INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y

HOMEOPATA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
E INVESTIGACIN

EFECTO DE Ustilago maydis SOBRE LA

VIABILIDAD DE CLULAS HeLa in vitro
TESIS QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE ESPECIALIDAD EN
TERAPUTICA HOMEOPTICA

PRESENTA
AGUSTIN BARBOSA MRQUEZ

DIRECTORES:
M. en H. Mara de Lourdes Cruz Jurez
D. en C. Paula Figueroa Arredondo

Mxico D.F. Junio, 2011

El presente trabajo se llev a cabo en el

Laboratorio de Microbiologa Molecular
del Departamento de Investigacin
de la ENMH-IPN

Bajo la direccin de las

Dras. Mara de Lourdes Cruz Jurez y Paula Figueroa Arredondo
con la asesora de los M en C Ana Laura Luna Torres
y Miguel Espinoza Laparra.

Se cont con el
Financiamiento parcial de los
Proyectos SIP 2011 y Megaproyecto de Cncer.

ndice
Resumen ...10
Abstracts ............................................................................................................. 121
INTRODUCCIN .................................................................................................. 13
CNCER ............................................................................................................... 15
Epidemiologia .............................................................................................................................. 15

CNCER DE CUELLO UTERINO (CaCU). ........................................................... 20

Fisiopatologa .............................................................................................................................. 20
Cuadro clnico ............................................................................................................................. 22

HOMEOPATA ...................................................................................................... 34
Ustilago maydis ..................................................................................................... 37
Patogenesia de Ustilago maydis .............................................................................................. 39

JUSTIFICACIN ................................................................................................... 40
Hiptesis................................................................................................................ 42
Objetivo General ................................................................................................... 42
Objetivos Particulares ........................................................................................... 42
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ........................................................................... 43
Material y mtodos ..................................................................................................................... 45
Metodologa ................................................................................................................................. 46
Cultivo celular y aplicacin de Ustilago maydis ..................................................................... 52

RESULTADOS. ..................................................................................................... 56
CONCLUSIONES.................................................................................................. 63
6

PERSPECTIVAS ................................................................................................... 64
BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 65

Lista de figuras
Figura 1

Principales causas de muerte en hombres por tumores

malignos en Mxico

Figura 2

16

Principales causas de muerte en mujeres por tumores

malignos en Mxico

17

Figura 3

Causas de defuncin por tumores malignos segn sexo

18

Figura 4

Tazas de mortalidad por entidad federativa en Mxico

17

Figura 5

Factores de riesgo relacionados con el cncer de crvix

19

Figura 6

Tcnica para la toma del Papanicolau

25

Figura 7

Neoplasia Intraepitelial Cervical

26

Figura 8

Clulas HeLa

30

Figura 9

Efecto de la tintura madre y medicamentos dinamizados en

clulas de carcinoma de ascitis de Ehrlich

32

Figura 10

Efecto de Arsenicum album en clulas HeLa in vitro

34

Figura 11

Elote con la parasitacin del hongo de Ustilago maydis

36

Figura 12

Estrategia experimental

41

Figura 13

Clulas HeLa en caja de petri.

44

Figura14

Medios nutritivos especiales para cultivo de clulas

44

Figura 15

Caractersticas morfolgicas de clulas HeLa (ATCC)

45

Figura 16

Cmara de Neubauer

47

Figura 17

Cuadriculado especial de la cmara de Neubauer

47

Figura 18

Evaporacin del alcohol Homeoptico

48
8

Figura 19

Placa de pozos para cultivos celulares

50

Figura 20

Fotografa de clulas HeLa

53

Figura 21

Comparacin de clulas HeLa 10x y 20x a las 24 horas

con los tratamientos

54

Figura 22

Viabilidad de clulas HeLa in vitro a las 24 horas

55

Figura 23

Porcentajes de viabilidad de clulas HeLa in vitro a las 24

horas

55

Abreviaturas
DMEM:

Dulbeco Modified Eagle Medium.

DNA:

Acido Desoxirribonucleico.

HeLa:

Henrietta Lacks.

LCR:

Regin Larga de Control.

l:

Microlitro.

NIC:

Neoplasia Intraepitelial Cervical.

Pap:

Papanicolau.

PBS:

Solucin Buffer de Phosphatos.

pRb:

Protena del Retinoblastoma.

SFB:

Suero Fetal Bovino.

SIL:

Lesin intraepitelial escamosa.

H-SIL:

Lesin intraepitelial escamosa de alto riesgo.

L-SIL:

Lesin intraepitelial escamosa de bajo riesgo.

VPH:

Virus del Papiloma Humano.

Tintura

10

Resumen
El cncer es una causa de mortalidad a nivel mundial, se le atribuyen 7.9 millones
de defunciones en el 2004 (aprox. 13%), se prev que aumente hasta 12 millones
para el 2030. En Mxico el cncer del cuello uterino es la segunda causa de
defunciones en mujeres. En la actualidad no se tienen estudios in vitro con
Ustilago maydis y su accin en clulas de cncer de crvix, aunque en la materia
medica homeoptica se menciona un cuello uterino tumefacto que sangra al
menor contacto por lo tanto se puede sugerir para el tratamiento de cncer de
crvix. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de Ustilago maydis sobre la
viabilidad de clulas Hela (Lnea de cncer cervical). Las clulas se trataron
durante 24 horas con diferentes concentraciones de Ustilago maydis (Tintura, 6c y
30c). A travs de la tcnica con Azul de tripano, se realiz el conteo de las
mismas. Los resultados obtenidos muestran que las clulas tratadas con la tintura
de Ustilago maydis tuvieron un incremento en la viabilidad de un 70%, las tratadas
con la solucin homeoptica a la sexta centesimal (6c) incrementaron su viabilidad
un 75%, las tratadas con la 30c la incrementaron un 64%, las tratadas con alcohol
tuvieron un incremento del 75% comparado con un 83% de las clulas sin
tratamiento. Con estos resultados, concluimos que a partir de las cuentas viables,
se puede sugerir que en las clulas HeLa tratadas con la tintura de Ustilago
maydis, se disminuye la proliferacin y por el contrario, los tratamientos con las 6c
y 30c estaran mostrando un aumento de la proliferacin.

11

Abstracts
Cancer is cause of mortality worldwide, 7.9 million deaths were attributed in 2004
(aprox. 13%) and it is expected to increase to 12 million by 2030. In Mexico,
cervical cancer is the second leading cause of deaths in women. Currently there
are not in vitro studies with Ustilago maydis and its action in cells derived from
cervical cancer, but in the homeopathic medical matter cervical cancer is
mentioned as a swollen cervix that bleeds at the slightest touch. Applying the rule
of the similar, therefore Ustilago maydis may be suggested for the treatment of
cervical cancer. The aim of this study was to evaluate the effect of Ustilago maydis
on the viability of Hela cells (cervical cancer derived cell line). Cells were treated
with different concentrations of Ustilago maydis during 24 hours (Tincture, 6c and
30c), then quantitated through the technique using trypan blue dye. Results from
our study show that cells treated with Ustilago maydis tincture showed an increase
in viability of 70%, those treated with the homeopathic solution diluted to the sixth
centesimal (6c) increased their viability by 75%, those treated with the 30c the
reach a 64%, those treated with the alcohol the reach a 75% in comparison with
83% of the cells without treatment. With results from our experiments we here
conclude from the viablility estimations, may we suggest that HeLa cells treated
with tincture from Ustilago maydis, decreased their proliferation. On the contrary
treatments using the 6c and 30c show an increase in proliferation.

