Université Abou Bekr Belkaïd Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

Travaux Pratiques:
Séparation des lipides par chromatographie sur couche mince

Principe:
Les lipides sont présents dans les composés biologiques sous la forme d'un mélange complexe. Tout d'abord,
plusieurs frations sont obtenues par extraction dans des solvants organiques. la séparation des constituants de
chaque fraction peut être réalisée par chromatographie sur couche mince. le solvant est choisi en fonction des
lipides à séparer et, généralement, les lipides neutres sont séparés par des solvants apolaires et les lipides chargés
sont séparés par des solvants polaires. De nombreux supports chromatographiques existent pour la séparation des
lipides. Leur choix dépond du type de lipide étudié et du solvant utilisé. Le gel de silice a été largement employé et
la séparation à l'aide de ce support est fondée autant sur l'adsorption que sur le partage.
Dans les expériences suivantes, les lipides sont séparés en différents groupes, en fonction de leur polarité, et des
exemples pris dans chacun des groupes sont utilisés comme témoins. Des huiles et des graisses naturelles sont
étudiées pour détecter la présence de la classe de lipides considérés.

Matériel:

1. Plaques de couche mince de gel de silice.

2. Cuves de séparation.
3. Système-solvant:

* Ether de pétrole,p.e. 60-70 °c /diéthyléther/acide acétique glacial ;80:20:1.

* Chloroforme/methanol/eau ; 60:30:4.
* Ether de pétrole/éther éthylique/acide acétique ;90:10:1.
4. Hydrocarbures(n-hexadecane et n-octadecane).
5. Esters de cholestérol( acétate de cholestérol, oléate de cholestérol, stéarate de cholestérol).
6. Esters de vitamine A( plmitate de vitamine A).
7. Triacylglycérol.
8. Acides gras libres.
9. Stérols( cholestérol).
10.Huiles naturelles( huile d'olive et huile de foie de morue).
11.2',7' Dichlorofluorescéïne( 2g/l d'éthanol à 95% v/v).
12.Acide sulfurique(50% v/v).
13.Etuves à 110°c.
14.Lampes à rayons ultraviolets.

Méthode:

Nettoyer les plaques de verre avec de l'éthanol, puis étaler le gel de silice à leur surface sous la forme d'une couche
d'une épaisseur de 250µm. Activer les plaques par chauffage à 110 °c pendant une heure et les refroidir. Déposer 20
à 50 µl d'une solution d'environ 1 % p/v de chaque lipide solubilisé dans le solvant et développer la
chromatographie.
Localiser les lipides par pulvérisation de la plaque avec la solution de dichlorofluorescéïne, puis observer sous
lumière ultraviolette (270 nm). Les lipides sont visibles sous la forme de taches vertes fluorescentes sur fond
sombre. De même, les taches peuvent être visualisées par pulvérisation d'acide sulfurique à 50% v/v(ou mélange
d'acide sulfurique et l'anhydride acétique) et chauffage à 110 °c pendant 10 minutes. De même les taches peuvent
être localisées par l'iode( lipide neutre). Le mélange de ninhydrine et le molybdene peut être utilisé pour visualiser
les lipides comportant les fonctions amine.
Dans quel ordre les lipides sont-ils séparés et pourquoi ?