Camaron

Programa de Estudios de Posgrado
Estudio sobre el rgano genital del camarn blanco del

Pacfico Litopenaeus vannamei (Boone), con nfasis en la
glndula andrognica
TESIS
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias
Uso, Manejo y Preservacin de los Recursos Naturales
( Orientacin Acuicultura )
Presenta
RODOLFO GARZA TORRES
La Paz, Baja California Sur, Noviembre de 2011
CONFORMACIN DE COMITS
Co-directores:
COMIT TUTORIAL
Dr. Rafael Campos Ramos (CIBNOR, S.C.).
Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez (CIBNOR, S.C.).

Tutores:
Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra (CIBNOR, S.C.).

Dr. Gopal Murugan (CIBNOR, S.C.).
Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz (UANL).
Dr. Rafael Campos Ramos.
COMIT REVISOR DE TESIS
Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez.
Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra.

Dr. Gopal Murugan.
Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz.
Dr. Rafael Campos Ramos.
JURADO DE EXAMEN DE GRADO
Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez.
Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra.

Dr. Gopal Murugan.
Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz.
Dra. Danitzia Adriana Guerrero Tortolero (Suplente).

Dr. Claudio Humberto Meja Ruz (Suplente).
PREFACIO
El presente trabajo de tesis doctoral comprende los siguientes artculos

publicados:
I.
Garza-Torres, R., R. Campos-Ramos, y
A. M. Maeda-Martnez. (2009).
Organogenesis and subsequent development of the genital organs in female

and male Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture
296: 136-142.
II.
Garza-Torres, R., A. M. Maeda-Martnez, D. A. Guerrero-Tortolero, H. ObregnBarboza y R. Campos-Ramos. (2011). Description of meiosis in female and male
Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Decapoda: Penaeidae). Journal of
Crustacean Biology 31 (1): 75:81.
RESUMEN
En la acuicultura, el crecimiento de las especies es la caracterstica ms
importante para la rentabilidad de la industria. En peneidos existe dimorfismo sexual

en donde las hembras tienen un mayor crecimiento en comparacin con los machos.
La reversin sexual del camarn blanco Pacfico Litopenaeus vannamei podra
contribuir a una mayor produccin en la camaronicultura a travs del cultivo

monosexual de hembras. En Malacostraca (ispodos, anfpodos y decpodos), el
rgano responsable de determinar la masculinidad es la glndula andrognica (GA).
Sin embargo, el conocimiento sobre el desarrollo, funcin y control de esta glndula
son prcticamente nulos en especies comerciales de peneidos. Con este conocimiento

se tendran las bases para emprender ensayos de reversin sexual en el camarn
blanco y finalmente integrar una biotecnologa como cultivo monosexual de hembras
a la industria. En el presente estudio, se realizaron 4 investigaciones concernientes al

estudio de la GA en machos de camarn blanco, incluyendo el desarrollo de esta
durante la organognesis del aparato genital, su funcin en el mantenimiento de la
espermatognesis en relacin con el ciclo de muda, el control endocrino proveniente
de la glndula sinusal que se encuentra en el tallo ocular y el efecto que tiene al ser
ablacionado, adems de un anlisis molecular de su expresin. Se describe
organognesis y el desarrollo subsecuente del rgano genital a partir de postlarvas

(PL) de L. vannamei. El rgano genital de cada sexo se reconoci por completo a travs
de la diseccin en el da PL16. Este se observa como un lbulo bilateral en la parte
anterior al hepatopncreas, conectados a un tubo colector que se extiende

dorsalmente hacia la regin posterior en forma de U invertida, de este tubo se
proyectan bilateralmente 8 lbulos, un oviducto, y un lbulo posterior en hembras, y 7

lbulos en el macho adems de los vasos deferentes. Alrededor de PL50, se evidencia
la diferenciacin sexual externa con la formacin del tlico en hembras y los
gonoporos en machos, y es cuando se forma la GA en los vasos deferentes rodeado de
un tejido conectivo el cual lo conecta al 8 lbulo testicular. La diferenciacin de la
gnada ocurri a partir de PL68, en donde fue posible distinguir entre ovario y
ii
testculo. Con el objeto de establecer una relacin entre la gametognesis y el ciclo de
muda, se analizaron las etapas de la profase meitica I en cada uno de los estadios de
ecdisis en ambos sexos. Se observaron clulas meiticas en etapa de cigoteno,
paquiteno (denotado por la completa sinapsis de sus bivalentes) y diploteno en los

estadios de inter-muda, pre-muda y post-muda temprana y tarda, lo cual sugiere que
no existe una relacin entre esos 2 procesos. Se realiz un bioensayo para analizar el
efecto de la ablacin unilateral y bilateral de los tallos oculares sobre el rgano genital
y la GA. La ablacin en ambos grupos mostr un efecto significativo en el peso total del
rgano genital con respecto al grupo control. Los conteos espermticos se
incrementaron significativamente en el grupo bilateral (6X106) respecto al unilateral

y control (2X106). En cortes histolgicos se logr observar en ambos grupos
ablacionados, un incremento en el nmero de clulas en la GA del vaso deferente
medio y el mpula terminal, lo cual denota una hiperplasia producida una semana
despus de la ablacin. Por ltimo, se disearon oligos a partir de las secuencias

nucleotdicas de la GA en decpodos reportadas en GenBank. Se obtuvieron
amplificaciones de ADNc por RT-PCR en tejido del vaso deferente medio y mpula
terminal. La secuencia de este producto fue similar a las publicadas en peneidos y su
traduccin peptdica tiene la misma estructura del tipo-insulina que muestran los
dems decpodos para la hormona de la GA. El conocimiento general que se obtuvo en
este trabajo sobre la GA ayudar a prximos estudios enfocados a la produccin de

cultivos monosexuales en el camarn blanco.
Palabras clave: L. vannamei., glndula andrognica, diferenciacin sexual
Dr. Rafael Campos Ramos

Co-director de tesis
Dr. Alejandro M. Maeda Martnez

Co-director de tesis
iii
ABSTRACT
In aquaculture, growth is the most important characteristic for the profitability
of the industry. Peneid shrimp have a gender dimorphism, where females grow larger
than males. Sex reversal of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei could
contribute to the mayor production of the shrimp farming trough an all-female
culture. In Malacostraca (isopods, amphipods and decapods), the androgenic gland

(AG) is the responsible for their maleness. However, knowledge in the development,
function and control of the AG are practically null in commercially reared peneids.
This knowledge can create the foundations to undertake sex reverse essays on the
white shrimp and finally integrate a biotechnology that could produce a monosexual
culture in shrimp. In the present work, 4 AG investigations were carried out, including
its development during the organogenesis of the genital organ, its function in the
maintenance of the spermatogenesis related to the molt cycle, its endocrine control
from the sinus gland in the eyestalk, and the effect if ablated, plus a molecular analysis
of its expression. Timing of the organogenesis and subsequent development of the
genital organ of females and males of L. vannamei is here described. The genital organ
was fully recognized from postlarve day-16 (PL16) as a bilateral lobe located in the
anterior region of the midgut gland that connects to an anterior collector tube that
extends dorsally towards the posterior region and forms an inverted U-shape
collector. 8 lobes, an oviduct, and a posterior lobe in females and 7 lobes including the
vas deferens in males, are connected bilaterally along the collector tube. Around PL50,
where external gender differentiation is recognized as the thelycum in females and
the gonopores in males, the AG appears along the vas deferens, surrounded by
connective tissue that attaches it to the eighth testicular lobe. Gonad differentiation
occurred from PL68, where it was possible to differentiate the female ovary from the
male testes. The meiotic prophase I stages were analyzed in both genders on each
molt stadium to establish if the gametogenesis and the molt cycle are related. Meiotic
cells at zygotene, pachytene, (recognized by the complete synapsis of the bivalents)
and diplotene stages were observed at inter-molt, pre-molt, and early and late post-
iv
molt stages in all individuals, which suggests that there is no relationship between
molting and the meiotic prophase. A bioassay to analyze the effect of the unilateral
and bilateral eyestalk ablation over the genital organ and the AG was conducted.
Ablation in both groups caused a significant effect over the total weight of the genital
organ over the control group. Spermatic counts also had a significant increase in the
bilateral group (6X106) over the unilateral and control (2X106). An increase in the AG
cell number in the vas deferens in both ablated groups was observed trough histology,
which denotes that eyestalk ablation caused hypertrophy of the gland. Finally,
primers were designed based on the published AG nucleotide sequences of decapods.
Amplifications of cDNA by RT-PCR were amplified on vas deferens and terminal
ampule tissues of L. vannamei. The sequence of these products was similar to those
published in peneids, and its peptide translation has the same insulin-like structure
that other AG hormones in decapods have. The AG knowledge here achieved, will
contribute to future studies focused on the production of all-female cultures in the

white shrimp.
Key words: L. vannamei, androgenic gland, sexual differentiation
A
La Paz
vi
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mis directores de tesis, el Dr. Rafael Campos Ramos y el Dr. Alejandro M.
Maeda Martnez.
Gracias a mi comit tutorial, la Dra. Norma Y. Hernndez Saavedra, el Dr. Gopal
Murugan y el Dr. Gabino A. Rodrguez Almaraz.
Gracias a la Dra. Elva Corts, a la Dra. Danitzia Guerrero y a la Dra. Hortencia
Barboza, gracias a Sandra de la Paz, Carlos Cesea, Carmen Rodrguez, Eulalia Meza,
Delia Rojas y Miguel Correa.
Gracias a toda mi familia, incluida Arlett.
Gracias a todos mis amigos y compaeros.
Gracias al CIBNOR y al personal de Posgrado, gracias al CONACyT por la beca
otorgada (No. 166576).
Quiero dar gracias a todos por haberme ayudado a llegar hasta aqu.
CONTENIDO
INTRODUCCIN .....................................................................................................................................................1
ANTECEDENTES ....................................................................................................................................................5
Aparato genital en hembras y machos de Litopenaeus vannamei ................................................5
Organognesis del aparato genital ............................................................................................................8
Descubrimiento e investigaciones de la glndula andrognica en malacostrceos ..............8
Relacin entre la gametognesis y el ciclo de muda en decpodos .......................................... 15
Control neuroendocrino de la glndula andrognica ..................................................................... 19
OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................................................... 25
OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................................................................ 25
HIPTESIS ............................................................................................................................................................. 26
MATERIALES Y MTODOS .............................................................................................................................. 27
ORGANOGNESIS .......................................................................................................................................... 27
CICLO DE MUDA Y MEIOSIS ...................................................................................................................... 28
ABLACIN DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA ... 30

ANLISIS ESTADSTICOS ........................................................................................................................... 31
ANLISIS MOLECULAR ............................................................................................................................... 31
RESULTADOS........................................................................................................................................................ 35
ORGANOGNESIS .......................................................................................................................................... 35
Lnea de tiempo de eventos durante la diferenciacin sexual interna y externa ........... 35

Organognesis de la gnada (PL12 a PL16) .................................................................................. 35
Morfologa del rgano genital .............................................................................................................. 36
Desarrollo temprano de la gnada (PL12 a PL28) ...................................................................... 37

Histologa del oviducto y del vaso deferente ................................................................................. 37
Diferenciacin sexual externa temprana (PL32 a PL44) .......................................................... 38
Diferenciacin sexual externa subsecuente (PL44 a PL48) .................................................... 39
Organognesis de la GA y del tejido adiposo blanco (PL48 a PL50) .................................... 40
Desarrollo del epitelio germinal y diferenciacin sexual de la gnada (PL52 a PL72) 40

Desarrollo subsecuente de los vasos deferentes y de la glndula andrognica.............. 41
ABLACIN DEL TALLO OCULAR E HIPERTRFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA ... 50

DISCUSIN............................................................................................................................................................. 60
ORGANOGNESIS .......................................................................................................................................... 60
ABLACION DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA ... 67

CONCLUSIONES ................................................................................................................................................... 71
RECOMENDACIONES ........................................................................................................................................ 72
LITERATURA CITADA ....................................................................................................................................... 73
ANEXO ..................................................................................................................................................................... 86
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aparato reproductor femenino de peneidos...........................................................................5
Figura 2. Aparato reproductor masculino de peneidos .........................................................................6
Figura 3. Aparato reproductor masculino ...................................................................................................7

Figura 4. Vaso deferente de Litopenaeus vannamei.............................................................................. 10
Figura 5. Corte longitudinal de vaso deferente distal.......................................................................... 10

Figura 6. Vaso deferente de Cherax destructor ....................................................................................... 11
Figura 7. Localizacin de la expresin del gen ....................................................................................... 13

Figura 8. Modelos linear de la pro-protena (A) y en 3D de la protena madura (B) del gen
Cq-IAG...................................................................................................................................................................... 13
Figura 9. Modelo linear de la pro-protena de Mj-IAG......................................................................... 14
Figura 10. Modelo linear de la pro-protena (A) y en 3D de la protena madura (B) Pm-IAG
....................................................................................................................................................................................15
Figura 11.Tlico abierto en hembras Litopenaeus vannamei (A); y tlico cerrado ................. 17
Figura 12. Complejo sinaptonmico ........................................................................................................... 18

Figura 13. Tallo ocular de un peneido ...................................................................................................... 20
Figura 14. Esquema del control endcrino de la reproduccin ...................................................... 21
Figura 15. Efectos de ablacin del tallo ocular ....................................................................................... 22
Figura 16. Cambios morfolgicos en urpodos de L. vannamei ...................................................... 30

Figura 17. Lnea de eventos de la diferenciacin sexual externa e interna ................................ 35
Figura 18. rgano genital de L. vannamei ................................................................................................ 36

Figura 19. rgano genital de la hembra de L. vannamei..................................................................... 37
Figura 20. rgano genital de L. vannamei ................................................................................................ 39

Figura 21. Vaso deferente de L. vannamei ................................................................................................ 40
Figura 22. Gnada de L. vannamei ............................................................................................................... 41
Figura 23. rgano genital de macho de L. vannamei............................................................................ 42
Figura 24. Vaso deferente medio de L. vannamei .................................................................................. 43
Figura 25. Vaso deferente de L. vannamei ................................................................................................ 44
Figura 26. Cromosomas en cigoteno y paquiteno de L. vannamei. ................................................ 46

Figura 27. Cromosomas en diploteno de L. vannamei ......................................................................... 47
Figura 28. Cromosomas en diploteno avanzado y en mitosis de L. vannamei .......................... 48
Figura 29. Dimetro de los ncleos ............................................................................................................. 49
Figura 30. Comparacin del peso del rgano genital e ndice genital-sotico entre
camarones ablacionados ................................................................................................................................. 51
Figura 31. Comparacin del peso del testculo e ndice gonadosomtico entre camarones
ablacionados ......................................................................................................................................................... 53
Figura 32. Comparacin del peso del vaso deferente e ndice vaso deferente entre
Figura 33. Comparacin del peso del espermatforo y conteo espermtico entre
Figura 34. Efecto de la ablacin en L. vannamei .................................................................................... 56
Figura 35. RT-PCR de L. vannamei usando como templado ARN total de diferentes tejidos
del vaso deferente. ............................................................................................................................................. 57
Figura 36. Anlisis de alineamiento de secuencias de aminocidos de la HGA ........................ 58
Figura 37. Dendrograma consenso de similitud .................................................................................... 59
LISTA DE TABLAS
Tabla I. Oligonucletidos diseados ........................................................................................................... 32

Tabla II. Componentes para la reaccin de PCR..................................................................................... 33
Tabla III. Conteos espermticos ................................................................................................................... 49
INTRODUCCIN
En la acuicultura, el crecimiento de las especies es la caracterstica ms importante

para la rentabilidad de la industria. Es por ello que es necesario tener un mejor
conocimiento de la zootecnia, la fisiologa reproductiva, la resistencia a

enfermedades, la nutricin y la gentica de la especie propuesta (Lutz, 2008).
La produccin de camarn por cultivo ha alcanzado una gran importancia a
nivel mundial, y es por esto que se necesitan avances cientficos y tecnolgicos que
ayuden a incrementar el sistema productivo (Martnez-Crdova, 2002). Los
peneidos presentan fertilizacin externa y sexos separados (gonocricos). Su

dimorfismo sexual se caracteriza principalmente por la presencia del petasma en
machos y el tlico en hembras (Dall et al., 1990); dichas estructuras se utilizan en

la
identificacin
taxonmica
de
estas
especies
(Prez-Farfante,
1988).
Adicionalmente, se presenta tambin dimorfismo sexual en talla y peso durante su

desarrollo, en donde las hembras crecen ms rpido que los machos.
De acuerdo a las investigaciones realizadas en el CIBNOR (Campos-Ramos
et al., 2006; Garza-Torres, 2006), los estudios en camaronicultura enfatizan el

dimorfismo sexual en el crecimiento de las especies y las posibles ventajas que ello
representa para mejorar la produccin a travs del monocultivo de hembras. Tal es
el caso del camarn blanco del Pacfico, Litopenaeus vannamei (Boone), en donde el
dimorfismo sexual comienza alrededor de los 10 g de peso (Chow y Sandifer,
1991) y se vuelve significativo aproximadamente a los 17 g (Prez-Rostro et al.,
1999).
Los estudios sobre el dimorfismo sexual, como posible ventaja en el cultivo
de camarones a travs del monocultivo de hembras, incluyen tambin a especies

asiticas como Penaeus (Marsupenaeus) japonicus (Bate) (Nakamura et al., 1992;
Annimo, 1999; Li et al., 2003b), Penaeus monodon (Fabricius) (Lumare et al.,
1998; Hansford y Hewitt, 1994), la especie hind Penaeus indicus (H. Milne-
Edwards) (Mohan y Siddeek, 1995) y Fenneropenaeus chinensis (Kishinouye) (Yin

et al., 1986; Li y Xiang, 1997; 2002; Li et al., 2003a).
En los Malacostraca (ispodos, anfpodos y decpodos), tanto la
determinacin como la diferenciacin sexual son procesos particularmente

interesantes, ya que la glndula andrognica (GA), que se localiza en los conductos
deferentes de los machos, es el rgano responsable de la diferenciacin testicular,

el desarrollo de las caractersticas sexuales secundarias y forma parte del eje
endocrino reproductivo que regula la espermatognesis. La morfologa y funcin
de esta glndula fue descrita por primera vez en el anfpodo Orchestia gammarella
(Pallas)
(Charniaux-Cotton,
1953;
1954;
1960).
En
langostinos
como
Macrobrachium rosenbergii (Nagamine et al., 1980a,b; Sagi y Cohen, 1990; Sagi et
al., 1990) y acociles como Cherax destructor (Fowler y Leonard, 1999), Cherax
quadricarinatus (von Martens) (Khalaila et al., 2001; Barki et al., 2003; Manor et
al., 2007) y Procambarus clarkii (Taketomi y Nishikawa, 1996), la andrectoma
(remocin de los vasos deferentes del macho) y la implantacin de la GA en
hembras han dado resultados parciales y totales de reversin sexual de la gnada y
del individuo en cuanto a su estructuras sexuales externas. Sin embargo, el
conocimiento sobre el desarrollo de la GA durante la organognesis del aparato

genital, su funcin en el mantenimiento de la espermatognesis (incluyendo el
control endocrino proveniente de la glndula sinusal), adems de la
caracterizacin molecular y el anlisis de expresin, es prcticamente nulo en
especies comerciales de peneidos. Con estos conocimientos, se tendran las bases

para emprender ensayos de reversin sexual en el camarn blanco y sera factible
integrar una biotecnologa, como el cultivo monosexual de hembras, en la industria

de la camaronicultura.
En la presente tesis, se realizaron cuatro investigaciones concernientes al
estudio de la GA en machos de camarn blanco. Dado que la GA forma parte del

rgano genital en el macho, el primer estudio se enfoc al conocimiento sobre la
anatoma del mismo, documentando la organognesis a partir de postlarva y

determinando el momento en que aparece la GA y sucede la diferenciacin de la
gnada en ovario o testculo. Dado que no se encontr informacin reciente sobre

las hembras, stas tambin se incluyeron en el estudio. Se encontr que despus de
63 aos de la primera descripcin del rgano genital en peneidos realizada por
King (1948) y muchas otras descripciones subsecuentes revisadas por Dall et al.
(1990), la anatoma del rgano genital en hembras estaba mal descrita; toda esta
informacin se puede consultar en Garza-Torres et al. (2009).
Como segundo tema de investigacin, se investig si la espermatognesis (y
por ende la meiosis) es un proceso continuo a lo largo de los estadios del ciclo de
muda, o si se trata de un desarrollo meitico ordenado, en donde para cada estadio

de muda corresponde una etapa de la profase I, tal como ocurre en decpodos de
agua dulce (Sagi et al., 1988; 1991; Okumura y Hara, 2004; Poljaroen et al., en
prensa). Para ello, se obtuvieron y analizaron cromosomas meiticos en cada uno
de los estadios del ciclo de muda de camarn blanco que, adicionalmente, no

estaban descritos en la literatura. De esta manera, se aclara en esta especie una
controversia en la literatura, en donde se planteaba que la gametognesis en

peneidos (hembras y machos) est regulada por el ciclo de muda, lo cual se
descart en vista de los resultados que se obtuvieron en esta investigacion. Asi
mismo, en este trabajo se corrobor que al menos en camarn blanco, la meiosis en
hembras comienza una vez que la gnada en el juvenil se ha diferenciado en ovario

y se detiene en metafase I, y no como haban propuesto Yano (1998) y Qiu (1986)
para otras especies, en donde la meiosis comienza y antecede al desove y, por lo

tanto, es dependiente del ciclo de muda; toda esta informacin se puede consultar
en Garza-Torres et al. (2011).
El tercer tema de investigacin, se relacion con el control endocrino que
ejerce la glndula sinusal (localizada en el pednculo ocular) sobre la GA,
corroborando que al igual que otros decpodos (Khalaila et al., 2002; Sroyraya et
al., 2010) la ablacin (unilateral y bilateral) produce hipertrofia de la GA y, por
ende, un aumento significativo en la produccin de esperma. De hecho, con la

hipertrofia observada en la GA se logr determinar que esta glndula contina
hasta la parte distal del mpula terminal.
Como cuarto y ltimo tema de investigacin, se logr obtener la secuencia
nucleotdica del precursor de la hormona que produce la GA en camarn blanco,
as como su expresin en los diferentes tejidos del rgano genital. Cabe resaltar
que durante el transcurso de este estudio doctoral en el CIBNOR, en el 2009 se dio
a conocer la secuencia nucleotdica del precursor de la hormona que produce la GA

en P. monodon en GenBank (GU208677.1) y en mayo del 2011 los datos se
publicaron formalmente por investigadores australianos e israelitas (Mareddy et
al., 2011). En el 2010, se dio a conocer la secuencia nucleotdica del precursor de la
hormona de la GA del cangrejo Portunus pelagicos (Rathbun) que es una especie de
importancia econmica en las pesqueras (Sroyraya et al., 2010). De manera

interesante, la secuencia de nucleotidos del precursor de este cangrejo es similar a
la del langostino Cherax, cuando se hubiera esperado que estuviera mas
relacionada con las de los peneidos por tratarse de un organismo de ambiente
marino y no de agua dulce. Por ltimo, en marzo del 2011, se dio a conocer la
secuencia de nucleotidos del precursor de M. japonicus por investigadores
japoneses (Banzai et al., 2011), resultando ser muy similar a la de P. monodon.
Con lo anterior, la obtencin de la secuencia del precursor de la hormona de
la GA en L. vannamei por investigadores del CIBNOR, se hizo ms que relevante y

en esta tesis doctoral, se presenta dicha informacin.
Finalmente se sugieren recomendaciones para continuar con estas
investigaciones.
ANTECEDENTES
Aparato genital en hembras y machos de Litopenaeus vannamei