12

INTRODUCCIN
Las clulas del crvix estn en constante divisin durante la vida reproductiva, por
lo tanto el crecimiento anormal de las clulas, se puede promover al conjugarse
con factores de riesgo para el desarrollo de la patologa cervical. Lo anterior junto
con la alta incidencia del virus del papiloma humano (VPH) se ha establecido
como causa de la displasia cervical, que evoluciona al cncer crvico-uterino. Las
neoplasias del crvix son de gran importancia ya que constituyen 21.4% del total
de neoplasias malignas y 85% de las ginecolgicas. La prevencin del cncer de
crvix se puede realizar por medio de la deteccin oportuna, orientada a evitar o
disminuir factores de riesgo, el uso de preservativo, posponer el inicio de la vida
sexual, el nmero de gestas y la frecuencia de realizacin del Papanicolau (Pap),
lo anterior debe considerarse y tomar conciencia en mujeres con alto riesgo de
cncer de tero (OMS,2007; Rodrguez,2009).
El cncer de tero es uno de los principales problemas de Salud Pblica no solo
en la Repblica Mexicana sino en toda Amrica Latina; en el Distrito Federal y la
Zona Metropolitana ocupa el primer lugar en frecuencia, en la ltima dcada se
reportaron ms de 4950 defunciones (19.9/100 000 mujeres), se estima que cada
ao mueren 12.5 mujeres al da debido a ste mal (INEGI, 2007).
De acuerdo con los resultados obtenidos en los diversos estudios epidemiolgicos,
el factor asociado en forma ms consistente con cncer de crvix es la infeccin
con el Virus del Papiloma Humano (VPH). Los tipos asociados con el cncer
crvico-uterino son el VPH16 y VPH18 (Harold zur Hausen,1981 y Lutz Gissman,
1984). Se observ que las oncoprotenas E6 y E7 del VPH tienen un potencial
13

oncognico y alteran el ciclo celular, por ejemplo: la oncoprotena E6 inhibe la

funcin de la protena p53 que es una protena supresora de tumores; la
oncoprotena E7 secuestra a la protena Rb que interacta con factores de
transcripcin de E2F, que controlan la replicacin celular (Lodish, 2008).
En la bsqueda de tratamientos contra el cncer se han realizado estudios en
diferentes lneas celulares, una de estas lneas es la de clulas HeLa que
provienen de una mujer afroamericana Henrietta Lacks que muri de cncer de
tero (Goodwin, 2000).
En homeopata se ha experimentado el tratamiento para el cncer con diversos
medicamentos como Graphites, Arsenicum album, Carbo animalis, Carbo
vegetabilis (en cncer genital) entre otros (Ranjit K. Roy,2008; Olvera, 2009) J. M.
Clarke observ que Ustilago maydis tiene afinidad a fibromas (Ranjit K. Roy,
2008). Pero en la actualidad no se han realizado estudios in vitro de Ustilago
maydis en cncer de crvix a pesar de que en la materia medica homeoptica
(Vijnosky, 2002; Vannier ,2008) la patogenesia menciona un cuello uterino
esponjoso, tumefacto, que sangra al menor contacto, lo que es similar a la
sintomatologa del CaCU. Por lo que sera muy importante observar el efecto de
este medicamento en la viabilidad de las clulas HeLa in vitro.

14

CNCER
El cncer se define como la prdida del control del crecimiento y divisin de las
clulas a causa de mutaciones genticas experimentadas. Estas clulas pueden
invadir otros tejidos destruyendo estructuras adyacentes y a su vez pueden
propagarse a sitios alejados, lo que se denomina metstasis. As mismo puede
producir tumores en partes distales, con lo que pueden causar la muerte (NOM014-SSA2-1994). Otros trminos utilizados para denominar al cncer son
neoplasias y tumores malignos (Lacruz, 2001)
Epidemiologia
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) indica que desde la edad madura
hasta la vejez, una de las principales causas de muerte en las mujeres es el
cncer y en los hombres son las cardiopatas. Los tumores malignos que afectan a
ambos sexos son: cncer de pulmn, trquea, bronquios, esfago,

hgado,

prstata, colon y recto, con mayor incidencia en varones y de mama, pulmn,

colon, rectal y de tipo ginecolgico, en la poblacin femenina (OMS, 2007).
Se estima que a nivel mundial el cncer es la primera causa de mortalidad; se le
atribuyen 7.9 millones de defunciones en el 2004 (aprox. 13 % del total) de las
cuales un 30% de las defunciones son prevenibles.
Se prev que siga aumentando hasta llegar a un estimado de 12 millones de
muertes para el 2030.

15

Las estadsticas muestran lo siguiente:

Pulmn (1.4 millones de defunciones)
Estmago (866 000 defunciones)
Hgado (653 000 defunciones)
Colon (677 000 defunciones)
Mama (548 999 defunciones)
Un 72% de las muertes por cncer ocurridas en el 2007 se registraron en pases
de medianos y bajos recursos econmicos (OPS, 2009).
En el ao 2005, en Mxico se registraron 495 240 defunciones, de los cuales
55.2% en hombres y 44.8% en mujeres. Los tumores malignos son la segunda
causa de muerte con 30 899 defunciones (11.3%) en hombres y en mujeres con
32 224 defunciones (14.5%).
En los varones las tres principales causas de muerte por tumores malignos son:
1. Trquea, bronquios y pulmn (15.6%)
2. Prstata (15.5%)
3. Estomago (9.1) (Fig. 1)

16

PRINCIPALES CAUSAS DE MUERTE EN HOMBRES POR TUMORES MALIGNOS

EN MXICO.

Fig. 1. Se observa el porcentaje ms alto de cncer siendo el de trquea y pulmn los

ms afectados. (INEGI, 2007)

En las mujeres las tres principales causa de muertes por tumores malignos son:
1. Mama (13.3%)
2. Cuello del tero (13.1%)
3. Hgado y vas biliares (7.9%) (INEGI,2007) (Fig. 2)

17

PRINCIPALES CAUSAS DE MUERTE EN MUJERES POR TUMORES

MALIGNOS EN MXICO

Fig. 2. Se observa el porcentaje ms alto de cncer siendo el de mama el de mayor

incidencia seguido muy de cerca por el de cuello uterino. (INEGI, 2007)

Tanto a nivel mundial como en Mxico, el control y prevencin del cncer del
cuello uterino es de suma importancia, y se han implementado importantes
programas para su deteccin oportuna y su tratamiento inmediato, teniendo como
objetivo reducir el ndice de mortalidad en la poblacin femenina.
El cncer crvico-uterino es uno de los principales problemas de Salud Publica no
solo en la Repblica Mexicana sino en toda Amrica Latina. Siendo la segunda
causa mas frecuente de neoplasia en la poblacin femenina, teniendo como
consecuencia la muerte y observndose el mayor ndice de mortalidad en zonas
marginadas, en donde los programas de salud para su prevencin y tratamiento
no han tenido el resultado esperado. (INEGI, 2007) (Fig. 3).

18

CAUSAS DE DEFUNCIN POR TUMORES MALIGNOS SEGN SEXO

Fig. 3 Se observan los porcentajes de tumores en Mxico por sexo (INEGI, 2007)

El cncer crvico uterino (CaCU) representa un grave problema por su magnitud

creciente y la trascendencia en el mbito individual, familiar, social y econmico.
Es ms frecuente entre los 25 y 45 aos de edad, lo que significa que afecta a las
mujeres en etapa productiva. Se ha observado que las defunciones ocurren en
mujeres sin escolaridad (30%), o que no alcanzan la primaria completa (60%).
En la Repblica Mexicana algunos estados presentan una mayor incidencia de
tazas de mortalidad de CaCU en el perodo del 2000 al 2006. (Programa de
Accin Especfico, SS, 2007-2012) (Fig.4).

19

TAZAS DE MORTALIDAD POR ENTIDAD FEDERATIVA EN MXICO

Fig. 4 Se observa la mortalidad por estados en la Republica Mexicana (Programa

de Accin Especifico, SS, 2007-2012) 2006

CNCER DE CUELLO UTERINO (CaCU).

