Espectrofotometra

Espectroscopa
La espectroscopa es el estudio de la interaccin entre la
radiacin electromagntica y la materia, con absorcin o
emisin de energa radiante.
Algunos de los primeras medidas experimentales realizadas
con biomolculas implicaban el estudio de su interaccin con
la radiacin electromagntica
Las radiacin electromagntica puede interaccionar de dos
formas con la materia:
ser absorbida, interaccin resonante o absortiva
o desviada, interaccin no resonante o dispersiva

La radiacin electromagntica
Longitud de onda (), distancia entre dos mximos
consecutivos (un ciclo)
Frecuencia (), n de ciclos hechos por la
onda en un segundo
Intensidad (I), n de fotones por
unidad de tiempo que atraviesan
la unidad de rea; est
relacionado con la amplitud del
vector elctrico (E)

E = h

!"
!
I1 = K E1
!!"
I 2 = K E2

: frecuencia
c: velocidad
: longitud de onda
E: energa
h: cte de Planck (6,62610-34 J s)

El nmero de onda ( ), es el nmero de ciclos completos por unidad de longitud

(normalmente se se mide en cm-1)

Espectro electromagntico
g
y su uso en mtodos
espectroscpicos
10

102

103

104

105

106

107

108

109

107

106

105

104

103

102

10

10-1

Rayos X

1017

1016

UV

Vis

1015

IR

1014

Microondas

1013

1012

Electrnica
Capa inter
Ca
interna
erna

1011

1010

Capa
externa

Cristalografa
Cris
Cr
istalografa
a de Espectroc.
UV-V
UV-Vis
-Vis
is
rayos X

Espectroscopa
Espe
Es
pectroscop
opa
infraroja y Rama
infraroja
Raman
man
n

spin electrnico
elect
lectrnico

Espect
Espectroscopa
ctro
roscopa de
microondas

Energa
(Jmol-1)

Radio

109

108

Cambios rotaciones de
Camb
Vi
Vibracional
y
rotaciones

Longitud de
onda (nm)

spin nuclear

RMN

Frecuencia
(s-1)

Tipo de
transicin

Tcnica

Estructura electrnica y radiacin

electromagntica
n=5
n=4
n=3

-0,8710-19 J
-1,3610-19 J
-2,4210-19 J

E3
E2

n=2

n=1

E1 = 16,3710-19 J;

1 = 121,4 nm

E2 = 19,3810-19 J;

2 = 102,5 nm

E3 =

20,4410-19

E1

-21,810-19 J

3 = 97,2 nm

J;

E =

-5,4310-19 J

hc

Diagrama de energa de una molcula diatmica

Las molculas posee estados de

energa cuanticados. Estos estados
dieren en la distribucin de los
electrones de valencia. Cuando los
electrones son promovidos a un
estado de mayor energa se dice
que han sufrido una transicin
electrnica.
La energa asociada a la radiacin
UV-Vis es suciente para promover
estas transiciones

Transiciones electrnicas en biomolculas

Conociendo las
transiciones electrnicas
posibles en una
determinada biomolcula
sera posible predecir si
absorber o no en la
regin del UV-Vis.Y al
contrario, conociendo
donde absorbe podemos
obtener informacin sobre
el tipo de transiciones que
tienen lugar
Transiciones posibles
con energas del
espectro UV/Vis

Transiciones que
requieren mayores
energas (i.e. rayos X)

Absorcin de la luz
La ley de Beer-Lambert
I

Io

dI
= '!I !c
dx

I: intensidad de la radiacin incidente

c: concentracin de la especie absorbente
: coeciente de extincin logartmico natural

Para una cubeta de paso de luz d irradiada con una

intensidad I0, la absorcin total vendr dada por la
integral:
d
dI
=
Io I 0 '!c !dx
I
ln 0 = '!d!c
I

En trminos de decaimiento logartmico

decimal resulta

A = log

Io
= !d!c
I

A: absorbancia de la solucin
solucin
c: concentracin de la solucin
: coeciente de extincin molar
l: longitud

La ley de Beer-Lambert

Transmitancia, T, o porcentaje de luz transmitida. Magnitud

adimensional , cuyo valor depende de la concentracin de soluto
segn una relacin de tipo exponencial (T = 10-cd)

T=

I
100
I0

Absorbancia, A, expresada como log(I0/I), permite calcular el

coeciente de extincin molar como la absorbancia de una
solucin 1 M de soluto con un paso ptico de 1 cm.

