Université Abou Bekr Belkaïd Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane
& F.Lahfa

Isolement des lipoprotéines sériques

1-isolement des lipoprotéines sérique :

A défaut d’ultracentrifugation qui est la méthode de référence, nous pouvons isoler les fractions lipoprotéiques, par des
méthodes de précipitation sélective. Ces méthodes permettent néanmoins d’isoler à l’état pur les lipoprotéines sériques.

 Réactif :
Sérum humain (animal), clair ou lactescent, séparé après rétraction spontanée du caillot ou centrifugation à 4000/tmin pendant
5min. le sérum est recueilli sur tube à hémolyse après sacrifice de l’animal (rat ou souris) par décapitation.
Solution de phosphotungstate de soude à 4% ; PH 7,5-7,6. A 4g d’acide phosphotungstique (P2O5 24WO3+X H2O; P.M
anhydre 5708) ; on ajoute environ 15 cm³d’une solution de soude normale et l’on complète à 100cm3 avec de l’eau distillée ;
ajuster le PH.
Solution de Mg Cl2 2M ; 40,6g de Cl2 Mg 6 H2O dans l’eau distillée ; volume 100 cm³.
L’acide phosphotungstique est un hétéropolyacide inorganique qui possède, comme les polysaccharides sulfatés, des groupes
polaire à forte charge électronégative, et exerce une activité de type héparinique.

2-mode opératoire :

En présence de Mg Cl2 0.1M, le phosphotungstate, à la concentration de 2‰ environs (2 cm³ de sérum+ 0.1cm³ d’une
solution de Mg Cl2 2M), flocule instantanément les B lipoprotéines qui se déposent au fond après centrifugation (10min,
6000t/min). Le surnageant clair (PH 7.6 environ) est dépourvu de
B- lipoprotéines.
Pour séparer les lipoprotéines, il est nécessaire de centrifuger dans les minutes qui suivent l’adjonction de phosphotungstate ;
en cas de centrifugation plus tardive le précipité ne se dépose pas.
En présence de Mg Cl2 0.1M, le phosphotungstate, à la concentration de 0.05% (0.1ml de sérum+5µl de MgCl2 2M+ 1.2µl
de phosphotungstate 4%) (Tableau). Après centrifugation (10min, 6000t/min), le sous-nageant parfaitement clair renferme les
et B lipoprotéines. Les VLDL floculent à la surface du tube. En cas de sérum lipémique, les chylomicrons floculent également.

Tableau récapitulatif

Réactif Chylomicrons+VLDL LDL HDL

Phosphotungstate 4% 0.05% 0.2% 2%
MgCl2 2M 0.1M 0.1M 0.2M

Le précipité séparé à séparé à partir d’un volume donné du sérum se dissout dans 1/10 de NaCl à 4% de ce même
volume (1/20 d’oxalate de sodium 0,1M ; citrate de sodium 0.2M).

Electrophorèse sur acétate de cellulose

1-Principe :

L’électrophorèse est une méthode d’analyse (identification et dosage) et de fractionnement, basée par la migration
différentielle de particules, chargées électriquement sous l’influence d’un champs électrique. Les particules chargées peuvent
être des macro ions ou macromolécules (protéines, lipoprotéines etc.…), qui peuvent être séparées par différence de vitesse de
transport.
 2-Accessoires nécessaires :

Alimentation : chambre d’électrophorèse, kit applicateur, micropipette, bacs de coloration et portoir

Réactif et consommables :

-plaques d’acétate de cellulose.

-solution tampon Véronal-Véronal sodique (PH 8.4) et force ionique I=0.05 mol/l.
-colorant lipidique O.R.O (oil-Red O). Dissoudre 7mg de colorant (ORO) dans 50cm3 de méthanol
(Solution A)
-solution B : environ 5min avant la fin de la migration, 35 cm³ de la solution A, on ajoute 10 cm³de NaOH 1N.
-papiers buvards.
-ponts papier.

3-technique :

Les bandes acétate sont imprégnées de tampon par flottation, puis immersion pendant environ 20mn.
La cuve est remplie en ajustant le tampon au même niveau dans les deux compartiments.
Le dépôt est fait du coté cathodique. On dépose 2µl de l’échantillon sur une bande de 25mm de large, à l’aide d’un applicateur
constitué de deux fils métalliques. A défaut on utilise une technique plus ancienne, à l’aide d’une micropipette par un
mouvement de va et vient ou par une lame de microscope.
Migration pendant 20min à 180V.