Es el crecimiento y desarrollo desordenado del recubrimiento epitelial del crvix
uterino. De acuerdo al grado de lesin de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) las
lesiones tempranas se clasifican en: crecimiento desordenado del tercio inferior
del epitelio NIC I, la maduracin anormal de los dos tercios inferiores del epitelio
NIC II. Al abarcar ms de dos tercios del espesor epitelial, la lesin se clasifica
como una NIC III o Carcinoma in situ (DeCherney, 2007).
Fisiopatologa
Las clulas a nivel del crvix requieren estar en divisin constante, esta actividad
del epitelio es necesaria para reponer las clulas viejas o muertas, por medio de
estmulos que dependen de las molculas de sealizacin extracelular. La mitosis
se inicia despus de que se haya replicado la totalidad del DNA y solo permite la

20

divisin celular si se ha completado el ciclo celular. Si uno de los pasos del ciclo
celular se retrasa, el sistema de control demora la activacin del siguiente paso, o
sea que si la sntesis del DNA se demora durante la fase de la sntesis (S), la
clula no progresa a la fase de la mitosis (M) con una replicacin incompleta, ya
que se activan protenas reguladoras del ciclo celular como la P53 y Rb. Si una
clula llegara a ser daada en la fase G1, se eleva el nivel de p53 que a su vez
activa la expresin del gen p21, deteniendo el avance del ciclo celular, dando el
tiempo necesario para reparar el dao gentico antes de iniciar la replicacin del
DNA.

La protena Rb ayuda a regular el paso de las clulas en la fase G1 del ciclo

celular a la fase de sntesis, durante la cual se produce la sntesis del DNA.
Aproximndose a la etapa final de fase de G1, la subunidad pRb fosforilada libera
al factor de transcripcin E2F y esto marca el compromiso irreversible de la clula
para ingresar a la fase de la sntesis (S) (Lodish, 2008). Existen factores de riesgo
que pueden inducir mutaciones las cuales dan lugar a la formacin de clulas
anormales que pueden proliferar, llegando a producir los tumores, en este caso de
cncer de crvix.

21

Cuadro clnico
Por lo general no hay sntomas ni signos de la neoplasia intraepitelial.
Frecuentemente el diagnostico se basa en un resultado anormal de un frotis de
citologa cervical teida por Papanicolaou (Pap), o si al realizar un examen
colposcpico este revela una zona de transformacin atpica con epitelio
acetoblanco engrosado y capilares superficiales, con patrones punteados gruesos
o en mosaico. Tambin es tpico encontrar la lesin como un rea de epitelio
escamoso que no se tie con yodo (prueba de Schiller positiva) (DeCherney,
2007).
Factores de riesgo
Se han observado factores de riesgo que influyen para el desarrollo de cncer de
tero, siendo el tabaquismo, multiparidad, mltiples parejas, inicio de vida sexual
antes de los 18 aos y sin proteccin, analfabetismo o baja escolaridad etc.
(Lpez-Saavedra, et al; 2006, NOM-014-SSA2-1994) (Fig. 5).

22

FACTORES DE RIESGO RELACIONADOS CON EL CNCER DE CRVIX

Fig. 5. Los factores de riesgo relacionados con el CaCU, son el tabaquismo,

multiparidad, vida sexual con mltiples parejas, inicio temprano de las relaciones
sexuales, desnutricin, analfabetismo, mujeres de 25 a 64 aos y el VPH.

De acuerdo con los resultados obtenidos en diversos estudios epidemiolgicos, el

factor ms importante asociado con el cncer de tero es la infeccin por el virus
del papiloma humano (VPH), transmitido por contacto sexual. Se dice que 20% de
las mujeres contraen esta infeccin, al inicio de las relaciones sexuales, pero la
mayor incidencia se presenta entre los 25 a 45 aos de edad.

La infeccin por el VPH es un proceso crnico que se describe como un espectro

de la enfermedad, sta puede progresar durante meses o aos, desde el primer
contagio hasta que se presenta primero la displasia y posteriormente esta contina
agravndose, hasta desarrollar finalmente un cncer invasor. Sin embargo, la
persistencia del VPH 16 y el VPH18, se asocia con ms frecuencia con el
desarrollo de lesiones de alto grado y por lo tanto a un cncer de crvix (Long Fu
Xi, 2006).
23

Los factores de riesgo ms importantes para desarrollar cncer cervical, se

pueden enumerar como sigue:
1. Tabaquismo
Un estudio hecho en el departamento de Obstetricia y Ginecologa de
Escandinavia, mostr que las mujeres fumadoras tienen un alto grado de
prevalencia de lesiones intraepiteliales escamosas 40% en comparacin
con las mujeres no fumadoras que presentan un 6%. Esto se atribuye a que
las toxinas inhaladas de los cigarrillos se acumulan en el moco cervical
actuando como mutgenos (Wolfgangeppel, 2005)
2. Multiparidad
El hecho de tener mltiples embarazos favorece el desarrollo del cncer de
crvix debido a los cambios hormonales que ocurren durante el embarazo,
siendo susceptible la zona de transicin del crvix. Adems el trauma de
esta zona al paso del producto durante el parto, es otro factor que lesiona la
zona de transformacin, por lo que es importante (Lazcano-Ponce, 1993).
3. Contacto sexual con mltiples parejas (tanto la mujer como su esposo).
En clnicas de Nicaragua determinaron la prevalencia de factores de riesgo
en infecciones de transmisin sexual encontrando que la promiscuidad
condiciona a la aparicin de un alto grado de lesiones intraepiteliales
escamosas del crvix uterino (H-SIL) (Claeys P, 2002).
4. Inicio temprano de las relaciones sexuales (antes de los 18 aos)

24

El inicio de la vida sexual temprana, favorece la infeccin por virus del

papiloma humano por la omisin en el uso de mtodos preventivos contra
infecciones de transmisin sexual, tales como el condn.
5. Deficiencia de folatos y vitaminas A, C, E en la dieta
Los radicales libres que nuestro organismo produce y bajo el control de los
antioxidantes, permite formar defensas para los virus y bacterias
protegiendo la salud, como por ejemplo: los betacarotenos (precursores de
Vitamina A, Vitamina C, Vitamina E, Glutatin, acido flico, etc.
(antioxidantes, 2008).
6. Analfabetismo o baja escolaridad
La baja escolaridad, que es reflejo de un nivel de educacin en
conocimientos generales y la carencia total de informacin para la salud
sexual, principalmente en zonas marginadas, hace que la mayora de
mujeres en esta condicin, no acudan a realizarse citologas vaginales y no
se puedan diagnosticar a tiempo las lesiones tempranas del cncer del
crvix.
7. Las mujeres con vida sexual activa de 25 a 64 aos que nunca se hayan
practicado Pap (Lpez-Saavedra, 2006). Las mujeres que se realizan Pap
al menos una vez al ao, tienen mas probabilidad de detectar a tiempo una
lesin temprana y por tanto de recibir un tratamiento que la erradique.
8. La infeccin cervical por virus del papiloma humano
Se ha observado que el VPH es el principal factor de riesgo para el cncer
de crvix, ya que en estudios epidemiolgicos, en la gran mayora de las
biopsias de cncer invasor se encontraron secuencias de los tipos de virus
25

HVP16 y predominantemente el HVP18. Algunas de las muestras de cncer

cervical expresaban en sus clulas las oncoprotenas virales E6 y E7
(Harald zur Hausen, 2002).

Prevencin
Prevenir la aparicin del cncer crvico uterino significa modificar conductas o
realizar acciones orientadas a evitar o disminuir los factores de riesgo que
aumentan la posibilidad de desarrollar tumores (Len, 2008; Muoz, 2007).
Este contexto, puede estar enfocado en dos aspectos:

Prevencin primaria con aplicacin de vacunas profilcticas contra los VPH en

la edad infantil o adolescencia, la divalente contra los tipos virales 16 y 18 y la
tetravalente contra los tipos 6, 11, 16 y 18 que expresan las protenas E6 y E7
con el propsito de evitar la aparicin de cncer cervical. (Harald zur Hausen,
2002).

