Instituto Tecnolgico & de Estudios

Superiores de Monterrey
Vernica Avilez.
A01129237

[Seleccin de una mutante de Rhizobium

etli, cepa CFN42, biofertilizante y
biorremediadora de Metil Paratin.]
La relacin simbitica que existe entre bacterias y plantas representa
una contribucin directa a la nutricin de estas ltimas y a la desnitrificacin del
ambiente. Conforme la poblacin ha crecido se ha hecho primaria la necesidad
de aumentar la produccin de alimentos tales como las leguminosas; con la
finalidad de preservarlas ante cualquier plaga se han empleado diversas
sustancias qumicas que interfieren en la simbiosis planta-bacteria, pues se
afecta la nodulacin y la fijacin de nitrgeno. En este proyecto, gracias a una
presin de seleccin, luz ultra violeta y un proceso de gentica clsica se indujo
una mutacin a la bacteria fijadora natural de nitrgeno Rhizobium etli, cepa
CFN42, con la finalidad de seleccionar aquella degradara Metil Paratin,
insecticida organofosforado altamente txico, de modo que al combatir el
antagonismo entre plaguicida y fertilizante, actuara como biofertilizante
biorremedador. Los resultados de esta experimentacin permiten comprobar la
existencia de una mutante con una eficiencia degradadora de Metil Paratin de
30% superior a la wild type. Sugiriendo as que, debido a su frecuencia de
mutacin de 4.9x10^-5 se trata de una mutacin espontnea.

ndice
pp.
Introduccin....4
Marco Terico
Antecedentes Generales
I.
Bacterias fijadoras de nitrgeno.......5
i. Cianobacterias...
ii. Frankia..6
iii. Rhizobium......
II. Fijacin de nitrgeno......
i. Fijacin de nitrgeno en leguminosas............7
ii. Importancia biolgica.........8
III. Fertilizantes
i. Biofertilizantes.....9
IV. Plaguicidas....
i. Efectos colaterales10
Antecedentes Especficos
I.
Importancia de Rhizobium etli..
i. Genoma de Rhizobium etli......11
ii. Simbiosis Rhizobium etli-Phaseolus vulgaris .....12
II. Metil Paratin...........
i. Efectos del Metil Paratin .....14
Planteamiento del problema...15
Justificacin........
Objetivos
i.
ii.

Objetivos Generales.16
Objetivos Especficos...

Hiptesis...
Material & Mtodos
Materiales.17
Preparacin de medios de cultivo y antibiticos..
Preparacin y esterilizacin de antibiticos..
Mtodos18
Discusin & Resultados...19
Conclusin...21

Perspectivas
Referencias Bibliogrficas..22
Anexos
I.

Rhizobium etli
i. Imagen de la bacteria.23
ii. Genoma de etli. (Cromosoma y plsmidos).24
II. Metil Paratin
i. Especificaciones tcnicas..25
ii. Estructura Molecular..
III. Proyecto
i. Fotografas del experimento26

Palabras clave:
Simbiosis Rhizobium-leguminosa, Rhizobium etli, fijacin de nitrgeno, Metil
Paratin, nodulacin, biorremedador, biofertilizante, mutacin.
Introduccin:
El crecimiento que tiene una sociedad se basa principalmente de las
innovaciones tecnolgicas y cientficas en las que invierte econmicamente.
Una de las principales fuentes de ingresos que posee Mxico se encuentra
ligada, ya sea, directa o indirectamente a la agricultura. De modo que
basndose en el hecho de que sta representa un factor clave para el medio
ambiente y el desarrollo del hombre, satisfaciendo la demanda de alimentos
que existe; tambin se ha vuelto un motivo primario de contaminacin y
deterioro de recursos naturales. De ah que se derive la necesidad de emplear
prcticas y productos sustentables dentro de la agricultura capaces de
optimizar la productividad y al mismo tiempo conservar el ecosistema en el que
se trabaja.
Una de las soluciones que se ha brindado a este problema, es el uso de
microorganismos biorremedadores y biofertlizantes, los primeros se encargan
de atacar, ya sea absorbiendo o degradando cualquier contaminante que
afecte a la planta, y los segundos de optimizar el crecimiento y el
aprovechamiento de nutrientes de esta.
Si bien actualmente se ha tenido una amplia aceptacin hacia los
productos biotecnolgicos en materia agrcola, an queda mucho por hacer,
por ejemplo: hasta el momento no se ha estudiado a fondo la posibilidad de
combinar tanto la fertilizacin del cultivo, como su biorremediacin; ambos
factores clave para la productividad de este.
Partiendo del hecho de que simbiosis Rhizobium etli-Planta de frijol no
se desarrolla a cabo plenamente gracias al antagonismo que existe entre
plaguicida y fertilizante, se seleccion una mutante capaz de degradar el Metil
Paratin, de manera in vitro con una eficiencia de 30% ms que la wild type.
Creando as una mutante biorremedadora, la cual de no haber perdido su
capacidad de fijar nitrgeno, tendr tambin la cualidad de biofertilizar.

