Tecnolgico de Monterrey

Campus Guadalajara

Diagnstico Molecular para la deteccin de anemia falciforme

Claudia Del Toro Runzer A01222071

Sebastin Patio Valenzuela A01222331
Francisco Andrs Robles Escoto A01133410
Ricardo Hernndez Medina A01226072
Vicente Pal Armenta Prez A01112119
Ingeniera Gentica
Grupo 1
Dra. Clara Patricia Ros Ibarra

Diagnstico Molecular para la deteccin de anemia falciforme

Introduccin
La anemia falciforme es una enfermedad en la que su cuerpo produce glbulos rojos con
un contorno anormal. Las clulas tienen forma semilunar o de una hoz. Estas clulas son
ms rgidas y menos flexibles, por lo que se atascan en los vasos sanguneos y bloquean
el flujo, esto provoca dolor y puede lesionar los rganos e incluso pueden causar infartos.
Debido tambin a sus extremos puntiagudos, pueden llegar a desgarrar las paredes de
los vasos. A diferencia de los hemates normales, que duran unos 120 das en la corriente
sangunea, los falciformes son eliminados despus de slo unos 10 o 20 das y, como no
pueden reponerse con suficiente rapidez, la sangre tiene insuficiencia permanente de
glbulos rojos (eritrocitopenia), causando la enfermedad conocida como anemia (NIH,
2014).
Las personas con la enfermedad nacen con dos genes de clulas falciformes, uno
de cada padre por lo que son homocigotos. Si hereda el cambio del gen de uno solo de
sus padres, ser portador y tendr el gen de clulas falciformes y otro normal, por lo que
sern heterocigotos, a este rasgo se le denomina drepanoctico. Aproximadamente 1 de
cada 12 personas de raza negra es portadora del rasgo drepanoctico, y la enfermedad
como tal, afecta al 8% de la poblacin afroamericana (ONSALUS, 2013).
Existen varias alternativas para hacer un diagnstico de esta enfermedad por
ejemplo se puede hacer un recuento de reticulocitos, es decir, de la cantidad de glbulos
rojos inmaduros de la sangre, a su vez se puede hacer pruebas para determinar las
concentraciones de hierro en la sangre y en el cuerpo. No obstante una alternativa ms
precisa es el diagnstico molecular, que a su vez es una opcin sencilla y rpida.
El diagnstico molecular se define como el conjunto de tcnicas que emplean la
biologa molecular para identificar anomalas o defectos moleculares subyacentes a una
enfermedad de carcter hereditaria o infecciosa. El empleo de estas tcnicas ofrece una
evaluacin ms especfica, sensible y rpida, adems se requiere cantidades mnimas de
muestra en comparacin con las pruebas convencionales. Para planear una estrategia
de diagnstico es necesario plantearse una serie de preguntas secuenciales para
enfocarse en el problema en cuestin, dichas preguntas se pueden observar en la Tabla1.

1 Est asociada a una alteracin cromosmica? NO

SI
2

Presenta herencia mendeliana?

Locus localizado?

Gen identificado?

ir a 2
Diagnstico citogentico

NO Estudios de asociacin y factores de riesgo

SI

ir a 3

NO

Diagnstico por patrn de segregacin

SI

ir a 4

NO

Diagnstico Indirecto con marcadores

SI

ir a 5

Muchos alelos mutados?

Diagnstico Indirecto con marcadores

Un alelo prevalente?

Diagnstico Directo

Tabla 1. Cuadro dicotmico para la eleccin de la estrategia diagnstica (Fibla, 2006).

