UNIVERSIDAD CENTRAL DELECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
QUIMICA DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGIAINDUSTRIAL

TEMA:
INFORME

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS

LEVADURIFORMES DEGRADADORAS DEL BAGAZO DE
CAÑA DE AZÚCAR

Integrantes:

Arboleda Marcelo
Cóndor Belén
Cueva Nathaly
Góngora Estefanía

Curso:
9º ALIMENTOS
 INDICE

1 TEMA:............................................................................................................... 3

2 INTRODUCCIÓN................................................................................................3

3 MARCO TEORICO..............................................................................................4

3.1 Bagazo de caña de azúcar.........................................................................4

3.1.1 Propiedades físicas y químicas del bagazo .........................................4

3.1.2 Componentes principales de la materia prima....................................5

3.2 Empleo de substrato orgánico por los microorganismos............................7

3.3 Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradación . . .8

3.3.1 Levaduras degradadotas de lignina .................................................8

4 MARCO METODOLOGICO..................................................................................9

4.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS..........................................................9

Muestreo......................................................................................................9

Preparación de la muestra...........................................................................9

4.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS.........................................................9

4.2.1 Diseño del medio de cultivo ................................................................9

AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA....................10

PURIFICACION............................................................................................10

IDENTIFICACION.........................................................................................10

SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES.....................10

4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluación de la capacidad degradadora

de lignina.................................................................................................11

PRESERVACIÓN..........................................................................................11

5 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................11

6 ANEXOS..........................................................................................................14

6.1 Composición de medios de cultivo...........................................................14

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1 TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS LEVADURIFORMES

DEGRADADORES DEL BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

2 INTRODUCCIÓN

El bagazo de caña de azúcar es un material lignocelulósico constituido principalmente por celulosa,

hemicelulosa ligadas fuertemente a la lignina. Tradicionalmente en los centrales azucareros este
desecho se quema como una forma de limitar la disposición final de este desecho, desperdiciando
un elemento de tan valiosa importancia para diversas industrias como la fabricación de papel,
producción de alimentos balanceados para animales y elaboración de aglomerados para la
construcción, industrias donde se usa actualmente el bagazo de caña, pero no en todo su
potencial.

Se obtiene como subproducto o residuo en los centrales azucareros después de la extracción del
jugo de caña de azúcar y representa aproximadamente entre el 25 y 40 % del total de la materia
procesada, dependiendo del contenido de fibra de la caña y la eficiencia en la extracción del jugo.
En el Ecuador existen cultivadas 79.913 Has. de caña de azúcar, y una producción bruta de 5 618
045 TM, con un rendimiento promedio de 70,30 TM/ha. El bagazo uno de los residuos agrícolas
más abundantes con una producción anual estimada de 158 000 toneladas, obtenidas de los 6
ingenios azucareros existentes en el Ecuador y de otros productores pequeños.

El bagazo de caña tiene en su composición 20% de lignina, y 80% entre celulosa y hemicelulosa,
por lo que varias investigaciones han propuesto el uso de diversos microorganismos, cepas
fúngicas degradadoras de lignina, un ejemplo de estos hongos es Phanerochaete chrysosporium,
que crece en cultivo liquido y se ha demostrado que secreta enzimas ligninoliticas extracelulares
que tienen la habilidad de degradar numerosos compuestos aromáticos policiclicos; la
Ceriporiopsis subvermispora es otro hongo filamentoso capaz de realizar la biodegradación de la
lignina. Un ejemplo más es Panus tigrinus, microorganismo que ha sido estudiado debido a su
capacidad de producir lacasas y peroxidasas que atacan a la lignina, Pleurotus ostreatus,
Trametes versicolor, Trametes subectypus, Cariolopsis gallica y heterobasidion annosum, son
algunos de los microorganismos estudiados debidos a su capacidad ligninocelulitica.

Por lo que este proyecto va orientado al aprovechamiento de los residuos de la extracción del jugo
de la caña de azúcar, al degradar la lignina en celulosa y hemicelulosa mediante organismos
levaduriformes degradadores de este compuesto.

Los objetivos del proyecto fueron:

• Aislar levaduras con capacidad de degradar lignina a partir del bagazo de caña de azúcar..
• Seleccionar las mejores cepas, de acuerdo a las condiciones de pH, temperatura y otras
en las que ellas van a degradar el bagazo de caña.
• Identificar macro y microscópicamente las levaduras seleccionadas, y adaptarlas a un
medio estable.
• Evaluar la capacidad de degradación de lignina de las levaduras aisladas del bagazo de
caña.
• Preservar las levaduras seleccionadas mediante críocongelación.