Marco Terico
Antecedentes Generales
I.

Bacterias fijadoras de nitrgeno

Un factor primordial para el desarrollo de la vida se basa en las bacterias

fijadoras de nitrgeno que habitan los suelos, al llevar a cabo este proceso son
capaces de fungir como biofertilizantes biolgicos. Se encuentran clasificadas
en bacterias simbiticas, propias de las leguminosas, y bacterias libres, las
cuales no necesitan de una planta para reproducirse
Una de las principales ventajas que ofrecen estas bacterias, es su larga
permanencia

en

los

suelos,

mismos

que

enriquecen

con

nitrgeno

regenerndolos y conservndolos. La mayora de ellas poseen funciones

protectoras, pues evitan que agentes exgenos afecten a la planta en la que se
encuentran, benefician directamente la productividad de la cosecha al
aumentar la germinacin de esta.
Las bacterias fijadoras de nitrgeno aportan un sinnmero de ventajas al
terreno en el que se encuentran, tanto en materia econmica, como ecolgica.

i. Cianobacterias
Las cianobacterias son capaces de llevar a cabo dos procesos
fundamentales para la vida, la fotosntesis oxignica y la fijacin de nitrgeno.
Este tipo de bacterias posee la habilidad de tomar el N2 del aire y de reducirlo a
amonio (NH4+), este proceso, como en las dems bacterias fijadoras, lo lleva a
cabo la enzima nitrogenasa, la cual posee una incompatibilidad con el oxgeno
obtenido en la fotosntesis, de manera que la bacteria suele separar a los dos
procesos, uno lo realiza en el da, y el otro solamente por la noche.

Los simbiontes empleados por las cianobacterias son en su mayora

plantas acuticas. Aparte de suministrarles el nitrgeno necesario, tambin son
capaces de incorporarlo a la cadena alimentaria, en la cual actan como
productores primarios o como descomponedores.

ii. Frankia
Los Frankia son un tipo de bacterias gram-positiva, fijadoras de
nitrgeno que viven una simbiosis con plantas actinoricicas. Estas plantas
pueden colonizar suelos escasos en nitrgeno o un alto estrs ambiental,
hecho que vuelve a las Frankia aptas para la regeneracin de suelos. Los
ndulos que se presentan en ese tipo de simbiosis son relativamente ms
simples que aquellos propios de las leguminosas. Una diferencia bsica entre
Frankia y Rhizobium, es su capacidad de resistencia al oxgeno; tambin, el
proceso simbitico es menos especfico.
iii. Rhizobium
Rhizobium es una bacteria gram-negativa capaz de fijar nitrgeno de
manera natural gracias a la enzima nitrogenasa. Son conocidas colectivamente
como rizobiaceas, palabra que proviene del griego riza, es decir raz, y bios,
que quiere decir vida. Para que este tipo de bacterias puedan llevar a cabo su
funcin, necesitan establecer una relacin simbitica con la planta que las
hospeda, ya que no son capaces de fijar nitrgeno por s mismas.

Las rizobiaceas habitan en el tallo de las leguminosas y una vez que se

encuentran ah, gracias a la nodulacin este tipo de bacterias comienza a
convertir el nitrgeno atmosfrico (N2) en amonio (NH4+); actuando as como
un fertilizante natural que le aporta a la planta lo necesario para poder vivir.
II.

Fijacin de nitrgeno

Uno de los elementos primordiales para la vida es el nitrgeno, pues

forma parte de componentes celulares, protenas y cidos nucleicos de
cualquier ser vivo. An a pesar de que ms del 80% de nuestra atmsfera
contiene este elemento, una gran mayora de seres vivos es incapaz de
aprovecharlo debido al triple enlace que existe entre sus tomos, y que lo hace
relativamente inerte. Para hacer aprovechable este elemento para cualquier
otro organismo, existe un tipo de bacterias capaces de reducir el nitrgeno (N2)
a (NH4+); este proceso se conoce como fijacin biolgica de nitrgeno.

Las bacterias fijadoras de nitrgeno, deben esta cualidad a la enzima

nitrogenasa, la cual obtiene la energa necesaria para funcionar de la
fotosntesis, enzima tras la cual deben su nombre. Una vez que estas bacterias
llevan a cabo esta fijacin, al resto de los seres vivos no les queda ms que
tomar el nitrgeno necesario.
Para que se pueda llevar a cabo esta fijacin, tiene que existir una
simbiosis, la cual se basa en una cooperacin del tipo metablica; as mismo,
existen tres tipos de simbiosis; las cuales se llevan a cabo entre dos especies
distintas; la primera es el mutualismo, en donde la relacin que se establece es
necesaria y resulta beneficiosa para ambos organismos. El comensalismo, en
la cual slo un simbionte se beneficia sin afectar al otro, y finalmente, el
parasitismo en donde un organismo se beneficia a costa del otro. La simbiosis
ms empleada por las fijadoras de nitrgeno es del tipo mutualista.