Muchas patologas genticas estn asociadas a alteraciones en el complemento

cromosmico, sobre todo aquellas que se manifiestan de forma sindrmica. Por lo que se
debe de averiguar si la patologa pertenece a este grupo, de ser as, se efecta un
diagnstico citogentico, con el cual se realizar una caracterizacin cromosmica del
propositus y de su familia, esto se obtiene con la elaboracin de un cariotipo para el
estudio de posibles alteraciones estructurales cromosmicas (Echegaray, Rosetti &
Vildoza, 2014).
Si la enfermedad no pertenece a este grupo, se debe plantear si la patologa
presenta o no un herencia mendeliana. De tratarse de una patologa con herencia
multifactorial, como es el caso de la hipertensin, la diabetes, las enfermedades
cardiovasculares etc., las nicas aproximaciones diagnsticas son los estudios de
asociacin y la determinacin de factores de riesgo. Si la patologa estudiada presenta
una herencia mendeliana definida, deberemos preguntarnos si se ha localizado o no al
locus implicado. De no ser as, solo podremos ofrecer un diagnstico basado en el patrn
de segregacin. Se trata en este caso de un diagnstico eminentemente probabilstico y
de una baja calidad informativa principalmente empleado para enfermedades no
caracterizadas que se basa en un anlisis del patrn hereditario (Vizmanos, 2014).
Si el gen ha sido caracterizado y se conoce la mutacin o mutaciones
responsables de la patologa, podemos encontrarnos con dos situaciones: existe una
nica mutacin que causa la enfermedad o su nmero es muy limitado siendo una de
ellas muy prevalente, o bien, existe un gran nmero de mutaciones distintas que causan
la enfermedad y su frecuencia es equitativa. En el primer caso, es posible abordar una
estrategia de diagnstico directo mediante la deteccin de la mutacin nica o la ms

prevalente, es decir, mediante la deteccin del cambio producido a nivel del ADN. En el
segundo supuesto, es ms apropiado un diagnstico indirecto mediante el estudio de la
segregacin del carcter estudiado con marcadores polimrficos ntimamente ligados a
ste (Fibla, 2006).
Dado que la anemia falciforme es causada por una sola mutacin, la estrategia
que se describe a continuacin es para un diagnstico directo. Los temas de ingeniera
gentica asociados a este caso son: extraccin de DNA, diseo de oligonucletidos,
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), enzimas de restriccin y el uso de vectores
de clonacin como marcadores de peso molecular.

Glosario

Ac. glutmico, valina,

alanina, fenilalanina y
leucina

Amino cidos implicados en la formacin de los glbulos rojos

(ODNA, 2011).

Anemia falciforme

Enfermedad de carcter hereditario que consta en la

deformacin del contorno de los glbulos rojos en forma de
hoz y produce desgaste de rganos, obstruccin del flujo
sanguneo y anemia (NIH, 2014).

Cebador o primer

Secuencia de oligonucletidos complementaria a la secuencia

que se va a amplificar (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013).

Diagnstico
citogentico

Estudio de la estructura, funcin y comportamiento de los

cromosomas (Echegaray, Rosetti & Vildoza, 2014).

Diagnstico directo

Estudio mediante la deteccin de la mutacin nica o la ms

prevalente (Fibla, 2006).

Dianstico indirecto

Estudio de la segregacin del carcter estudiado con

marcadores polimrficos ntimamente ligados a ste (Fibla,
2006).

Drepanoctico

Rasgo adquirido cuando se hereda el cambio del gen de uno

solo de sus padres por lo que ser portador y tendr el gen
de clulas falciformes y otro normal (ONSALUS, 2013).

Enfermedad autosmica Rasgo, trastorno o enfermedad se puede transmitir de padres

recesiva
a hijos, deben estar presentes dos copias de un gen anormal
para que se desarrolle la enfermedad o el rasgo (NIH, 2014).
Enzimas MstII y Bsu36I

Isoesquizmeros que cortan en la diana donde se encuentra

la sustitucin de adenina por timina en el gen de la globina
beta (CMM, 2014).

Globina beta

Protena que forma parte de la hemoglobina (heteroprotena)

y se nica en el cromosoma 11 (Khalsa, 2008).

Hemates

Cada uno de los glbulos rojos de la sangre, discoides,

bicncavos, de seis a nueve micras de dimetro que
contienen la hemoglobina (Farlex, 2007).

Herencia mendeliana

Se refiere a la transmisin de un nico gen mediante un

patrn dominante, recesivo o ligado al cromosoma X
(Vizmanos, 2014).

Heterocigoto

Individuo que ha heredado un gen para un rasgo de un

progenitor y un gen alternativo distinto del otro progenitor. Es
decir, posee dos alelos diferentes para un mismo rasgo
(Enciclopedia Salud, 2013).