Prevencin secundaria, sta se refiere a la deteccin temprana de la

enfermedad, que se lleva a cabo mediante la tincin de Papanicolaou una vez
al ao y revisiones que incluyen la auscultacin directa del crvix por
colposcopa con foto-documentacin de las lesiones. Para la prevencin de las
lesiones precursoras y de cncer invasor, un aspecto fundamental es la
deteccin de la infeccin por el virus, en una etapa temprana mediante
coilocitosis en la citologa vaginal teida por Papanicolaou (NOM-014-SSA21994).

26

No obstante los avances en este campo, continua siendo primordial la educacin

para la salud, la informacin veraz y oportuna para la poblacin y la promocin de
un ejercicio de la sexualidad de manera informada, segura, responsable y libre
(Prez-Cruz, 2005).

Diagnstico
Para el diagnostico de los tipos oncognicos del VPH, se utilizan diferentes
tcnicas pero el estudio de la citologa cervical es el mtodo de eleccin para la
deteccin oportuna del cncer de crvix, adems del ensayo de captura de
hbridos que determina el tipo oncognico presente en la muestra. La muestra
para captura de hbridos, se toma en forma de un cepillado endocervical; se trata
de una prueba biomolecular, basada en la amplificacin de la seal de hbridos en
solucin in vitro, para detectar blancos de DNA o RNA del VPH y se obtienen
clulas del canal endocrvical a travs de un cepillo especial para su examen
microscpico.
El Papanicolau es un anlisis de citopatologa ginecolgica que consiste en la
tincin con el colorante especial diseado por este investigador, se usa para
detectar el cncer cervical y la infeccin por VPH, adems de otras entidades
inflamatorias de menor importancia como la hiperplasia. El Pap es parte de un
examen plvico, tiene una alta sensibilidad (75%) y especificidad (95%), con una
tasa de resultados negativos que varia del 5 a 50%, pero al repetir el estudio
disminuye la tasa de 1 a 2% (Fig. 6).

27

Para la toma es necesario acceder directamente al cuello del tero mediante un

espejo vaginal y que la mujer no est menstruando, se toma una muestra
suficiente del exocrvix y endocrvix, para despus extender las clulas del
cepillado cervical en una laminilla de vidrio (portaobjetos para microscopa) en la
que las clulas se fijan con spray para el cabello. (Ros Prez Mirta, 2009, NOM014-SSA2-1994)

TECNICA PARA LA TOMA DEL PAPANICOLAU

Fig. 6. El Pap es un anlisis para detectar el cncer cervical en forma preventiva,

mediante un examen plvico, con una sensibilidad del 75% aproximadamente y una
especificidad del 95% (Ros Prez Mirta, 2009).

Despus de tomada la muestra se procede a su anlisis para observar las

anomalas que pudieran haber, las cuales se clasifican de acuerdo al grado de
alteracin.

28

Dentro de la clasificacin de las neoplasias cervicales hay varias vertientes, entre

las ms importantes est la clasificacin de Bethesda, la cual toma en cuenta las
caractersticas de las lesiones y de las clulas encontradas con el exmen de
Papanicolaou y determina el grado de lesin, como se describe a continuacin.
La neoplasia intraepitelial cervical (NIC) con tres grados progresivos (1, 2, 3),
incluyndose en el grado 3 la displasia grave (Lacruz, 2003) (Fig. 7).
CIN I Displasia leve
CIN II Displasia moderada
CIN III Displasia intensa y CIS

NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL CON SUS GRADOS

PROGRESIVOS

Fig. 7. La clasificacin de Bethesda de las neoplasias del crvix uterino. Se

aprecian las caractersticas de las lesiones y de las clulas encontradas en
la biopsia como mtodo de diagnstico preventivo.

En abril de 1991 se hacen correcciones a la clasificacin de Bethesda (Maryland,

EEUU) en donde incluyen las mencionadas en la Tabla 1.

29

Tabla 1. CORRELACIN ENTRE LAS DIFERENTES

CLASIFICACIONES
Reagan, 1956

Richart, 1973

Bethesda, 1991

Normal

Normal

Normal
VPH

Displasia leve

NIC I

D. moderada

NIC II

D. intensa
"in situ"

NIC III
NIC III

VPH L-SIL
H-SIL

Clasificaciones de displasia (D. LEVE- displasia leve, NIC-Neoplasia Intraepitelial

Cervical, VPH-Virus del Papiloma Humano, L-SIL-Lesiones Intraepiteliales Escamosas
de Bajo Grado, H-SIL- Lesiones Intraepiteliales Escamosas de Alto Grado) (Bethesda,
2001).

(D. LEVE- displasia leve, NIC-Neoplasia Intraepitelial Cervical, VPH-Virus del

Las aportaciones de la ms reciente clasificacin de Bethesda son las siguientes:

Clasifica las anomalas de las clulas en categoras: NORMAL, ATIPIA,
L-SIL (lesin intraepitelial escamosa de bajo grado; H-SIL (Lesin
intraepitelial escamosa de alto grado) y el carcinoma invasor.
Evaluacin hormonal, Recomendaciones clnicas

Correlacin entre las diferentes clasificaciones (Tabla 2):

30

CLASIFICACIN ACTUAL DE BETHESDA, LESIONES CERVICALES.

Papanicolaou

CIN

Bethesda

Normal

II

Atipia

III

IV

II

III

L-SIL

H-SIL

V
Carcinoma
invasor
Carcinoma
invasor

Tabla 2: Clasificacin actual de lesiones cervicales (Bethesda, 2001).

Tratamiento para el cncer de cuello del tero

Los tratamientos en la actualidad son variados de acuerdo al sitio donde se
encuentre la lesin en el crvix y tienen como finalidad la de erradicar la lesin.
Los efectos secundarios de algunos mtodos conservadores como dolor, infeccin
bacteriana o fngica de las lesiones, o la falta de educacin para la salud, hacen
que las pacientes no terminen sus tratamientos y al no regresar al consultorio
quedan en un alto riesgo de que su lesin de lugar a metstasis precozmente
(Ahued, 2003; DeCherney, 2007).
Los tratamientos ms comunes para destruir clulas cancerosas en el cuello del
tero son:
Cauterizacin o electrociruga: empleo de la corriente elctrica alterna de
alta frecuencia para escindir la zona de transformacin y la lesin maligna
sobre el crvix con una profundidad no menor a 5 mm.

31

 Criociruga: Aplicacin de temperatura inferior a cero grados centgrados,

que alcanza el punto de congelacin en las clulas produciendo la muerte
celular.
Ciruga laser ambulatoria: Uso de la energa fotnica para la destruccin o
escisin de las lesiones y las zonas de transformacin del cuello uterino.
Conizacin:

Reseccin

quirrgica

de

una

lesin

de

la

zona de

transformacin del cuello uterino con una profundidad no menor a 5 mm.

Tambin se denomina cilindro o cono diagnostico.
Histerectoma: Intervencin quirrgica para extirpar totalmente el tero por
va vaginal o abdominal que se sugiere realizar desde el NIC II.
Radiacin: Uso de rayos X o de implantes de radium cerca de las clulas
anormales para destruir las clulas cancerosas.
Quimioterapia: Uso de sustancias qumicas antitumorales para destruir las
clulas cancerosas.
Terapia combinada: Se utiliza ciruga quirrgica y los tratamientos de
radiacin y quimioterapia (LALCEC, 2000; NOM-014-SSA2-1994).

Deben buscarse alternativas de tratamientos conservadores tratando de que estos

sean menos riesgosos y que ofrezcan mayores beneficios, preferentemente con
menos efectos secundarios que impidan finalizar el tratamiento. Una buena
educacin y concientizacin de las pacientes sera una excelente alternativa, ya
que no siempre les queda claro que su vida queda en riesgo de no terminar con
las clulas tumorales.

32

Se han realizado estudios para encontrar tratamientos ms eficaces. Se ha

experimentado con medicamentos homeopticos, en modelos de lneas celulares
tumorales, no tumorales (Kutan, 2007; Olvera, 2009).
Lneas celulares derivadas de cncer cervical.
Se han hecho estudios encaminados a detectar alteraciones a nivel celular y
molecular en el cncer crvico uterino y observar la inhibicin de la proliferacin
de cultivos expuestos con diferentes tratamientos, uno de estos modelos in vitro
utilizados para estudios del cncer cervical son las clulas HeLa.

