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2006
Sumrio
1. INTRODUO .................................................................................................... 4
2. REFERENCIAL TERICO .................................................................................. 5
2.1 Micro e Macromolculas ................................................................................ 5
2.2 Anlise Qumica............................................................................................. 6
2.3 Conservao do Material Vegetal .................................................................. 7
2.4 Homogeneizao ........................................................................................... 8
2.5 Extrao....................................................................................................... 10
2.5.1 Acondicionamento dos Produtos de Extrao .......................................... 11
2.5.2 Avaliao do resultado do processo de extrao ..................................... 11
2.6 Identificao e Quantificao de Biomolculas............................................ 12
2.6.1 Espectrofotometria ................................................................................ 12
2.6.2 Cromatografia ....................................................................................... 13
2.7 Tratamentos dos dados.............................................................................13
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 14
4. MATERIAL E MTODOS .................................................................................. 15
4.1 Preparo das amostras.................................................................................. 15
4.2 Homogeneizao ......................................................................................... 15
4.3 Extrao....................................................................................................... 15
4.3.1 Extrao com MCW................................................................................... 16
4.3.2 Extrao com Etanol 80%...........................................................................17
4.3.3 Extrao com tampo fosfato 0,1 M, pH 7,5 ou gua.................................18
4.4 Quantificao de Macro e Micromolculas .................................................. 18
5. RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................... 19
5.1. Quantificao bioqumica de folhas frescas de Seringueira com diferentes
homogeneizadores e extratores. ....................................................................... 19
5.1.1 Aucares Solveis Totais ...................................................................... 20
5.1.2 Acares Redutores.............................................................................. 21
5.1.3 Protenas ............................................................................................... 22
5.1.4 Aminocidos...........................................................................................23
5.2. Quantificao bioqumica de folhas secas de Seringueira com diferentes
extratores........................................................................................................... 25
5.2.1 Aucares Solveis Totais ...................................................................... 25
5.2.2 Acares Redutores.............................................................................. 26
5.2.3 Protenas ............................................................................................... 26
5.2.4 Aminocidos...........................................................................................27
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 28
7. ANEXOS.............................................................................................................29
1. INTRODUO
Dentro do universo vegetal, e mesmo em uma nica planta, existem diversos
compostos orgnicos que so fundamentais para o desenvolvimento e
manuteno das funes vitais desses organismos. As substncias que compem
um vegetal podem ser classificadas de uma maneira geral, em micromolculas
(aminocidos, nucleotdeos e oligossacardeos) e macromolculas (protenas,
cidos nuclicos, polissacardeos e lipdeos), sendo as macromolculas
constitudas de monmeros de unidades micromoleculares.
Muitas biomolculas tm que ser extradas e isoladas da sua fonte biolgica
antes que possam ser estudadas com alguma profundidade. Os modelos
biolgicos para estudos moleculares podem ser vrios e das mais diversas
naturezas. Dependendo do objetivo da investigao, pode ser mais relevante
trabalhar com organismos inteiros (plantas, animais, microorganismos) ou, no
outro extremo com sistemas sub-celulares "cell-free", ou sistemas livres de
clulas.
A separao entre micro e macromolculas uma prtica comum, tendo por
finalidade a identificao e quantificao das mesmas. Tal prtica, no entanto,
considerada grosseira, mas constitui-se numa etapa essencial, a qual antecede a
separao de cada uma das classes que compem essas biomolculas.
Uma anlise qumica de tecidos vegetais requer uma srie de etapas que se
iniciam desde a seleo do material vegetal at a identificao e quantificao de
metablitos ativos de interesse. evidente que para cada molcula ou grupo de
molculas-alvo, reunidas por suas afinidades qumicas, existem diferentes
mtodos que variam de acordo com a natureza qumica, funo biolgica e
compartimentalizao das mesmas o que requer conhecimentos dos processos
metablicos que participam.
De modo geral, os passos para a anlise completa de um tecido vegetal
abrangem: conservao do material vegetal, desde a coleta at sua posterior
utilizao, homogeneizao, extrao e fracionamento (purificao) de grupos
carboidratos
podem
ser
definidos
como
poliidroxialdedos
ou
biolgicas
duras
obrigam
utilizao
de
tcnicas
de
Vrtex:
apresenta
maior
potncia,
entretanto,
pode
ocasionar
desnaturao de enzimas.
Microtriturador: o mais eficiente mtodo de homogeneizao, utilizando o
sistema de facas associado ao ultra-som. Atravs dele possvel estudar
organelas celulares intactas, ainda que o rendimento no seja grande. Para cada
tipo de estudo necessrio determinar o tempo e a potncia a ser utilizada na
homogeneizao.
Homogeneizadores:
Liquidificador (Blendor) constitui-se num dos mtodos mais empregados.