En Litopenaeus setiferus (L.), la anatoma bsica del aparato genital de una hembra
adulta fue descrita por King (1948); en este trabajo se describe al ovario como una
estructura bilateral parcialmente fusionada con lbulos proyectados. En la
actualidad, se acepta que dicho aparato consiste en un par de ovarios parcialmente
fusionados (ms el oviducto), cada uno con lbulos laterales cortos que se
extienden desde la regin cardiaca, dorsalmente al hepatopncreas, hasta el telson.
La revisin de Dall et al. (1990) sobre peneidos hembras describe al ovario como
dos estructuras bilaterales independientes con lbulos proyectantes, i.e., el lbulo
anterior, de seis a ocho lbulos laterales, y un lbulo posterior largo, adems del
oviducto en el sexto lbulo lateral (Figura 1).
Figura 1. Aparato reproductor femenino de peneidos: lbulos anteriores (LA);

lbulos laterales (LL); lbulos posteriores (LP); oviducto (O) (tomado y modificado
de Dall et al., 1990).
De igual manera, sobre la base de la descripcin original de King (1948), en
peneidos la forma general del aparato reproductor masculino es similar al

femenino, con la excepcin de que no presenta los lbulos posteriores. Consiste en
un par de testculos, cada uno con siete u ocho lbulos laterales, algunos
fusionados, localizados en la regin cardiaca, dorsalmente al hepatopncreas

(Figura 2). Los vasos deferentes se prolongan dorsalmente desde el extremo de
cada uno de los dos lbulos testiculares y continan lateralmente en una direccin
dorso-ventral hasta llegar a las aberturas ventrales en el exterior (King, 1948;
Treece y Yates, 1988; Dall et al., 1990).
Figura 2. Aparato reproductor masculino de peneidos: testculos (T); vasos

deferentes (VD); vasos deferentes proximales (VDP); vasos deferentes medios
(VDM); vasos deferentes distales (VDD); mpula terminal (AT) (tomado y
modificado de King, 1948).
Sin embargo, posteriormente Chim (1983), Laubier et al. (1983) y
Charniaux-Cotton y Payen (1985) describieron el aparato reproductor del macho

de M. japonicus, y Chow et al. (1991) el de machos de L. setiferus y L. vannamei
(Figura 3), coincidiendo todos que el testculo presenta ocho lbulos testiculares
bilaterales que desembocan independientemente a un vaso colector en forma de

herradura o de U invertida. En estos trabajos se establece que cada lbulo
testicular est compuesto de un solo tubo seminfero enrollado, en vez de varios
tbulos como se haba propuesto en los primeros estudios. El vaso colector

bilateral contina, ahora como vaso deferente medio proximal, con una porcin
corta y estrecha que asciende y se ensancha hacia la parte dorsal (vaso deferente
medio ascendente), cerca de la comisura posterior del cefalotrax. El vaso

deferente medio se pliega a la mitad de su longitud formando un doblez, en donde
contina de forma descendente hacia la parte ventral (vaso deferente medio

descendente) formando una estructura tipo herradura. La parte distal de cada uno
de los vasos deferentes medios descendentes, se angosta formando el vaso medio
deferente distal que continua como un tubo delgado, denominado vaso deferente
distal, el cual llega hasta el mpula terminal.
Figura 3. Aparato reproductor masculino: lbulos testiculares (TL); tubo colector

(CT); vasos deferentes anteriores proximales (APV); vasos deferentes posteriores
proximales (PPV); vasos deferentes medios ascendentes (AMV); vasos deferentes
medios descendentes (DMV); vasos deferentes distales (DV); mpula terminal
(TA); lnea hialina en los vasos deferentes medios (HL); ducto del mpula terminal
(WI);ala del espermatforo en Litopenaeus setiferus (WD), ausente en
Litopenaeus vannamei (mpula izquierda); gonoporo (GP) (tomado de Chow et al.,
1991).
Organognesis del aparato genital

La organognesis del aparato reproductivo, incluyendo la morfologa de la GA y el
proceso de diferenciacin sexual han sido estudiados en machos de P. japonicus
por Chim (1983), Laubier et al. (1983), Charniaux-Cotton y Payen (1985) y
Nakamura et al. (1992). Estos estudios coinciden en que la organognesis de la GA
ocurre antes o en el momento de la espermatognesis, durante el segundo mes

como postlarva, mucho tiempo despus de que se diferenci el sexo del individuo
con la formacin de la gnada indiferenciada y los vasos deferentes que identifican
al macho, dentro de las dos primeras semanas del desarrollo postlarval. En
ninguna otra especie de peneido se han estudiado a fondo el desarrollo del aparato
reproductivo en machos, y las hembras han sido consistentemente excluidas de
estos anlisis, no existiendo antecedente sobre la organognesis del oviducto y la

diferenciacin de la gnada en ovario.
Descubrimiento e investigaciones de la glndula andrognica en malacostrceos

En 1947 Cronin observ por primera vez la GA en un crustceo decpodo, el
cangrejo Callinectes sapidus (Rathbun). En Francia, Charniaux-Cotton (1954)
sugiri que la GA estaba involucrada en la regulacin de la diferenciacin sexual y

la espermatognesis en el anfpodo O. gammarrella, lo cual fue posteriormente
confirmado en esta especie por Legrand (1955) y Suzuki y Yamasaki (1997).
Durante las siguientes dcadas, Katakura y colaboradores investigaron al
ispodo Armadillidium vulgare (Latreille) en Japn (Katakura, 1961; Katakura et
al., 1975; Katakura y Hasegawa, 1983). Sus trabajos consistieron en la purificacin

y caracterizacin parcial de la hormona de la glndula andrognica (HGA) y, por
primera, vez realizaron experimentos de masculinizacin de hembras mediante la

inyeccin directa de extractos de la GA (Hasegawa et al., 1991; Nagasawa et al.,
1995). Posteriormente, se obtuvo la secuencia nucleotdica del precursor de la

HAG en esta especie (Martin et al., 1999; Okuno et al., 1999).
En California Nagamine et al. (1980 a, b), trabajaron con el decpodo M.
rosenbergii, revirtiendo hembras genotpicas a machos fenotpicos (neomachos) a
travs de la implantacin de GAs en las hembras juveniles. De igual forma, se

revirtieron machos genotpicos a hembras fenotpicas (neohembras) mediante la
andrectomizacin de los vasos deferentes. En machos de M. japonicus, Chim

(1983), Laubier et al. (1983), Charniaux-Cotton y Payen (1985) y Nakamura et al.
(1992), localizaron la GA en los vasos deferentes distales. Cabe mencionar que

Charniaux-Cotton y Payen (1985), tambin identificaron la GA en Penaeus
keraturus (Forsskl). En M. japonicus, se observa que la fase indiferenciada del
aparato genital se extiende hasta el da onceavo como postlarva (Charniaux-Cotton

y Payen, 1985), la diferenciacin interna ocurre con la formacin de los conductos
deferentes del macho y la aparicin de la GA es tarda, ya que se observa a partir
del da 55 como postlarva (Nakamura et al., 1992). Externamente, la fase
indiferenciada se prolonga en toda la vida larval, hasta que la postlarva muestra
una caracterstica muy peculiar: en la cara interna del protopodito del primer par
de plepodos se forma una depresin en forma de mueca, lo cual es una
caracterstica exclusiva de los machos. Posteriormente, aparece el apndice

masculino, que se desarrolla en el segundo par de plepodos, adems, el
endopodito del primer par de plepodos se diferencia en el petasma, continuando

con la aparicin de gonoporos en la coxa del quinto pereipodo.
Nagamine y Knight (1987) estudiando al acocil P. clarkii, lograron observar
caractersticas sexuales secundarias de macho en hembras implantadas con GAs.
Alfaro (1994) en L. vannamei y Litopenaeus stylirostris (Stimpson) y

posteriormente Campos-Ramos et al. (2006) en L. vannamei, documentaron la
localizacin de la GA en los vasos deferentes distales (Figura 4), y la histologa de la
GA en L. vannamei (Figura 5), la cual corresponde con la reportada en la literatura

para otros malacostracos, como C. destructor (Fowler y Leonard, 1999) (Figura 6).
10
Figura 4. Vaso deferente de Litopenaeus vannamei por microscopa de barrido.

Glndula andrognica (GA); vaso deferente medio (VDM); vaso deferente distal
(VDD); mpula terminal (AT) (tomado de Campos-Ramos et al., 2006).
Figura 5. Corte longitudinal de vaso deferente distal de Litopenaeus vannamei (a).

Magnificacin de GA en (b). Glndula andrognica (AG); capa muscular (ML); capa
epitelial (EL); tejido conjuntivo (CT) (tomado de Campos-Ramos et al., 2006).
11
Figura 6. Vaso deferente de Cherax destructor por microscopa de barrido (1).

Seccin del vaso deferente de C. destructor por histologa (2). Vaso deferente (VD);
glndula andrognica (AG); msculo (M); epitelio (E); masa espermtica (S),
(tomado y modificado de Fowler y Leonard, 1999).
En L. vannamei, Campos-Ramos et al. (2006) describieron que durante el
segundo mes como postlarva, despus de que alcanza un peso mnimo de 150 mg
(y un tamao de 20 mm) comienzan a aparecer las estructuras externas que

distinguen a las hembras de los machos, lo cual concuerda con las pocas especies
de peneidos estudiadas como M. japonicus (Charniaux-Cotton y Payen, 1985;

Nakamura et al., 1992), y F. chinensis (Yin et al., 1986; Li y Xiang, 2002).
Dependiendo de qu tan favorable o desfavorable puede ser una condicin

ambiental (como temperatura, densidad y alimento) para los camarones, la
diferenciacin sexual externa ocurrir alrededor del segundo mes. En L. vannamei,

Campos-Ramos et al. (2006) documentaron la estructura de la GA como una
estructura celular compacta, en paralelo al vaso deferente distal (Figuras 4 y 5),

conectada a una capa muscular a travs de un recubrimiento epitelial (Figura 5A).
Su longitud es de 2.5 mm, es tubular, con un dimetro de 100 m en la parte

media. La masa celular est compuesta por clulas ovales largas, con citoplasma
vacuolado y cada clula presenta un ncleo prominente (Figura 5b). Mediante
microscopa de barrido, la GA se observa como un cordn pegado en la parte distal
del vaso deferente medio, o bien en la parte distal del tubo eyaculador. De cada
12
extremo de la glndula se extienden cordones ms delgados que se dirigen tanto

hacia el bulbo eyaculador, como hacia el vaso deferente distal delgado (Figura 4).
En C. quadricarinatus Sagi et al. (1999) monitorearon el comienzo de la
vitelognesis utilizando pruebas de ELISA. Este estudio provey una herramienta

exacta para investigar la influencia de la GA en la expresin de una protena
vitelognica-especfica en las hembras. Posteriormente, mediante una prueba

inmunohistoqumica que detecta lipoprotenas vitelogenina-especficas, estos
investigadores observaron en hembras implantadas con GAs que el proceso de

vitelognesis disminuye drsticamente (Khalaila et al., 2001), lo que confirma el
papel de esta glndula en la plasticidad sexual de la especie. Abdu et al. (2002)

clonaron el ADNc de la vitelogenina de C. quadricarinatus y mostraron que el gen
de la vitelogenina estaba presente en el hepatopncreas de hembras durante la
vitelognesis secundaria. En los machos a los que se les removi la GA, se
observaron transcritos del gen que codifica la vitelogenina, lo que indica que el gen
est regulado negativamente por la GA. Mediante la implantacin de GAs en
hembras de C. quadricarinatus, Barki et al. (2003) lograron inhibir tanto la segunda
vitelognesis como el desarrollo de los ovarios, adems ellos tambin observaron

en ellas la aparicin de caractersticas secundarias de macho.
Manor et al. (2007) construyeron la primera librera substractiva de ADNc
de la GA de C. quadricarinatus. Mediante experimentos de hibridacin in situ estos
autores observaron que el gen solo se expresa en machos; estos resultados

confirmaron la localizacin exclusiva de la expresin del gen en la GA (Figura 7).
Este gen especfico del sexo, fue denominado como Cq-IAG (C. quadricarinatus
insuline-like androgenic gland factor), y produce una protena similar a los

miembros de la familia tipo-insulina (por ello su nombre) especfica para los
crustceos decpodos machos (Figura 8). Esta protena consta de un pptido seal,
dos cadenas (A y B) adems de un pptido C, que se dobla y une a las dos cadenas
mediante puentes di-sulfuro en los residuos de cistena de las cadenas.
13
Figura 7. Localizacin de la expresin del gen Cq-IAG en secciones del ducto

espermtico (SD) y de la glndula andrognica (AG) de Cherax quadricarinatus. (A)
tincin con hematoxilina y eosina, (B) sonda con deteccin (C) sonda testigo
(tomado de Manor et al., 2007).
Figura 8. Modelos linear de la pro-protena (A) y en 3D de la protena madura (B)

del gen Cq-IAG, que presenta la estructura clsica de las insulinas (tomado de
Manor et al., 2007).
14
Ventura et al. (2009) crearon una librera de ADNc de GA de M. rosenbergii
ablacionado del tallo ocular, en donde encontraron el gen especifico de la GA (Mr-
IAG). Para silenciar este gen, inyectaron in vivo dsRNA, lo cual previno
temporalmente le regeneracin de caractersticas secundarias sexuales, como el

apndice masculino, adems del retraso en la muda y la reduccin del crecimiento,
de acuerdo con los parmetros para esta especie. La ablacin tambin detuvo la
espermatognesis y el desarrollo del espermatforo del mpula terminal, adems
de provocar hipertrofia e hiperplasia de la GA. Sroyraya et al. (2010) publicaron la

secuencia nucleotdica de la GA del cangrejo nadador P. pelagicus, basndose en la
secuencia de Cq-IAG, observando entre ellas una similitud del 83%. Banzai et al.
(2011) publicaron la secuencia de la GA de M. japonicus (Mj-IAG), basndose en
una secuencia de 531 pb de P. monodon (Mareddy et al., 2011) (Figura 9),

encontrando una similitud del 68%.
Figura 9. Modelo linear de la pro-protena de Mj-IAG (tomado de Banzai et al.

(2011).
Mareddy et al. (2011) publicaron la secuencia de la GA de P. monodon (Pm-
IAG), la cual se muestra en la Figura 10, que resulta ser muy similar a la de M.
japonicus.
15
Figura 10. Modelo linear de la pro-protena (A) y en 3D de la protena madura (B)

Pm-IAG, la cual sostiene la estructura clsica de las insulinas (tomado de Mareddy
et al., 2011).
Hasta el momento existen nueve secuencias de la GA en decpodos,
publicadas en la base de datos del GenBank: Penaeus monodon (GU208677.1),

Marsupenaeus japonicus (AB598415.1), Cherax quadricarinatus (DQ851163.1),
Macrobrachium rosenbergii (FJ409645), Macrobrachium lar (AB579012.1),
Portunus pelagicus (HM459854.1), Cherax destructor (EU718788.1), Palaemon

paucidens (AB588013) y Palaemon pacificus (AB588014.1).
Relacin entre la gametognesis y el ciclo de muda en decpodos

En camarones machos, los testculos producen espermtidas que son
transportadas
acumuladas
en
los
vasos
deferentes,
en
donde
la
espermatognesis contina a travs de los bulbos eyaculadores, y la masa de
16
espermatocitos es guardada en el mpula terminal, en donde finalmente se
empaqueta por secreciones glandulares formando los espermatforos (King,
1948). Se conoce que en decpodos la actividad espermatognica est regulada por
la circulacin de la hormona de la GA (Charniaux-Cotton y Payen, 1988). Un
estudio histolgico mostr que la espermatognesis en L. vannamei es un proceso
continuo, sin relacin alguna con el ciclo de muda (Heitzmann et al., 1993). Por
otro lado, Parnes et al. (2006) observaron que cada vez que el macho muda el
espermatforo viejo es reemplazado en el mpula terminal por uno recin

formado, es decir, que el ciclo de renovacin del espermatforo est regulado por
el ciclo de la muda y, por ende, la espermatognesis pudiera estarlo tambin. A este
respecto, en los decpodos de agua dulce, y en langostinos y acociles, cada estadio

de muda corresponde a una etapa de la profase I; esto indica una sincrona entre la
meiosis y el ciclo de muda (Sagi et al., 1988, 1991; Okumura y Hara, 2004;
Poljaroen, et al., en prensa). Adicionalmente, en M. rosenbergii se ha observado que

durante el ciclo de muda, los niveles de la hormona de la GA se mantienen
constantes, sin la regulacin de un estadio especfico de muda (Okumura y Hara,
2004).
El proceso de ciclo de muda y gametognesis est ampliamente
documentado en decpodos hembras, ya que el desarrollo ovrico (vitelognesis),

la maduracin final y la ovulacin (desove) estn controlados por rganos
endocrinos y neurosecretores, de acuerdo a los ciclos de muda (Qiu, 1986; Yano,
1988, 1995; Dall et al., 1990).
De hecho, el comportamiento reproductivo de inseminacin en camarones
depender ciclo de la muda. En peneidos de tlico cerrado como P. monodon y M.
japonicus (Figura 11B), los machos maduros colocan la masa espermtica en el
tlico de la hembra recin mudada (tlico suave), y a partir de ah, comienza la

maduracin del ovocito (vitelognesis) hasta alcanzar la maduracin final y el
desove. Por lo tanto, en especies de tlico cerrado, el apareamiento y la

transferencia de esperma se dan antes de la vitelognesis (Yano, 1988, 1995; Dall
et al., 1990). Por otra parte, en peneidos de tlico abierto como L. vannamei y L.
stylirostris (Figura 11A), los machos adhieren el espermatforo en el tlico de la
17
hembra con una maduracin de la gnada avanzada, en etapa de inter-muda (tlico
duro), etapa en la que el comportamiento de apareo es un requisito indispensable
para la transferencia del espermatforo y una fertilizacin exitosa. Es por eso que
en especies de tlico abierto, el apareamiento ocurre alrededor de dos horas antes

de la maduracin final del ovocito y el desove, despus de la vitelognesis (Dall et
al., 1990; Yano, 1995).
Figura 11.Tlico abierto en hembras Litopenaeus vannamei (A); y tlico cerrado en

hembras P. monodon (B) (tomado de Prez-Farfante, 1998).
Existe una discrepancia en cundo comienza la meiosis I en los decpodos
hembras, algunos reportes indican que comienza en el desove, asociado con la

maduracin final, y por ende, al ciclo de muda. Como ejemplos se pueden
mencionar M. japonicus, en donde la ovulacin y la meiosis I caracterizan la etapa

de maduracin de los ovocitos (Yano, 1988) y el camarn rojo Acetes chinensis
(Hansen) en los que la meiosis I inicia en el momento del desove (Qiu, 1986). Sin
embargo, otros reportes indican que la meiosis I est detenida o arrestada en
metafase I, y reinicia en hembras maduras, previo al desove. En este caso, el

comienzo de la meiosis I es independiente de la maduracin final, del desove y del
ciclo de muda. En la metafase I, el arresto de la meiosis en el ovocito se ha
18
documentado en L. vannamei utilizando sondas fluorescentes para ADN y tubulina

con un microscopio confocal (Hertzler, 2005), y por histologa tanto en
Farfantepenaeus aztecus (Ives) (Clark et al., 1980) como en el langostino M.
rosenbergii (Okumura y Aida, 2000).
Actualmente, no existen estudios extensos sobre la meiosis en crustceos.
La larga y compleja primera profase meitica consiste de las etapas de leptoteno,
cigoteno, paquiteno, diploteno y diaquinesis (Strickberger, 1976; Bernhard, 1990;