Clulas HeLa
Las clulas HeLa provienen de una mujer afroamericana de 31 aos de edad
llamada Henrietta Lacks a quien le diagnosticaron un carcinoma invasor de crvix
uterino y muri a causa del mismo (Fig. 8).
.

MICROGRAFA DE LAS CLULAS HELA

Fig. 8 La lnea celular Hela vistas a baja densidad y alta

densidad (ATCC, American Type Culture Collection)

33

El Dr. George Otto Gey tom una muestra del tejido epitelial del crvix e inicio la
realizacin de cultivos derivados de estas clulas.
Sus caractersticas como lnea celular de origen tumoral son las siguientes: tienen
un periodo de duplicacin de 24 horas, requieren de un periodo de estabilizacin
de 4 a 5 horas luego de sembrarse en placas, su transportacin se debe realizar
en viales congelados, estas clulas contienen secuencias de DNA del virus del
papiloma humano 18 (VPH18) que se transcriben activamente. Este modelo de
lnea celular es representativo, estable, presenta inmortalizacin y transformacin
maligna y puede emplearse en el estudio in vitro de ste tipo de cncer ya que
proviene de un carcinoma invasor de crvix.

HOMEOPATA
Han pasado ms de 200 aos en que la Homeopata solo se basaba en la
experiencia de los mdicos que utilizan los medicamentos homeopticos para
tratar a los pacientes. En la Escuela Nacional de Medicina y Homeopata se hacen
esfuerzos para trabajar sobre esta rea de investigacin a travs de caminos
indirectos diferentes y variados, que sugieren que estos remedios pueden tener
algunas acciones eficaces sobre los crecimientos malignos y sus diferentes
etapas.
Los medicamentos homeopticos antitumorales conocidos hasta ahora se han
aplicado y probado en la India y los Estados Unidos. En algunos estudios
realizados por el Dr. Kutan G. de la India (2007), en su artculo de Preparaciones
dinamizadas en cultivos celulares, por ejemplo observo que Thuja y Lycopodium

34

eran sumamente citotxicos en clulas de carcinoma de ascitis de Ehrlich (Ehrlich

ascites carcinoma- EAC) (Fig. 9).

Porcentaje de clulas muertas

EFECTO DE LA TINTURA MADRE Y MEDICAMENTOS DINAMIZADOS

Drogas

Fig. 9. Efecto de la tintura madre y medicamentos dinamizados en clulas de

carcinoma de ascitis de Ehrlich. (a) Control no tratado, (b) diluyente dinamizado, (c)
Thuja, (d) Hydratsis, (e) Lycopodium, (f) Conium, (g) Carcinosinum, (h) Ruta, (i)
Chelidonium, (j) Condurango, (k) Podofhyllum, (l) Phytolacca. Fila oscura-Tintura
madre; Fila gris-30c; Fila blanca-200c. *P<0.01 (Kutan, 2007).

Una recopilacin de datos por el Dr. Roy Ranjit K (2008) en su libro La

homeopata en el tratamiento del cncer nos ilustra como los sntomas o signos
del paciente con cncer nos pueden orientar a elegir el medicamento homeoptico
adecuado, tal como lo menciona Hahnemann en el principio de la Ley de los
Semejantes.
El medicamento Thuja, fue descrito por Hahnemann para la Sycosis. FortierBernoville observ que todas las lesiones malignas tempranas, son susceptibles a
este medicamento, para todos los tipos de pre-canceres y cnceres tempranos
(mencionado en Ranjit, 2008).

35

Otros medicamentos que pueden ser prescritos para varios tipos de cncer, son
aquellos que estn indicados para los sntomas psicolgicos que se suscitan al
recibir la noticia de tener cncer. Por ejemplo: despus del diagnostico, todos las
pacientes con cncer, sufren de un estado mental de severa ansiedad, inquietud,
miedo a la enfermedad y miedo a la muerte. Arsenicum album puede ser un
medicamento indicado en estos casos.

Para cnceres de rganos

genitales femeninos se ha observado que el

Kresosotum y otros carbones como: Carbo animalis, Carbo vegetabilis y Graphites

son medicamentos muy tiles (Ranjit, 2008).
J. H. Clarke (1986) en su materia mdica menciona un nmero de medicamentos
que tienen accin contra el cncer. Olvera en su tesis de Especialidad en
Homeopata encontr que Arsenicum album a la 1c y 3c inhibi el crecimiento de
clulas HeLa in vitro (Olvera, 2009) (Fig. 10).
Ustilago maydis es til para el tratamiento de los fibromas (Ranjit K Roy, 2008),
por lo que piensa que el medicamento Ustilago maydis pudiera tener accin en la
inhibicin de procesos cancergenos del tero.

36

EFECTO DE ARSENICUM LBUM EN CLULAS HELA IN VITRO.

Porcentaje

Viabilidad del total

100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%

Vivas

Fig. 10. Se observa disminucin de clulas HeLa a las diluciones de 1c y 3c

(Olvera, 2009).

Ustilago maydis
Familia de los hongos: Tizones o carbones
Los hongos que constituyen el ltimo grupo de los basidiomicetes son los
Ustilaginales, nombre relacionado con el latn Ustus, quemado, porque reducen
los granos de maz y de otros cereales a una masa negra y pulverulenta, como el
holln.
Los filamentos de estos hongos penetran tambin en la planta en que se han de
hospedar y se desarrollan dentro de ella, entre sus clulas, y, principalmente, en
los rganos florales. Las masas filamentosas se resuelven, finalmente, en sus
clulas elementales, de paredes muy engrosadas y de color oscuro, que son las

37

esporas. Los basidios, nacen tambin de las esporas que forman el carbn o tizn.
Ustilago maydis (latn) pertenece a la familia de las Ustilaginceas y es una
infeccin fngica del maz que afecta a los tallos, los granos y las flores de las
mazorcas. La lesin es suave, esfrica, lobulada, el color vara de un color pardo
azuloso a negruzco, tiene un aroma fuerte y desagradable (Zepeda, 2006).
Ustilago maydis
Tambien es conocido como tizn del maz (Sinnimos: Carbn del maz,
Carboncillo del maz, Bolsas del maz, Congorcio, Cuitlacoche o Huitlacoche. Este
hongo vive en el interior del maz y cuando es tiempo de esporular, produce unas
agallas carnosas, de color blanquecino a veces azulosos o lvidos, de forma
irregular y de dimensiones variables, poco mayores que las de los granos de este
cereal o tamaos como de la cabeza de un infante; unas se forman en las
mazorca; otras en los tallos, comnmente en la base de estos. Pero todas se
resuelven en gran cantidad de polvo negro y maloliente, Aparecen cuando el maz
est ya en avanzado estado de desarrollo y durante la salida del grano del elote.
De la masa esporfera del tizn del maz se han aislado dos alcaloides
cristalizados, la ustilagenina y la ustilagotoxina, que corresponden a la ergotonina
y a la ergotoxina del cornezuelo de centeno. Tambin contiene lactoflavina y
vitaminas, entre las otras sustancias. En los Estados Unidos de Norteamrica se
preconiza el uso del extracto fluido de este tizn por sus excelentes virtudes
hemostticas y para promover y facilitar el parto. Sera tanto y ms activo que el
cornezuelo de centeno y menos txico.

