Université Abou Bekr Belkaïd Tlemcen

Enseignants : F.Lahfa
& A.Bedrane Fractionnement cellulaire

 Prévoir des feuilles fraîches d’épinards et de la gaze.

 Il est demandé à chaque étudient de lire attentivement le polycopie et de traduire le protocole expérimental sous forme
d’un schéma général.
 Coordonner les différentes étapes du TP entre les binômes, de façon à synchroniser les centrifugations.

Important : Equilibrer les tubes 2à 2 entre les différents binômes.

Toutes les manipulations doivent être réalisées dans la glace 0°c.

 50g de feuilles d’épinards sont lavées à l’eau courante puis à l’eau distillée.
 Sécher les feuilles, les débarrasser des grosses nervures, puis les couper en petits morceaux.
 Placer le matériel biologique dans un mixer et jouter 150ml de milieu d’extraction froid.
 Broyer à faible vitesse pendant quelques secondes à un intervalle court pour éviter d’altérer les structures cellulaires.
 Verser l’homogénat cellulaire sur l’épaisseur de gaze. Recueillir le filtrat sur un nombre pair de tubes.
 Centrifuger 10mn à 5000t/min et à +4°c. Au terme de cette centrifugation, nous dénommerons le surnageant « S » et
le culot « C ».

1-Chloroplastes :

1- isolement :

 reprendre le culot « C » par 1à 2 ml de milieu de lavage (pour chaque tube).

 regrouper les différents culots « repris » et centrifuger à nouveau 10min à 5000t/min et à +4°c.
Au terme de cette centrifugation, nous obtenons surnageant « S1 » et un culot « C1 »
 chaque culot est repris par 1ml de milieu de lavage.
 réaliser une observation au microscope optique (G×100+huile à immersion) avec C1 et S1. Comparer.

2- purification des chloroplastes :

Afin d’éliminer les contaminations éventuels, les chloroplastes sont purifier sur gradient discontinu de saccharose.

a- préparation du gradient :

 les solutions de saccharose à 0.75 M, 1.5M et 3M vous sont fournies prêtes à l’emploi.
 Déposer soigneusement à l’aide d’une pipette pasteur et contre la paroi du tube 3ml de solution de saccharose à 3M,
1.5M puis 0.75M.

Remarque :

Eviter toute manipulation brûlante qui risquerait de perturber le gradient.

b - purification proprement dite :

 déposer 1.5ml de la préparation de chloroplastes au sommet du gradient. Observer.

 Centrifuger 20mn à 5000t/min et à 4°c. Observer.
 Prélever délicatement à l’aide d’une pipette pasteur, la phase susceptible de contenir les chloroplastes.

Remarque :
 ne pas perturber le gradient car il servira ultérieurement.
 Observer au microscope photonique (G×100 +l’huile à immersion).
 Conclure

2-noyaux et mitochondries :

En raison de leur petite taille, ces organites ne peuvent être observé distinctement au microscope photonique. Au cour de ce
TP, vous aurez à les localiser dans les différentes fractions obtenues, grâce à des colorants spécifiques que sont :
-le vert de Janus à 1% en solution aqueuse pour la mise en évidence des mitochondries.
-la fuschine basique pour la mise en évidence des noyaux.
1-observer au microscope photonique (G×100+huile à immersion) la fraction 3M et la fraction S après addition de chacun des
colorants spécifiques (1goutte) sur des lames distinctes.

2- redistribuer les surnageants « S » sur un nombre pair de tubes.

 centrifuger à nouveau 10min à 5000t/min (+4°c) vous obtenez un surnageant « S2 » et un culot « C2 »
 reprendre le culot « C2 » par1ml de milieu de lavage
 fractionner en 2 volumes identiques, à savoir :
* 0.5ml+1à2 gouttes de vert de Janus (fraction M)
*0.5ml+1à2 gouttes de fuschine basique (fraction N), Que vous déposez respectivement sur 2 tubes (M et N) ayant
préalablement reçu 3ml d’une solution de saccharose à 2.2M.
 centrifuger 20min à 5000t/min (+4°c)

Remarque :

Organiser votre TP de façon à synchroniser cette centrifugation (20min à 5000t/min) avec celle de la
purification des chloroplastes.
 observer à l’œil nu les tubes M et N au terme de la centrifugation
 prélever délicatement à l’aide d’une pipette pasteur, la zone où la coloration est la plus intense.
 observer au microscope photonique (G×45 et G×100 +huile à immersion). Conclure.

N.B :
 regrouper les fractions chloroplastes purifiés par les différents binômes, qui serviront lors d’un TP ultérieur.
 Il vous est demandé, d’inclure dans votre compte rendu de TP un schéma général récapitulatif des différentes étapes.