A = !d!c

Transmitancia/Absorbancia vs concentracin
100

1.5

A = !d!c
50

1.0

25

0.5

0.0

Absorbancia

Transmitancia

75

2.0

I
T = 100
I0

Concentracin

La transmitancia disminuye exponencialmente con la concentracin,

mientras que la absorbancia aumenta linealmente con la concentracin

Precisin en las medidas de absorbancia

Errores instrumentales
Concentraciones del analito muy altas o muy bajas
Imposibilidad de seleccionar una nica longitud de onda sino
un rango
Errores qumicos
Cambios en la ionizacin del analito
Cambios en el indice de refraccin de la muestra a
concentraciones elevadas
Interacciones soluto/radiacin distintas de la absorcin
(dispersin, ...)
Falta de uniformidad de la muestra y presencia de impurezas

Limitaciones (II)
A altas concentraciones la
relacin entre la absorbancia y
la concentracin deja de ser
lineal

1.5

Absorbancia

1.0

En la prctica la medida de la
absorbancia, y por tanto la
concentracin, es precisa entre
0,1 y 1,5 unidades de absorbancia

0.5

0.0

Concentracin

Aplicaciones de la espectroscopa UV-Vis

Cuanticacin de compuestos biolgicos
Colorimetras
Titulacin de reacciones enzimticas
Identicacin de cromforos
Caracterizacin de la unin de ligandos a
macromolculas
Cambios conformacionales de macromolculas
Desnaturalizacin y renaturalizacin de macromolculas

Factores de afectan a la absorcin UV/Vis

El ambiente qumico afecta al espectro de absorcin
observado:
Protonacin/desprotonacin (pH, Redox)
Polaridad del solvente
Efectos de orientacin
Mediante cambios en el espectro de absorcin podemos
probar el ambiente qumico de un cromforo

red shift, cambio hacia longitudes de onda ms altas

blue shift, cambios hacia longitudes de onda ms bajas
Efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia
Efecto hipocrmico, disminucin de la absorbancia

Estudio del mecanismo de reaccin de la HDC

Olmo et al. J. Biochem. 2002 vol. 132 (3) pp. 433-439

Espectrofotmetros
Es un equipo de medicin que produce una
banda angosta de radiacin espectral, llamada
luz monocromtica, y mide el grado de
interaccin entre la radiacin y la muestra.

Espectrofotmetros

Actualmente existen equipos que

permiten medir la absorbancia en
microvolmenes (0,5-2 L)

Cubetas
Las cubetas ms utilizadas tienen
un paso ptico de 10 mm.
Los volmenes necesarios para
medir pueden ser muy variables

vidrio

cuarzo

Las cubetas pueden ser de cuarzo (para

UV/Vis), vidrio (Vis) o plstico (Vis).
Hay que tener en cuenta que las cubetas
tambin absorben luz, por lo que siempre
hay que calibrar el espectrofotmetro

plstico

Fluorescencia y fosforescencia
La uorescencia y la fosforescencia es un fenmeno de emisin en el cual la
transicin desde niveles energticos superiores hasta niveles inferiores va
acompaada de radiacin.

10

10
10

Algunos uorocromos
NH
N
H2

H2 N

O
O

HO3S
BrN+
H2N

C
H2

H
N

H2
C

H2
C

OH

CH3

C2H5

Alexa Fluor 350

Bromuro de etidio
HO
O

Las biomolculas pueden marcarse con un grupo qumico

uorescente (uorocromo) mediante una reaccin
qumica simple, lo cual permite una deteccin sensible y
cuantitativa de la molcula.