i. Fijacin de nitrgeno en leguminosas

Las rizobiaceas son uno de los organismos fijadores de nitrgeno ms
importantes que existe, pero para que puedan llevar a cabo este proceso
necesitan forzosamente estar en simbiosis con otro organismo, en este caso
una planta con el fin de obtener de ellas la proteccin que requieren. La
manera con la cual establecen relacin con las leguminosas es introducindose
en las clulas de sus races y nodulndolas, este tipo de estructuras les provee
un ambiente moderado en oxgeno, elemento que afecta el desarrollo de la
nitrogenasa, y les brinda una fuente de carbono, obtenida por la planta durante
la fotosntesis.
Entre las leguminosas que presentan una relacin simbitica con
bacterias tipo rizobiaceas encontramos a los chcharos (Pisum sativum), soya
(Glycine max), lentejas (Lens culinaris), alfalfa (Medicago sativa), entre otras.
Cabe destacar que las relaciones rhizobium-leguminosa suelen ser muy
especficas.

La simbiosis que ms destaca en Mxico es la establecida entre

Rhizobium etli - Phaseolus vulgaris (frijol), y es de suma importancia, pues le

permite a esta leguminosa crecer de manera adecuada.

ii. Importancia Biolgica

El nitrgeno es uno de los elementos esenciales para la vida, la
importancia de la fijacin biolgica de este no deriva solamente de su
contribucin a la nutricin de las plantas, sino tambin por lo que supone al
contrarrestar el nitrgeno combinado que pasa a la atmsfera por
desnitrificacin (Olivares, s.f).
Un cultivo que no posee la cantidad necesaria de nitrgeno, no crecer
de manera adecuada, la productividad de este no ser la ptima. Del mismo
modo, este proceso implica que la desnitrificacin en los suelos disminuya, ya
que es capaz de equilibrar el ambiente en el que se da. Teniendo as gran
relevancia econmica y ecolgica.
Otra implicacin directa de la fijacin de nitrgeno, es el impacto que
causa en los productos alimenticios del ser humano, mismos que deben de
crecer a la par de la explosin demogrfica; con la finalidad de abarcar la
demanda de alimento, el hombre ha hecho uso de fertilizantes nitrogenados,
recurso que se puede evitar si se tiene una buena fijacin de nitrgeno en los
suelos.
III.

Fertilizantes

Toda planta necesita de nitrgeno para poder crecer adecuadamente,

cuando las plantas no son capaces de obtener por s mismas los elementos
necesarios para su desarrollo, se hace uso de fertilizantes, mismos que
enriquecern el suelo en el que se rocen y favorecern el crecimiento vegetal.
Al hacer uso de fertilizantes nitrogenados, se le est brindando a la planta
artificialmente todos aquellos nutrientes que necesita.
Cabe aclarar que un fertilizante es de origen mineral, es decir, fabricado
por el hombre, de modo que el uso indiscriminado, que trae como
consecuencia una acumulacin de sales, provoca marchitamiento o bien la
muerte de las plantas. Si bien es importante un fertilizante que contienda con
las limitaciones que acarrea la falta de nitrgeno, tambin se deben de
considerar los efectos secundarios que puedan traer.

i. Biofertilizantes
Los biofertilizantes han surgido como una solucin al problema del
crecimiento de plantas, y que al mismo tiempo evita los efectos colaterales que
trae un fertilizante comn. Compuestos en su mayora por microorganismos,
los biofertilizantes buscan solucionar la incapacidad de la planta para absorber
los nutrientes requeridos.
Los biofertilizantes traen como beneficios no slo una optimizacin en el
desarrollo de la planta, sino tambin representan un costo menor, y un dao
ecolgico casi nulo. Uno de los organismos que se ha empleado como
biofertilizante son aquellas bacterias fijadoras de nitrgeno, tales como
rhizobium o frankia.
Otro recurso empleado para la conservacin del cultivo, son los
plaguicidas, los cuales tienen un antagonismo marcado con los fertilizantes.
IV.

Plaguicidas

Un plaguicida1 es aquella sustancia qumica que se emplea para matar,

repeler o bien impedir la proliferacin de plagas, las cuales pueden ir desde
insectos hasta pequeos mamferos que sean capaces de transmitir
enfermedades, o bien que daen al cultivo.
En 1980 tuvo lugar la revolucin agrcola, la cual precis del uso
indiscriminado de plaguicidas debido a su eficacia y bajo precio; la manera en
la que estos se aplicaron no pareca traer consecuencias aparentes, pero
estudios posteriores revelaron el dao ambiental que eran potencialmente
capaces de generar, si a eso se le ana que la mayora de las plagas a las que
se les ha administrado una dosis alta han desarrollado cierta resistencia al
plaguicida, el uso de estos resulta relativamente ineficaz.