38

Su uso debe quedar

reservado exclusivamente a los facultativos; no por su

toxicidad, sino por sus facultades abortivas (Pio Font Quer, 1979) (Fig. 11).
ELOTE PARASITADO CON EL HONGO DE Ustilago maydis

Fig. 11. Se aprecian diferentes tamaos del hongo en el maz. (Foto de Inforural.
Com.mx)

Patogenesia de Ustilago maydis

En la experimentacin pura los resultados de la patogenesia esta reportada en la
materia mdica como: Cuello uterino esponjoso, suave, tumefacto, sangrando por
el menor contacto (Vijnosky, 2002; Vannier, 2008). Uno de los principales signos
del cncer cervicouterino es el sangrado transvaginal y siendo reportado en la
materia medica, se debe realizar investigacin para observar que efecto tiene
Ustilago maydis en el tratamiento del cncer del crvix.
Segn Stevens (Diseases of Economic Plants, 1921) en Amrica esta especie fue
mencionada por primera vez en 1754. En Europa, y ms concretamente en
Francia se haba introducido ya, por lo menos en 1815.

39

Pero el uso mdico del tizn del maz no empez hasta el ltimo tercio del siglo
pasado, en medicina homeoptica. Hace unos 20 aos que su empleo parece
ganar terreno en farmacologa, sobre todo en Norteamrica.

Practica homeoptica
Se menciona en la literatura mdica homeoptica por el doctor Kchenmaister en
1845. La experimentacin pura fue reportada por el Dr. Heyne en 1872. (Allen, T.,
1872).

40

JUSTIFICACIN
El cncer crvico uterino (CaCU) sta aumentando su tasa de mortalidad en
Latinoamrica, siendo la segunda causa de muerte en mujeres mayores de 25 a
45 aos, lo mismo que en Mxico (INEGI 2007). Se ha encontrado una relacin
importante entre el virus del papiloma humano (VPH) y el desarrollo de cncer
crvico-uterino (CaCU).
Este cncer afecta a mujeres en la etapa productiva de sus vidas teniendo un
impacto negativo en su mbito familiar, social, y comunitario (Programa de Accin
Especifico, SS, 2007-2012); su tratamiento y control se ubican entre los costos
ms altos en la medicina. Esto representa un grave problema de salud pblica por
su magnitud creciente y su trascendencia en las mujeres, causando la muerte.
En el campo de la homeopata existen medicamentos que en su patogenesia
presentan signos semejantes a los reportados para el CaCU, entre los cuales
destaca Ustilago maydis, el cual tiene una accin sobre el crvix uterino
presentando hipertrofia, tumefaccin y hemorragias al menor contacto.
El CaCU provoca sangrado transvaginal, observado por colposcopia se aprecia un
crvix tumefacto, sensible al tacto, siendo esta caracterstica la misma

que

provoca el tratamiento con Ustilago maydis en personas sanas.

Por lo anterior consideramos que es de gran importancia evaluar el efecto que
tiene el Ustilago maydis sobre la clulas Hela, debido a que estas provienen de un
cncer crvico uterino.

41

Hiptesis
Dado que produce una patogenesia similar a la del cncer de crvix,
consideramos que Ustilago maydis podra mostrar su utilidad como medicamento
antitumoral al disminuir la viabilidad o causar citotoxicidad in vitro en clulas HeLa.

Objetivo General
Evaluar el efecto de Ustilago maydis como un probable tratamiento contra el
cncer cervicouterino, usando tratamientos con la Tintura () diluida hasta la 6C y
30C, en un ensayo in vitro para evaluar la viabilidad de la lnea celular HeLa.

Objetivos Particulares
1. Determinar la viabilidad de clulas HeLa en los cultivos celulares sin
tratamiento.
2. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las clulas
HeLa empleando tratamientos con la tintura.
3. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las clulas
HeLa empleando tratamientos a la dilucin 6C.
4. Determinar si Ustilago maydis tiene efecto sobre la viabilidad de las clulas
HeLa empleando tratamientos a la dilucin 30C.

42

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Se procedi a la estandarizacin de los cultivos de las clulas HeLa. Para
observar su viabilidad, se depositaron 200 000 clulas en cada pozo de una placa
para cultivos de clulas de fondo plano.
La preparacin de los tratamientos que se utilizaron para los cultivos celulares fue
como sigue: un control negativo en el que se mezcla un volumen de alcohol con
dos de agua y luego se evapora solamente el vehculo (alcohol), quedando el
volumen acuoso. Por separado se realiz el mismo procedimiento con el
medicamento homeoptico que contiene Ustilago maydis en las tres formas a
ensayar, como tintura, a la 6c y a la 30c. En los ensayos se les agreg los
tratamientos a las clulas en sus pocitos y se dejarn por 24 horas de incubacin
a 37 en presencia de CO2 al 5%. A continuacin se tripsiniz la monocapa y se
resuspendieron en medio DMEM complementado con suero al 10%.
Una alcuota de 20 microlitros se tom y las clulas contenidas en ese volumen,
se tieron con azul de tripano para realizar la cuenta viable en una cmara de
Neubauer, esto se repiti dos veces y los datos se vaciaron en una hoja de clculo
para posteriormente obtener el anlisis estadstico (Fig. 12).

43

Diseo de la estrategia experimental

.
Fig. 12 Estrategia experimental

44

Material y mtodos
1. Clulas HeLa.
2. Medio nutritivo DMEM.
3. Suero fetal bovino (SFB) al 10%.
4. Unidades de filtracin desechables para medio.
5. PBS (Solucin Buffer de Phosphatos).
6. Solucin de Penicilina-estreptomicina.
7. Ustilago maydis tintura, 6c y 30c.
8. Alcohol homeoptico 87.
9. Azul de tripano.
10. Agua destilada.
11. Tripsina.

Instrumental
1. Botella de 25 cm2 para cultivo o caja petri 10 cm de dimetro.
2. Microscopio invertido Eclipse TS100 Marca Nikon. NIS immage.
3. Placa de 24 pozos de fondo plano. especial para cultivos celulares.
4. Tubo eppendorf de 1.5 ml.
5. Cmara de Neubauer.
6. Vaso de precipitado de 500 ml.
7. Jeringas de 5 ml.
8. Puntas desechables de 200/1000 l.
9. Puntas de 20/200 l.
45

10. Micropipetas automticas de 20, 200, 1000 l.

11. Filtros de 0.22 micras.
12. Frasco color mbar de 30 ml.
13. Gasas estriles de 10 x 10 cm.
Equipo
1. Microscopio invertido marca Nikon modelo Eclipse TS 100, Class II Type
A2.
2. Centrifuga para tubos eppendorf.
3. Campana de flujo laminar marca Nuaire Biological Safety Cabinets.

Metodologa
Obtencin de clulas HeLa
Las clulas HeLa se obtuvieron por donacin del Dr. Patricio Gariglio del
Departamento de Gentica del CINVESTAV, Ciudad de Mxico, en una caja petri
para cultivo como se observa en la Fig. 13 y en la Fig. 14 se muestran los
suplementos y el medio de cultivo empleado.

46

CLULAS HeLa EN CAJA DE PETRI

Fig. 13. Obtencin de Clulas HeLa

gentica del CINVESTAV.

por donacin del Departamento de

MEDIOS NUTRITIVOS ESPECIALES PARA CULTIVO DE CLULAS

Fig. 14. Medio de cultivo contiene DMEM, Suero Fetal Bovino (SFB) al 10% y
ciproxina o Penicilina/Estreptomicina como antibitico.

Mantenimiento del cultivo

Las clulas HeLa se cultivaron en botellas de 25 cm2 con 5 ml de DMEM al 10%
de SFB y penicilina-estreptomicina; se incubaron a 37 y 5% de CO2 en una
incubadora el tiempo necesario para llegar a una confluencia del 80%. Se cuid

47

que las clulas tuviesen la morfologa que marca el ATCC (American Type Culture
Collection) como se muestra en la figura 15.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE CLULAS HELA (ATCC)

Fig. 15 Clulas HeLa vistas a baja y alta densidad

Tripsinizacin en la campana de flujo laminar

A una confluencia de 80%, se tripsiniz para separar las clulas de la placa, de la
siguiente manera:
1. Se aspir el medio DMEM con una pipeta Pasteur nueva.
2. Se adicionaron de 2 a 3 ml de PBS (1X) a 37C y se agit suavemente.
3. Se elimino el PBS y se volvieron a lavar las clulas con PBS nuevo.
4. Se retir el PBS del lavado anterior y se adicion 1 ml de tripsina.
5. Se dejaron las clulas con la tripsina por 5 minutos.