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3 MARCO TEORICO

3.1 Bagazo de caña de azúcar

La caña de azúcar crece en climas tropicales y subtropicales. El bagazo es el residuo fibroso que
queda de la caña después de ser exprimida y de pasar por el proceso de extracción. Por lo general
el bagazo se utiliza en los ingenios azucareros como combustible, sin embargo para la industria
papelera representa una de las materias primas más importantes.

El bagazo, subproducto de la industria azucarera, conserva una posición única entre las fibras no
leñosas consiste en que el costo de su recolección, la extracción de jugo y su limpieza, son cargo
del ingenio azucarero.

La temporada de procesamiento de la caña dura usualmente de cuatro a seis meses, pero se

extiende hasta nueve meses en Hawai, Perú, México. Puede reunirse y almacenarse una cantidad
adecuada de bagazo durante la temporada, con el fin de lograr una operación continua en la
fábrica de pulpa en tanto llega la caña.

3.1.1 Propiedades físicas y químicas del bagazo

El bagazo completo esta integrado por tres componentes principales:

- El recubrimiento, en el que se incluye la epidermis, la corteza y el periciclo.

- Los mazos de fibra vascular, entre los que figuran las células conductoras de pared
delgada asociadas con fibras de pared relativamente con estrecho lumen.
- El tejido básico (parénquima) o medula, con mazos de fibra distribuidos irregularmente.

La composición química de las diferentes fracciones de bagazo, incluyendo el bagazo entero, la

fibra separada y la medula se indican en la Tabla 1.

Tabla 1. Propiedades químicas de las fracciones del bagazo (2)

Entero Fibra Medula

Solubilidad en éter (%) 0.25 0.12 2.5
Solubilidad en alcohol-benceno (%) 4.1 1.8 2.8
Solubilidad en agua caliente (%) 2.5 0.9 1.9
Lignina (%) 20.2 20.8 20.2
Pentosas (%) 26.7 27.9 28.4
Hemicelulosa (%) 76.6 77.8 77.7
Alfa celulosa (%) 38.1 42.4 34.8
Ceniza (%) 1.67 0.7 2.29

3.1.2 Componentes principales de la materia prima

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Un material de interés en las paredes celulares de la planta de la madera, es el material
ligninocelulósico, el cual esta formado por celulosas y hemicelulosas enlazadas mediante lignina,
un polímero aromático altamente oxigenado, con un esqueleto de fenilpropano que se repite. Sobre
esta matriz se deposita una mezcla de compuestos de bajo peso molecular llamados extractivos.

a) Celulosa

Es el componente más simple encontrado en el material ligninocelulósico de las plantas, es el más

abundante en la biosfera. Esta compuesto por un polímero de residuos de D-glucosa unidos por
enlaces β −1,4 , (Figura-1). Cada resto presenta una rotación de 180º respecto a los restos
contiguos, estabilizada por puentes de hidrogeno intramoleculares. Debido a su estructura, las
cadenas de celulosa se unen por puentes de hidrogeno intermoleculares formando agregados
(microfibrillas). La celulosa y el almidón pueden ser hidrolizados para formar glucosa, pero sus
estructuras son muy diferentes. La celulosa es una molécula que da estructura y soporte a la
planta. Las cadenas de glucosa están arregladas de una manera que permite que se empaquen
juntas formando un cristal que es impermeable al agua. Consecuentemente el polímero celulosa es
insoluble y resistente a la hidrólisis.

Fig.1 Estructura química de la celulosa

b) Hemicelulosa

Las hemicelulosas forman cadenas cortas y son polímeros heterogéneos que contienen tanto
hexosas (azúcares de 6 carbonos como glucosa, manosa y galactosa) como pentosas (azúcares
de 5 carbonos como xilosa y arabinosa). Dependiendo de la especies de la planta, estos azucares
se asocian con ácidos urónicos formando estructuras poliméricas diversas, qué pueden est6ar
relacionados cercanamente tanto con celulosa como lignina. Los tres polímeros principales son los
xilanos, los mananos y los arabinogalactanos.

c) Lignina

La lignina es un polímero complejo, tridimensional, globular, irregular, insoluble y de alto peso

molecular (>10,000), formado por unidades de fenilpropano cuyos enlaces son relativamente
fáciles de hidrolizar por vía química o enzimática. Ésta molécula tiene diferentes tipos de uniones
entre unidades aromáticas de fenilpropano (Figura 2).