Loidl, 1994) e involucra tres procesos importantes: (1) El apareamiento de los
cromosomas homlogos (sinapsis), (2) la recombinacin gentica, y (3) la
segregacin de los cromosomas homlogos. El complejo sinaptonmico (CS)
(Figura 12) es un complejo protico que se forma durante la primera fase meitica,
en donde ocurren la sinapsis y la recombinacon gentica entre cromosomas
homlogos durante las fases de cigoteno y paquiteno, respectivamente (Moses,
1956; Fawcett, 1956; Carpenter, 1979; von Wettstein et al., 1984; Schmekel et al.,
1993; Loidl, 1994).
Figura 12. Complejo sinaptonmico (tomado de Alberts et al., 2002).
19
En el camarn blanco L. vannamei y en otras especies de peneidos
comerciales los cromosomas mitticos han sido estudiados ampliamente (CamposRamos, 1997). La mayora de las especies tienen un nmero diploide de 88
cromosomas, donde los cromosomas son pequeos y con una longitud

descendente progresiva, lo cual hace difcil estudiar su cariotipo. Se han obtenido
ncleos en diploteno de cromosomas meiticos de testculo de M. japonicus

(Hayashi y Fujiwara, 1988), F. chinensis (Jixun et al., 1989), F. aztecus,
Farfantepenaeus duorarum (Burkenroad) y L. setiferus (Chow et al., 1990), y L.
vannamei (Chow et al., 1990; Campos-Ramos, 1997; Alcivar-Warren et al., 2006);
existe solo un reporte en ovario en la hembra de F. chinensis (Jixun et al., 1989). El

conteo de los bivalentes altamente condensados ha llevado a establecer el nmero
haploide de las especies, confirmndolo con el nmero diploide anteriormente

obtenido. Por otro lado, el CS ha sido analizado en triploides y diploides de F.
chinensis (Xie et al., 2008).
Control neuroendocrino de la glndula andrognica

Hoy en da, en las granjas productoras de postlarvas de camarn utilizan la tcnica
de la ablacin del tallo ocular para inducir a la maduracin a las hembras. La
glndula sinusal, que se encuentra en el tallo ocular (Figuras 13 y 14), sirve como
reservorio y liberador de hormonas producidas por el rgano-X. Este complejo,

rgano-X/glndula sinusal, produce la hormona inhibidora de la vitelognesis
(HIV), tambin llamada de la gnada, y es la razn por la que la ablacin crea un

desbalance hormonal y provoca (en corto tiempo) la maduracin de la hembra.
Otras neurohormonas se encuentran en el tallo ocular donde se almacenan
y se liberan de la glndula sinusal, incluyendo la hormona inhibidora de la muda

(HIM) y la hormona inhibitoria del rgano mandibular (HIOM) (Chang y Kaufman,
2005). Otras hormonas como el metilfarnesoato (MF), tambin llamada la
hormona juvenil del crustceo, tiene una funcin estimulante en la reproduccin
en ambos gneros; esta hormona se sintetiza en la glndula del rgano mandibular
(OM). En el cangrejo araa Libinia emarginata (L.) Laufer et al. (1987) reportaron
20
un incremento en la produccin de MF en el OM en hembras en proceso de
ovognesis. Existe una patente para el uso de la MF en la reproduccin de camarn,

sin la necesidad de la ablacin unilateral (Patente no. 5,168,481), sin embargo, la
ablacin continua utilizndose comnmente para la maduracin gondica ya que
las hembras responden positivamente a ella.
Las ecdisisteroides, mejor conocidas como las hormonas de la muda,
estimulan la vitelognesis de algunos insectos. Okumura y Hara (2004) trabajaron

en M. rosenbergii con estas hormonas, sobre la base de la analoga existente entre
los sistemas endocrinlogos entre insectos y crustceos. Sin embargo, no se ha
encontrado relacin entre el ecdisisteroide y la vitelognesis, ya que los niveles de
esta hormona en la hemolinfa no cambiaron entre los ciclos de muda en hembras

en reproduccin respecto a hembras normales (control), sugiriendo que estas
hormonas no estn relacionadas con la vitelognesis.
Figura 13. Tallo ocular de un peneido (Decpoda, Natantia) mostrando ganglio del
rgano-X (GOX); poro sensitivo del rgano-X (PS); glndula sinusal (GS); el tracto
rgano-X - glndula sinusal (TGOXGS) y el tracto del poro sensitivo del rgano-X
(TPSGX) (modificado de Adiyodi y Adiyodi, 1970).
21
Figura 14. Esquema del control endcrino de la reproduccin del macho en

camarn. Hormona inhibidora del rgano mandibular (HIOM); hormona de la
glndula andrognica (HA); metilfarnesoato (MF) (modificado de Okumura, 2004).
En el mbito cientfico un tema interesante a discusin ha sido la presencia
de feromonas en camarones, ya que Takayanagi et al. (1986) observaron que las

hembras de Paratya compressa (Kemp) retrasan su desarrollo ovrico a menos de
que un macho este presente o cuando se agrega un extracto de testculo al agua.
Tambin se han realizado estudios en M. japonicus en los que inyecciones de
progesterona inducen la maduracin ovrica y estimulan la secrecin de
vitelogenina (Yano, 1985) as como inyecciones de serotonina en decpodos

(Sarojini et al., 1995; Alfaro et al., 2004).
En decpodos existen varias funciones fisiolgicas reportadas en el
complejo rgano X/glndula sinusal (dentro del tallo ocular de machos y
hembras), como lo son la reproduccin (Charniaux-Cotton y Payen, 1988; Sagi et
al., 1991, Subramoniam, 2000; Khalaila et al., 2002; Parnes et al., 2006; Huberman,
2000), el crecimiento (Hopkins, 1984) y la regeneracin de miembros (Holland y
Skinner, 1976; Hopkins, 1984). En langostinos, como M. rosenbergii (Okumura y

Hara, 2004) y C. quadricarinatus (Khalaila et al., 2002), la ablacin del tallo ocular
22
causa hipertrofia e hiperactividad de la GA, lo que estimula la espermeacin y
genera espermatforos maduros. En machos de C. quadricarinatus con ablacin

bilateral, la espermeacin inicial elevada deriva, despus de un tiempo, en una
disminucin en el peso de la gnada y en la ocurrencia de espermatocitos
primarios en los lbulos testiculares (Figura 15). En una inhibicin in vitro de la
sntesis de polipptidos de la glndula sinusal, se encontr una ocurrencia en GA

pero no en testculo, sugiriendo de esta forma un eje tallo ocular-GAtestculo
(Khalaila et al., 2002).
Figura 15. Efectos de ablacin del tallo ocular. (A) GA de langostino intacto (B) GA
de langostino ablacionado (C) grfica representando el ndice del peso gonadal en
langostinos intactos y ablacionados a travs del tiempo. Glndula andrognica
(AG), ducto espermtico (SD) (tomado y modificado de Khalaila et al., 2002).
Sroyraya et al. (2010) ablacionaron bilateralmente al cangrejo nadador, P.
pelagicus, y observaron un crecimiento de tres veces su tamao normal de la GA

ocho das despus de la ablacin.
Existe evidencia indirecta que indica que al incrementar la tasa de
renovacin del espermatforo de forma manual, se incrementa la produccin de

gametos del macho, debido a que se observa un incremento significativo en el peso
del espermatforo, lo que incluye una mejor calidad y cantidad del esperma en
camarones marinos. El mejoramiento del esperma ocurre cuando los machos
23
adoptan un comportamiento sexual (Parnes et al., 2006), cuando son eyaculados
manualmente (Alfaro y Lozano, 1993; Ceballos-Vzquez et al., 2004) y cuando son

ablacionados unilateralmente del tallo ocular (Leung-Trujillo y Lawrence,
1987,1985; Alfaro y Lozano, 1993). Aunque no existen estudios realizados en
camarones, este mejoramiento pudiera ocurrir por la estimulacin de la GA a falta

de un control de la glndula sinusal, la cual mantiene y regula el incremento o
decremento en la actividad espermatognica. En investigaciones posteriores, sobre
la cantidad y calidad espermtica L. vannamei, se encontr que la edad ptima para

el uso de machos como reproductores es cuando alcanzan los 12 meses de edad
(Ceballos-Vzquez et al., 2003), por lo que la edad del macho puede ser un factor
que determina tambin la actividad de la GA sobre la espermatognesis. Sin
embargo, en peneidos se desconoce hasta qu punto la glndula andrognica est
implicada en el eje neuroendocrino inhibitorio rgano X/glndula sinusalglndula andrognica-testculo. De igual forma, no existen reportes cientficos que
analicen el papel de la glndula andrognica en la calidad y/o produccin
espermtica (cantidad).
24
JUSTIFICACIN
El camarn blanco L. vannamei ocupa un lugar importante en la acuicultura

mundial y, en Mxico representa la especie ms importante de cultivo por lo que se
requiere realizar ms investigacin cientfica acerca de esta especie. Este estudio
contribuye al conocimiento de la biologa y la fisiologa de la reproduccin en
decpodos adems de abordar el estudio de su diferenciacin sexual. En

decpodos de agua dulce, la investigacin que se ha realizado es muy extensa y, en
este sentido, la fisiologa reproductiva de camarones marinos (especficamente la
del macho) requiere de mayor atencin por la comunidad cientfica, ya que en
peneidos el papel fisiolgico de la GA debe de estar bien estudiado y comprendido.
En peneidos, no fue sino hasta aos recientes que algo de informacin a nivel
molecular ha emergido en la literatura cientfica, por lo que avances similares a los
obtenidos en decpodos de agua dulce se generarn en la prxima dcada. Por lo
anterior, tanto Mxico como Latinoamrica deben de estar a la vanguardia en este
tipo de investigaciones, para estar en la posibilidad de ofrecer, en el corto plazo,
estrategias de cultivo y biotecnologas en las que a travs del cultivo monosexual

de hembras se incremente el rendimiento por hectrea de este crustceo.
25
OBJETIVO GENERAL
Realizar estudios encaminados a analizar el desarrollo de la glndula andrognica
(GA) durante la organognesis del rgano genital, su funcin en la
espermatognesis y su anlisis molecular en el camarn blanco del Pacfico

Litopenaeus vannamei.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Documentar el perodo de indiferenciacin sexual y la anatoma del

rgano genital en ambos sexos.
2. Documentar la diferenciacin sexual interna, con respecto a la externa, y

a la edad en nmero de das como postlarva.
3. Documentar el momento de aparicin de la GA en los vasos deferentes del

macho y el momento en que se diferencia la gnada en testculo.
4. Analizar cromosomas meiticos en los diferentes estadios de muda.
5. Realizar conteos espermticos en espermatforos en las diferentes etapas

de muda.
6. Describir la anatoma de la GA, testculo y vaso deferente, una semana

despus de la ablacin unilateral y bilateral del tallo ocular.
7. Analizar el efecto de la ablacin sobre los diferentes tejidos del rgano

genital.
8. Obtener la secuencia nucleotdica del precursor de la hormona que

produce la GA y su expresin en los diferentes tejidos del rgano genital.
26
HIPTESIS
I.
Como hiptesis nula, se plantea que si la organognesis de la gnada y vasos
deferentes de machos de M. japonicus se lleva a cabo dentro de las primeras

dos semanas de desarrollo postlarval y la glndula andrognica, seguida de
la diferenciacin testicular se llevan a cabo durante el segundo mes del

desarrollo, entonces este proceso debe de ser similar en L. vannamei.
Alternativamente, se plantea que los tiempos en la organognesis del

camarn blanco no corresponden al del camarn kuruma.
II.
Como hiptesis nula, se plantea que la meiosis es continua en ambos sexos,
sin tener relacin con la muda. Alternativamente, si la espermatognesis en

los machos est vinculada con la muda, entonces cada etapa meitica de la
profase I deber corresponder a un estadio del ciclo de muda. En el caso de
las hembras, si la meiosis se lleva a cabo previo al desove, con una

ovognesis avanzada, y por ende, vinculada con la muda, entonces no se
observarn etapas meiticas en hembras inmaduras.
III.
Como hiptesis nula, se plantea que en camarn blanco no existe un eje
endocrino: complejo rgano X/ glndula sinusal-GA-testculo y por ende no
ocurre, ni una hipertrofia en dicha glndula, ni tampoco un incremento en la

produccin espermtica. Alternativamente, existe un eje endocrino entre
dichos rganos y por ende se observar una hipertrofia y como
consecuencia se incrementar la produccin espermtica.

IV.
Como hiptesis nula, se plantea que en L. vannamei, al igual que en todos

los malacostracos estudiados hasta ahora, la hormona de la glndula
andrognica es del tipo-insulina. Alternativamente, dicha hormona en

camarn blanco presenta una estructura molecular diferente.
27
MATERIALES Y MTODOS
ORGANOGNESIS
Las postlarvas de camarn se obtuvieron en el laboratorio de produccin

Acuacultura Mahr en La Paz, BCS, Mxico. Las postlarvas, juveniles, pre-adultos y
adultos fueron cultivados en el laboratorio de crustceos del CIBNOR. Se criaron

camarones desde postlarva 4 (PL4) en seis tanques de 1000 L mantenindose con
agua marina (salinidad: 36 38 ppm) filtrada y aireada, a una temperatura de 27
1C con calentadores de 300 W a una densidad de 200 camarones por tanque. Se
realizaron recambios de agua del 50% tres veces por semana. Las postlarvas PL4
hasta PL20 se alimentaron tres veces al da con nauplios de artemia y microencapsulado comercial (250 500 m); camarones de talla ms grandes (>PL20)
se alimentaron tres veces al da con artemia viva y congelada, hojuelas de artemia
y pellets triturados. Para registrar peso (mg y g) y longitud (mm, rostrum-telson),
cada cuarto da, a partir de PL4 hasta PL80, se tomaron aleatoreamente diez
camarones de cada uno de los seis tanques. Se analizaron las estructuras sexuales
externas (Prez-Farfante, 1988; Campos-Ramos et al., 2006) y los rganos internos
(King, 1948; Kong y William, 1988; Dall et al., 1990); la examinacin interna y
externa se llev a cabo con un microscopio estereoscpico de diseccin (Olympus,
Tokio, Japn). Los rganos genitales internos se tieron con azul de metileno
comercial (Acuario Lomas) en una solucin de NaCl al 0.9%. Los camarones
utilizados para el anlisis histolgico, se fijaron en solucin Davidson por 24 h y

despus en etanol al 70% hasta su procesamiento mediante la tcnica histolgica
de hematoxilina-eosina (Bell y Lightner, 1988); las laminillas se analizaron con un
microscopio de luz compuesto (Olympus, Tokio, Japn). Las imgenes fueron

documentadas mediante fotografa digital y analizadas con el software Image Pro
Plus 4.0 (Media Cybernetics).
28
CICLO DE MUDA Y MEIOSIS

En camarn blanco, los estadios de muda se identificaron sobre la base de la
descripcin de de-Oliveira-Cesar et al. (2006) (Figura 16), y la identificacin de las
etapas meiticas se bas en las descripciones de von Wettstein et al. (1984) y Loidl
(1994). Los rganos genitales de un grupo control (sin tratamiento) de camarones
adultos (25-27 g de peso corporal) fueron disecados despus de identificarse los

estadios de muda. Otro grupo se inyect con colchicina (5 g/gr de peso corporal)
despus identificar los estadios de muda, disectndose 8 h despus de la inyeccin.
Cada grupo de camarones consisti de seis hembras (ovarios) y seis machos

(testculos) en cada uno de los siguientes estadios de muda: post-muda tarda
(Etapa B), inter-muda (Etapa C), premuda temprana (Etapa D1), y pre-muda tarda
(Etapa D3). Los lbulos de las gnadas fueron disectados y posteriormente

procesados bajo dos tcnicas y tres protocolos de tincin. La primera tcnica fue la
de secado al aire, que consiste en un shock hipotnico en agua destilada durante
una hora con tres cambios posteriores de 15 minutos cada uno en solucin fijadora
Carnoy (3:1, metanol:cido actico) recin preparada y fra, seguido de la

disociacin de tejido en cido actico al 50%. Se prepararon tres laminillas por
gnada, de acuerdo a Campos-Ramos (1997), dejando caer y reabsorbiendo

inmediatamente el lquido sobre la laminilla previamente calentada a 30C. (1) Las
laminillas se tieron en orcena (orcena 2% en cido actico al 45%) por 5
minutos, se lavaron dos veces en agua destilada, una en etanol y despus se
dejaron secar al aire. (2) Las laminillas se tieron con DAPI (diclorhidrato de 4',6-
diamidino-2-fenilindol). La segunda tcnica consisti en una pequea modificacin
(adaptada a tejido gondico de camarn) de la tcnica para obtencin de CS en
tilapia (Campos-Ramos et al., 2001), la cual consiste en cortar el tejido de la gnada

con un pequea tijera en 1 ml de solucin Triton X-100 (Triton X-100 0.2%; ; pH
8.5 ajustado con tetraborato de sodio 0.01 M). La suspensin celular resultante se
dej reposar por una hora en un tubo de 1.5 mL a 4C. Posteriormente, se
transfirieron 500 L de sobrenadante a otro tubo con 500 L de paraformaldehdo

(paraformaldehido 4%, disuelto en NaOH 1 N; pH 8.5 ajustado con tetrarborato de
sodio 0.2 M), se mezcl suavemente y se incub por 10 minutos a temperatura
29
ambiente. Sobre tres laminillas se pipetearon 100 L de la suspensin celular ya
fijada, y se dejaron secar al aire dentro en una campana de extraccin de humos.