48

6. Se observaron al microscopio que las clulas estuvieran redondeadas y

despegadas.
7. Se agregaron 2 ml de DMEM para neutralizar la tripsina.

Tincin con azul de tripano

Para realizar las cuentas viables de cada condicin:
1. Se colect el medio + tripsina en un tubo eppendorf

(15ml) para

centrifugarse a 1500 rpm a 4 por 5 minutos.

2. Se decant el medio y al pellet (botn) de clulas se le adicionaron 2 ml
de DMEM, se homogeniz suavemente sin hacer burbujas.
3. Una vez que se homogeniz la suspensin celular, se tomaron 50 l (de
la parte media del tubo) y se adicionaron a un tubo eppendorf 50l de
azul de tripano.
4. La mezcla anterior se homogeniz suavemente, y se tomaron 20l de la
suspensin y se colocaron en la cmara de Neubauer (Fig. 15) y se
observaron los cuatro cuadrantes de las esquinas, contando el nmero
de clulas vivas (clulas refringentes) y clulas muertas (color azul).
5. Este procedimiento se repiti por 3 ocasiones, a fin de obtener la media
y la desviacin estndar.

Para conocer el nmero de clulas por ml se empleo la siguiente formula.

49

CAMARA DE NEUBAUER

Fig. 16. Se utiliza para el conteo de clulas, por el sistema de cuadriculado

especial con que cuenta.

CUADRICULADO ESPECIAL DE LA CMARA DE NEUBAUER

Fig. 17. Se utilizan los cuadros que se observan en las 4 esquinas de la

cuadrcula para el conteo de las clulas, las azules estn muertas.

50

Evaporacin del alcohol homeoptico

En un vaso de precipitado de 500 ml se agregaron 5 ml de alcohol homeoptico de
87 ms 10 ml de agua destilada, quedando un total de 15 ml, esto se hace para
tener un control negativo adecuado. Se cubri este preparado con una gasa para
evitar la contaminacin y se dej por 24 hrs a temperatura ambiente, a fin de que
se evaporara el alcohol 87, quedando solamente 5 ml de la solucin acuosa. Este
mismo procedimiento se llev a cabo con la Tintura, 6c y 30c de Ustilago maydis
(Fig.18).

EVAPORACIN DEL ALCOHOL HOMEOPTICO

Fig. 18. Se agreg en un vaso de precipitado 5 ml de alcohol homeoptico adems

Ustilago maydis en Tintura a la 6c y 30c, en forma independiente ms 10 ml de
agua destilada a cada uno.

51

Cultivo celular y aplicacin de Ustilago maydis

En una placa de 24 pozos de fondo plano para cultivo celular se sembraron
100,000 cl /ml en 15 pozos. Se incubaron estas celulas por 24 horas. Sabiendo
que el tiempo de duplicacin de las clulas Hela es de 24 horas aproximadamente,
al da siguiente contbamos con 200 000 cl/pozo.
A estos pocillos se les adicionaron 200 l del tratamiento: alcohol evaporado,
Ustilago maydis en tintura, medicamento a la 6c y a la 30c.
A los pozos con clulas no tratadas se les adicionaron 200 l de DMEM fresco a
fin de homogenizar todos los tratamientos.
Se emple el siguiente esquema de tratamiento:
1. Control: Se agregaron clulas HeLa, en tres pozos (A, B, C)
2. Vehculo: Se agregaron clulas HeLa y alcohol homeoptico evaporado.
3. Tintura: Se agregaron clulas HeLa y tintura de Ustilago maydis.
4. Ustilago maydis 6C: Se agregaron clulas HeLa y medicamento.
5. Ustilago maydis 30C: Se agregaron clulas HeLa y medicamento

Las clulas se incubaron a 37C en presencia de CO 2 al 5% durante 24 horas, en

la Figura 19 se muestra la forma en que se aplicaron los tratamientos.

52

PLACA DE POZOS PARA CULTIVOS CELULARES

A1

A2

A3

A4

A5

B1

B2

B3

B4

B5

C1

C2

C3

C4
54

C5

Fig. 19. Solo se utilizaron 15 pozos de los 24 que trae la placa

para cultivos celulares

Determinacin de la viabilidad celular despus de la administracin de

Ustilago maydis
Tcnica: Determinacin de viabilidad de clulas por exclusin de azul de tripano.
Transcurrido las 24 horas con el medicamento, se realiz la siguiente operacin en
la campana de flujo laminar.
1. Se aspir el medio.
2. Se agreg 200 l de PBS (1X) a temperatura ambiente a cada pozo para
lavar las clulas una sola vez.
3. Se quit el PBS y se adicion 200 l de tripsina a cada pozo por 5 minutos.

53

4. Una vez finalizado el tiempo se observaron al microscopio las clulas para

confirmar si se despegaron por completo.
5. Posteriormente se agreg 400 l de DMEM con SFB al 10% para
neutralizar la tripsina.
6. Se colect el medio + tripsina y se coloco en un tubo eppendorf nuevo;
esta operacin se repiti por cada tratamiento. A fin de que las clulas se
mantuviesen vivas, los tubos se trasladaron en hielo.
7. Se centrifugaron los tubos a 1500 rpm a 4 por 5 minutos.
8. Finalizado el tiempo, se decant el sobrenadante dejando solo el pellet (en
hielo).
9. Se agreg 400 l de PBS que son del lavado de cada pozo y se centrifug
nuevamente a 1500 rpm a 4 por 5 minutos.
10. Se decant el sobrenadante y se adicionaron 500 l de PBS, el cual se
homogeniz suavemente y se tomaron 50 l de la suspensin celular, estos
50 l se mezclarn con 50 l de azul de tripano y toda la mezcla se
homogeniz suavemente.
11. Se tom 20 l de la suspensin anterior y se coloc en la cmara de
Neubauer para el conteo de clulas (Fig. 19).
12. Se realiz el conteo en los cuatro cuadrantes anotando el nmero de
clulas vivas (clulas refringentes) y el nmero de clulas muertas (color
azul).
54

13. Se cont cada ensayo por triplicado.

14. Se grafic y se realiz el anlisis estadstico mediante la aplicacin de los
datos al programa Stata.

55

RESULTADOS.
Con la finalidad de comprobar el efecto de Ustilago maydis en el tratamiento del
cncer cervicouterino, evaluamos la viabilidad celular de las HeLa en ausencia y
presencia de los diferentes tratamientos homeopticos.
Se tomaron fotografas de las clulas HeLa antes de adicionar los diferentes
tratamientos, a fin de corroborar su morfologa caracterstica como lo marca la
ATCC e identificar los cambios posteriores atribuibles a los tratamientos.
.

FOTOGRAFAS DE CLULAS HELA

Fig. 20 Clulas HeLa (20X y 40X). La morfologa celular que se aprecia corresponde a la
documentada por la ATCC.

Despus de agregar los diferentes tratamientos a las clulas en cultivo, se observ

y se foto-document al microscopio invertido el resultado (10X, 20X), luego de 24
horas de incubacin. Los resultados se muestran en la siguiente figura (Figura 20)

56

COMPARACIN DE CLULAS HELA A 10X Y 20X A LAS 24 HORAS CON

LOS TRATAMIENTOS

10X

20X

Control

Alcohol

Tintura

Um 6c

Um 30c

Fig. 21 Imgenes de las clulas HeLa a las 24 hrs con los diferentes tratamientos
empleados, captadas con objetivo 10X y 20X.