La palabra pesticida en trminos exactos es un biocida capaz de eliminar al microorganismo

Yersinia pestis.

i. Efectos colaterales
Uno de los riesgos principales que se corre al utilizar un plaguicidas, es
el dao que se le puede generar especies diferentes del objetivo principal, por
ejemplo; un descenso en el nmero de organismos beneficiosos para el cultivo,
reduciendo de este modo la biodiversidad.
Otra consecuencia negativa es la capacidad de bioacumulacin que
poseen, existen ciertos plaguicidas que debido al alto grado de toxicidad que
poseen son capaces no slo de afectar a una generacin, sino a los
descendientes de esta. Esta capacidad que tienen de persistir en un ambiente
trae una serie de daos ambientales, y si a eso se le ana la capacidad de
difusin que poseen algunos plaguicidas, la contaminacin es an mayor.
Gracias a la resistencia que pueden adquirir ciertos organismos a un
plaguicida determinado, ha vuelto necesaria la utilizacin de un nuevo
plaguicida, o bien el aumento de dosis. Varios estudios cientficos han arrojado
evidencia del antagonismo que se encuentra presente entre plaguicidas y la
fijacin de nitrgeno (Fox y Gulledge, 2007; De la Vega, 2009), lo cual implica
que entre ms cantidad de plaguicida se emplee, peor ser la fijacin de
nitrgeno que la planta realizar.

Antecedentes Especficos
I.

Importancia de Rhizobium etli

Partiendo de que las rizobiaceas no son capaces de fijar el nitrgeno por

s mismas, y que necesitan de una planta en la cual hospedarse, se establece
una relacin biolgica-molecular entre la planta y la bacteria, el tipo de
simbiosis que se da, suele ser especfico, es decir, una bacteria determinada
para una planta establecida.
Rhizobium etli (R. etli), se encuentra en simbiosis con Phaseolus
vulgaris, es decir, la planta de frijol. La manera en la que R. etli lleva a cabo la
fijacin de nitrgeno, es gracias a la creacin de ndulos en la raz de la planta.

La relacin que mantienen ambos organismos es tan estrecha e imprescindible,

que la bacteria debe su nombre a la planta; etli, en Nhuatl significa frijol.
La importancia de R. etli radica en que permite que el frijol sea capaz de
ser cultivado en suelos pobres en nitrgeno sin que exista una necesidad
apremiante de fertilizantes qumicos.
i. Genoma de Rhizobium etli
En 2006 cientficos del Centro de Ciencias Genmicas (CCG) lograron
secuenciar el genoma de la bacteria Rhizobium etli por completo. Este genoma
se compone de 6, 530, 228 bp2, repartidas dos tipos de replicones; un
cromosoma circular (de aproximadamente 6 millones de pares de bases) y seis
plsmidos, mismos que se encuentran flotando libremente en el citoplasma de
etli, debido a su falta de ncleo. Cada replicn lleva a cabo una funcin distinta;
dentro del cromosoma se llevan a cabo la mayor parte de los procesos que
permiten el crecimiento celular; cabe resaltar que slo algunas rutas
metablicas esenciales se encuentran en los plsmidos.
De los seis plsmidos que contiene R. etli aquel que contiene lo
necesario para llevar a cabo la fijacin del nitrgeno, es el plsmido D, con 371,
254 bp, este plsmido es conocido en la literatura como plsmido simbitico
(pSim). Dentro de este existen numerosas enzimas encargadas de supervisar
la simbiosis que ocurre entre la leguminosa y la bacteria. Junto con los
plsmidos A, B, C, E y F, el pSim se encarga de permitir a la bacteria lidiar con
el ambiente en el que se encuentre.
Una de las ventajas que conlleva el conocer el genoma completo de R.
etli, es que se conoce el material gentico exacto presente en plsmidos (el
cual va de un 25% hasta un 50%). Pero sobre todo, se ha podido comprobar
que el pSim presenta una elevada cantidad de secuencias reiteradas, mismas
que representan sitios potenciales para ser usadas en recombinacin, y por
ende idneas para explicar el nivel de conservacin de secuencia de ADN.
(Rodrguez, 2010).

Para ver una imagen del genoma de Rhizobium etli ver anexos

ii. Simbiosis Rhizobium etli-Phaseolus vulgaris

La relacin entre la planta del frjol y R. etli es una simbiosis de tipo
mutualista, pues ambos se ven beneficiados con ella; se ha observado que si
se aslan ambos organismos, la planta se desarrollara de manera deficiente y
carecera de nutrientes.
El proceso de simbiosis comienza tras un reconocimiento mutuo, el cual
se da gracias a seales qumicas; la primera seal es provista por la planta al
momento de secretar flovonoides, las cuales son molculas de un peso
molecular relativamente bajo que son captadas por R. etli gracias a uno gen
llamado NodD (el cual se encuentra contenido dentro del pSim); una vez que
ocurre esto, se desencadena la expresin de otros genes cercanos a este, se
necesita de este reconocimiento qumico para que la infeccin y penetracin de
la bacteria se d de manera efectiva. Una vez dentro, se libera un compuesto
lipopolisacardico el cual incita deformaciones en los pelos radiculares de la
raz.
Es durante la fase de penetracin que R. etli comienza a nodular a la
planta, los ndulos son vesculas especializadas en los cuales R. etli
permanecer hasta el fin de la simbiosis. Una vez que esto sucede, la
cooperacin metablica inicia, por un lado la fotosntesis llevada a cabo por
planta se encarga de reducir el CO2 en azcares, los cuales son transportados
a la raz, lugar en donde la bacteria los ocupar como suministro de energa,
para proveer el ATP (de 20 a 30 molculas, 200 kcal aproximadamente)
necesario para la fijacin de nitrgeno, proceso que reducir el N2 a NH4+.
El proceso de fijacin tiene lugar nicamente en el pSim de R. etli y es
llevado a cabo por la Nitrogenasa (la cual se encuentra codificada por tres
genes llamado nifHDK, los cuales se expresan de manera paralela). Cabe
recalcar que la nitrogenasa slo es capaz de funcionar en ausencia de oxgeno,
por lo que R. etli, a travs de la enzima Leghemoglobina, aprisiona al oxgeno y
limita la concentracin de este dentro del ndulo. De modo que, la importancia
en la simbiosis del pSim es tal, que sin l, simplemente R. etli no sera fijar
nitrgeno, pues no nodulara a la planta.