Las laminillas secas se lavaron con agua corriente, agua destilada y por ltimo con
etanol, dejndolos secar al aire. (3) Las laminillas se tieron con nitrato de plata al
50% (Howell y Black, 1980). Las clulas meiticas se fotografiaron con un
microscopio compuesto equipado con fluorescencia y una cmara digital

(Olympus, Tokio, Japn), mientras que la determinacin del dimetro de los CS se
realiz
en
seis
ncleos
de
cada
etapa
meitica
(software
Image
J,
http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). En cada estadio de muda se registr la
abundancia relativa de ncleos meiticos de la siguiente manera: (sin ncleos

presentes); + (ncleos raramente presentes); ++ (pocos ncleos presentes); +++
(ncleos comnmente presentes); ++++ (ncleos abundantes). Para contrastar la
informacin cualitativa obtenida de las clulas meiticas, en cada uno de los

estadios de muda se obtuvo informacin cuantitativa de los vasos deferentes y
espermatforos de seis machos. Los rganos se disectaron, se cortaron en pedazos
pequeos y se homogenizaron manualmente en 1 mL de agua de mar filtrada
estril y los conteos de esperma se realizaron con un hemacitmetro (0.1 mm de

fondo; HausserScientific, Horsham, PA). El promedio de los conteos se determin a
partir de los dos vasos deferentes y los dos espermatforos de cada camarn.
30
Figura 16. Cambios morfolgicos en urpodos de L. vannamei durante el ciclo de

muda. Etapa A (postmuda temprana), la flecha seala el lumen de las setas llenas
de matriz; etapa B (postmuda tarda), la flecha seala la retraccin de la matriz del
lumen y el comienzo de la formacin de conos internos; etapa C (intermuda), la
flecha seala el vaco de las setas; etapa D1 (premuda temprana), la flecha seala la
separacin entre la cutcula y la epidermis; etapa D3 (premuda tarda), la flecha
seala la formacin de nuevas setas. Imgenes de urpodos a 40X, en animales de
tres meses de edad (tomado de deOliveira-Cesar et al., 2006).
ABLACIN DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA
Mediante un corte con tijera sobre el pednculo ocular se ablacionaron
unilateralmente cien camarones machos adultos. Tres das despus, se realiz la
ablacin del segundo pednculo ocular a cincuenta de estos camarones. De esta
manera, se conformaron dos grupos experimentales, uno con 50 camarones

ablacionados unilateralmente y otro con 50 organismos con ablacin bilateral, ms
un ltimo grupo de 50 camarones no ablacionados (control); todos ellos fueron
utilizados en este estudio. Despus del corte, se aplic un trozo de papel
absorbente con pegamento instantneo (Ceys) sobre la herida, para evitar
hemorragia. Los organismos se mantuvieron en estanques cuadrados de concreto

en el rea de estanques del laboratorio de crustceos del CIBNOR. Cada semana se
muestrearon aleatoriamente 6 camarones de cada grupo, a los cuales se les

determin la longitud (cm; rostrum-telson) y el peso (g). Posteriormente, a cada
31
camarn se le disect el rgano genital y se pesaron las siguientes estructuras
sexuales: 1) rgano genital, 2) lbulos testiculares y, 3) vasos deferentes con las

mpulas terminales. Adicionalmente, se registr el peso de los espermatforos y se
realiz un conteo espermtico de los mismos mediante un hemacitmetro (0.1 mm
de fondo; HausserScientific, Horsham, PA). El experimento dur seis semanas. Se
calcul el ndice gonadosomtico (peso del testculo/peso corporal) X 100, el
ndice genital-somtico (peso total del rgano genital/peso corporal) X 100, el
ndice del vaso deferente-somtico (peso del vaso deferente/peso corporal) X 100.
Los vasos deferentes con la GA de los camarones analizados en la primera semana,
se fijaron en solucin Davidson (Howard y Smith, 1983; Bell y Lightner, 1988) por
24 h y posteriormente en etanol (70%) para ser procesarse por la tcnica

hematoxilina-eosina (Bell y Lightner, 1988).
ANLISIS ESTADSTICOS
La normalidad de los datos del dimetro de los CS, los conteos espermticos (en
cada estadio de muda y en el experimento de ablacin) y los pesos registrados del

rgano genital, se corrobor mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y, la
homogeneidad de varianzas, mediante la prueba de Levene con el programa
Statistica 8. Los datos de cada experimento fueron analizados mediante un ANOVA,
utilizando el programa SPSS ver. 16.0 (SPSS, Chicago, IL), con un nivel de
significancia de P < 0.05. Las diferencias significativas entre los tratamientos se

analizaron por medio de la prueba de Tukey.
ANLISIS MOLECULAR
Se disearon una serie de oligonucletidos (Tabla I) con el software Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) a partir de las secuencias de la GA de
decpodos disponibles en el GenBank: C. quadricarinatus (DQ851163.1), M.
rosenbergii (FJ409645) y P. monodon (GU208677.1). Por otra parte, se utilizaron
los oligos publicados por Banzai et al. (2011), con los cuales amplificaron regiones
32
especficas de M. japonicus basndose en la secuencias reportadas de P. monodon:
Jap(F)-CTTCGACTG-CGGTGACATCG y Jap(R)-ACACGTCCGCTGGCTCACGT.
Tabla I. Oligonucletidos diseados a partir de secuencias reportadas de la GA en

decpodos.
Inicialmente, se obtuvo ARN total utilizando el mtodo de extraccin de
tiocianato de guanidina acido-fenol cloroformo (Chomczynski y Sacchi, 1987), a
partir de los siguientes tejidos: 1) la parte distal del mpula terminal (dAT), 2) la
parte proximal del mpula terminal (pAT), 3) vaso deferente distal (VDD), 4) la
parte distal del vaso deferente medio (dVDM) y testculo (T). Posteriormente, se
sintetiz la primera hebra de ADNc usando 2.5 g del ARN total utilizando la
transcriptasa reversa cloned AMV (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del

fabricante. El ADNc se us como templado para la amplificacin mediante PCR con
33
los oligonucletidos diseados (Tabla 1), en diluciones 1:4; 1:3, 1:2, 1:1 y 1:0,
preparadas con Agua Sigma. El programa utilizado para las amplificaciones de PCR
consisti de un ciclo de 3 min por 30s (desnaturalizacin inicial), 35 ciclos de: 30 s
a 94C (desnaturalizacin), 30 s a 55C (alineamiento), 1 min a 72C (extensin), y
un paso de extensin final de 3 min a 72C. La amplificacin del ADNc se llev a
cabo en un termociclador MJ Mini (Bio-Rad). Se prepararon mezclas de 15 l por
reaccin para la amplificacin, con los siguientes componentes mostrados en la

Tabla II.
Tabla II. Componentes para la reaccin de PCR.
La electroforesis de los amplicones se realiz en geles de agarosa-TAE
(1.5%-1%, respectivamente), a 100 V por 30 min. Posteriormente, los geles se

trasladaron a bolsas plsticas resellables (Zip-lock), en donde se agregaron 100 ml
de Fast Blast DNA Stain 1X (Bio-Rad), tiiendose con agitacin suave por 5 min a
temperatura ambiente. Despus, se realiz un lavado con agua corriente tibia
durante 10 min. Finalmente, los geles se observaron y documentaron mediante

fotografa digital en un fotodocumentador MiniBIS Pro (DNR). Los productos de
PCR se purificaron con el kit Geneclean Turbo (MP); la secuenciacin de los
amplicones puros se realiz mediante el metodo dideoxy por el servicio GeneWiz

(USA). Las secuencias obtenidas se analizaron con el programa Chromas Pro, para
34
determinar la calidad de los electroferogrmas y corroborar ambigedades en las
bases secuenciadas. Posteriormente, para el anlisis de alineamiento mltiple de

las secuencias de aminocidos deducidas se us el software Clustal X ver. 1.8,
usando parmetros estndar. Para la elaboracin de dendogramas de similitud se

utiliz el algoritmo Neighborg-Joining (NJ) implementado en el programa Mega 5.0
(Tamura et al., 2011).
35
RESULTADOS
ORGANOGNESIS
Lnea de tiempo de eventos durante la diferenciacin sexual interna y externa
En la Figura 17 se muestra una lnea de tiempo con los eventos que conforman el
proceso de diferenciacin sexual interna y externa en hembras y machos de

camarn blanco, en la que se liga cada evento a una figura.
Figura 17. Lnea de eventos de la diferenciacin sexual externa e interna de L.

vannamei.
Organognesis de la gnada (PL12 a PL16)
La observacin de las laminillas histolgicas revel la ausencia de gnada en PL4 y
PL8. Sin embargo, a partir de PL12 la gnada se observ como una estructura
bilateral localizada dorsalmente en la regin anterior del hepatopncreas. El
rgano genital de cada gnero se reconoci por completo a travs de la diseccin
en PL16. Durante este periodo, el peso corporal del camarn oscil entre los 80
130 mg con una longitud de 15 18 mm (Figura 17).
36
Figura 18. rgano genital de L. vannamei, PL24. Vista ventral de la hembra (A) y de
macho (B), localizado en la regin cefalotorcica. Tubo colector en forma de
herradura (hmc), lbulos gondicos (nmeros romanos), oviducto (ov) y vasos
deferentes (vd).
Morfologa del rgano genital
Tanto en la hembra como en el macho, el primer par de lbulos anteriores est
conectado a un tubo colector que se encuentra perpendicular al eje del cuerpo, que
se extiende dorsalmente hacia la regin posterior del hepatopncreas formando un
tubo en forma de herradura. A lo largo, y perpendicularmente conectados a este

colector, se encuentran ocho lbulos laterales en hembras, numerados del II hasta
el IX, adems del oviducto bilateral (Figura 18 A), siete lbulos laterales en los
machos, numerados del II al VIII, adems de los vasos deferentes (Figura 18 B);
estos lbulos se encuentran extendidos sobre la superficie del hepatopncreas por

debajo del pericardio, representando la anatoma bsica de la gnada. En la
hembra, el lbulo bilateral X emerge de la regin distal del tubo colector y se

desarrolla dorsalmente junto con el intestino a travs de los cinco segmentos
abdominales durante los siguientes ocho das. Adicionalmente, en PL28 el cuarto

lbulo no se desarroll y tuvo una regresin hasta que aparentemente fue
absorbido, dejando un espacio evidente entre el tercer y quinto lbulo, sin dejar
rastro de lbulos rudimentarios (Figura 19 A). Por lo tanto, la morfologa final de la
gnada de la hembra comprende un lbulo bilateral anterior, siete lbulos
37
laterales bilaterales, numerados del II al VIII, adems del oviducto bilateral (Figura
19 B), y del IX lbulo bilateral distal abdominal.
Figura 19. rgano genital de la hembra de L. vannamei. (A) Vista ventral del rgano
en una hembra juvenil PL80 (3 g), las flechas muestran un espacio interlobular que
corresponde al cuarto lbulo. (B) Hembra adulta (28 g) mostrando un lbulo
anterior y siete laterales (nmeros romanos), adems del oviducto (ov) y el tubo
colector en forma de herradura (hmc).
Desarrollo temprano de la gnada (PL12 a PL28)
La morfologa inicial del lbulo anterior indiferenciado est compuesto por clulas
ordenadas en forma irregular (Figura 20 A), las que para PL28 se forman en
grupos de clulas en todos los lbulos gondicos (Figura 20 B).
Histologa del oviducto y del vaso deferente
El oviducto bilateral es un tubo colapsado que, visto transversalmente, tiene una
forma de media luna, lo que le permite distinguirse de los dems lbulos gondicos
(Figura 20 C). Esta estructura se localiza entre los lbulos VI y VII y contina
lateralmente sobre el hepatopncreas, extendindose ventralmente hacia el

musculo torcico-abdominal, al nivel del tercer peripodo. En el macho, el vaso
deferente proximal surge de la parte distal del tubo colector herradura, detrs
38
del hepatopncreas. Se extiende hacia arriba y hacia los lados, descendiendo

posteriormente en paralelo con la aorta, que corre hacia abajo en el lado izquierdo
del cuerpo entre el musculo torcico-abdominal y el intestino, rodeado por un

tejido conectivo suelto indiferenciado (Figura 20 D). Cada vaso deferente se
extiende hacia el empalme de los msculos torcico-abdominal y el flexor oblicuo
abdominal, descendiendo lateral y directamente como vaso deferente distal que

alcanza ventralmente la regin interna de la base del quinto peripodo como una
mpula terminal primordia. Los vasos deferentes son filiformes, sin notarse an
ningn bulbo eyaculador medio, y estn compuestos de clulas epiteliales

columnares con un lumen, formando una estructura columnar y un septum
longitudinal que divide al tubo en una gran cmara lineada por epitelio y con otra
cmara pequea incompleta (Figura 21). El desarrollo temprano de los vasos

deferentes se observ despus de PL36, cuando la regin anterior se observ ms
amplia, diferencindose en un vaso deferente medio que funciona como bulbo
eyaculador.
Diferenciacin sexual externa temprana (PL32 a PL44)

La diferenciacin sexual externa temprana comienza alrededor de PL32; el peso
corporal oscila entre 180-280 mg y la longitud entre 25-35 mm. Se observaron dos
caractersticas externas importantes: 1) el endopodito que surge como una
pequea protuberancia con una o dos setas apicales. En el transcurso de los das, el
endopodito de la hembra se ampla en la parte externa proximal-media, formando
tres o cuatro setas proximales en su borde, manteniendo las apicales. En machos,
en el endopodito se forman una o dos setas proximales y apicales que se pierden

durante las siguientes mudas, y el endopodito se mantiene como un apndice
tubular, que posteriormente forma el petasma. 2) En hembras, el protopodito del

primer par de plepodos tiene una articulacin rectangular, mientras que en
machos esta articulacin presenta una muesca en su regin distal.
39
Figura 20. rgano genital de L. vannamei. Corte longitudinal del lbulo gondico
anterior en PL18 (A) y PL28 (B). Corte transversal del oviducto localizado en la
parte postero-lateral del hepatopncreas en hembras PL40 (C). Corte longitudinal
de la regin cefalotorcica posterior y abdominal anterior de machos PL32 (D).
Aorta (a), semi-arreglos de clulas mesodrmicas (sgc), paquetes de clulas
mesodrmicas (cgc), intestino (i), hepatopncreas (mg), msculo torcicoabdominal (tam), msculo flexor-abdominal oblicuo (ofam), oviducto (vd) y vaso
deferente proximal (vdp).
Diferenciacin sexual externa subsecuente (PL44 a PL48)
La diferenciacin sexual externa continua en PL44; con un peso corporal entre los
0.5-0.6 g y una longitud entre los 45-50 mm. En hembras, en el tlico se comienzan
a formar un par de crestas afiladas y oblicuas, lo que es caracterstico de la especie,
mientras que en machos comienzan a desarrollarse los gonoporos, en la coxa de

quinto peripodo y los apndices masculinos, en el segundo par de plepodos.
40
Organognesis de la GA y del tejido adiposo blanco (PL48 a PL50)

En los machos, las clulas primordias de la GA se forman a partir de PL45, unidas
en lnea, aparentemente sujetas por un tejido conectivo fibroso fino en la pared

externa-posterior de cada vaso deferente, el lado que encara al msculo abdominal
oblicuo (Figura 21 A). Poco despus (PL52) las clulas ovaladas se acumulan en
esta rea formando el tejido de la GA (Figura 21 B).
Figura 21. Vaso deferente de L. vannamei. Corte longitudinal de los vasos

deferentes en macho PL44 (A) y en PL52 (B). Clulas andrognicas primordias
(pagc), clulas de la glndula andrognica (agc), tejido adiposo blanco (wat), pared
posterior externa (pew) y vaso deferente (vd).
Durante este tiempo, en hembras y machos, el tejido conectivo suelto se
diferencia en un tejido adiposo blanco, llenando la cavidad que se encuentra entre

la regin posterior del hepatopncreas, el musculo torcico-abdominal, el intestino
y el rea que rodea la aorta en el lado izquierdo del cuerpo. Los ncleos de estas
clulas se desplazan hacia la periferia por el alto contenido graso en el citoplasma
(Figura 21).
Desarrollo del epitelio germinal y diferenciacin sexual de la gnada (PL52 a PL72)

Los grupos de clulas que se formaron en la gnada se diferencian en epitelio
germinal a partir de PL52. Las clulas germinales son ms grandes y ms redondas

que las clulas originales, y forman una estructura tubular ovalada donde las
41
clulas gondicas se encuentran en la periferia rodeando al lumen. Sin embargo, la
gnada se encuentra an sin diferenciarse. Las clulas secundarias gondicas se
transforman en ovocitos primarios, los cuales comienzan un crecimiento

previtelognico primario a partir de PL72, lo que la caracteriza como una gnada
femenina (Figura 22 A) a diferencia de una gnada masculina (Figura 22 B). La
diferenciacin de la gnada ocurre cuando ambos sexos alcanzan un peso entre

1.8-2.2 g y una longitud de 70-74 mm. En las hembras, los ovocitos alcanzan un
mayor tamao y toman una forma triangular o de pera, llenando y expandiendo los
lbulos que caracterizan al ovario. Por otro lado, los espermatocitos primarios del
macho, son redondos y se encuentran estrechamente acomodados, producen las

espermtidas que se transfieren hacia el lumen del lbulo testicular; durante esta
etapa la diseccin de cualquier lbulo testicular mostr solo un tbulo seminfero

largo.
Figura 22. Gnada de L. vannamei. Corte longitudinal de la gnada de la hembra (A)

y del macho (B) en PL72. La flecha muestra en (A) ovocitos en forma triangular o
de pera (ooc), y en (B) la espermatogonia (sper) alrededor del lumen (L).
Desarrollo subsecuente de los vasos deferentes y de la glndula andrognica
En camarones juveniles la apariencia externa de la GA fue difcil de observar
debido a que en organismos en este estadio la glndula es minscula y
transparente. Sin embargo, el desarrollo de tejido conectivo fue evidente en la
42
regin media de los vasos deferentes, lo que indica la localizacin de la supuesta
GA. El tejido conectivo del vaso deferente se encuentra tambin sujeto al octavo
lbulo testicular, lo que permite que el vaso y el testculo se encuentren juntos, en

paralelo (Figura 23 A).
Figura 23. rgano genital de macho de L. vannamei. Vista ventral del rgano genital
del macho en PL48, 0.5 g (A), un adulto de 26 g (B). Detalle de los vasos deferentes
de B (C). Tubo colector herradura (hmc), lbulos testiculares (tl), bulbo eyaculador
anterior (aeb), bulbo eyaculador posterior (peb),octavo lbulo testicular (etl), vaso
deferente proximal (pvd), vaso deferente medio (mvd), vaso deferente distal (dvd)
y mpula terminal (ta).
Durante el crecimiento del macho, la parte media del vaso deferente
continua su desarrollo hasta convertirse en un vaso deferente medio, grande y

doblado, tomando forma de herradura o de una U invertida (llamado de doble
fijado por Treece y Yates, 1988). Cada uno de los vasos deferentes medios
incluyen un bulbo eyaculador anterior y posterior (Figura 23 B y C). En camarones
43
pre-adultos y adultos, la GA se muestra como un cordn inmerso en el tejido

conectivo, conectando la parte distal del bulbo eyaculador posterior con el octavo
lbulo testicular (Figura 24 A y B). Posterior a la diseccin del vaso deferente, bajo
examinacin histolgica, la GA se observa como una masa delgada y compacta con

clulas ovaladas con un ncleo prominente.
Figura 24. Vaso deferente medio de L. vannamei. Anatoma externa del vaso
deferente medio en macho adulto mostrando la interconexin a travs de un tejido
conectivo (ct) entre la regin distal del bulbo eyaculador posterior (peb), la
glndula andrognica (ag) y el octavo lbulo testicular (etl). Levantamiento del
bulbo eyaculador posterior (A) y diseccin junto con el octavo lbulo testicular (B).
En el experimento de ablacin del pednculo ocular que se detalla ms
adelante, se observ hipertrofia de la GA, la cual expandi su localizacin a lo largo,

y por la parte interna, del vaso deferente distal, rodeando el mpula terminal y
ensanchndose en su parte distal (Figura 25).
44
Figura 25. Vaso deferente de L. vannamei. Histologa del vaso deferente distal
(VDD) y mpula terminal (AT). Las flechas indican el cordn de la glndula
andrognica (GA). Barra = 500m.
45

La mejor tcnica para la observacin de los complejos sinaptonmicos (CS) fue la
de secado al aire, con tincin de orcena. Los CS no se observaron con la tincin de

DAPI ni con la de nitrato de plata, previamente habiendo fijado los tejidos con
paraformaldehdo. La etapa de diploteno se observ ms ntida bajo las tcnicas de

tincin de orcena y DAPI que con la de nitrato de plata. La etapa de cigoteno se
diferenci de la de paquiteno ya que los cromosomas homlogos an no se
encontraban en completa sinapsis. Durante cigoteno, los bivalentes, se observaron
ms delgados y ms largos que en paquiteno por su poca condensacin de

cromatina, en contraste con los bivalentes en la etapa de paquiteno, en donde se
observaron completamente unidos (sinapsis).
Ambos sexos del camarn mostraron todas las etapas de la meiosis I,
exceptuando la etapa de leptoteno (). Tanto el grupo control como el tratado con
colchicina, mostraron ncleos en cigoteno (++), paquiteno (++++), diploteno

temprano (+) y diploteno-diaquinesis (++). Sin embargo, en el grupo tratado fue
ms fcil de encontrar la etapa de diploteno. En ambos sexos, la mayora de las
clulas meiticas se identificaron en la etapa de paquiteno, caracterizada por los
bivalentes en completa sinapsis. En el camarn, la naturaleza de los CS observados

muestra a los cromosomas homlogos en sinapsis, revelando una alta densidad de
cromatina y un arreglo complejo, un tanto desorganizado dentro del ncleo.
Las etapas de cigoteno (Figura 26 A y B), paquiteno (Figura 26 C y D),
diploteno temprano (Figura 27 AD) y diploteno-diaquinesis (Figura 28 A y B) se

observaron en los estadios de post-muda, inter-muda y pre-muda, en ambos sexos
en todos los camarones analizados. Las ovogonias (++) y espermatogonias (+++) se
observaron en todos los estadios de muda, y solo los machos presentaron algunas
ncleos mitticos conteniendo 88 cromosomas (Figura 28 C y D).
46
Figura 26. Cromosomas en cigoteno y paquiteno de L. vannamei. Complejos

sinaptonmicos enredados en etapa de cigoteno de hembras (A) y machos (B), y
en etapa de paquiteno en hembra (C) y macho (D), Tcnica de tincin: orcena. Se
observan los elementos laterales, en donde los cromosomas homlogos an no han
hecho sinapsis (flechas pequeas). La sinapsis ocurre a manera de un cierre en
una sola direccin, aparentemente de un extremo a otro (flechas grandes). Sinapsis
completa en paquiteno (flechas dobles). Barra = 10 m.
47
Figura 27. Cromosomas en diploteno de L. vannamei. Hembra (A y B) y macho (C y

D) en etapa temprana de diploteno, mostrando 44 bivalentes. Tcnica de tincin: A,
B y D, orcena; C, DAPI. Barra = 10 m.
48
Figura 28. Cromosomas en diploteno avanzado y en mitosis de L. vannamei.