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 Fig.2 Estructura de la lignina

En las plantas, la lignina se encuentra químicamente unida a la hemicelulosa y rodeado a las fibras
compuestas por celulosa. Es responsable de la rigidez de las plantas y des sus mecanismos de
resistencia al estrés y a ataques microbianos. Es especialmente abundante (20-30% del peso de la
pared) en células conductoras (vasos xilemáticos) y estructuras (fibras) con engrosamiento
secundario.
En cuanto a su biosíntesis, se sabe que los precursores de la lignina se forman por conducto de la
ruta correspondiente al acido shiquimico. Éste acido, formado por unión del acido fosfoenolpirúvico
y eritrosa-4-fosfato, se convierte en el principal escalón de la biosíntesis de los aminoácidos L-
tirosina y L-fenilalanina, que están formados por aminación reductiva. Las enzimas desaminantes
convierten a continuación los dos aminoácidos en sus respectivas contrapartes del acido
shinamico.
La hidroxilación en etapas por hidroxilasa, y en su momento la metilación por o-metiltransferasas,
transforma los ácidos shinámicos en los tres ácidos para hidroxi-shinámicos conocidos como
precursores de la lignina.
Por el productor de pulpa y de papel, la lignina es un componente de la madera que ocasiona de
los problemas que surgen durante la producción de la pulpa. De no ser por la lignina no resultaría
necesario aplicar reactivos fuertes alcalinos o ácidos para la deslignificación química de la madera
a fin de obtener pulpa y productos de papel. La deslignificación es la meta más importante en la
producción de papel.

d) Extractivos

Los extractivos son aquellas sustancias que se encuentran presentes en las diferentes fibras
vegetales, pero que no son carbohidratos, tales como ácidos grasos, terpenos, fenoles y resinas.
Muchos de estos compuestos son solubles en agua o disolventes orgánicos polares como el
metanol, etanol o acetona, por lo que se eliminan rápidamente en los procesos extracción de
celulosa.

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3.2 Empleo de substrato orgánico por los microorganismos

Todas las formas de vida, desde los microorganismos hasta los seres humanos toman del
ambiente las sustancias que requieren para sintetizar su material celular, generar energía y
efectuar un funcionamiento adecuado. Estas sustancias se denominan nutrientes o substratos y el
consumo o degradación de los mismos, depende de los siguientes factores:

Composición elemental, la estructura de las unidades básicas de repetición, los enlaces entre
unidades de repetición, los nutrientes presentes en el ambiente, la comunidad microbiana presente
y las condiciones abióticas como pH, potencial de oxido-reducción, O 2 , condiciones osmóticas.
Los principales substratos complejos que utilizan los microorganismos se resumen en la Tabla-3

Tabla 3. Características de los substratos orgánicos complejos que influyen en la descomposición y

la degradabilidad.

Elementos Degradación
presentes en
gran cantidad

Substrato Subunidad básica Enlaces C H O N P Con Sin

O2 O2

Almidón Glucosa α(1 − 4)α(1 −6) + + + - - + +

Celulosa Glucosa β(1 −4) + + + - - + +

Hemicelulosa Monosacáridos C5 β(1 −4) + + + - - + +

y C6 β(1 −3)
β(1 −4)

Lignina Fenilpropano Enlaces C-C, C- + + + - - + -

O

Quitina N- β(1 −4) + + + + - + +

acetilglucosamina

Proteínas Aminoácidos Enlaces + + + + - + +

peptídicos

Hidrocarburos Alifático, cíclico, + + - - - + +/-+

aromático

+Lípidos Glicerol, ácidos Esteres + + + + + + +

grasos

La lignina es un caso especial en el que la biodegradabilidad depende la disponibilidad de oxigeno.

A menudo no existe una degradación sustancial porque la mayoría de los hongos filamentosos que
degradan lignina, pueden actuar solo en presencia de oxigeno.

7
3.3 Organismos degradadores de lignina y mecanismo de biodegradación

Como se menciono anteriormente, la pared celular de los tejidos vegetales esta constituida por
lignina, una substancia difícil de degradar y que los hongos descomponen debido a que poseen
enzimas que rompen dicha molécula y dependiendo de cómo los hongos lo ataquen, se clasifican
en hongos de pudrición blanca y hongos de pudrición parda (o de color café), Los hongos de
pudrición blanca han sido ampliamente investigados como posibles organismos utilizados en la
biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y en la
degradación del polímero lignina
.
Estos hongos no pueden utilizar directamente lignina como su fuente de carbono y energía, por ello
dependen de azúcares mas digeribles como los monómeros precursores de fenilpropano. La
función primaria de la ligninólisis es exponer estos monómeros al ataque del hongo con ayuda
diferentes tipos de enzimas. En la mayoría de los hongos se ha visto que la ligninólisis ocurre
durante el metabolismo secundario, es decir bajo limitación de nutrientes, lo que permite que el
hongo solo sintetice y secrete agentes ligninoliticos que comiencen a fragmentar el polímero.