iii. Rhizobium etli como biofertilizante.

Etli es conocida por la excelente capacidad de fijacin de nitrgeno que
posee, del mismo modo se ha descubierto que la presencia de esta bacteria
disminuye las posibilidades de ataque de Fusarium solani, responsable de
marchitar a la planta (Estvez, et al., 2000).
Esta bacteria sin duda ha sido estudio de la comunidad cientfica, por las
caractersticas que posee, mismas que le confieren la capacidad de biofertilizar
el cultivo en el cual habite.
El Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y
Pecuarias (INIFAP) reporta que en el periodo otoo-invierno de 2008-200 R. etli
fue el biofertilizante que logr conseguir el porcentaje ms alto de eficiencia en
el cultivo.
Del mismo modo, una investigacin realizada por la Sede Universitaria
Municipal de Fomento S. Spiritus Cuba con Rhizobium etli en suelos arenosos
y parcialmente secos arroj que el rendimiento y la germinacin (95% ms) en
los cultivos era considerablemente mejor en donde haba presencia de
Rhizobium.
Un proyecto similar, realizado por parte de la Universidad Michoacana
de San Nicols de Hidalgo, propone la seleccin de una mutante que sin perder
la capacidad de fijar nitrgeno, fuese resistente al plaguicida Diazinn. Cabe
resaltar que al ser resistente, no lo quitaba del medio, sino solamente no se
vea afectado por el plaguicida, de modo que no puede ser considerada como
una mutante biorremedadora.

II.

Metil Paratin

El Metil Paratin3 es un insecticida organofosforado de fcil solubilidad

con disolventes orgnicos, capaz de inhibir las seales qumicas de la
simbiosis Rhizobium etli-leguminosa, por lo que la fijacin de nitrgeno no se
realiza de manera ptima.

Informacin tcnica en anexos.

Datos del Instituto Nacional de Estadstica y Geografa (INEGI, 2005)

revelan que mientras que el uso de Metil Paratin se encuentra prohibido en
diversos pases como Estados Unidos, Suecia, Alemania, Noruega o Japn; en
Mxico est permitido. De hecho, de 90 de los pesticidas considerados como
peligrosos, o perjudiciales con el medio ambiente, 30 de ellos estn permitidos
en Mxico.
Una de las principales caractersticas de este insecticida, es que basa su
toxicidad, o bien, su capacidad de degradacin en la temperatura y el tipo de
suelo en el que se encuentra, el grado de persistencia es mayor conforme el
clima se vuelve ms clido; cabe recalcar que el Metil Paratin es el insecticida
ms usado en el estado de Morelos.
El mecanismo de accin con el cual se sabe que el Metil Paratin est
haciendo efecto, es cuando hay una inhibicin de la acetilcolinesterasa, enzima
encargada de la regulacin del neurotransmisor acetilcolina.
Segn el Centro Panamericano de Ecologa Humana y Salud este
compuesto tarda aproximadamente 6 das en ser biodegradado, siempre y
cuando est presente en cantidades razonables (< 100ppm), una vez que se
excede, su degradacin tarda significativamente. Si se parte de la idea de que
ciertas plagas han desarrollado una cierta resistencia a los plaguicidas, y que
se ha tenido que aumentar la dosis de estos, entonces la concentracin a la
que estos se encuentran en los suelos es relativamente alta, por lo que la
degradacin no se puede llevar a cabo en el tiempo establecido.
i.

Efectos del Metil Paratin.

En el caso que el Metil Paratin es esparcido es a travs del aire, se

corren riesgos de afectar no slo a la plaga deseada, sino tambin a
organismos beneficiosos para el cultivo, como polinizadores; de hecho,
estudios revelan que las abejas son especialmente susceptibles a este
plaguicida (Hertel, s.f).
Una caracterstica importante de este plaguicida, es su bajo potencial de
bioconcentracin, y no se transmite de generacin en generacin; de hecho
existen organismos que, con su debido tiempo, pueden metabolizarlo.

Planteamiento del problema.