Hembra (A) y macho (B) en etapa avanzada de diploteno, mostrando 44 bivalentes.
Tcnica de tincin: A, C y D, orcena; B, DAPI. Cromosomas mitticos (C y D). Barra
= 10 m.
Conforme la primera profase meitica avanza hacia la etapa de diploteno,
ocurre una reduccin en el dimetro de los ncleos, dejando a los cromosomas

homlogos unidos solo por los quiasmata (puntos de recombinacin). En esta
etapa fue posible determinar el nmero haploide de 44 cromosomas, ya que el

ncleo se encontraba con el grado de condensacin ms alto de bivalentes. Los
ncleos de diploteno (en ambos sexos) presentaron 44 bivalentes, de los que ~40
presentaron forma de anillo y el resto una forma de v. No se observaron
diferencias significativas en el dimetro de los ncleos entre ambos sexos: cigoteno
49
(p=0.39); paquiteno (p=0.19) y diploteno (p=0.26). La media en dimetro de los
ncleos disminuy gradualmente a partir de cigoteno (95 16 m en hembras, 88

15 m en machos), paquiteno (66 9 m en hembras, 60 8 m en machos) y
diploteno (42 10 m en hembras, 38 8 m en machos), llegando a decrecer el

dimetro de los ncleos (a lo largo de las etapas) alrededor del 50% (Figura 29).
Las espermtidas (++++) y el esperma inmaduro (++++), as como ovocitos
previtelognicos (+++) fueron observados comnmente durante todo el ciclo de

muda. Los conteos espermticos en los vasos deferentes (p=0.34) y
espermatforos (p=0.25) no fueron significativamente diferentes durante los

estadios de muda (Tabla III).
Figura 29. Dimetro de los ncleos (Media DS) en etapas de cigoteno, paquiteno y
diploteno en hembras y machos de L. vannamei.
Tabla III. Conteos espermticos (MediaES) en los vasos deferentes y en
espermatforos durante el ciclo de muda de L. vannamei.
50
ABLACIN DEL TALLO OCULAR E HIPERTRFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA

Los resultados del bioensayo de ablacin del pednculo ocular mostraron
que el peso total del rgano genital, se increment significativamente en los
machos ablacionados bilateralmente (referenciado como bilateral) en la primera
(p=0.03) y segunda (p=0.01) semanas, con respecto a los camarones ablacionados
unilateralmente (referenciado como unilateral) y los organismos control. En la

tercera semana no se observaron diferencias significativas (p=0.42) entre los tres
grupos, sin embargo, en la cuarta semana los grupos bilateral y unilateral fueron
similares (p=0.35), mientras que el peso promedio del rgano genital de los
organismos con ablacin bilateral fue significativamente mayor (p=0.04) que el de
los controles (Figura 30 A). En la quinta semana de cultivo se observ un
incremento significativo del rgano genital en el grupo unilateral con respecto a

los controles (p=0.02), mientras que en la sexta semana ambos grupos fueron
similares (p=0.36) (Figura 30 A). Cabe sealar que el grupo de camarones bilateral
tuvo una alta mortalidad y ms all de la cuarta semana de experimentacin
ningn organismo sobrevivi. Los resultados del ndice genital-somtico ajustan el

peso del rgano genital respecto al peso corporal, y se observ, que solo en la
primera (p=0.01) y cuarta (p=0.04) semanas se increment significativamente el
grupo bilateral, respecto a los grupos unilateral y control. Sin embargo, el grupo
bilateral fue significativamente mayor (respecto a los controles) en cada una de las
cuatro semanas (1: p=0.01; 2: p=0.01; 3: p=0.04; 4: p=0.03), mientras que el

unilateral lo fue nicamente en la primera (p=0.04) y quinta (p=0.01) semanas
(Figura 30 B).
Respecto a los resultados del peso de los testculos, se observ que en el
grupo bilateral se increment significativamente en la segunda (p=0.01) y cuarta

(p=0.04) semanas de cultivo, respecto al grupo unilateral y control, mientras que
en la tercera semana, en ambos grupos ablacionados, el peso de los testculos fue
significativamente mayor que el de los del grupo control (p=0.04). El grupo
unilateral fue significativamente mayor (p=0.04) que el control en la tercera

semana del cultivo (Figura 31 A).
51
Figura 30. Comparacin del peso del rgano genital e ndice genital-sotico entre
camarones ablacionados unilateralmente, bilateralmente y controles. Semana (S).
Letras minsculas diferentes denotan una diferencia significativa.
52
Al ajustar el peso del testculo con respecto al peso corporal, el ndice
gonadosomtico del grupo bilateral mostr un incremento significativo en la
primera (p=0.01), segunda (p=0.01) y cuarta (p=0.01) semanas de cultivo, respecto
a los grupos unilateral y control, mientras que en la tercera semana no existi una
diferencia significativa entre los tres grupos (p=0.66) (Figura 31 B). Cabe sealar
que tanto en el peso testicular as como en el ndice gonadosomtico del grupo
control mostr una oscilacin bien marcada: de forma descendente durante las
primeras dos semanas, ascendente durante la tercera y cuarta, y descendente
durante la quinta y sexta semanas (Figura 31 A y B).
Los resultados del peso del vaso deferente mostraron que no es sino hasta
la cuarta semana que existi un incremento similar entre los grupos ablacionados,
los cuales fueron significativamente ms altos que el control (p=0.01) y que se
mantuvieron de esta forma una semana posterior en el grupo unilateral,

disminuyendo a valores similares en la sexta semana (Figura 32 A). Al ajustar el
peso del vaso deferente con respecto al peso corporal, el ndice del vaso deferente-
somtico mostr un patrn muy similar al anterior (Figura 32 B). El peso del
espermatforo mostr una tendencia ligera de incremento hacia la cuarta semana
de cultivo, seguida de una ligera disminucin hacia la sexta semana. Sin embargo,
los datos no mostraron una diferencia significativa (p=0.93) en los tres grupos
(Figura 33 A). El conteo de esperma mostr que solamente en la cuarta semana, el

grupo
bilateral
aumento
significativamente
(p=0.01)
de
1.5
106
cel/espermatforo al da cero hasta ~6 x 106 cel/espermatforo con respecto al

grupo unilateral y control, los cuales se mantuvieron en ~2 x 106
cel/espermatforo durante las seis semanas de cultivo (Figura 33 B).
53
Figura 31. Comparacin del peso del testculo e ndice gonadosomtico entre
54
Figura 32. Comparacin del peso del vaso deferente e ndice vaso deferente entre
55
Figura 33. Comparacin del peso del espermatforo y conteo espermtico entre
56
Figura 34. Efecto de la ablacin en L. vannamei. Cortes histolgicos del vaso

deferente y GA en el camarn una semana despus de la ablacin. Barra = 100 m.
En los cortes histolgicos se logr observar que despus de una semana,
tanto en el grupo de ablacin unilateral como en el grupo bilateral, la GA

increment el nmero de clulas en la parte distal del vaso deferente medio y en el
mpula terminal, lo cual denot una hiperplasia producida por la ablacin (Figura
34).
ANLISIS MOLECULAR
Mediante RT-PCR/secuenciacin se obtuvo un fragmento de la secuencia de
nucletidos de la hormona de la GA de L. vannamei (Lv-IAG) utilizando los
oligonucletidos mono3F-mono3R (Tabla I). Este fragmento de aproximadamente
360 pb (~120 aa), se obtuvo cuando se us ADNc de tejido de la mpula terminal

(AT) y de la parte distal del vaso deferente medio (dVDM) del camarn macho,
como templado para la amplificacin (Figura 35).
57
Figura 35. RT-PCR de L. vannamei usando como templado ARN total de diferentes
tejidos del vaso deferente. Escalera (E), mpula terminal distal (AT), mpula
terminal proximal (ATP), vaso deferente distal (VDD), parte distal del vaso
deferente medio (dVDM, carril 4) y testculo (T). Gel de agarosa-TBE 1.5% teido
con Fast Blast DNA Stain (Bio-Rad).
El anlisis de alineamiento de la secuencia nucleotdica de L. vannamei
realizado con el programa Mega 5.0, mostr que existe un 87% de identidad con
aquella reportada para P. monodon y un 80% con la de M. japonicus. A partir de la

secuencia de nucletidos Lv-IAG se dedujo la secuencia de aminocidos que
mediante anlisis de alineamiento (Figura 36) con las secuencias de decpodos
reportadas se obtuvo que: con P. monodon (GU208677.1) se encontr una

identidad del 80%, 76% con M. japonicus (AB598415.1), 33% con C.
quadricarinatus (DQ851163.1), 55% con M. rosenbergii (FJ409645), 37% con M. lar

(AB579012.1), 39% con
P. pelagicus (HM459854.1), 38% con C. destructor
(EU718788.1), 30% con P. paucidens (AB588013) y 39% con P. pacificus

(AB588014.1).
58
Figura 36. Anlisis de alineamiento de secuencias de aminocidos de la HGA

reportadas en decpodos. Las flechas indican el trmino del pptido seal, en cajas
se sealan los residuos de cistena conservados, y en lneas los puentes de
disulfuro predichos (sitios de unin de las cadenas A y B). Anlisis realizado con
ClustalX ver. 1.8, con parmetros estndar.
59
Figura 37. Dendrograma consenso de similitud, sin raz, basado en las secuencias
de aminocidos de la HGA de L. vannamei y otros crustceos decpodos. Algoritmo
Neighborg-Joining (NJ) y mtodo p-distance del programa Mega 5.0 (Tamura et al.,
2011). Soporte estadstico calculado mediante 10,000 rplicas de remuestreo
(bootstrap).
60
DISCUSIN
ORGANOGNESIS
La anatoma del rgano genital en machos de L. vannamei concuerda con las
descripciones de M. japonicus de Chim (1983) y con las de L. vannamei y L. setiferus

de Chow et al. (1991). Sin embargo, el rgano genital de las hembras de L.
vannamei y, en general, de los peneidos descritos por King (1948) y Dall et al.
(1990) no concuerdan con nuestras observaciones. Ambos sexos tienen una

anatoma
bsica
de
lbulos
bilaterales
anteriores
lbulos
laterales
independientes, acomodados simtricamente a cada lado de un tubo colector en

forma de herradura. Aparentemente, esta estructura es nica para especies de
peneidos (Laubier et al., 1983; Chow et al., 1991), sin embargo, esta anatoma no
ha sido estudiada en otras especies.
La descripcin de la organognesis genital aqu detallada, concuerda en lo
general, con los pocos estudios acerca de la morfologa externa e interna, y de la

diferenciacin sexual en peneidos (Chim, 1983; Laubier et al., 1983; Charniaux-
Cotton y Payen, 1985; Chow et al., 1991; Nakamura et al., 1992; Campos-Ramos et
al., 2006). En ambos sexos, la notoria separacin entre el tercer y cuarto lbulo
(ver Figura 19 A en hembras y Figura 18 B en machos) pudiera sugerir que el
cuarto lbulo bilateral se forma junto con las primeras capas de clulas
mesodrmicas que dan la estructura a cada lbulo gondico. La regresin de este
lbulo no es clara, dada la dificultad del anlisis de todo el rgano genital durante
estas primeras etapas de desarrollo; una vez que se desarrolla la gnada en cada
sexo, no hay diferencia en el desarrollo de los lbulos gondicos. Desde un punto
de vista anatmico, la posicin fsica del cuarto lbulo coincide con el eje ms
ancho y alto del hepatopncreas anterior, por lo tanto, si el cuarto lbulo se
desarrollara, sera ms largo y externo que los otros lbulos. En cambio, este
lbulo sufre una regresin, posiblemente por la morfologa y desarrollo del
hepatopncreas.
Se sugiere que tanto para M. japonicus como para L. vannamei, el tiempo en
que la postlarva se mantiene indiferenciada es muy corto despus de la
61
metamorfosis larval. De acuerdo a Laubier et al. (1983), en PL8 la gnada aparece

primeramente como dos masas de clulas germinales asociadas con clulas
somticas. En L. vannamei, las primeras estructuras gondicas que se observaron
fueron los lbulos bilaterales anteriores, a partir de PL12; estos autores

encontraron el rgano genital completo del macho en PL11. En contraste, nuestra
primera identificacin del oviducto y de los vasos deferentes ocurre hasta PL16.
Sin embargo, la diferenciacin sexual externa se lleva a cabo hasta que el camarn
alcanza un peso de 0.5 g y una longitud de 45 mm, aproximadamente en PL50, lo
cual coincide con el desarrollo de M. japonicus (Nakamura et al., 1992). Esta etapa
est representada y, hasta cierto punto, en sincrona por el desarrollo externo del
tlico de la hembra y de los gonoporos del macho, adems de la aparicin interna
de la GA. La organognesis de la GA en L. vannamei comienza en la regin lateral-
posterior de cada vaso deferente y el mpula terminal, como se observa en M.
japonicus (Nakamura et al., 1992). Aparentemente, las clulas primordias de la GA
se diferencian independientemente del tejido conectivo suelto, el que a su vez se
diferencia en ambos sexos en tejido adiposo-blanco alrededor del intestino y del

hepatopncreas. Las clulas de la GA pudieran originarse a partir de las clulas
mesodrmicas que forman el tejido conectivo, el cual mantiene a los lbulos

testiculares debajo del pericardio. La GA est inmersa dentro de un tejido
conectivo que interconecta a los vasos deferentes y el octavo lbulo testicular,
detalle no observado previamente en M. japonicus (Charniaux-Cotton y Payen,

1985) o en L. vannamei (Alfaro, 1994; Campos-Ramos et al., 2006).
De acuerdo con Charniaux-Cotton y Payen (1985), los grupos de clulas que
se acumulan en los lbulos gonadales son clulas mesodrmicas, mientras que los
oviductos y vasos deferentes crecen a partir del tejido del rgano genital que se
diferencia a epitelio columnar. Para PL52 (0.5 g y 45 mm), estos grupos de clulas
forman estructuras tubulares ovaladas donde las gonias se renen alrededor de un
lumen, lo que indica una zona germinal. De PL68 a PL72 ( 2 g y 72 mm), los
camarones muestran ovocitos primarios en desarrollo, indicando el tiempo de
diferenciacin de la gnada, ocho das ms tarde de lo que se reporta en M.
japonicus por Nakamura et al. (1992).
62
Como lo describe King (1948), en machos las espermatogonias se renen en
la periferia del lbulo testicular, mientras que en el lumen se acumulan
espermatocitos secundarios y espermtidas. De acuerdo con Chow et al. (1991), el

ciclo de produccin de gametos, independiente en cada tbulo seminfero, consta
de dos fases caractersticas, en donde las clulas sustentaculares (soporte epitelial)
juegan el papel de expandir y contraer el lumen comenzando un nuevo ciclo de
produccin de espermatocitos primarios por la espermatogonia. Inicialmente, la
primera fase, llamada fase cuerda, es donde la espermatognesis esta soportada

por las clulas sustentaculares multifuncionales y generan las espermtidas
tardas; posteriormente, en la segunda es la fase lumen, es en la que las clulas
sustentaculares se retractan y se alinean para formar una cavidad donde las
espermtidas tardas se transfieren al vaso deferente posterior, donde la
espermatognesis continua. De acuerdo a Parnes et al. (2006), los machos tambin

tiene un ciclo de muda reproductivo. La masa espermtida-espermatozoide se
transporta a lo largo del vaso deferente, envuelta y almacenada en el mpula
terminal, formando el espermatforo que ser expulsado a travs de los gonoporos
y renovado cada ciclo de muda, si es que no existiera un comportamiento

reproductivo.
De acuerdo con Campos-Ramos et al. (2006), L. vannamei posee un sistema
de determinacin sexual gentico estable no influenciado por condiciones

medioambientales. El tamao de los camarones sirvi de gua para el seguimiento
al desarrollo sexual bajo las condiciones de crianza de ese estudio. Sin embargo,
tambin se encontr que la diferenciacin externa ocurre durante el mismo tiempo
bajo dos condiciones de temperatura diferentes (27 y 32C), donde el tamao del
camarn fue variable, y que tambin la diferenciacin en condiciones de
temperaturas
menores
(18C)
condiciones
biolgicas
ambientales
desfavorables pudieran retrasarla. Por lo tanto, el tamao no debe tomarse como
factor para la determinacin sexual. Es necesario identificar las estructuras

sexuales internas y externas, las cuales se resumen en la figura 17. Aunque la GA es
nica para malacostracos, existe evidencia que en dos especies de peneidos esta
glndula no est involucrada en la diferenciacin y determinacin sexual, ya que el
63
sexo se diferencia antes de que esta se desarrolle, poco despus de la

transformacin larval.
Probablemente, la interconexin entre los vasos deferentes y el testculo
est relacionada con la espermatognesis y la maduracin del testculo, o algn
otro proceso regulatorio de inhibicin del ovario, ya que la gametognesis

comienza despus de que la GA se forma. Como se muestra en este estudio, ya hay
evidencia de que en peneidos, la GA est involucrada con el eje endocrino tallo
ocularGA testculo, como se reporta para C. quadricarinatus (Khalaila et al.,

2002).
En langostinos en hembras implantadas con GA se ha observado una
induccin de la masculinizacin, la aparicin de caractersticas secundarias

sexuales y la inhibicin de la vitelognesis; mientras que en machos juveniles la
andrectoma induce a la feminizacin (vitelognesis). Esta estrategia de induccin
de la reversin sexual para producir cultivos monosexuales en langostinos como
en M. rosembergii, est bien documentada en la literatura (Nagamine et al., 1980a,

b; Sagi et al., 1990; Aflalo et al., 2006). En contraste, Li y Xiang (1997) trataron de
revertir el sexo en F. chinensis sin obtener resultados. Este experimento fallido
puede relacionarse con la falta de conocimientos adecuados del proceso de
diferenciacin sexual en peneidos comparados con los de langostinos. An se
desconoce si la implantacin y andrectomizacin de la GA en camarones tenga

xito para promover la reversin sexual; ciertamente, trabajos previos y el que
aqu se presenta debern tomarse en cuenta. En este trabajo se concluye que, en

ambos sexos de L. vannamei, la diferenciacin externa se desarrolla alrededor de
15-20 das antes de la diferenciacin de la gnada. En teora, en el camarn blanco

cuando se observa la diferenciacin externa, cualquier procedimiento quirrgico
de los vasos deferentes o la implantacin de GA a las hembras, comprometer el
camino de la diferenciacin de la gnada, que es bsicamente el mismo principio
biotecnolgico de reversin sexual utilizado en M. rosembergii.
64

En el camarn blanco, las clulas meiticas en la gnada mostraron las
caractersticas generales de la primera profase observadas en eucariontes. Los CS

de las clulas gondicas se obtuvieron bajo la tcnica de secado al aire, usando
Carnoy como fijador y orcena como tincin, gracias a la alta densidad de
cromatina de los bivalentes. Esta tcnica fue ms fcil de procesar en comparacin
con la de fijacin con paraformaldehdo y plata como tincin, lo que es

comnmente utilizado para el estudio de varias especies. En trminos de esparcir
los ncleos, las tcnicas utilizadas fueron tiles para separar los bivalentes. La gran
cantidad de bivalentes con un arreglo enredado en el ncleo, no permiti la
medicin y reconocimiento de cada bivalente, y mucho menos, de un bivalente

relacionado con el sexo, si es que existiera. Por este arreglo desordenado de los CS
y la baja resolucin de las tcnicas, no se pudieron observar otras estructuras de

los bivalentes, como cinetocoros y placas de anclaje. En ambos sexos, la mayora de
las clulas meiticas se observaron en paquiteno, reconocida por la completa

sinapsis de los bivalentes, lo cual soporta las observaciones histolgicas de
Heitzmann et al. (1993) en machos de L. vannamei. Xie et al. (2008), al analizar
mediante microscopia electrnica de barrido los CS de F. chinensis diploides y
triploides, observaron el mismo arreglo enredado de bivalentes sin revelar ms
caractersticas. Los autores acentuaron lo extremadamente difcil que es localizar

un ncleo bien disperso para analizar. Dado lo anterior, se requiere de una mejora
a la tcnica en gnada de camarones, especficamente, un mtodo para dispersar

los bivalentes.
En este estudio se encontr que en hembras de L. vannamei el comienzo de
la meiosis I es continuo, por lo tanto, ocurre de manera independiente de la
vitelognesis, la maduracin final y el desove, y por consiguiente del ciclo de muda.
Hertzler (2005) ha documentado hembras en desove la fase de arresto de los

ovocitos en metafase I. De acuerdo con los resultados obtenidos en los estudios de
organognesis, el crecimiento primario previtelognicos en la hembra del camarn

blanco ocurre alrededor de PL70, lo cual distingue la diferenciacin gondica de la
hembra. Es por eso que se sugiere que la meiosis I ocurre despus de la
65
diferenciacin ovrica en juveniles y que el ovario contina almacenando ovocitos

arrestados en el crecimiento previtelognico. En edad adulta, y bajo condiciones
reproductivas, ocurre la maduracin del ovocito secundario (vitelogenina) y en el

momento del desove, el ovocito continua con la meiosis. La separacin del primer
cuerpo polar meitico es evidente alrededor de los siete minutos despus de la

ovulacin en el camarn blanco (Dumas y Campos-Ramos, 1999). De acuerdo con
Bernhard (1990), en la mayora de los invertebrados existe un arresto de ovocitos
en metafase I, incluyendo artrpodos, anlidos y algunos moluscos y tunicados.