Por otra parte se sabe que dos de las mas conocidas peroxidasas (enzimas que atacan a la
lignina) son secretadas por diversos hongos entre ellos Pleurotus eryngii. Una de ellas es la enzima
es la enzima de manganeso peroxidasa y la otra es la enzima lignina peroxidada. Este hongo ha
sido muy estudiado debido a su capacidad de degradar lignina selectivamente cuando crece en
substratos naturales y por lo tanto es un organismo considerado como modelo para estudios de
biodegradación de lignina y con aplicaciones biotecnológicas.

En términos generales la degradación de lignina es catalizada por un complejo enzimático

extracelular que poseen algunos hongos. Los mayores componentes de este sistema incluye a la
enzima peroxidada (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y al enzima generadora de peroxido glioxal
oxidasa (GLOX). Bajo condiciones de limitación de nutrientes en el medio de cultivo, diversos
hongos son capaces de secretarlas.

3.3.1 Levaduras degradadotas de lignina

Como se menciono anteriormente, la descomposición de lignina la realizan principalmente

basidiomicetos de pudrición blanca. Dichos hongos no tienen substrato específico y pueden oxidar
a una gran variedad de componentes incluyendo contaminantes ambientales. Sin embargo existen
otros microorganismos aislados del suelo que pueden tener una actividad similar. La habilidad de
algunas especies de levaduras para biodegradar lignina ha recibido poca atención, en comparación
con los hongos basidiomicetos.
Recientemente, se ha descrito que algunas especies de levaduras como Candida ingeniosa,
Rhodotorula graminis y Rhodotorula mucilaginosa son organismos que degradan productos
derivados de lignina.

CARACTERISTICAS

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 Descripción Características típicas de levadura
Fenotípica

Hábitat Bagazo de caña de azúcar.

Grupo trófico Quimiorganotrófico

Fuente de Carbono Lignina (Heterótrofo)

y energía

Grupo aceptor de Lignina (Organótrofo)

electrones

Fórmula maestra Lignina  →Célulosa

Levadura
+ Hemicelulo sa
del bioproceso

4 MARCO METODOLOGICO

4.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS

Muestreo

Las muestras se tomaran del residuo de la elaboración de jugo de caña de azúcar, del sector de
Tambillo, esta será representativa y recogida a diferentes tiempos, durante un día de producción.

Preparación de la muestra

Se molera perfectamente la muestra y se pesara 10 g de la misma, posteriormente se colocaran

en un matraz con 90 ml de agua destilada estéril, se agitará y se hará diluciones que van desde 10-
2
hasta 10-7.

4.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS

4.2.1 Diseño del medio de cultivo

Medio minimal + Agar

Compuesto Cantidad
K2HPO4 1,73 g
KH2PO4 0,68 g
(NH4)2SO4 0,83 g
Medio minimal líquido MgSO4. 7H2O 0,10 g
Solución de elementos traza 1 ml
Lignina* Compuesto 0,2 %
Cantidad
Agar
K2HPO4 15 g
1,73 g
Gentamicinaª
KH2PO4 1 ml g
0,68
Agua destilada
(NH4)2SO4 1000gml
0,83
pH=5
MgSO4. 7H2O 0,10 g
Solución de elementos traza 1 ml
Lignina* 0,2 %
Agua destilada 1000 ml
pH=5
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*Se utiliza como fuente de carbono presentes en el bagazo de caña de azúcar.
ªPara inhibir bacterias.

AISLAMIENTO DE LEVADURAS DEGRADADORAS DE LIGNINA

Las muestras obtenidas se sembrarán por el método de extensión (asa de digrasky) en el medio
minimal, tres cajas petri por dilución, y se dejarán a temperatura ambiente durante cinco días en
aerobiosis.

El pH del medio minimal mas agar debe ser de 5 debido a que las levaduras que se van a aislar
crecen mejor a ese pH y los otros microorganismos que no son de nuestro interés no.

De las cepas levaduriformes que se reproducirán en el medio al cabo de cinco días, las
enriquecemos nuevamente en un medio de cultivo líquido (medio base), las llevamos al shaker
durante 24 horas a 37º C y 150 rpm.