57

Se determin la viabilidad por exclusin del azul de tripano, como se mencion en

el apartado de metodologa, encontrando los siguientes resultados.
A las 24 horas encontramos que en las clulas sin tratar y en las clulas en que se
aplic el tratamiento con el simulador (usando el agua despus de evaporar el
alcohol homeoptico), no se observaron alteraciones en la viabilidad celular (Fig.
21). En las condiciones con tratamiento de Ustilago maydis tintura, a la 6c y 30c al
microscopio solo se observaron algunas clulas muertas (ver mas adelante las
cuentas viables). En los tratamientos con Ustilago maydis a la 6c y a la 30c
aparentemente no se condiciono la viabilidad celular.

Por otra parte, en el experimento con la tintura de Ustilago maydis, la viabilidad fue
menor en comparacin con un control sin tratamiento, lo que indica que su
contenido lleva inhibidores del crecimiento o la proliferacin celular.

Por otra

parte, la viabilidad en el experimento con tintura tambin result menor al

compararla contra los tratamientos empleando las diluciones de Ustilago maydis a
la 6c y a la 30c. En el grupo de Ustilago maydis a la 6c, la viabilidad result ser la
mayor en comparacin con los dems grupos, al parecer las concentraciones
homeopticas permiten diluir la toxicidad de la tintura, de modo que la viabilidad
no solo no se afecta sino que los cultivos an parecen proliferar.
En la Figura 22 se muestra por separado el numero de clulas vivas y muertas
contabilizadas en cada condicin. Se presenta la media aritmtica Error
estndar. Encontramos que el nmero de clulas viables fue menor en el grupo
con la tintura de Ustilago maydis y por consiguiente hay una mayor viabilidad a la
6c y 30c contra el grupo que contiene el simulador.
58

VIABILIDAD DE CLULAS HELA IN VITRO A LAS 24 HORAS

(CLULAS VIVAS Y MUERTAS POR SEPARADO)
500000

Nm. de clulas

450000
400000
350000

300000
250000

200000
150000
100000

50000
0
Control

Alcohol

Tintura
Muertas

6c

30c
Vivas

Fig. 21. Viabilidad de clulas HeLa in vitro a las 24 horas. Control sin tratamiento, alcohol
dinamizado, Ustilago maydis -Tintura, Ustilago maydis 6c, Ustilago maydis 30c (*
p<0.05)

Finalmente cuando se estim el nmero de clulas muertas, nicamente se

encontraron diferencias estadsticamente significativas comparando con el grupo
tratado con simulador vs los experimentos realizados con tintura, 6c y 30c de
Ustilago maydis, el paquete estadstico usado es el SIGMA-STAT 3.1, la prueba
estadstica empleada fue la ANOVA (Anlisis de varianza mltiple) de una cola
va, y la prueba post-hoc fue Kruskall-Wallis, p> 0.005 (Fig. 21).

Las clulas tratadas con Tintura de Ustilago maydis tuvieron un incremento del
70% de la viabilidad; las tratadas con la 6c tuvieron un incremento del 75 % de
viabilidad y las clulas tratadas con la 30c tuvieron un incremento del 64 % de

59

viabilidad, las clulas tratadas con alcohol tuvieron un incremento del 75 %

comparadas con las clulas sembradas inicialmente con el control sin tratamiento
que fue del 83% (Fig. 22).

PORCENTAJE DE VIABILIDAD CELULAR DE CELULAS HELA

IN VITRO A LAS 24 HORAS

Fig. 22. Porcentaje de Viabilidad de clulas HeLa in vitro a las 24 horas. Control sin
tratamiento, alcohol dinamizado, Ustilago maydis -Tintura, Ustilago maydis 6c, Ustilago
maydis 30c (* p<0.05)

60

DISCUSIN
Al tratar con la tintura homeoptica, no solamente hubo menor viabilidad sino que
hubo muerte celular, la viabilidad baj hasta un 57% comparando con el control
del simulador (100%).
En este trabajo encontramos que las clulas tratadas con las diluciones de
Ustilago maydis a la 6c y 30c tuvieron una mayor viabilidad, con respecto a los
experimentos tratados con la tintura homeoptica.
Sin embargo al comparar el nmero de clulas muertas, la mayor proporcin de
clulas con muerte celular la presenta Ustilago maydis a la 6c, seguida por la
tintura y finalmente la 30c.
Por lo anterior podemos sugerir que la tintura madre de Ustilago maydis tiene
efecto, disminuyendo la proliferacin o deteniendo el ciclo celular y probablemente
por ello hay un nmero menor de clulas viables en la tintura, con respecto al
control (clulas no tratadas) y al grupo tratado con el simulador.
Aunque la dilucin a la 6c provoca ms muerte celular, no podra tener aplicacin
como antitumoral, ya que finalmente causa un aumento de la viabilidad, por lo que
se cree que puede estimular la proliferacin.
La dilucin a la 30c no podra tener aplicacin como antitumoral, ya que su
viabilidad semeja a la obtenida en los experimentos sin tratamiento y con el
tratamiento usando simulador. La muerte celular result ser ms bien baja en
esta dilucin 30c y por lo tanto no parece tener efecto modulador en la lnea

61

celular Hela bajo las presentes condiciones experimentales. Los principios txicos
de la tintura se diluyen tanto que se pierde el efecto citotxico.
No hemos encontrado que Ustilago maydis est reportado como antitumoral, pero
s se le han descrito toxinas como constituyentes.
En la literatura se han reportado a la ustilagenina y la ustilagotoxina que
corresponden a la ergotonina y ergotoxina del cornezuelo de centeno con virtudes
hemostticas y para promover y facilitar el parto; sin embargo no hay reportes de
los efectos de estos metabolitos sobre el ciclo celular y la viabilidad. No obstante,
estas toxinas podran ser las que estn modulando la viabilidad y la muerte celular
en nuestros experimentos, pero habra que caracterizar los componentes del
extracto para confirmar que contengan molculas con estas propiedades.
Por lo anterior consideramos que ms experimentos deben ser desarrollados a fin
de comprobar si realmente se est alterando el ciclo celular por el tratamiento con
Ustilago maydis y en este caso determinar a que nivel tiene su accin biolgica.

62

CONCLUSIONES
1. En las clulas control (no tratadas) y las clulas tratadas con el simulador,
(una solucin acuosa que resulta de evaporar el alcohol homeoptico), no
se afecto la viabilidad celular por cuentas viables y exclusin del colorante
azul de tripano.
2. En el grupo tratado con tintura de Ustilago maydis se encontr que la
viabilidad celular fue alterada (clulas muertas) adems que se mostr una
disminucin en el nmero de clulas vivas con respecto a los controles sin
tratamiento y las clulas tratadas con el simulador *control tipo mock.
3. Finalmente encontramos que las clulas tratadas con Ustilago maydis a la
6c y 30c tuvieron un mayor nmero de clulas viables con respecto al grupo
tratado nicamente con la tintura homeoptica,
4. Sin embargo el nmero de clulas muertas con tintura fue mayor que las
muertas en la potencia (6c) y menor que las muertas en la potencia (30c).
Indicando que la tintura contiene el efecto citotxico y este se diluye.
5. Por lo tanto la tintura de Ustilago maydis disminuye el nmero de clulas
viables con respecto a las clulas tratadas con Ustilago maydis a la 6c y
30c y adems presentan un nmero considerable de clulas muertas.
Por lo anterior sugerimos que se requieren experimentos adicionales a fin de
poder complementar estos resultados con ensayos de viablilidad y de muerte
celular relacionada con la inflamacin para elaborar mejores conclusiones.

63

PERSPECTIVAS
1. Determinar en las potencias menores (1c, 2c, 3c, 4c y 5c) el efecto del
Ustilago maydis en la viabilidad celular a fin de determinar si es
dependiente de la potencias.
2. Evaluar en diferentes tiempos el efecto de Ustilago maydis en los cultivos
celulares.
3. Emplear tcnicas moleculares como reduccin del MTT a fin de evaluar la
actividad mitocondrial; proliferacin celular por incorporacin de timidina 3H,
o bien por una tcnica que no emplea la radiactividad como la 5-carboxifluorescena o bien con alguna tcnica que determina la posible
genotoxicidad de la tintura de Ustilago maydis.

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