Algunos reportes indican que en decpodos hembras, la meiosis I en los ovocitos
comienza en el momento del desove (Qiu, 1986; Yano, 1988); esto todava se
encuentra en controversia y requiere de confirmacin.
El presente estudio, tambin confirma que en machos la meiosis
(espermatognesis) de L. vannamei es continua, y no se relaciona con las etapas de
muda, lo cual concuerda con las observaciones de Heitzmann et al. (1993). Por lo
tanto, la produccin de gametos por la meiosis (no relacionado con la muda) y la

liberacin del esperma caduco (relacionado con la muda) son dos procesos
fisiolgicos diferentes (Heitzmann et al., 1993; Parnes et al., 2006). En otros
decpodos, como en el langostino M. rosenbergii de morfotipo tenaza roja, la
sntesis de ADN en testculo en la etapa de pre-muda es al menos tres veces mayor
cuando se compara con la etapa de inter-muda del morfotipo tenaza azul (Sagi et
al., 1988, 1991). Tambin en esta especie, las etapas de la profase I coinciden con
los estadios de la muda (Poljaroen et al., en prensa). Por lo tanto, no existe ninguna
regla general que indique que la espermatognesis es continua en todas las
especies de decpodos.
El genoma diploide en el camarn blanco est compuesto por 88
cromosomas (Campos-Ramos, 1997), y su nmero haploide consta de 44

bivalentes (Chow et al., 1990; Campos-Ramos, 1997; Alcivar-Warren et al., 2006).
De acuerdo a Campos-Ramos (1997), el cariotipo tentativo es 4m + 10sm + 56st +
18t. La mayora de estos cromosomas son subtelocntricos y telocntricos (37

pares), los cuales aparentemente tienen una configuracin de anillo durante la fase
temprana de diploteno lo que representa dos intercambios o crossovers por
66
bivalente por meiosis. Los otros siete pares de cromosomas que presentan una
configuracin tipo v y donde ocurre un solo intercambio, pudieran ser
metacntricos o submetacntricos. Estas observaciones sugieren que en ambos
sexos existe recombinacin en la mayora de los bivalentes, lo que es un escenario

comn en animales gonocricos, ya que la meiosis aquiasmatica raramente se
presenta. Marcadores ligados al sexo mapeados en el genoma materno de M.
japonicus (Li et al., 2003b) y de L. vannamei (Zhang et al., 2007) sugieren que existe
un bivalente involucrado a la determinacin sexual, lo que implica que la hembra
es el sexo heterogamtico en estas especies.
La determinacin sexual en crustceos gonocricos es principalmente a
travs de cromosomas sexuales (Charniaux-Cotton, 1960; Ginsburger-Vogel y
Charniaux-Cotton, 1982). Se ha encontrado evidencia de genes ligados al sexo

mediante el fenotipo ojo-blanco de la Artemia franciscana (Kellogg) bisexual, el
cual est ligado al sexo de la hembra en el cromosoma W (Bowen, 1963; 1965;

Bowen et al., 1966). Entre los cromosomas, la recombinacin obligada es durante
la profase I (paquiteno), mientras que la restauracin del cigoto diploide WZ toma
lugar durante la segunda divisin meitica en Artemia parthenogenetica (Bowen y

Sterling, 1978; Campos-Ramos et al., 2006b). Al parecer, en langostinos y
camarones peneidos, tambin es comn la determinacin sexual de tipo WZ.
En camarones marinos, como F. chinensis (Li et al., 2003a) y M. japonicus
(Coman et al., 2008) se ha logrado exitosamente la induccin a la triploida. Li et
al. (2003a) observaron un sesgo hacia hembras en proporcin 4:1 en camarones
triploides. Coman et al. (2008) observaron una poblacin triploide de puras
hembras y plantearon que no era posible explicar el mecanismo de determinacin

sexual, como se describe en peces. Ellos propusieron un cromosoma W
sobredominate y un genotipo letal ZZZ. Esta explicacin pareciera controversial ya
que el camarn macho triploide si existe, como se encontr en F. chinensis con
citometra de flujo (Li et al., 2003a) y con el anlisis de CS (Xie et al., 2008). Una
alternativa a la hiptesis de los genotipos dominantes y letales, es la
recombinacin entre cromosomas sexuales, ya que explica mejor el sesgo en la
proporcin hacia hembras, como se muestra en especies de peces que tiene un
67
sistema WZ/ZZ, e. g., la tilapia azul Oreochromis aureus (Steindachner) (Penman et
al., 1987; Mair et al., 1991). En cualquier caso, la proporcin de sexos en triploides
sugiere la existencia de un cromosoma sexual en peneidos, requiriendo futuras
investigaciones de determinacin sexual.
ABLACION DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLNDULA ANDROGNICA

Derivados de los experimentos de ablacin, los resultados mostraron un
incremento del peso del rgano genital muy acentuado, en donde el peso del
testculo se increment significativamente en los grupos unilateral y bilateral,
principalmente durante las dos primeras semanas de cultivo. Este resultado,
conjuntamente con la hipertrofia de la GA, conlleva a sugerir que las
espermatogonias fueron estimuladas por una hiperactividad de la GA, que fue
desinhibida de la accin regulatoria de la glndula sinusal. Entonces, en este

proceso, las espermatogonias entran en actividad mittica para la produccin de
ms espermatogonias y espermatocitos primarios, los que continuaron con la
espermatognesis. De esta manera, el incremento en peso del testculo se debi a

un incremento en clulas germinales y meiticas, lo que demuestra un eje
endocrino glndula sinusal-GA-testculo. Sin embargo, para la cuarta semana de

cultivo, los camarones bilaterales ya haban muerto por lo que no fue posible
continuar con el seguimiento experimental. El grupo unilateral tuvo una mejor
supervivencia y mostr que para la quinta y sexta semanas, el peso del testculo
fue similar al de los controles, lo que sugiere que la estimulacin temprana de la
GA es temporal y, subsecuentemente, la espermatognesis disminuye o bien se
deteriora. Estas observaciones estn de acuerdo con Khalaila et al. (2002) quienes
documentaron un incremento en el tamao de la GA de C. quadricarinatus despus
de la primera semana de ablacin bilateral. Posteriormente, el peso de la GA
disminuyo sustantivamente al trmino de la tercera semana, en comparacin con
langostinos controles. El incremento en el peso de los vasos deferentes se atribuy
a que las espermtidas producidas en los lbulos testiculares, por la estimulacin
de espermatogonias, continuaron su desarrollo en los vasos deferentes. Cabe
68
resaltar que no fue hasta la cuarta semana que se observ un incremento similar
en los grupos ablacionados, que fue significativamente ms alto que el del control.
El incremento del peso de los vasos deferentes coincidi con el incremento de
esperma en el espermatforo del grupo bilateral, lo que significa que la masa

espermtica se desarroll desde los vasos deferentes y termin como
espermatforo. Sin embargo, esto no ocurri con el grupo unilateral; se sugiere
que la masa espermtica permanece en los vasos deferentes durante la quinta y

sexta semanas, y que la formacin del espermatforo ocurriere quizs a partir de
la sptima semana. En este sentido, el grupo unilateral tendera a un mayor tiempo

de respuesta en la produccin de esperma con respecto al grupo bilateral.
Los resultados del grupo control mostraron una oscilacin en la
espermatognesis en el contexto de que la produccin de gametos disminuy en la

primera y segunda semanas en los lbulos testiculares, lo cual corresponde a la
transferencia de espermtidas a los vasos deferentes durante la segunda semana,

volviendo a incrementarse hacia la cuarta semana para volver a disminuir hacia la
sexta semana, posiblemente con el proceso de renovacin de espermatforo a
travs de la muda. Esta oscilacin se observ invertida en el grupo bilateral a

durante las cuatro semanas, mientras que no fue del todo oscilante en el grupo
unilateral. Se observa que el peso del espermatforo no es un indicador de cambio.
Sin embargo, esto se pudo deber a que la concentracin de esperma no fue mayor a
los 5 o 6 millones en el grupo bilateral, con respecto a los grupos unilateral y

control. Cabe mencionar que la concentracin de esperma de un reproductor
macho de 35 g en condiciones reproductivas, flucta alrededor de los 20 millones

de esperma por espermatforo (Leung-Trujilllo y Lawrence, 1985). Los pesos y
conteos que reporta Ceballos-Vsquez et al. (2003), con camarones de 12 meses de
edad (38 g) coinciden con los datos obtenidos en los controles de este estudio. Sin
embargo, Ceballos-Vsquez et al. (2004), observaron una concentracin de
esperma de entre 25 y 30 millones por espermatforo en camarones
reproductores, lo cual es mucho mayor en comparacin con nuestras muestras.
Los autores discuten que el conteo espermtico pudiera estar relacionado con el
peso y no con la edad, por consiguiente la calidad espermtica depende de las
69
condiciones de los cultivos (alimentacin, temperatura y densidad). Alfaro y
Lozano (1993), encontraron en camarones ablacionados unilateralmente un
incremento significativo en el conteo espermtico en espermatforo con respecto a

controles, lo cual no coincide con nuestros resultados; sin embargo, en este estudio
se observ una tendencia al incremento en el conteo de esperma hacia la sptima
semana.
ANLISIS MOLECULAR
El xito en la obtencin de amplicones (por RT-PCR) a partir de ARN total de la
mpula terminal de L. vannamei concuerda con los resultados obtenidos con
planteamientos metodolgicos similares en C. quadricarinatus (Manor et al., 2007)
y P. monodon (Mareddy et al., 2011). Sin embargo, en M. japonicus (Banzai et al.,
2011), el amplicn que corresponde al precursor de la GA se obtuvo a partir de

ARN total de la mpula terminal distal, el mpula terminal proximal, del vaso
deferente distal y de la parte distal del vaso medio. En L. vannamei se us ARN total
de ATD y dVDM, pero no se obtuvieron productos usando tejidos de ATP y VVD. De

acuerdo a las observaciones histolgicas reportadas en este trabajo, la GA se
observa con un mayor tamao en la parte distal del mpula terminal en

comparacin con el vaso deferente distal y medio, por lo que es posible que la
obtencin de amplicones sea ms factible al usar este tejido o este influenciada por
el estado reproductivo del camarn disectado.
Dado que el vaso deferente distal es un tubo delgado y atraviesa el msculo
torcico-abdominal, la GA se presenta como una cuerda muy delgada, que conecta

y comunica la parte mayor y ms ancha (que se encuentra en el mpula terminal)
con la parte ubicada en la parte distal del vaso deferente medio, dndole una forma
de auriculares. En la secuencia de aminocidos traducida de camarn blanco que
se muestra alineada con nueve secuencias de precursores de la hormona de la GA
en decpodos en la Figura 26), se puede observar la estructura tpica de los
miembros de la familia de las tipo-insulinas, conformadas por una cadena A, los
70
residuos de cistena (C) en posicin, uno doble y dos sencillos; una cadena B y ente
ellas un pptido C.
La secuencias de nucletidos y de aminocidos (obtenida y deducida,
respectivamente) mostraron mayor identidad con aquellas de P. monodon y M.

japonicus que con las de los dems decpodos reportados, y las relaciones que se
muestran en el dendrograma (Figura 37), concuerdan desde el punto de vista
filogentico, ya que L. vannamei, P. monodon y M. japonicus son de la familia
Penaeidae, C. quadricarinatus y C. destructor de la familia Parastacidae, P. pacificus

de la familia Palaemonidae y P. pelagicus de la Portunidae.
Con los genes de la familia Pro-insulina reportados, que aparentemente solo
se expresan en la GA de machos decpodos, se podr demostrar el proceso

molecular de la diferenciacin sexual, con la finalidad de generar de nuevas
estrategias tcnicas para la reversin sexual en camarones comerciales. Desde una
perspectiva de regulacin gentica, este estudio pudiera tener implicaciones

importantes, ya que permitira establecer con detalle el desarrollo, diferenciacin y
cambios estructurales del rgano genital en futuras investigaciones moleculares

aplicados a la acuacultura.
71
CONCLUSIONES
En L. vannamei el periodo de indiferenciacin sexual comprende las

primeras dos semanas como postlarva (PL12-PL16).
El rgano genital de la hembra del camarn blanco comprende

bilateralmente 1 lbulo anterior, 8 laterales, 1 oviducto y 1 lbulo
posterior.
1 lbulo anterior, 7 laterales y 1 conducto deferente.
El rgano genital del camarn blanco macho comprende bilateralmente

La GA comienza a formarse a partir PL48 y se encuentra interconectada
en un tejido conectivo entre la base del bulbo eyaculador (CDM) y el 8
lbulo testicular.
En camarn blanco, la gnada se diferencia, ya sea en ovario o testculo,
a partir de PL72.
sexos.
provoca la hiperplasia de la GA.
glndula sinusal)- GA-Testculo en camarn blanco.
camarn blanco es similar a la de los peneidos.
En L. vannamei la meiosis no es regulada por el ciclo de muda en ambos

La ablacin unilateral y bilateral del tallo ocular en camarn blanco
Se sugiere la existencia de un eje endcrino Tallo ocular (Eje rgano x/
La secuencia nucleotdica del precursor de la hormona de la GA del
La secuencia de aminocidos del precursor de la hormona producida
por la GA del camarn blanco es similar en estructura a la de los dems
decpodos y corresponde al grupo de las tipo-insulina (insulin-like).
72
RECOMENDACIONES
La continuacin lgica de estos estudios deber ser la caracterizacin del gen que
codifica la hormona de la GA en L. vannamei, como punto de partida para futuros

trabajos que involucren la dinmica de expresin del gen durante la diferenciacin
sexual as como su efecto con la ablacin del pednculo ocular.
Se recomienda la elaboracin de sondas moleculares para su uso en
trabajos encaminados a la localizacin de los sitios de sntesis de la GA en tejidos,

as como para intentar la localizacin del gen en cromosomas meiticos, que
ayuden a determinar la existencia de posibles cromosomas sexuales.
Mediante el conocimiento de la secuencia de este gen es posible la
generacin de ARN de interferencia (ARNi) con el que se pudiera bloquear la
expresin del gen que codifica la hormona de la GA, teniendo como objetivo la
reversin sexual del camarn blanco.
73
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86
ANEXO
Aquaculture 296 (2009) 136142
Contents lists available at ScienceDirect
Aquaculture
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s ev i e r. c o m / l o c a t e / a q u a - o n l i n e
Organogenesis and subsequent development of the genital organs in female and

male Pacic white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei
Rodolfo Garza-Torres, Rafael Campos-Ramos , Alejandro M. Maeda-Martnez
Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste (CIBNOR), Mar Bermejo 195, Col. Playa Palo de Santa Rita, La Paz, B.C.S. 23096, Mxico
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 19 February 2009
Received in revised form 5 August 2009
Accepted 5 August 2009
Keywords:
Androgenic gland
Genital organ
Penaeus (Litopenaeus) vannamei
Organogenesis
Sexual differentiation
a b s t r a c t
Timing of organogenesis and subsequent development of genital organs were studied in female and
male Pacic white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei postlarvae. This was linked to the timing of
differentiation of external structures that differentiate the genders. Anatomy of the gonad appears to be
unique for penaeid species. The genital organ was fully recognized from postlarve day-16 (PL16) as a
bilateral lobe located in the anterior region of the midgut gland (rst anterior lobes) that connects to an
anterior perpendicular collector tube that extends dorsally towards the posterior region of the midgut gland
and forms an inverted U-shape collector. Eight bilateral lobes in females (second to ninth) and the bilateral
oviduct between the seventh and eighth lateral lobes and seven bilateral lobes in the male (second to eighth)
are connected along the inverted U-shape collector tube. These lobes extend over the surface of the midgut
gland beneath the pericardium. Shortly after organogenesis of the female gonad, the tenth bilateral lobe
emerges from the distal region of the collector tube and continues dorsally along the intestine, and the fourth
bilateral lobe did not develop and regressed until apparently absorbed. In males, the posterior bilateral vas
deferens emerges from the same region. Around PL50 (0.50.6 g; 4550 mm), external gender
differentiation was recognized in the form of the thelycum in females and the gonopores in males.
Additionally, the male androgenic gland appears at the posterior-external wall of each anterior vas deferens,
surrounded by connective tissue that attaches to the anterior vas deferens and the eighth testicular lobe.
Gonad differentiation occurred from PL68 (1.82.2 g; 7074 mm), where it was possible to differentiate the
female ovary from the male testes. Timing of sex reversal studies in penaeids is discussed.
2009 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
Information concerning development of internal and external sexual
characteristics in commercially reared decapods is useful because there
is gender dimorphism, whereby one sex grows larger than the other
does. In freshwater prawns, males grow larger than females, as in the
Malaysian prawn Macrobrachium rosenbergii (De Mann) (Sagi and
Aalo, 2005; Aalo et al., 2006). In penaeid shrimp, females grow larger
than males, as in the Pacic white shrimp Penaeus (Litopenaeus)
vannamei (Boone) (Chow and Sandifer, 1991), and other American,
Asian, and Indian species reviewed by Campos-Ramos et al. (2006). The
relevance of sexual dimorphism in P. vannamei is that it involves a
signicant differential growth at harvest size (Prez-Rostro et al., 1999),
and therefore, an all-female culture would increase protability for
farmers based on size and market weight (Zhang et al., 2007). Sex
determination and differentiation is particularly interesting in crustacean malacostracans like isopods, amphipods, and decapods because
the organ responsible for maleness is the androgenic gland (AG). This
gland was discovered in the amphipod Orchestia gammarellus (Pallas)
Corresponding author. Tel.: +52 612 123 8451; fax: +52 612 125 3625.
E-mail address: rcampos@cibnor.mx (R. Campos-Ramos).
0044-8486/$ see front matter 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.aquaculture.2009.08.012
(Charniaux-Cotton, 1953, 1954, 1960). In freshwater prawns, such as M.

rosenbergii (Nagamine et al., 1980a,b; Sagi and Cohen, 1990; Sagi et al.,
1990; Malecha et al., 1992), Cherax destructor (Clark) (Fowler and
Leonard, 1999), C. quadricarinatus (von Martens) (Khalaila et al., 2001;
Barki et al., 2003; Manor et al., 2004), and Procambarus clarkii (Girard)
(Taketomi and Nishikawa, 1996), andrectomy and implantation of the
AG leads to partial or total gonad sex reversal. However, the AG function
in commercial penaeid species requires further investigation to
understand its role in sex differentiation; the regulation of spermatogenesis during reproduction; sex reversal techniques; and in the
production and secretion of hormones. Alfaro (1994) and CamposRamos et al. (2006) documented the structure of the AG in P. vannamei,
which resembles those described in the literature for other malacostracans. The organogenesis of the genital organ, including the AG and
the time of gender differentiation, has been studied in male Penaeus
japonicus (Bate) by Chim (1983), Laubier et al. (1983), CharniauxCotton and Payen (1985), and Nakamura et al. (1992). These studies
agree that organogenesis of the AG occurs before or at the onset of
spermatogenesis by the end of the second month of the postlarval stage,
long after gender differentiation takes place by the formation of the
male vas deferens within the rst two weeks of the postlarval stage. No
other penaeid species male has been examined for this detail. Females
R. Garza-Torres et al. / Aquaculture 296 (2009) 136142
have been excluded from these analyses, having no record of the