PURIFICACION

Para evitar el crecimiento de bacterias y hongos filamentosos se sembrarán las diluciones

enriquecidas en medios Saburoud (anexo 1) y otras en medio papa dextrosa (anexo1) adicionadas
con tetraciclina para inhibir el crecimiento de los organismos mencionados anteriormente.

IDENTIFICACION

Análisis de la morfología micro y macroscópica

A cada una de las cepas aisladas se les realizará tinción Gram para observarlas al microscopio. Y
se observará como crecen en el medio de cultivo.

SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS LEVADURIFORMES

Parámetros de selección:
Parámetros de selección
pH 4,5 a 6,5
Temperatura 24 y 48ºC.

Se utilizará un pH de 5 y una temperatura de 37ºC, para las levaduras de nuestro interés

Concentración de nutrientes

La lignina es el principal compuesto para el crecimiento de este tipo de levaduras, el bagazo de

caña de azúcar tiene alrededor del 20%.

10
Para la selección de las cepas con mayor poder degradador elaboraremos medios con las
siguientes concentraciones de lignina 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la
selección se efectuará en el medio de cultivo con estas concentraciones.

Los microorganismos seleccionados serán puestos nuevamente en un medio minimal líquido y

sólido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendrá como fuente de carbono el
bagazo de caña de azúcar que van a ser degradados. Después de sembrar los microorganismos
seleccionados estos deberán permanecer por lo menos cuatro o cinco días a temperatura ambiente
para su crecimiento

4.2.1.1 Curva de crecimiento y evaluación de la capacidad degradadora de lignina

Para verificar tanto el crecimiento de los organismos aislados como su capacidad de degradar
lignina se emplea en medio minimal adicionado con lignina al 0,2% en forma de medio liquido en
matraces de 250 ml, se sembraran las diferentes levaduras bajo las siguientes condiciones de
crecimiento: pH = 5 , temperatura ambiente y agitación a 150 rpm.

Curva de crecimiento

Para evaluar el crecimiento de las cepas se tomaran diariamente 1ml de medio de cultivo de cada
uno de los matraces donde se sembraron las levaduras, se colocaran en tubos de ensayo que
contengan 9 ml de agua estéril, se mezclaran y a partir de estos, se realizaran diluciones hasta 10-
7. Posteriormente cada dilución se sembrara en caja petri con medio solido YEPD (anexo 1). Cada
caja se incubara a 37°C y una vez obtenido el crecimiento se contaran las levaduras.

Degradación de lignina

Para analizar la degradación se observaran diariamente los matraces con el fin de verificar el
cambio de coloración del medio de cultivo.

PRESERVACIÓN

Para la preservación de las cepas puras que son de utilidad biotecnológica se usara la técnica de
criocongelación (crioviales con glicerol al 20%).

5 BIBLIOGRAFÍA

1. www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf
2. home.aigonline.com/AIGEnvironmental/ind_profile/read_p0rofile/1,1990,MTYtL0FJR0Vudm
lvb25tZW50YWwvSW5kdXN0c...-50k.
3. http://www.umbbd.ahc.umn.edu:8015/umbbd/servlet/pageservlet?
ptype=pypathway_abbr=van-5k
4. http://www.fao.org/docrep/n5525S/n5525s01.htm.
5. http://www.fao.org/docrep/n5525S/lignin.htm.
6. http://www.bioxamara.tuportal.com.

11
7. http://www.industry/.lignin.com.
8. http://www.nrel.gov/biotech_symposium/docs/abst1b-48.doc
9. http://www.bioplanet.net/magazine/bio_julago_2001_julago_industria.htm.
10. http://www.unsa.edu.ar/matbib/micagrip3.pdf

ANEXOS

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13
 6 ANEXOS

6.1 Composición de medios de cultivo

Solución de elementos traza Medio glucosado Sabouraud

Compuesto Cantidad Compuesto Cantidad

CaCl2.H2O 1g Glucosa 20 g
Medio de
MnSO4.H2O 0.3 g agar papa- Peptona 10 g
dextrosa
Compuesto
Agar Cantidad
20 g
FeSO4.7H2O 0.5 g (PDA)
Medio Extracto de levadura
EDTA.7H2O 0.2 g Agua destilada 10005ml
g
líquido
Agua destilada 100 ml
YEPD pH = 5 Peptona 5g

Compuesto Cantidad Glucosa 10 g

Papa 250 g Agua destilada 500 ml

Glucosa anhidra 1% pH = 5

Peptona de carne 1%

Agar 15 g

Agua destilada 1000 ml

pH = 5