OH
O

Fluoresceina

Espectro de excitacin
Mximo de excitacin (580 nm)

Espectro de excitacin

400

500
500
50
0

600
600
60
0

700

Molcula excitada

Cada uorforo posee

p
su propio
p p espectro
p
de excitacin con un mximo caracterstico

Espectros de emisin

Excitacin fuera del mximo

Fuentes de excitacin

Filtros

Espectrouormetros
La espectroscopa de uorescencia presenta una mayor sensibilidad que la
espectroscopa de UV/Vis, lo que permite trabajar a concentraciones muy bajas del
uorforo

Aplicaciones
http://sebbm.es/ES/divulgacion-ciencia-para-todos_10/pinacoteca_112/4#1

Fluorescencia intrnseca
Fluorescencia extrnseca
Quenching o desactivacin
Transferencia de energa
Microscopa de uorescencia
espectro de excitacin,
em = 340 nm
espectro de excitacin,
em = 340 nm
espectros de
emisin,
ex = 280 nm
espectro de
emisin,
ex = 295 nm

espectros de
emisin,
ex = 280 nm
espectro de
emisin,
ex = 295 nm

Introduccin al estudio
experimental y al
laboratorio cientco
Normas de seguridad y buenas prcticas en el
laboratorio. El mtodo cientco. Errores de medida.
Presentacin de los resultados. Publicacin

Normas de seguridad

Normas generales de seguridad

No fumar, comer o beber en el laboratorio
Utilizar una bata y tenerla siempre bien abrochada, as se proteger la
ropa
Guardar las prendas de abrigo y los objetos personales en un armario
o taquilla y no dejarlos nunca sobre la mesa de trabajo
No llevar bufandas, pauelos largos ni prendas u objetos que diculten
la movilidad
Procurar no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no
correr dentro del laboratorio
Si se tiene el cabello largo, recgeselo

Normas generales de seguridad (II)

Disponer sobre la mesa slo los libros y cuadernos que sean
necesarios
Tener siempre las manos limpias y secas. Si se tiene alguna herida,
taparla
No probar ni ingerir los productos
En caso de producirse un accidente, quemadura o lesin, comuncarlo
inmediatamente al profesor
Recordar dnde est situado el botiqun
Mantener el rea de trabajo limpia y ordenada

El mtodo cientco
observaciones y
experimentos

patrones, tendencias
y leyes

hiptesis

nuevos
experimentos para
probar las hiptesis

Teora

Las medidas y sus errores

mL
25

mL
25

20

20
15
10

15

10

> 20 mL y < 25 mL

> 23 mL y < 24 mL

El error depende del instrumento de medida

5 0,1

5 0,2

51

10

10

20

30

40

50

Las cifras signicativas

Son todos aquellos dgitos que pueden leerse directamente del aparato de medicin
utilizado, tienen un signicado real o aportan una determinada informacin, se conocen
con seguridad o se tiene cierta certeza
1.

Todos los dgitos distintos de cero son cifras signicativas

(5,004; 13,021; 10,310)

2.

Los ceros situados entre cifras signicativas tambin son cifras signicativas
(5,004; 13,021; 10,310)

3.

Los ceros situados al nal de un nmero y a la derecha del punto decimal, son cifras
signicativas (10,310)

4.

Los ceros que aparecen al nal de un nmero y a la izquierda de un supuesto punto

decimal, puede ser cifras no signicativas (3000)

5.