organogenesis of the oviduct and gonad differentiation into an ovary
that would identify a female. The basic anatomy of the adult female
genital apparatus in the literature is the original description by King
(1948) for P. setiferus (L.), which describes the ovary as a partly fused,
bilaterally paired structure with projecting lobes. The review of Dall
et al. (1990) of female penaeids describes the ovary as two independent
bilateral structures with projecting lobes, i.e., the anterior lobe, six to
eight short lateral lobes, and the long posterior lobe, plus the oviduct at
the sixth lateral lobe. In the case of males, the original description by
King (1948) was complemented by Chim (1983) in P. japonicus and
corroborated by Chow et al. (1991) in two species of shrimp (P. setiferus
and P. vannamei) regarding the individuality of the testicular lobes
connected to a horseshoe-shaped proximal vas deferens. Additionally,
Chow et al. (1991) observed that it was a single, non-multiple,
seminiferous tubule along each independent testicular lobe.
This study focused on the timing of organogenesis and subsequent
development of the genital organs in female and male P. vannamei in
concordance with the timing of the development of external
structures that differentiate genders. We present a timeline of events
of internal and external gender differentiation that is critical for
developing techniques for sex reversal, with the objective of future
production of female monosex populations for shrimp farming. We
also provide new evidence on the morphology of the female genital
organs that is different from descriptions in previous reports on
related species. Further, we emphasized organogenesis and development of the AG, and how they interconnect the vas deferens and testis,
apparently participating in spermatogenesis and testis maturation.
2. Materials and methods
Shrimp postlarvae were obtained from a shrimp laboratory in La
Paz City, Mexico. The postlarvae, juvenile, preadult, and adult
specimens were cultivated at the CIBNOR facilities. Shrimp were
reared from postlarvae day-4 (PL4) in six 1000-L outdoor oval tanks
maintained with ltered and aerated seawater (3638 ppt salinity) at
27 1 C by submersible 300-W heaters at a density of 200 shrimp/
tank. Exchange of seawater was ~ 50% three times weekly and
temperature of the seawater was adjusted to that of tank water
before the exchange. Shrimp up to PL20 were fed three times daily to
apparent satiation with brine shrimp nauplii and commercial microparticulates (250500 m); older shrimp (NPL20) were fed three
times daily with live and frozen adult brine, brine shrimp akes, and
137
crumbled, commercial pellets. Every four days (from PL4 to PL80), ten
shrimp from the six tanks were randomly chosen and their weight
(mg and g) and length (mm, rostrum tip to the end of the telson) were
recorded. External sex structures were analyzed, as described by
Prez-Farfante (1988) and Campos-Ramos et al. (2006), and their
internal organs, as described by King (1948), Kong and William
(1988), and Dall et al. (1990). Shrimp were xed in Davidson's
solution (Howard and Smith, 1983; Bell and Lightner, 1988) for 24 h
and then in 70% ethanol until processed with the hematoxylin and
eosin histological technique (Bell and Lightner, 1988). External and
internal examination was performed under a dissecting stereoscopic
microscope (Olympus, Tokyo, Japan). Internal genital organs were
stained with commercial aquarium methylene blue in 0.9% NaCl saline
solution. Prepared slides of the tissues were examined with a
compound light microscope (Olympus, Tokyo, Japan). Images were
recorded with an attached digital camera and stored in the software
Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics).
3. Results
3.1. Timeline of events of internal and external differentiation of gender
A timeline of events of internal and external differentiation in
females and males is shown in Fig. 1, which links each sex-development
to a specic gure.
3.2. Organogenesis of the gonad (PL12 to PL16)
After histological preparations, no sign of gonad tissue was
observed in PL4 and in PL8. The gonad was recognized in PL12 as a
bilateral structure located dorsally at the anterior region of the midgut
gland. The genital organ of each gender was fully recognized through
dissection in PL16. During this time, the body weight of shrimp ranged
from 80130 mg and body length from 1518 mm.
3.2.1. Morphology of the genital organ
The rst bilateral anterior lobe is connected to a main anterior
collector tube that is perpendicular to the body axes, extends dorsally
towards the posterior region of the midgut gland, and forms an
inverted U-shaped collector. Along and perpendicularly connected to
the inverted U-shaped collector, eight bilateral lobes in the female,
numbered from second to ninth lobe plus the bilateral oviduct
(Fig. 2A), seven bilateral lobes in the male, numbered from second to
Fig. 1. Timeline of events of internal and external differentiation of female and male Pacic white shrimp Penaeus vannamei.
138
Fig. 2. Penaeus vannamei, PL24. Ventral view of genital organ in female (A) and male (B)
located in the cephalothoracic region. Exo-skeleton and midgut gland were removed.
Horseshoe-shape main collector tube (hmc), gonadic lobes (Roman numbers), female
oviduct (ov), and male vas deferens (vd).
Fig. 3. Penaeus vannamei. Ventral view of genital organ in juvenile female PL80 (3 g)
showing a bilateral physical space (arrows) that corresponded to the fourth lobe (A).
Ventral view of genital organ in adult female (28 g) showing one anterior and seven
lateral lobes plus the oviduct. Exo-skeleton and midgut gland were removed.
Horseshoe-shape main collector tube (hmc), gonadic lobes (Roman numbers), and
oviduct (ov).
eighth lobe (Fig. 2B), extend over the surface of the midgut gland
beneath the pericardium. They represent the basic anatomy of the
gonad. In the female, the tenth bilateral lobe emerges from the distal
region of the collector tube and develops dorsally along the intestine
through the ve abdominal segments during the following eight days.
In addition, from PL28, the fourth lobe did not develop and regressed
until apparently absorbed, leaving no rudimentary lobe-tissue and an
evident space between the third and the fth lobes (Fig. 3A).
Therefore, the nal morphology of the female gonad was composed
of the rst bilateral anterior lobe, seven bilateral lateral lobes,
numbered from second to eight, plus the bilateral oviduct (Fig. 3B),
and the ninth distal abdominal bilateral lobe.
abdominal muscles, descending laterally and straightforward as a distal

vas deferens that reaches ventrally to the internal region of the base of
the fth pereiopod as a primordial terminal ampoule. The vas deferens
are liform, with no distinguishable ejaculator medium bulb and
composed of columnar epithelium cells with a lumen that forms a
tubular structure and a longitudinal septum that divides the tube into a
large chamber lined with epithelium and a smaller, incomplete cavity
(Fig. 5). Earlier development of the male vas deferens was clear after
PL36, when the anterior region became wider and differentiated into a
middle vas deferens that will function as ejaculatory bulbs.
3.2.2. Early development of the gonad (PL12 to PL28)

The initial morphology of the sex-undifferentiated bilateral
anterior lobe was composed of unarranged cells of irregular shape
(Fig. 4A), which by PL28 developed clusters of cells in all gonadic lobes
(Fig. 4B).
Early external sex differentiation began around PL32; body weight

ranged from 180280 mg and body length from 2535 mm. Two
external characteristics were evident: First, the endopodite emerged
as a tiny protuberance with one or two apical setae. Over the following
days, the endopodite of females became wider at the external proximal
and middle regions and started developing three or four proximal
setae along its ridge and maintaining the apical setae. The endopodite
of males had one or two proximal and apical setae, which are lost in the
following molts and remained as a tubular appendage forming the
petasma. Second, the protopodite of the rst pair of pleopods had a
rectangular articulation in females and the same articulation was
notched in the distal region in males. Detailed morphology of these
external structures is provided in Campos-Ramos et al. (2006).
3.2.3. Histology of female oviduct, and male vas deferens

The bilateral oviduct is a single, collapsed tube, with a half-moonshaped cross-section that distinguishes it from the gonadic lobes
(Fig. 4C). It is located between the sixth and seventh gonadic lobes,
continuing laterally to the midgut gland, and then extends ventrally to
the thoracic-abdominal muscle at the level of the third pereiopod. In the
male, the proximal bilateral vas deferens continues from the distal end
of the U-inverted collecting tube behind the midgut gland. It extends
upward and laterally, and then descends parallel to the aorta that runs
down the left side of the body between the thoracicabdominal muscle
and the intestine, surrounded by a wide space of undifferentiated loose
connective tissue (Fig. 4D). Each vas deferens extends towards the
lateral junction of the thoracicabdominal and the oblique exor
3.3. Early external sex differentiation (PL32 to PL44)
3.4. Further external sex differentiation (PL44 to PL48)

Further external sex differentiation began from PL44; body weight
ranged from 0.50.6 g and body length from 4550 mm. Females started
developing a pair of oblique, sharp ridges in the thelycum that is
139
Fig. 4. Penaeus vannamei. Longitudinal sections of the gonadic anterior lobe in PL18 (A) and PL28 (B). Cross section of the oviduct located in the postero-lateral side of the midgut
gland of a female in PL40 (C). Longitudinal internal section of the posterior cephalothoracic region and the anterior abdominal region of a male in PL32 (D). Aorta (a), semi-arranged
gonadic cells (sgc), clustered gonadic cells (cgc), intestine (i), midgut gland (mg), oblique exor abdominis muscle (ofam), oviduct (ov), thoracicoabdominis muscle (tam), and vas
deferens (vd).
characteristic of this species and males started developing gonopores at

the coxa of the fth pereiopods and the male appendage at the second
pair of pleiopods. The morphological detail of these structures is
provided in Campos-Ramos et al. (2006).
3.5. Organogenesis of the AG and white adipose tissue (PL48 to PL52)
In males, primordial AG cells appeared by PL48, gathering in line,
and apparently held and orientated by a thin brous connective tissue
at the posterior-external wall of each vas deferens, the side of the vas
deferens that faces the oblique exor abdominal muscle (Fig. 5A).
Shortly afterward, by PL52, oval cells accumulated in the area forming
the AG tissue (Fig. 5B).
During this time, females and males differentiated loose connective tissue into white adipose tissue lling the cavity in the posterior
region of the midgut gland, the thoracicabdominal muscle, the
intestine, and the area around the descending aorta on the left side of
the body. The nuclei of these cells are pushed to the periphery because
of the fat content in the cytoplasm (Fig. 5).
3.6. Development of germinal epithelium and gonad sex differentiation
(PL52 to PL72)
By PL52, the clusters of cells in the gonad differentiated into germinal
epithelium. The germinal cells were larger than the original clustered
cells and were rounded, forming an oval tubular structure where gonia
cells were at the periphery, surrounding the lumen. However, the gonad
was still undifferentiated. Secondary gonia cells transformed into
primary oocytes that began previttelogenic primary growth by PL68PL72, which distinguished the female gonad (Fig. 6A) from the male
gonad (Fig. 6B). The differentiation of the gonad occurred when both
genders reached a body weight of 1.82.2 g and a body length of 70
74 mm. Female oocytes grew larger and formed a pear-like or triangular
shape and began lling and expanding the lobes that characterize the
ovary. Primary male spermatocytes, which were rounded and tightened,
produced spermatids that were transferred into the lumen of the
testicular lobe. By this time, the dissection of any independent testicular
lobe showed a long and single seminiferous tubule.
3.7. Subsequent development of the vas deferens and the AG
The external appearance of the AG in juvenile shrimp was difcult
to observe because it is small and transparent. However, development
of an external connective tissue is evident at the wider middle region
of the vas deferens, which indicates the location of the putative AG.
The connective tissue of the vas deferens also attached along the
eighth testicular lobe so that the vas deferens and testis are held to
each other in parallel (Fig. 7A). As the male grows, the bilateral
anterior vas deferens continues to develop and turns into a huge
median and folded vas deferens that takes the form of an inverted U
(named double xture by Treece and Yates, 1988). Each of the
median vas deferens includes the anterior and posterior ejaculator
bulbs (Fig. 7B and C). In preadult and adult shrimp, the AG appears as
cords immersed in the connective tissue, connecting the internal
distal region of the posterior ejaculator bulb with the eighth testicular
lobe (Fig. 8A and B). After dissecting the vas deferens, the AG appears
as a slender and compact mass of oval cells with prominent nuclei
under histological examination. Detailed morphology of the AG in
preadult and adult penaeid shrimp is provided in Charniaux-Cotton
and Payen (1985), Alfaro (1994), and Campos-Ramos et al. (2006).
140
Fig. 5. Penaeus vannamei. Cross section of the vas deferens of male in PL44 (A) and in
PL52 (B). Primordial androgenic cells (pagc), androgenic gland cells (agc), white
adipose tissue (wat), posterior-external wall (pew), and vas deferens (vd).
4. Discussion
The anatomy of the genital organ in male P. vannamei matches the
description of P. japonicus by Chim (1983) and in P. vannamei and P.
setiferus by Chow et al. (1991). However, the female genital organ in P.
vannamei and, in general, of penaeids described by King (1948) and
Dall et al. (1990) does not match what we found. Both genders have a
basic anatomy of a bilateral anterior lobe and independent lateral lobes
arranged symmetrically on each side of a single collecting tube with an
inverted U or horseshoe shape. This structure appears to be unique for
penaeid species (Laubier et al., 1983; Chow et al., 1991; this study).
However, many other species have not been studied with this detail.
Our description of genital organogenesis concurs, in general, with
the few previous investigations of penaeids regarding internal and
external morphology and sexual differentiation (Chim, 1983; Laubier
et al., 1983; Charniaux-Cotton and Payen, 1985; Chow et al., 1991;
Nakamura et al., 1992; Campos-Ramos et al., 2006). The evident
separation between the third and fourth lobes in both genders (see
Fig. 3A in female and Fig. 2B in male) may suggest that the fourth
bilateral lobe forms during the early network of mesodermic cells that
give structure of each gonadic lobe. The regression of this lobe is not
clear, and the entire genital organ is difcult to analyze during these
early stages. Once the gonad of each gender was developed, there was
not a difference in gonad development among the ten shrimp
sampled, at each PL-stage. From an anatomical point of view, the
physical position of the fourth lobe would coincide with the wider and
higher transversal axes of the anterior midgut gland. Therefore, if the
fourth lobe would develop, it would be higher, and more external than
the other lobes. Instead, this lobe regresses, possibly because of the
morphology and development of the midgut gland.
It appears that in both P. japonicus and P. vannamei, the duration that
postlarvae remain gender-undifferentiated is remarkably short after
Fig. 6. Penaeus vannamei. Cross section of gonad in female (A) and male (B) in PL72. Arrow
in (A) shows pear-like or triangular shape oocytes (ooc), and in (B) spermatogonia (sper),
around a lumen (lu).
larval metamorphosis. According to Laubier et al. (1983), the gonad rst

appears as two masses of germ cells associated with somatic cells by PL8.
In P. vannamei, the bilateral anterior lobe was observed by histological
examination in PL12 as the rst recognizable gonadal structure. These
authors recognized the entire male genital organ by PL11. In contrast,
our earliest identication of the female oviduct and lliform male vas
deferens was in PL16. Nevertheless, external gender differentiation was
delayed until shrimp reached 0.5 g and 45 mm, which is about PL50,
which agrees with the development of P. japonicus (Nakamura et al.,
1992). This stage is represented by and, to some extent, synchronized by
the external development of the female thelycum and male gonopores
and internally by the appearance of the male AG. The organogenesis of
the AG in P. vannamei begins at the posteriorlateral region of each vas
deferens, as observed in P. japonicus (Nakamura et al., 1992). It appears
that primordial AG cells differentiated independently from the loose
connective tissue, which in turn, differentiated into white adipose tissue
around the intestine and midgut gland in both genders. The AG cells may
originate from mesoderm cells that formed the connective tissue that
holds testicular lobes beneath the pericardium. The AG is immersed
within a connective tissue that interconnects the vas deferens and the
eighth testicular lobe, which was not previously observed in P. japonicus
(Charniaux-Cotton and Payen, 1985) or P. vannamei (Alfaro, 1994;
Campos-Ramos et al., 2006).
According to Charniaux-Cotton and Payen (1985), the clusters of
cells gathering at the gonadal lobes are mesoderm cells, whereas
oviducts and vas deferens grow from tissue from the genital organ that
differentiates into columnar epithelium. By PL52 (0.5 g and 45 mm),
these clusters of cells form oval tubular structures where gonia cells
gather around a lumen, which indicate a germinal zone. From PL68 to
PL72, (around 2 g and 72 mm) shrimp showed early developing oocytes,
indicating the time of gonadal differentiation, which is eight days later
than the time reported by Nakamura et al. (1992) in P. japonicus.
141
Fig. 7. Penaeus vannamei. Ventral view of male genital organ in PL48, 0.5 g (A), and adult (26 g) (B). Detail of vas deferens from B (C). Horseshoe-shape main collector tube (hmc),
testicular lobes (tl), anterior ejaculatory bulb (aeb), posterior ejaculatory bulb (peb), eighth testicular lobe (etl), proximal vas deferens (pvd), medium vas deferens (mvd), distal vas
deferens (dvd), and terminal ampoule (ta).
In males, spermatogonia gather at the periphery of the testicular lobe

and the lumen is lled with secondary spermatocytes and spermatids, as
described by King (1948). According to Chow et al. (1991), the gamete
production cycle, independent in each seminiferous tubule, includes two
distinguishable phases where sustentacular (supporting epithelial) cells
play a role in expanding and contracting the lumen to begin a new cycle
from primary spermatocytes produced by spermatogonia. Initially, the
cord phase, where spermatogenesis is supported by multi-functional
sustentacular cells, generates late spermatids; secondarily, the lumen
phase, where sustentacular cells retreat and align to form a cavity where
late spermatids are transferred to the posterior vas deferens, where
spermiogenesis continues. According to Parnes et al. (2006), males also
have reproductive molt cycles. The spermatidspermatozoa mass is
transported along the vas deferens, wrapped, and stored in the terminal
ampoule, forming the spermatophore that will be expelled through the
gonopores and renewed every molting cycle, if no reproductive behavior
occurs.
According to Campos-Ramos et al. (2006), P. vannamei possesses a
stable genetic sex determination system that is not inuenced by
environmental conditions. The size of shrimp was a good guide of
gender development under the rearing conditions of this study.
However, Campos-Ramos et al. (2006) found that external gender
differentiation occurs during the same time of development under two
temperature conditions at 27 and 32 C, where shrimp size was variable,
and can be delayed under low temperature at 18 C and unfavorable
biological and environmental conditions. Therefore, size must not be a
factor to assume a gender development. It is necessary to identify
external and internal gender structures, which are resumed in Fig. 1.
Although the AG is unique among malacostracans, the evidence from
the two species of penaeids that have been studied indicates that this
gland is not involved in sex determination or sex differentiation because
the gender differentiates earlier, soon after transformation of larvae.
Most likely, the interconnection between the vas deferens and testis
seems to be related to spermatogenesis and testis maturation or some
regulatory process of ovary inhibition, since gametogenesis begins after
the AG is formed. In penaeids, it is still unknown if the AG is involved in
the eyestalk-AG-testis endocrine axis, as reported for C. quadricarinatus
(Khalaila et al., 2002).
In freshwater prawns, the AG induces masculinization and secondary
sexual male characteristics and inhibition of vitellogenesis in implanted
young females; andrectomy induces feminization (vitellogenesis) in
young male prawns. The strategy to induce sex reversal and produce
male monosex aquaculture in freshwater prawns, such as M. rossembergii, is well documented in the literature (Nagamine et al., 1980a,b;
Sagi et al., 1990; Aalo et al., 2006). In contrast, Li and Xiang (1997)
attempted reversing the gender of Fenneropenaeus chinensis (Kishinouye) without success. This unsuccessful experiment may be related to
the lack of adequate knowledge of the process of sex differentiation in
penaeid shrimp compared to freshwater prawns. It remains unknown
whether implantation of the AG and andrectomy in penaeid shrimp will
be successful in sex reversal. Certainly, previous studies and our study
should be taken into account. We conclude that in both genders of P.
vannamei, external gender differentiation develops around 1520 days
earlier than gonad differentiation. In theory, when external gender
differentiation is observed, any surgical procedure on the vas deferens or
an AG implantation in females would compromise the fate of gonad
differentiation in P. vannamei, which is the same biotechnological sex
reversal principle used in M. rossembergii. Pro-insulin-like genes
expressed exclusively in the AG of male C. quadricarinatus and male M.
rosenbergii have been recently reported (Manor et al., 2007; Ventura
et al., 2009). The discovery of these specic genes may show molecular
processes of sex differentiation and may provide clues to innovative
strategies for sex reversal techniques in commercially reared freshwater
prawns. From a gene regulation perspective, this study may have
142
Fig. 8. Penaeus vannamei. External anatomy of the medium vas deferens in an adult male is
showing the interconnection trough connective tissue (ct) among the distal region of the
posterior ejaculatory bulb (peb), the androgenic gland (ag), and the eighth testicular lobe
(etl). Lifted posterior ejaculatory bulb (A) dissected with the eighth testicular lobe (B).
implications in commercially reared penaeid shrimp, because it will

allow establishing with detail the development, differentiation, and
structural changes of the genital organs in further applied molecular
aquaculture research.
Acknowledgements
We thank three anonymous reviewers for their comments, suggestions, and corrections to the manuscript. We also thank the shrimp lab
Acuacultura Mahr for providing postlarvae for this study. Ira Fogel at
CIBNOR provided editorial support. This investigation was funded by
Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste. R.G.T. received a
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa doctoral fellowship.
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JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY, 31(1): 75-81, 2011
DESCRIPTION OF MEIOSIS IN FEMALE AND MALE PACIFIC WHITE SHRIMP LITOPENAEUS

VANNAMEI (DECAPODA: PENAEIDAE)
Rodolfo Garza-Torres, Alejandro M. Maeda-Martnez, Danitzia A. Guerrero-Tortolero,
Hortencia Obregon-Barboza, and Rafael Campos-Ramos
(RGT, rgarza@cibnor.mx; AMMM, almaeda04@cibnor.mx; DAGT, daguet04@cibnor.mx; HOB, hobregon04@cibnor.mx; RCR,
correspondence, rcampos@cibnor.mx) Centro de Investigaciones Biologicas del Noroeste (CIBNOR), Mar Bermejo 195, Col. Playa Palo
de Santa Rita, La Paz, Baja California Sur, 23096, Mexico
ABSTRACT
The first meiotic prophase was analyzed in both genders of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Progression through meiosis,
from the formation of the synaptonemal complex to diplotene is described during molting stages. Most of the meiotic cells in both
genders were observed at pachytene, recognized by complete synapsis of bivalents. In both genders, the zygotene, pachytene, and
diplotene stages occurred at inter-molt, pre-molt, and post-molt stages in all individuals, which suggests that there is no relationship
between molting and the first meiotic prophase. Sperm counts from the vas deferens and spermatophores support a continuous
production of male gametes. The nature of the synaptonemal complex in gonad cells shows that each pair of homologous chromosomes
synapses end to end, revealing a high chromatin density and a complex tangled arrangement in the nucleus. Both genders have 44
bivalents, of which around 40 have an o-ring configuration, and the rest have a v-shape, meaning that most bivalents present chiasmata at
both ends, each representing two crossing-over events per bivalent per meiosis.
KEY WORDS: chromosomes, Litopenaeus vannamei, meiotic prophase, synaptonemal complex

