
Resveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor
canceroase. Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce
denatureaza proteinele celulare. In plus, oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte anti
mutagene ale resveratrolului.
Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostatica:
Resveratrol cu eficacitate citostatica: Mecanismul molecular
Ca agent citostatic la cancerul de plamin
Inhiba tumorogeneza intestinala,
In cresterea celulara de cancer bucal,
Reduce inflamatia indusa de colita
In studiu pe animale, s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar, esofag si
cancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrol
La predispozitia genetica de cancer de colon, efectul prin administrarea orala s-a
mixat

14

15

Efectele administrarii resveratrolului asupra corpului sobolanilor


Concentraiile de resveratrol(ptrate, linia punctat) i DMU212(rombi, linia dreapta)
n plasm i esuturi de oarecii care au primit o singur doz de droguri (240 mg/kg-1)
Valorile difer semnificativ (p <0,05,).

16

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A COMPUSILOR DIN


UNELE VINURI ROMANESTI

17

Cateva sute de compusi chimici diferiti: alcooli superiori, aldehide, etili esteri ai acizilor
grasi, cetone, monoterpene, fenoli volatili etc au fost identificati in vinuri. Acesti compusi au
diferite proprietti fizice si chimice, cum sunt polaritatea si volatilitatea, si au domenii de
concentratii de la cateva mg/l pana la mai mult de 100 mg/l.
Consideratii generale
Componentii din vin provin pe mai multe cai:
- componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric, acid malic, acid citric,
substante minerale, anioni si cationi sub forma de acizi minerali, saruri),
- componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor procese fermentative
(alcooli, acid lactic si acid succinic),
- componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare nascanda sau a celor
existente (esteri, acetali, polifenoli)

HPLC

HPLC metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii


substantelor organice si anorganice aflate in solutie
ANALIZE:
farmaceutice
clinice
toxicologice
de mediu
industriale
alimentare
Calitativ: separarea, determinarea componentilor pe baza timpului de retentie;
Cantitativ: curba de etalonare - pe domeniul de valabilitate al legii Lambert Beer

(variatie liniara a raspunsului DAD cu concentratia)

18

19

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare


Cromatografia de adsorbtie :
- faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice
- principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie
- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa
- Interactiuni polare (dipol-dipol) faza normala
Cromatografia de schimb ionic :
- suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului
- specifica analitilor ionici/ionizabili
- Interactiuni ionice
SEC (GPC) :
- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate
- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat
Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

20

Cromatografie cu faza normala


- faza stationara puternic polara (silicagel)
- faza mobila nepolara
Cromatografie cu faza inversa
- faza stationara nepolara, lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice
- faza mobila polara (faza organica - CH3OH, CH3CN, THF si/sau apa, cu/fara sol.
tampon)

Octadecilsilice (ODS, C18)


10%

Octil (C8)

5%

Butil (C4)

3%

Fenil

2%

Ciano (CN)

Elutie
izocratica

in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica


Coloana: dimensiuni (L,d), T
Faza stationara: natura, diametrul particulelor
Faza mobila: tipul de elutie, debitul, solventii
Analitul: polaritate, masa moleculara, concentratie

21

Dimensiunea Timpul de Presiunea


particulelor

retentie

(bar)

(m)
5
3
1,5

(min)
30
18
9

19
87
700

Separarea unor compusi aromatici folosind o coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm, 60%
MeOH in Apa:
Benzamida, alcool benzilic, acetofenona, benzoat de metil, fenetol, naftalina,
benzofenona, bifenil
Faza mobila
compatibila cu elementele instrumentului si cu faza stationara puritate avansata
compresibilitate si vascozitate scazute lipsita de gaze dizolvate (aer) rezultatul UV si
probleme de compresibilitate

Elutie in gradient

Elutie izocr

(1)-Benzen,(2)-Monoclorbenzen,(3) Ortodiclorobenzen, (4)-1,2,3 triclorobenzen,(5)-1,3,5triclorobenzen, (6)-1,2

22

Exemplu de cromatograma
Detectorul cromatografic ideal
Raspuns independent de compoziia fazei mobile, debit, temperatura
Sensibilitate panta curbei de calibrare mare sensibilitate mare
Selectivitatea
Raspuns rapid
Zgomot de fond scazut
Non-destructiv pentru proba
Domeniu dinamic liniar mare
Stabilitate ntr-un timp ndelungat de operare

IR
Universal
4

Raspuns
Sensibilitate
Sensibilitate la debit
Sensibilitate

UV/VIS
Selectiv
5

Fluorescenta SM
Selectiv
Selectiv
3 picograme 1 picogram

micrograme nanograme
DA
NU
NU
la DA
NU
NU

NU
NU

temperatura
Cel mai folosit tip de detector cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLETVIZIBIL. Un astfel de detector, capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe
un domeniu larg 190-800nm, potrivit pentru majoritatea compusilor.

23

24

MATERIAL I METOD
Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului
Metoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi;
Metode de determinare :
Cromatografie pe strat subtire si HPLC;
Extracia din struguri se face prin refluxarea pielitelor cu metanol, evaporarea sub vid a
fazei lichide, reluare cu apa si extractie cu acetat de etil dupa schema:

25

26

Extracia din vin


Vinul este evaporat la din cantitate in evaporator sub vid, pentru indepartaea
alcoolului. Din vinul dezalcoolizat, compusii fenolici se extrag cu acetat de etil, dupa care se
analizeaza dupa schema prezentata mai sus. urmator:
Metoda de separare prin HPLC
Extractele obinute din prelucrarea probelor de struguri i vin au fost injectate n
coloan de trei ori.
Conditii de lucru :
Coloana - C18 250 mm x 4,6 mm ;debit 1 ml/minut
Elutie: Sistem gradient = 2 solventi : A apa

27

B - apa acetonitril

H2O / CH3 CN 2:8 (v/v)

Volumul injectat : 20l


Metoda de separare a compuilor fenolici prin HPLC are urmtoarele avantaje:
- este o metod rapid pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ a
compuilor aflai n amestecuri complexe;
- d posibilitatea separrii substanelor aflate n concentraii foarte mici n amestecurile
de analizat;
- este o metod simpl i uoar pentru interpretarea rezultatelor obinute;
Concluzii
Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor i
posibilitatea de diferentiere a acestora
Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa i cantitativa a
resveratrolului din struguri, must i vin dar i din alte produse alimentare.
HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice: fenoli,
polifenoli
Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului i in general a
compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie i reproductibilitate
inalta.
Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantitti mari de alcooli superiori,
etili esteri, acetati, acizi grasi si compusi carbonilici.
Continutul de resveratrol in vin (mg/l)
Alb

0,05-1,80

Rose

0,43-3,52

Rosu

1,92-12,59

Must de struguri 1,14-8,69

28

29

30

Exemplu
CROMATOGRAMA Resveratrolului de vin la timpul de retentie respectiv

31

Bibliografie
http://www.milestii-mici.md/rom/section/12
http://www.bloombiz.ro
http://www.jurnalul.ro
http://ro.wikipedia.org/wiki/Pinot_Noir
http://www.pietroasa.ro
http://www.didactic.ro/files/5/drum.ppt#23
http://www.vinmoldova.md/rom/section/517/
http://predimed.onmedic.net/Portals/0/2006%2023.pdf
www.clinchem.org/cgi/content/full/53/2/292
www.dmpkd.com/doc/2007paper01.pdf
http://www.univagro-iasi.ro/Horti/Lucr_St_2005/63_heroiu%20g.pdf
www.dbioro.eu/att_view.php?id=70
http://2008.igem.org/Team:Rice_University/RESULTS

32