Los ceros que preceden al primer dgito no cero, no son cifras signicativas ya que tan
solo sirven para situar el punto decimal (0,0005)

Cuando expresamos un nmero en notacin exponencial todas las cifras de la parte

no exponencial son signicativas (5,120 x 10-5)

Las cifras signicativas en clculos

En sumas y restas, el nmero de cifras
signicativas a la derecha del punto decimal
viene determinado por el nmero de
decimales ms pequeo de todos los
nmeros originales

39,483
+ 3,2
17,63
60,313
se redondea a

60,3
En multiplicaciones y divisiones, el resultado debe tener el mismo
nmero de cifras signicativas que la cantidad con menor nmero
de ellas

4,3 x 3,14159 = 13,508837

se redondea a

14

Los nmeros exactos obtenidos a partir de deniciones o contando objetos tienen

un nmero innito de cifras signicativas

Publicacin
Un artculo cientco es un informe escrito y publicado que
describe resultados originales de una investigacin.
El idioma de la ciencia es el ingls, pero no toda la ciencia se
escribe en ingls. La ciencia en espaol no se escribe como en
ingls (http://www.biorom.uma.es/contenido/norm_escrit/index.htm).
Un artculo cientco se organiza en los siguientes apartados:
Introduccin
Material y Mtodos
Resultados
Discusin
Bibliografa

La libreta de prcticas
Al nalizar las prcticas se elaborar un cuaderno de prcticas que
debe estructurarse como si se tratase de una artculo cientco

Introduccin
Debe explicar la nalidad de la prctica, dando detalles sobre el
problema que se va a estudiar y los objetivos de la prctica. Debe ser
breve, clara y concisa.

Materiales y Mtodos
En este apartado se describen el material y los mtodos utilizados.
Debe estar lo sucientemente detallado para que que otras personas
puedan repetirlas y juzgar la validez de las conclusiones. Debe seguir
un orden lgico, que puede ser un orden cronolgico o no. Debe
recoger todas las modicaciones realizadas sobre el guin original,
esto es, todo lo que se ha hecho realmente en el laboratorio.

La libreta de prcticas (II)

Resultados y Discusin
Los resultados deben presentarse en orden lgico, utilizando las
observaciones que sean pertinentes. Los datos que se calculen han
de ir sucientemente explicados para poder seguir sin problemas el
razonamiento. No se puede olvidar de poner las unidades durante
todos los clculos realizados, es una buena forma de asegurarse que
el resultado nal posee las unidades deseadas. El texto debe estar
en relacin con las tablas y guras presentadas. En la discusin se
valorarn los resultados sealando la validez de los mismos y
comentando su signicado. No se trata de repetir, en diferente
orden, lo expuesto en el apartado de resultados.

Bibliografa
En este apartado aparecern los textos utilizados en la realizacin
de la libreta de prcticas.

Las libretas de prcticas

En el Campus Virtual encontrareis las instrucciones y un chero
modelo para realizar vuestro cuaderno de prcticas

Errores en las representaciones grcas

Defectos comunes en la presentacin de rectas

patrones. Diferentes tipos de letras en los ejes.
Numeracin innecesaria en los ejes. Faltan los
puntos experimentales.

Errores en las representaciones grcas (II)

A: Movilidad relativa (Rf) de patrones de peso

molecular en electroforesis de agarosa.
B: Recta patrn de concentracin proteica.
La lnea continua es la recta ajustada utilizando
todos los valores experimentales, la lnea
discontinua es la recta ajustada descartando los
puntos fuera de rango o erroneos.

Errores en las representaciones grcas (III)

Defectos comunes en la presentacin de grcas
xy.
La escritura vertical diculta la lectura. Los ejes
tienen diferente tipo de letra y carecen de
unidades de medida. No se indica el signicado de
los smbolos

Presentacin correcta de los datos de la gura de

arriba.
Unidades de medida en los ejes. Tamao correcto
de lso ttulos de los ejes. Signicado de los
smbolos explicado. Los smbolos se distinguen
fcilmente.

Errores en las representaciones grcas (IV)

Defectos comunes en la presentacin de histogramas

amas o diagramas de barras
barras. Diferenciacin
insuciente entre columnas, Smbolos a y b demasiado pequeos o inexistentes. Diferentes
tipos de letras en los ejes. Escalas diferentes en a y b, y numeracin innecesaria en los ejes.