La inversin econmica que supone el hecho de emplear una gran
cantidad de fertilizante deriva del antagonismo que ocurre entre este y el
plaguicida empleado en la cosecha, mismo que afecta la nodulacin de la
planta, y por ende, la fijacin de nitrgeno que esta realiza.
Con la finalidad de evitar esta discrepancia, se plante la posibilidad de
encontrar una mutante de Rhizobium etli, cepa CFN42, capaz de fijar nitrgeno
mientras se encuentra en el ndulo, y de degradar al plaguicida Metil Paratin
una vez fuera de este.
Justificacin.
Rhizobium etli es una bacteria que, gracias a su capacidad fijadora de
nitrgeno, ha sido implementada como biofertilizante en numerosas ocasiones,
pues mejora la productividad y el rendimiento de la produccin agrcola. Del
mismo modo, con la finalidad de preservar el cultivo, se ha hecho uso de
plaguicidas como el Metil Paratin, ms utilizado en el estado, que aunado al
tipo de suelo y temperatura que Morelos presenta, resulta daino tanto para la
simbiosis existente entre Rhizobium-leguminosa, como para el medio en el que
se desarrolla.
Con la finalidad de vencer este antagonismo se han empleado bacterias
resistentes a los plaguicidas, pero nunca una capaz de aprovecharlo como
fuente de alimento. Si bien el Metil Paratin es degradado rpidamente y no es
transferido a travs de la cadena trfica, puede generar efectos secundarios
nocivos si no es metabolizado rpidamente por las plantas.
De modo que aprovechando la ventaja, ya empleada anteriormente, que
tiene Rhizobium etli como fertilizante natural y partiendo con la idea de
degradar el plaguicida y no solamente de tolerarlo, es que se someti a la cepa
CFN42 de Rhizobium etli a una presin de seleccin, con la finalidad de
encontrar aquella que, sin perder su capacidad innata de fijar nitrgeno, sea
tambin capaz de degradar al plaguicida.

Objetivos
Objetivos Generales.

Seleccionar una mutante de Rhizobium etli, cepa CFN42 capaz

de degradar el plaguicida contaminante Metil Paratin.

Crear un producto totalmente autosustentable que cumpla con las

caractersticas de biorremediar y biofertilizar.

Objetivos Especficos.

Lograr que la mutante de Rhizobium etli no pierda su capacidad

de fijar nitrgeno.

Verificar que las bacterias mutantes degradadoras de Metil

Paratin son nicamente Rhizobium etli.

Identificar la dosis mnima bajo la que puede estar sometida la

bacteria R. etli

Hiptesis.
Si se selecciona una mutacin de Rhizobium etli capaz de degradar Metil
paratin y que a su vez, no pierda o disminuya la capacidad de fijar nitrgeno,
la mutacin no habr sido pleiotrpica, pues habr afectado slo una ruta
metablica.

Material & Mtodos

Preparacin de medios de cultivo y antibiticos.
Medio PY.
Peptona de casena

5 g/l

Extracto de levadura

3 g/l

Agar

15 g/l

Autoclavear a 120 C durante 20 min.

Agregar 1 ml de una solucin de CaCl2 0,7 M por cada 100 ml de medio.

Solucin de CaCl2 0,7 M

7.769 g de CaCl2 en 100 ml H2O
Autoclavear a 120o C durante 20 min.

Medio LB.
Extracto de levadura

5 g/l

Peptona de casena
NaCl

10 g/l
10 g/l

Autoclavear a 120 C durante 20 min.

Nota: En caso de utilizar medios slidos, se adicionan 15 g/l de agar bacteriolgico
antes de esterilizar en la autoclave.

Preparacin y esterilizacin de antibiticos.

Antibitico

Solucin stock

cido Nalidxico (Nal20)

20 mg/ml de NaOH 0.1 M

Nota: Los antibiticos se esterilizan por filtracin con membrana de 0.22.

Mtodos
1. Se hizo crecer la cepa CFN42 de Rizhobium etli en un medio rico en
nutrientes (PYNal20).
2. Posteriormente, dichas bacterias fueron introducidas en un medio
mnimo, con la finalidad de someterlas a un proceso de seleccin
forzada: en el que agotaran sus reservas energticas.
3. Se eligen las R.etli sobrevivientes, y se les coloca en un medio pobre en
nutrientes con la dosis mnima de Metil Paratin, forzando as que a la
bacteria busque su fuente de carbono necesaria en la estructura qumica
del insecticida.
4. Esta cepa, fue sometida a una radiacin UV durante diferentes intervalos
de tiempo (30 seg, 60 seg y 90 seg); forzando as a la bacteria a mutar.
5. Las mutaciones fueron seleccionadas en cajas con medio mnimo,
introduciendo al Metil Paratin como nica fuente de carbono.
6. A travs de un mtodo llamado screening, se cuantific la actividad
especfica de la bacteria.
Actividad Especfica Degradacin de Metil Paratin
1. Preparar tubos con 3 ml de medio de cultivo e inocular cada uno con la
cepa de inters. Agitar con el vrtex e incubar durante toda la noche a la
temperatura apropiada.
2. Dividir el cultivo en dos tubos eppendorf, cada uno con 1 ml. Una de las
muestras se usar para cuantificar protena total, y la otra para
cuantificar la degradacin del pesticida.
3. Centrifugar el tubo con la muestra para medir degradacin de pesticida
durante 3 min a 13 000 rpm.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender con vrtex al paquete celular en
1 ml de TRIS-HCl 10 mM, pH=9, o en agua estril.
5. Centrifugar durante 3 min a 13 000 rpm a 4o C.
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender con vrtex al paquete celular en
1 ml de TRIS-HCl 10 mM, pH=9.
7. Adicionar al paquete celular 15 ml de SDS al 0.1% y 30 l de
Cloroformo.