Atravs de suas lminas de alta velocidade exerce uma grande fora sobre as
clulas, podendo, no entanto, trazer como conseqncia, a desnaturao
enzimtica.
Vidro utilizado na homogeneizao de amostras de textura macia e em
quantidades pequenas.
Durante a homogeneizao, para preservar a integridade das molculas-alvo,
meios de extrao especficos devem ser utilizados. A escolha destes meios
depende de uma srie de questes: se a determinao a realizar apenas
quantitativa; se a molcula em questo solvel nas substncias extratoras; se a
molcula est presa ou no parede celular e a membranas; se o objetivo da
extrao medir apenas a atividade de uma determinada enzima; se o objetivo
isolar e estudar determinado compartimento celular. Os meios de extrao podem
ser constitudos por vrias substncias, tais como:
Tampes: visam preservar a integridade metablica de algumas molculas,
principalmente das enzimas.
Agentes quelantes: grupamentos sulfidrilas de certas molculas podem
sofrer oxidao e reagir com metais pesados das prprias solues tampes
utilizadas na extrao. Para contornar este problema, agentes quelantes como o
EDTA e o Dietil-Ditiocarbamato so utilizados nestas solues.
Agentes antioxidantes: com o rompimento das clulas durante o processo
de homogeneizao, compostos fenlicos presentes nos tecidos vegetais se
oxidam e polimerizam, formando complexos com as protenas. Estes complexos
so
em
geral
coloridos
por
isso
dificultam
as
determinaes
eficiente
na
separao
entre
macro
micromolculas.
As
10
11
12
13
quantificao
de
biomolculas,
comparando-se
os
diversos
tipos
de
14
4. MATERIAL E MTODOS
4.1 Preparo das amostras
O preparo das amostras ocorreu imediatamente aps a coleta do material.
Para a anlise em matria fresca, inicialmente, as folhas selecionadas tiveram
retiradas de sua estrutura a nervura central. Posteriormente, o restante das
lminas foliares foi picado com o auxlio de um bisturi em fragmentos de
aproximadamente 4 mm2 e separado em amostras de 500 mg. Para a anlise em
matria seca, as folhas foram, aps a coleta, colocadas em uma estufa de
circulao mecnica sob temperatura de 70C, onde permaneceram at a
aquisio de peso constante.
4.2 Homogeneizao
Para a matria fresca, trs tipos de homogeneizadores foram utilizados:
Graal, Graal com Nitrognio Lquido e Microtriturador. A amostra de matria seca
foi homogeneizada em moinho tipo Wiley e dividida em 4 repeties de 500 mg
cada.
4.3 Extrao
Para a extrao, usou-se gua destilada, tampo fosfato 0,1M, pH
7,5,
15
16
17
quantificao
das
biomolculas
extradas,
foi
utilizada
18
160
140
mg/g MF
120
100
80
60
40
20
0
AST
TP GSN
AR
TP GCN
AA
PTN
TP Micro
19
140
120
mg/g MF
100
80
60
40
20
0
AST
TP
AR
GUA
AA
ETANOL
PTN
MCW
MDIAS
TP + Graal com N2
135,82 a
TP + Graal sem N2
130,24 b
TP + Microtriturador
129,49 b
20
MDIAS
Tampo Fosfato
129,49 a
gua
100,48 b
Etanol 80%
101,26 b
MCW
79,84 c
MDIAS
TP + Graal com N2
31,03 a
TP + Graal sem N2
31,48 a
TP + Microtriturador
28,07 b
21
MDIAS
Etanol 80%
49,84 a
gua
40,31 b
MCW
30,23 c
Tampo Fosfato
28,07 d
5.1.3 Protenas
Tabela 5. Teores mdios de Protenas em folhas frescas de Seringueira obtidos
com diferentes homogeneizadores.
HOMOGENIZADORES
MDIAS
TP + Graal com N2
18,59 a
TP + Graal sem N2
18,65 a
TP + Microtriturador
19,71 a
22
MDIAS
Tampo Fosfato
20,71 a
gua
16,05 b
MCW
15,04 b
Etanol 80%
11,66 c
MDIAS
TP + Microtriturador
48,09 a
TP + Graal sem N2
46,71 b
TP + Graal com N2
46,04 b
23
MDIAS
Tampo Fosfato
48,07 a
gua
40,19 b
Etanol 80%
39,64 b
MCW
30,20 c
24
160
140
mg/g MS
120
100
80
60
40
20
0
TP
AST
GUA
AR
AA
ETANOL
PTN
MCW
MDIAS
Etanol 80%
155,55 a
gua
137,81 b
Tampo Fosfato
139,01 b
MCW
100,43 c
25
estatisticamente entre si, sendo que todos estes superaram os valores obtidos
com o MCW.