DOI: 10.1651/10-3316.1
In female decapods, neurosecretory and endocrine

organs control the ovarian development (vitellogenesis),
final maturation, and ovulation (spawning) according to the
molt cycle (Qiu, 1986; Yano, 1988, 1995; Dall et al., 1990;
Browdy, 1992). In penaeid species with a closed thelycum
such as Penaeus monodon Fabricius, 1798 and M.
japonicus, mature males insert their spermatophore into
the soft thelycum of newly molted immature females, and
oocyte maturation begins until reaches final maturation and
spawning. Therefore, in closed-thelycum species, mating
with spermatophore transfer takes place before vitellogenesis (Yano, 1988, 1995; Dall et al., 1990). In contrast, in
penaeid species with an open thelycum such as L. vannamei
and L. stylirostris (Stimpson, 1874), mature males attach
their glutinous spermatophore onto the hard thelycum of
females having advanced gonad maturation at inter-molt
stage, where mating-chasing behavior is a prerequisite for
spermatophore transfer and successful fertilization. Therefore, in open-thelycum species, mating occurs around two
hours before final oocyte maturation and spawning,
following vitellogenesis (Dall et al., 1990; Yano, 1995).
There is a discrepancy in reports of female decapods
regarding when meiosis I begins. Some reports indicate that it
begins at the onset of spawning, associated with final
maturation, and hence, to the molt cycle. Examples are M.
japonicus, where ovulation and meiosis I characterize the
maturating stage of oocytes (Yano, 1988), and the red
flagellated shrimp Acetes chinensis Hansen, 1919 (Decapoda:
Sergestidae), where meiosis I starts prior to spawning (Quiu,
1986). Some reports indicate that meiosis I is arrested at
metaphase I and then resumes in mature females at the onset of
spawning. In this case, the beginning of meiosis I is independent
INTRODUCTION
Mitotic chromosomes have been comprehensively studied
in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone,
1931), and other commercially penaeid species (CamposRamos, 1997). Most species have a diploid number of 88
chromosomes, where chromosomes are small, and with a
progressively decreasing length, which is difficult for
karyotype analysis. Nuclei at the diplotene stage were
obtained from male testes in Marsupenaeus japonicus
(Bate, 1888) (Hayashi and Fujiwara, 1988), Fenneropenaeus chinensis (Osbeck, 1765) (Jixun et al., 1989),
Farfantepenaeus aztecus (Ives, 1891), Farfantepenaeus
duorarum (Burkenroad, 1939), and Litopenaeus setiferus
(Linnaeus, 1767) (Chow et al., 1990), and L. vannamei
(Chow et al., 1990; Campos-Ramos, 1997; Alcivar-Warren
et al., 2006), and there is only one report of this stage in the
female ovary of F. chinensis (Jixun et al., 1989). Counting
of highly condensed bivalents has led to establishing the
haploid number of species and confirmed the diploid
number that was previously obtained.
Currently, there are no comprehensive studies of meiosis
in crustaceans. The long and complex first prophase of
meiosis I (Strickberger, 1976; Bernhard, 1990; Loidl, 1994)
involves three important processes: 1) pairing of the
homologous chromosomes (synapsis), 2) genetic recombination, and 3) segregation of homologous chromosomes.
The synaptonemal complex (SC) is a protein complex that
forms during the first meiotic prophase, where chromosome
synapsis and genetic recombination occur during the
zygotene and pachytene stages, respectively (Moses,
1956; Fawcett, 1956; Carpenter, 1979; von Wettstein et
al., 1984; Schmekel et al., 1993; Loidl, 1994).
75
76
JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY, VOL. 31, NO. 1, 2011
Fig. 1. Litopenaeus vannamei. Tangled-arranged synaptonemal complexes of female (A) and male (B) at zygotene stage, and female (C) and male (D) at
pachytene stage stained with orcein. Bar represents10 mm. Zygotene, stage is distinguished from pachytene stage because homologous chromosomes have
just synapsed and started to zip-up in one direction, apparently from one end to the other (big arrowheads). During zygotene, thinner and longer than
pachytene bivalents are seen because of a less condensation stage of chromatin. Additionally, it is possible to observe chromosomes (lateral elements) that
are still unpaired (small arrowheads), in contrast to the fully synapsed bivalents at pachytene stage (double arrowheads).
of final maturation and spawning; hence, the molt cycle. The

arrested oocyte stage at metaphase I is shown to occur in L.
vannamei using fluorescent probes for DNA and tubulin and
confocal microscopy (Hertzler, 2005), by histology of F.
aztecus (Clark et al., 1980), a closed-thelycum species like M.
japonicus, and in the freshwater prawn Macrobrachium
rosenbergii de Mann, 1879 (Okumura and Aida, 2000).
In male shrimp, testes produce spermatids that are
transported to and accumulate in the vas deferens.
Spermatogenesis continues along the ejaculatory bulbs
and the spermatozoa mass is stored in the terminal
ampoule, where it is wrapped in secretions from glands
forming the spermatophore (King, 1948). A histological
study of L. vannamei shows that spermatogenesis is a
continuous process, not related to the molt cycle, in contrast

to the molt-related formation of the spermatophore
(Heitzmann et al., 1993); Parnes et al. (2006) confirmed
the timing of formation of the spematophore.
This study describes meiotic stages in gonads of both
genders of L. vannamei, and elucidates whether meiosis is:
1) continuous and not dependent on the molt cycle, or 2)
progresses as packages of meiotic cells from post-molt to
pre-molt stages or at a specific molt stage.
MATERIALS AND METHODS
Specimens of L. vannamei were obtained at the CIBNOR facilities. The
molt stages were based on the description of de Oliveira-Cesar et al.
GARZA-TORRES ET AL.: MEIOSIS IN LITOPENAEUS VANNAMEI
77
Fig. 2. Litopenaeus vannamei. Female (A and B) and male (C and D) at early diplotene stage, showing 44 bivalents. A, B, and D: orcein staining; C:
DAPI staining. Bar represents10 mm.
(2006), and the criteria for identification of meiotic stages were based on
the descriptions of von Wettstein et al. (1984) and Loidl (1994). The
genital organs (Garza-Torres et al., 2009) of one group of immature adult
shrimp (25-27 grams body weight) were dissected after identifying the
molt stage without any treatment (control). Another group, after
identifying the molt stage, was injected with 5-mg colchicine per body
gram, and dissected 8 h after injection. Each group consisted of six ovaries
and six testes in each of the following stages: late post-molt (Stage B),
inter-molt (Stage C), early pre-molt (Stage D1), and late pre-molt (Stage
D3). The lobes of gonads were dissected and processed using two
techniques and three staining protocols: the air-dried technique, consisting
of one hour of hypotonic shock in distilled water and then three changes
lasting 15 min each, of freshly prepared and cold Carnoy fixer (3:1
methanol to acetic acid), followed by dissociation of tissue in 50% solution
acetic acid.
Three slides per gonad were prepared according to Campos-Ramos
(1997) by dropping and immediately absorbing the liquid in a pre-warmed
slide around 30uC. Slides first were stained in 2% orcein in 45% solution
acetic acid solution for 5 min, rinsed twice in distilled water, once in
ethanol, and then air-dried. Slides then were stained with DAPI (49-6-
diamidino-2-phenylindole). A slightly modified technique to observe the

SC in tilapia (Campos-Ramos et al., 2001) was used on the shrimp gonad,
which consisted in cutting the gonad tissue with small scissors in 1 mL
0.2% Triton X-100 solution, buffered to pH 8.5 with 0.01 M sodium
tetraborate. The resulting cell suspension was left for one hour in a 1.5 mL
tube at 4uC, the upper 500 mL were transferred to another tube containing
500 mL 4% paraformaldehyde (dissolved with 1 N sodium hydroxyl and
buffered to pH 8.5 with 0.2 M sodium tetraborate), gently shaken, and then
incubated for 10 min at room temperature. About 100 mL of the fixed cell
suspension was pipetted onto three microscope slides, and horizontally airdried under a fume hood. Slides were washed gently with running tap
water and then distilled water, followed by a rinse in ethanol and then airdried. Finally, slides were stained with 50% silver nitrate (Howell and
Black, 1980).
Meiotic cells were photographed with a compound light microscope
equipped with fluorescence and attached digital camera. Measurements of
the diameter of each nucleus (mm) were made in six nuclei at each meiotic
stage with Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). The
relative abundance of nuclei of each molt stage was recorded as: 0 (nuclei
not present); + (nuclei rarely present); ++ (few nuclei present); +++ (nuclei
78
Fig. 3. Litopenaeus vannamei. Female (A) and male (B) at advanced diplotene stage, showing 44 bivalents; A, orcein staining; B, DAPI staining. Mitotic
spreads (C and D) from spermatogonia staining with orcein. Bar represents10 mm.
commonly present), and ++++ (nuclei abundantly present). To contrast the

qualitative information obtained from male germ cell meiotic stages,
quantitative data of sperm cells were obtained from six males at each molt
stage. Vas deferens and spermatophores from the terminal ampullae were
dissected, cut in small pieces, and manually homogenized in 1 mL sterile
seawater. Sperm counts were made with a hemacytometer (0.1 mm deep;
Hausser Scientific, Horsham, PA). The average of counts from the bilateral
vas deferens and from both spermatophores was obtained for each shrimp.
Normality (Kolmogorov-Smirnovs test) and homogeneity of variances
(Levenes test) of data were calculated. Mean nucleus diameter and sperm
counts among the molt stages were compared with ANOVA using SPSS v.
16.0 (SPSS, Chicago, IL). Statistical significance was set at P , 0.05.
RESULTS
The best technique for observing the SC was the air-dry
method, followed by orcein staining. The SC was not
resolved with DAPI staining and with tissue that was fixed
with paraformaldehyde and stained with silver nitrate.

Diplotene stage was resolved better with the orcein and
DAPI protocols than with the silver nitrate protocol. Both
genders showed all stages of meiosis I, with the exception
of the leptotene stage (0). The control group showed
zygotene (++) and pachytene nuclei (++++) only, but the
group injected with colchicine showed zygotene (++),
pachytene (++++), early diplotene (+), and advanced
diplotene (++). Most of the meiotic cells in both genders
remained at the pachytene stage, recognized by the
complete synapsis of bivalents. The nature of the SC in
our sample showed each pair of homologous chromosomes
synapses end-to-end, revealing high chromatin density and
a complex, tangled arrangement in the nucleus. In all
shrimp of both genders, zygotene (Fig. 1A, B), pachytene
(Fig. 1C, D), early diplotene (Fig. 2A-D), and advanced
79
Table 1. Mean sperm counts (6 SE) from the vas deferens and
spermatophorores during molt stages of Litopenaeus vannamei. No
statistical difference was obtained.
3 103
vas deferens
spermatophores
Fig. 4. Litopenaeus vannamei. Mean nucleus diameter (6 SD) at

zygotene, pachytene, and diplotene stages in females and males.
diplotene (Fig. 3A, B) were observed at post-molt, intermolt, and pre-molt stages. Female oogonia (++) and male
spermatogonia (+++) were observed during these molting
stages, and only males showed a few mitotic nuclei
containing 88 chromosomes (Fig. 3C, D). As the first
meiotic prophase continued to the diplotene stage, a
reduction and disabling of the SC occurred, leaving
homologous chromosomes attached by chiasmata. At these
stages, it was possible to obtain the haploid chromosome
number of 44 because nuclei contained the highest degree
of bivalent condensation. Early diplotene nuclei in both
genders had, of the 44 bivalents, , 40 with an o-ring
configuration and the rest had a v configuration (Fig. 2).
There was no significant difference in the nuclear diameter
at each meiotic stage between genders. The nuclear mean
diameter gradually diminished from the zygotene (95 6
16 mm in females, 88 6 15 mm in males) to the pachytene
(66 6 9 mm in females, 60 6 8 mm in males) and to
diplotene (42 6 10 mm in females, 38 6 8 mm in males),
more than a 50% decrease (Fig. 4). Spermatids (++++) and
immature sperm (++++), as well as previtellogenic oocytes
(+++) were common during the molt cycle. Sperm counts
from vas deferens and spermatophores were not significantly different during the molt stages (Table 1).
DISCUSSION
The meiotic cells in gonad of L. vannamei showed the
general features of prophase I that are observed in
eukaryotes. Because of high chromatin density, the SC
from gonads was best obtained through the air-dried
technique using Carnoy as a fixative and stained with
orcein. This was easier to process than the paraformaldehyde fixative and silver staining that is commonly used. In
terms of spreading of nuclei, neither technique was able to
unravel bivalents. The many bivalents that are tangled in
the nucleus made it impossible to measure each bivalent
and recognize any bivalent associated with a putative sex
bivalent. From the arrangement of the SC and the low
resolution of the technique, no other bivalent structures,
such as kinetochores and attachment plaques were
observed. Most of the meiotic cells in both genders
remained at the pachytene stage, recognized by the
complete synapsis of bivalents, which support the histological observation of Heitzmann et al. (1993), in male L.
Stage B postmolt Stage C intermolt Stage D1 premolt Stage D3 premolt
1581 6 243 1235 6 329 1356 6 219 1437 6 229

1837 6 317 1906 6 204 1765 6 212 1862 6 351
vannamei. When analyzing the SC in spermatocytes of

diploid and triploid F. chinensis using transmission electron
microscopy, Xie et al. (2008) observed tangled bivalents
without revealing further characteristics, they found that it
was extremely difficult to locate well-spread nuclei for
analysis. Further improvement of the SC technique in
gonads of shrimp is required, specifically, a method to
obtain better spreading of bivalents.
We found that the beginning of meiosis I in female L.
vannamei is continuous, and therefore, occurs independently from vitellogenesis, final maturation, and spawning,
hence, the molt cycle. Hertzler (2005) has documented the
arrested oocyte stage at metaphase I in spawning females.
According to Garza-Torres et al. (2009), previttelogenic
primary growth occurs from day 70 as postlarva, which
distinguishes female gonad differentiation. Therefore, we
suggest that meiosis I occurs after differentiation of the
gonad in juveniles and the ovary continues to accumulate
arrested oocytes in previtellogenic growth. At adulthood,
and under reproductive conditions, secondary oocyte
maturation (vitellogenin) takes place, and by the time of
spawning, the oocyte resumes meiosis. The separation of
the first meiotic polar body from the oocyte is evident ,
7 min after spawning (Dumas and Campos-Ramos, 1999).
According to Bernhard (1990), most invertebrates, including arthropods, annelids, some mollusks, and the tunicates
arrest the oocytes in Metaphase I. Some reports of female
decapods indicate that meiosis I in oocytes begins at the
onset of spawning (Qiu, 1986; Yano, 1988). This is still
controversial and requires confirmation.
Our study also confirmed that spermatogenesis in male
L. vannamei is continuous and is not related to the molt
cycle, which agrees with Heitzmann et al. (1993). The
production of gametes by meiosis (non-molt related) and
the elimination of old sperm (molt-related) (Heitzmann et
al., 1993; Parnes et al., 2006) are two separate physiological processes. In other decapods, such as the orange-claw
morphotype of male freshwater prawn M. rosenbergii,
DNA synthesis in testes at the pre-molt stage is at least
three times higher than at the post-molt and inter-molt
stages, and when compared to the inter-molt stage of the
blue-claw morphotype (Sagi et al., 1988, 1991). Therefore,
there is no a general rule that spermatogenesis should be
continuous in all male species of decapods.
The diploid chromosome number in L. vannamei is 88
chromosomes (Campos-Ramos, 1997), and the haploid
number is 44 bivalents (Chow et al., 1990; Campos-Ramos,
1997; Alcivar-Warren et al., 2006). According to CamposRamos (1997), the tentative karyotype is 4m + 10sm + 56st
+ 18t. Most of these chromosomes are subtelocentric and
telocentric (37 pairs) that, apparently according to the
present study, have an o-ring configuration during early
80
diplotene and represent two crossovers per bivalent per

meiosis. The other seven chromosome pairs are either
metacentric or submetacentric, which could represent
bivalents having a v configuration and where only one
crossover occurs. These observations suggest that there is
recombination in most bivalents in both genders, a scenario
that is common in gonochoric animals since achiasmatic
meiosis is rather rare. Sex-linked markers mapped on the
maternal genome in M. japonicus (Li et al., 2005) and L.
vannamei (Zhang et al., 2007) suggest that there is a
bivalent involved in sex determination, and imply that the
female is the heterogametic sex in these species.
Sex determination in gonochoric crustaceans is primarily
through sex chromosomes (Charniaux-Cotton, 1960; Ginsburger-Vogel and Charniaux-Cotton, 1982). Evidence of
sex chromosomes is found in the eye-white phenotype in
bisexual Artemia franciscana Kellogg, 1906, which is sexlinked to the female W-sex chromosome (Bowen, 1963,
1965; Bowen et al., 1966). The obligate recombination
between sex chromosomes occurs during pachytene and the
restoration of a diploid WZ zygote during the second
meiotic division in Artemia parthenogenetica Bowen and
Sterling, 1978 (Campos-Ramos et al., 2006b). In freshwater
prawns and marine penaeid shrimp, it also appears that a
WZ sex determination system is common (see CamposRamos et al., 2006a for a review).
In marine shrimp, triploid induction has been successfully
achieved in F. chinensis (Li et al., 2003) and M. japonicus
(Coman et al., 2008). Li et al. (2003) observed a skewed sex to
female in a 4:1 proportion in triploid shrimp. Coman et al.
(2008) observed all-female triploid shrimp and stated that it
was not possible to explain the sex-determining mechanism, as
described for fish. They proposed an over-dominant Wchromosome and a lethal ZZZ-genotype. This explanation
seems controversial because triploid male shrimp do exist, as
found by flow cytometry (Li et al., 2003) and SC analysis (Xie
et al., 2008). An alternative to the hypothesis of dominant and
lethal sex-genotypes, the recombination between sex chromosomes explains better why the gender proportion in penaeid
triploids is skewed to females, as shown in fish species having
a WZ/ZZ system, e.g., the blue tilapia Oreochromis aureus
(Steindachner, 1864) (Penman et al., 1987; Mair et al., 1991).
In any case, the gender proportion in triploids suggests that sex
chromosomes do exist in penaeids and that further research is
necessary in sex determination studies.
ACKNOWLEDGEMENTS
Funding was provided by Centro de Investigaciones Biologicas del
Noroeste and Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT
grant 101556-2008) awarded to RCR, AMMM, and DAGT. RGT received
a CONACYT doctoral fellowship. Thanks to Adriana Landa for technical
assistance.
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RECEIVED: 29 March 2010.
ACCEPTED: 1 July 2010.

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Programa de Estudios de Posgrado

Estudio sobre el rgano genital del camarn blanco del

RODOLFO GARZA TORRES

La Paz, Baja California Sur, Noviembre de 2011

Dr. Rafael Campos Ramos (CIBNOR, S.C.).

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez (CIBNOR, S.C.).

Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra (CIBNOR, S.C.).

Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz (UANL).

Dr. Rafael Campos Ramos.

COMIT REVISOR DE TESIS

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez.

Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra.

Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz.

Dr. Rafael Campos Ramos.

JURADO DE EXAMEN DE GRADO

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martnez.

Dra. Norma Yolanda Hernndez Saavedra.

Dr. Gabino Adrin Rodrguez Almaraz.

Dra. Danitzia Adriana Guerrero Tortolero (Suplente).

El presente trabajo de tesis doctoral comprende los siguientes artculos

Garza-Torres, R., R. Campos-Ramos, y

Organogenesis and subsequent development of the genital organs in female

Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Decapoda: Penaeidae). Journal of

Crustacean Biology 31 (1): 75:81.

importante para la rentabilidad de la industria. En peneidos existe dimorfismo sexual

La reversin sexual del camarn blanco Pacfico Litopenaeus vannamei podra

contribuir a una mayor produccin en la camaronicultura a travs del cultivo

son prcticamente nulos en especies comerciales de peneidos. Con este conocimiento

blanco y finalmente integrar una biotecnologa como cultivo monosexual de hembras

a la industria. En el presente estudio, se realizaron 4 investigaciones concernientes al

durante la organognesis del aparato genital, su funcin en el mantenimiento de la

espermatognesis en relacin con el ciclo de muda, el control endocrino proveniente

organognesis y el desarrollo subsecuente del rgano genital a partir de postlarvas

de la diseccin en el da PL16. Este se observa como un lbulo bilateral en la parte

anterior al hepatopncreas, conectados a un tubo colector que se extiende

proyectan bilateralmente 8 lbulos, un oviducto, y un lbulo posterior en hembras, y 7

testculo. Con el objeto de establecer una relacin entre la gametognesis y el ciclo de

paquiteno (denotado por la completa sinapsis de sus bivalentes) y diploteno en los

incrementaron significativamente en el grupo bilateral (6X106) respecto al unilateral

ablacionados, un incremento en el nmero de clulas en la GA del vaso deferente

despus de la ablacin. Por ltimo, se disearon oligos a partir de las secuencias

terminal. La secuencia de este producto fue similar a las publicadas en peneidos y su

este trabajo sobre la GA ayudar a prximos estudios enfocados a la produccin de

Palabras clave: L. vannamei., glndula andrognica, diferenciacin sexual

Dr. Rafael Campos Ramos

Dr. Alejandro M. Maeda Martnez

contribute to the mayor production of the shrimp farming trough an all-female

culture. In Malacostraca (isopods, amphipods and decapods), the androgenic gland

cells at zygotene, pachytene, (recognized by the complete synapsis of the bivalents)

primers were designed based on the published AG nucleotide sequences of decapods.

Amplifications of cDNA by RT-PCR were amplified on vas deferens and terminal

contribute to future studies focused on the production of all-female cultures in the

Key words: L. vannamei, androgenic gland, sexual differentiation

Gracias a mi comit tutorial, la Dra. Norma Y. Hernndez Saavedra, el Dr. Gopal

Murugan y el Dr. Gabino A. Rodrguez Almaraz.

Gracias a la Dra. Elva Corts, a la Dra. Danitzia Guerrero y a la Dra. Hortencia

Delia Rojas y Miguel Correa.

Gracias a toda mi familia, incluida Arlett.

Gracias a todos mis amigos y compaeros.

Gracias al CIBNOR y al personal de Posgrado, gracias al CONACyT por la beca

otorgada (No. 166576).

OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................................................... 25

OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................................................................ 25