8. Resuspender con vrtex a velocidad 3 durante 10 seg.

9. Dejar reposar durante 2 min a temperatura ambiente.
10. Preparar las siguientes soluciones de acuerdo a la tabla gua
proporcionada a continuacin:
Volumen de la
muestra
Blanco
Muestra

200 l

Volumen TRIS-HCl
10 mM, pH=9
998 l
798 l

Volumen de Metil
Paratin 10 000 ppm
2 l
2 l

Si se desea cuantificar empleando el equipo Synergy, usar la siguiente tabla:

Volumen de la
muestra
Blanco
Muestra

40 l

Volumen TRIS-HCl 10
mM, pH=9
199.6 l
159.6 l

Volumen de Metil
Paratin 10 000 ppm
0.4 l
0.4 l

11. Medir la degradacin del Metil Paratin en un espectrofotmetro

calibrado a una = 410 nm cada 10 min durante 1 hr.
12. Normalizar los datos obtenidos con respecto a la protena total, para as

obtener la actividad especfica.

Discusin & Resultados.
Se obtuvo una poblacin total de 490,000 bacterias, y se obtuvieron
aproximadamente 270 colonias de mutantes, se seleccionaron aquellas
candidatas degradadoras de Metil Paratin, es decir aproximadamente unas
24. La frecuencia de mutacin fue de 4.9x10-5, y la frecuencia bajo la cual mut
la cepa fue de 2.04x10-6 basndonos en esos datos, se podra considerar que
la mutacin se dio de manera espontnea.
A partir de las presuntas colonias mutantes, se extrajo la protena total,
cuantificada por el mtodo de Lowry. Simultneamente, se hicieron cinticas de
degradacin de Metil Paratin, las cuales fueron medidas a una longitud de
onda de una = 410 nm. La relacin de la cintica de crecimiento con la
concentracin de protena total, nos permite obtener una medida normalizada
llamada Actividad Especfica, cuyas unidades son: nm/min/mg de protena.

Si se comparan los resultados obtenidos de manera in vitro entre la wild

type y la mutante de Rhizobium etli elegida (Mutante 3), se observa claramente
que en materia de degradacin de Metil Paratin, la supera en un 30%; ahora
bien, para que un biorremedador sea considerado un xito, debe de tener un
20% de eficiencia.

Se sabe que el Metil Paratin, al momento de ser lisado, es capaz de

absorber una longitud de onda de 410 nm, de modo que todo lo que se
encuentre por encima del control, que no es otra cosa sino el plaguicida solo,
estar indicando que existe cierta degradacin. De modo que observando esa
grfica, se puede afirmar que la mutante 3 es la que mejor realiza esta
degradacin.
Los resultados de este proyecto arrojan que si la mutante elegida es
capaz de degradar al plaguicida en un 10% ms que los biorremedadores
normales, y a su vez, no ha perdido an la capacidad de fijar nitrgeno, esta
mutante se perfila como una candidata perfecta a considerarse como
biofertilizante biorremedador.

Conclusin.
La bacteria Rhizobium etli es una fijadora natural de nitrgeno, la cual ha
demostrado tener un gran potencial. Formada por un plsmido especializado
en dicha fijacin, refleja un alto grado evolutivo an a pesar de ser un
procarionte, pues las funciones que realiza son de un grado de complejidad
alto. Cuando la bacteria se somete bajo un proceso de presin de seleccin,
esta se ve obligada a contender contra colonias de ella misma, de modo que
slo aquellas ms fuertes sobreviven. Estas ltimas, sern las que posean una
capacidad de adaptacin mayor, y por ende sern candidatas potenciales a
mutantes.
Se debe de recordar que no todas las mutaciones son dainas para
aquel que las presenta; a travs del tiempo el hombre ha hecho mutar a varios
organismos con la finalidad de mejorar sus caractersticas fenotpicas o bien las
funciones que es capaz de realizar. En este proyecto se seleccion una
exitosamente una mutante degradadora de Metil Paratin en un 30% ms que
la wild type. Esta mutante, por el simple hecho de ser del gnero de las
rizobiaceas est predispuesta a cumplir con la funcin de fijar nitrgeno; pero,
tambin se debe de recordar que un cambio en el genoma, y ms en una ruta
metablica tan importante como lo es la de la alimentacin, puede traer efectos
colaterales, los cuales tiene que ser controlados.
La mutante 3 de Rhizobium etli aparenta cumplir con los requisitos de un
organismo biofertilizante y biorremedador.
Perspectivas.