Révélation :
Après la migration la bande acétate est imprégnée pendant environ 35 à 40 min dans la solution B (colorant lipidique).

Remarque :

Organiser votre TP de façon à synchroniser les différentes manipulations. Donc, au moment de la migration des fractions
lipoprotéiques, préparer le dosage des protéines sériques .la lecture au colorimètre peut être effectuée au moment de la
révélation des lipoprotéines au colorant O.R.O.

Dosage quantitatif Méthodes spectrophotometriques

Dosage des protéines par la méthode de biuret

*Partie théorique :

Les méthodes spectrophotometriques du dosage des substances se basent sur la loi de Beer-Lambert. Selon laquelle la
concentration de la solution d’une substance colorée est proportionnelle à sa densité optique.
La densité optique c’est la capacité d’une solution d’absorber la lumière d’onde déterminée qui passe à travers elle.
La loi de Beer-Lambert s’exprime sous forme intégrée par la relation :
E=log Io/I=ε.C.L
Où I0 est l’intensité de la lumière incidente, I l’intensité de la lumière transmise, ε le coefficient d’absorption molaire (en litre
par mole-centimetre), C-la concentration molaire du soluté absorbant, et L-la longueur du trajet option dans la solution (on la
fixe arbitrairement à 1 cm).l’expression log est appelée absorbance ou extinction ou densité optique(E).
Toutes choses égales par ailleurs en a dons une relation linéaire entre la concentration, du chromophore et de la densité optique
lue sur le spectrophotomètre ou colorimètre, pour réaliser en pratique un dosage quantitatif spectrophométrique d’un
chromophore il suffit de tracer la courbe de la densité optique en fonction de la concentration (E=f(C)) en effectuant plusieurs
mesures de E au spectrophotomètres avec des solutions du chromophore à différentes concentrations connues.
Chaque lecture comprend un ajustage au zéro en densité optique sur un tube témoin, puis une mesure sur le tube de dosage
.l’ajustage du zéro a pour but d’éliminer l’absorption aux composants qui accompagnent le chromophore dans la solution
étudiée.
Les protéines dans leur majorité ne sont pas colorées c’est pourquoi leurs solutions n’absorbent pas dans le spectre visible .les
protéine ont un maximum d’absorption à 280 nm du a l’absorption des acides aminés possédant des noyaux aromatiques :
Tyrosine, tryptophane et phénylalanine. La mesure de l’absorption de la lumière à 280 nm au spectrophotomètre est un moyen
extrêmement rapide de mesure de la concentration protéique d’une solution .Parceque l’absorption à 280 nm dépend
uniquement de la teneur des acides aminés aromatiques il faut l’employer avec précaution.
En réagissant avec Cu² en milieu basique les protéines donnent un complexe coloré, (violet).
Au moyen de cette réaction (réaction du biuret) on établit une procédure de dosage spectrophotométrique des protéines.
Dans cette partie on va déterminer la concentration des protéines dans le sérum sanguin en employant la méthode du biuret.

On dispose.

 D’ne solution du biuret :on dissout 1.5g de CU,5 H2Oet 6.0g de sel de seignette dans 500 ml de H2O .on ajoutant
300 ml de solution de soude à 10% et 2g de KI en suite on ajoute H2O pour obtenir un volume final de 2 litres.
 Solution-mére d’albumine-10mg/ml
 Solution protéique à la concentration inconnue
 15 tubes, 2pipettes à 2 ml, 2 pipettes à 10ml
Établissement de la courbe d’étalonnage. On prépare d’abord une gamme de solution étalons de concentration à 2 mg/ml,
4mg/ml, 6mg/ml, 8 et 10 mg/ml à partir de la solution mère d’albumine.
Pour chaque dilution la réaction de formation de complexe coloré du biuret sera conduite de la manière suivante : dans trois
tubes à essai mélanger 2ml de la solution protéique étudiée et 8ml de solution du biuret. Bien agiter, laisser les tubes pendant
30min à la T° ambiante. Faire ensuite les mesures de densité optique au spectrophotomètre à 540nm contre un tube témoin, qui
contient au lieu de la solution protéique un volume équivalent d’eau.
Détermination de la concentration des sérums sanguins.
Appliquer la même procédure de manipulation que pour les solutions de concentrations connues, lire la densité optique et
déterminée la concentration de protéines en utilisant la courbe d’étalonnage.
Trouver le pourcentage des protéines dans le sérum sanguin.