5.2.2 Acares Redutores
Tabela 10. Teores mdios de Acares Redutores em folhas secas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES
MDIAS
Tampo Fosfato
64,71 a
gua
55,48 b
Etanol 80%
54,47 b
MCW
39,70 c
MDIAS
gua
19,58 a
MCW
16,10 b
Etanol 80%
12,67 c
Tampo Fosfato
6,69 d
Todos
os
extratores
utilizados
para
quantificao
de
protenas
apresentaram diferenas significativas entre si, sendo que a gua foi o extrator
que apresentou maior eficincia, superando os demais extratores utilizados.
5.2.4 Aminocidos
Tabela 12. Teores mdios de Aminocidos em folhas secas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES
MDIAS
Tampo Fosfato
64,71 a
gua
55,48 b
Etanol 80%
54,47 b
MCW
42,33 c
27
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. 3. Ed.
Biologia molecular da clula. Porto Alegre: Artes mdicas, 1997, 1320p.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the qauntification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemestry, v. 72, p. 248-254, 976.
CLARK, J.M. Bioqumica experimental. Zaragoza: editorial Acribia, 1966, 290 p.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introduo
cromatogrficos. 4. ed. Campinas: UNICAMP, 1990. 279 p.
mtodos
28
7. ANEXOS
ANLISE ESTATSTICA SISVAR
HOMOGENEIZADORES
GL
SQ
Homogeneizador
Erro
2
21
191.44
25.54
Total
23
216.98
QM
95.72
1.21
Fc
78.70
Pr>Fc
0.0000
CV (%) = 0.84
Mdias
129.49 a
130.24 a
135.82 b
GL
SQ
Homogeneizador
Erro
2
21
54.95
15.25
Total
23
70.20
QM
Fc
Pr>Fc
27.47
0.72
37.83
0.0000
CV (%) = 2.82
29
Mdias
31,49 a
31.03 a
28,07 b
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
Homogeinizador
Erro
2
21
6.32
53.61
3.16
2.55
1.23
0.0000
Total
23
59.94
CV (%) =
8.42
Mdias
18.59a
18.65a
19.71a
30
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
Homogeinizador
Erro
2
21
17.55
19.10
8.77
0.90
9.64
0.0000
Total
23
36.66
CV (%) = 2.03
Mdias
48,09 a
46.71 a
46,04 b
31
GL
SQ
QM
Material Vegetal
Erro
3
28
9978.76
22.83
3326.25
0.81
Total
31
10001.60
Fc
4078.57
Pr>Fc
0.0000
CV (%) = 0.88
Quadro 2. Mdias para teores de acares solveis totais com diferentes extratores.
Tratamentos
TP
GUA
ETANOL
MCW
Mdias
129,49 a
100,49 b
101,27 b
79,84 c
GL
SQ
QM
Fc
Pr>Fc
Material Vegetal
Erro
3
28
2409.66
54.21
803.22
1.93
414.81
0.0000
Total
31
2463.88
CV (%) = 3.75
Mdias
49,84 a
40,31 b
30,23 c
28,07 d
32
GL
SQ
Material Vegetal
Erro
3
28
335.11
17.81
Total
31
352.92
QM
111.70
0.63
Fc
Pr>Fc
175.60
0.0000
CV (%) = 5.03
Mdias
20,71 a
15.05 b
16.05 b
11,66 c
GL
SQ
Material Vegetal
Erro
3
28
1286.96
22.71
Total corrigido
31
1309.67
QM
428.98
0.81
Fc
Pr>Fc
528.88
0.0000
CV (%) = 2.28
Mdias
48,09 a
39.64 b
40.19 b
30,20 c
33
GL
SQ
QM
Material Vegetal
Erro
8
28
11387.45
100.11
Total
31
11487.56
Fc
3795.81
3.5753
Pr>Fc
1061.66
0.0000
CV (%) = 1.43
Mdias
Etanol
gua
TP
MCW
150,55
137,81
139,01
100,44
a
b
b
c
GL
SQ
Material Vegetal
Erro
3
28
2567.01
114.91
Total
31
2681.92
QM
855.67
4.10
Fc
208.49
Pr>Fc
0.0000
CV (%) = 3.78
Mdias
64,71 a
54.47 b
55.48 b
39,70 c
GL
SQ
QM
Material Vegetal
Erro
3
28
722.97
17.43
240.99
0.62
Total
31
740.40
Fc
387.10
Pr>Fc
0.0000
CV (%) = 5.73
Mdias
19,59a
16,10b
12,67c
6,69d
GL
SQ
Material Vegetal
Erro
3
28
2024.96
498.17
Total
31
2523.14
QM
674.98
17.79
Fc
37.938
Pr> Fc
0.0000
CV (%) = 7.78
Mdias
64,71 a
54,47 b
55,48 b
42,33 c