Comprobar que la capacidad de fijar nitrgeno no se haya perdido o bien

disminuido.

Probar la capacidad de degradacin que posee la mutante in toto.

Mapear el sitio en el que ocurri la mutacin.

Analizar si este cambio en el genoma no afect otras rutas metablicas

importantes dentro de la planta.

Ver qu otros componentes, quizs con estructuras similares al Metil

Paratin, es capaz de degradar.

Verificar que la mutacin no haya afectado la ruta metablica encargada

de controlar la liberacin del oxgeno, pues en ese caso, la fijacin se
vera afectada.

Cuantificar si la cantidad de energa liberada al degradar Metil Paratin

in vivo es equivalente o superior a aquella que aporta la fotosntesis, (De
20 a 30 molculas de ATP, es decir 200kcal aproximadamente).

Comparar el genoma de la wild type y de la mutante.

Referencias Bibliogrficas

Agencia de Proteccin Ambiental. (1987). Metil paratin: efectos sobre la salud

y el ambiente. Mxico.
Recuperado de: http://www.bvsde.ops-oms.org/bvsacd/eco/000849.pdf

Barney, M., and Downie, J.A. (1993). ldentification of the NodC protein in the
inner but not the outer membrane of Rhizobium leguminosarum. MOI. PlantMicrobe Interact. 6, 669-672.

Bioagricultura. (2011). Extraordinarios resultados en maz y frijol con

biofertilizantes. Mxico.
Recuperado de: https://bioagricultura.wordpress.com/tag/rhizobium-etli

De la Vega-Salazar M. Y., Et al. (1999) Methyl Parathion Impact on Water

Sediment and Benthic Macroinvertebrates from the Ignacio Ramirez Dam in
Mexico. Toxicological and Environmental Chemistry. 71: 81-93.

De la Vega-Salazar M. Y., Et. Al. (1997) Bioaccumulation of Methyl Parathion

and Its Toxicology in Several Species of the Freshwater Community in Ignacio
Ramirez Dam in Mexico. Ecotoxicology and Environmental Safety 38: 53-62.

Fioravante, I. A.,I.A., Barbosa, F. A. R.,F.A., Augusti, R.,R., & Magalhes, S. M.

S.,S.M. (2010). Removal of methyl parathion by cyanobacteria microcystis
novacekii under culture conditions. England:
Recuperado de: http://search.proquest.com/docview/733258286

Gage, D. J. 2004. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing

rhizobia during nodulation of temperate legumes. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
68:280-300.

Gonzlez, V., Santamara, R., Bustos, P., Ramrez, M. & Jimnez, V. (2006)
The partitioned Rhizobium etli genome: Genetic and metabolic redundancy in
seven

interacting

replicons.

http://www.ccg.unam.mx/retlidb

Mxico.

Recuperado

de:

Gonzlez-Pasayo, R.,R., & Martnez-Romero, E.,E. (2000). Multiresistance

genes of rhizobium etli CFN42. United States:
Recuperado de: http://search.proquest.com/docview/71084674

Limpens, E., and T. Bisseling. 2003. Signalling in symbiosis. Curr. Opin. Plant
Biol. 6:343-350.

Snchez, C. (2010). La bacteria Rhizobium etli y su utilidad en los estudios de

recombinacin. Mxico. Recuperado de: http://hypatia.morelos.gob.mx

Sawada, H. & Kuykendall, Ld. (2003). Changing concepts in the systematics of

bacterial nitrogen-fixing legume symbionts. Japan :
Recuperado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12949698

Udvardi, M. K., and D. A. Day. 1997. Metabolite transport across symbiotic

membranes of legumes nodules. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
48:493-523.

Vance, C. P. 2001. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorus acquisition.

Plant nutrition in a world of declining renewable resources. Plant Physiol.
127:390-397.

Anexos

Rhizobium etli

Genoma de
Rhizobium etli

Plsmido A

Plsmido B

Plsmido C

Plsmido D (pSim)

Plsmido E

Plsmido F

Cromosoma

Informacin especfica del Metil Paratin

Nombre qumico (IUPAC): O,O-dimetil O-4-nitrofenil fosforotioato.

Frmula molecular: C8H10NO5PS
Peso molecular: 263.2 gr.
Presentacin: Polvo o slido cristalino.
Color: Blanco.
Punto de ebullicin: 154 C.
Punto de fusin: 35 C.
Densidad relativa : 1.358 a 20 C.
Solubilidad en agua: 55 mg/L a 20 C.
Soluble en: etanol, cloroformo y disolventes alifticos.
Presin de vapor: 0.2 mPa a 20 C.
Hidrolizable en: medios cidos y alcalinos.

Estructura Molecular

Bacterias candidatas para

degradadoras de Metil
Paratin.
(PyNal20)

Rhizobium etli mutantes,

degradadoras de Metil
Paratin.
Mutante Seleccionada: # 3.
(PyNal20)