Homocigoto

Individuo que ha heredado un gen para un rasgo de un

progenitor y un gen idntico del otro progenitor. Es decir,
posee dos alelos iguales para un mismo rasgo (Enciclopedia
Salud, 2013).

Isoesquizmero

Dos enzimas con la misma secuencia de reconocimiento,

aunque pueden que no corten en la misma posicin (CMM,
2014).

Locus

Localizacin especfica de un Gen o una secuencia de ADN

en un cromosoma (Karp, 2009).

Marcador pUC18/SFC1

Vector plasmdico que al cortarse con la enzima de restriccin

SFC1 funcion como marcador para la electroforesis de las
muestras de DNA.

PCR

Reaccin en cadena en la que se aprovecha una polimerasa

de DNA para amplificar durante varios ciclos una secuencia
especfica de DNA (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)

Reticulocitos

Glbulos rojos inmaduros de la sangre (NIH, 2014).

Diagrama

Diagrama 1. Esquema del diagnstico molecular para la deteccin de anemia falciforme

Discusin
La anemia falciforme es una enfermedad gentica autosmica recesiva resultado
de la sustitucin de adenina por timina en el gen de la globina beta, lo que conduce a una
mutacin de cido glutmico por valina en la posicin 6 de la cadena polipeptdica de
globina beta, esto ocasiona la produccin de una hemoglobina defectuosa llamada
hemoglobina S. Paralelamente se altera la diana de restriccin para el enzima MstII, o
bien para la enzima Bsu36I, que es un isoesquizmero de MstII, es decir, cortan para el
mismo sitio de restriccin. El cido glutmico tiene carga negativa y la valina es hidrfoba,
entonces se forman contactos con alanina, fenilalanina y leucina, lo que promueve
polmeros cruzados que deforman el glbulo rojo (Fibla, 2006).
Como se trata de una sola mutacin en un gen conocido se sigui una estrategia
de diagnstico directo; en primer lugar se extrae el DNA de la sangre, posteriormente
sigue el diseo de primers que flanqueen la diana donde ocurre la mutacin, ya sea con la
herramienta que ofrece Blast o bien manualmente; en este caso se us la herramienta
Blast; despus se procede con la amplificacin y en seguida se emplean enzimas de
restriccin que corten justo en donde ocurre la mutacin; finalmente, un gel de
electroforesis permitir hacer una evaluacin del diagnstico molecular. Estos pasos se
observan en el Diagrama 2 y a continuacin se explican a detalle.

Extraccin de DNA

Diseo de primers

Amplificacin
Corte con enzimas de
restriccin
Electroforesis

Diagnstico
Diagrama 2. Resumen de los pasos para el diagnstico molecular directo.

Extraccin de DNA
La extraccin de DNA a travs de sangre perifrica consta de dos etapas, la primera
es la extraccin de sangre; en donde, se hace uso de herramientas para una extraccin
correcta de sangre teniendo los cuidados necesarios para evitar cualquier tipo de contagio
o de infeccin ya que con el material que se trabaja es biolgico. para la extraccin de
sangre perifrica se necesita de: ligar el brazo de la persona 10 cm arriba del codo y
realizar la bsqueda de la mejor vena por medio de palpaciones, seguido de esto, con
ayuda de torundas empapadas en alcohol se procede a desinfectar el rea de puncin;
una vez que la vena se encuentra sujetada se introduce la jeringa, manteniendo la jeringa
lo ms cerca posible de la piel del antebrazo para no lastimar a la persona. se extraen 3
mL de sangre y una vez dentro de la jeringa se coloca alcohol con ayuda de una torunda
sobre la zona de extraccin y se procede a desligar y retirar la aguja; la sangre es
colocada en un tubo el cual es previamente rotulado. (Roque, 2012).
La segunda etapa es para la extraccin de DNA a travs de la muestra de sangre
obtenida. La extraccin consta de una lisis celular con ayuda de un tensoactivo como Tris
o tritn, los cuales, se encargan de romper las estructuras que confinan el citoplasma y
as liberar su contenido. Una vez lisada la clula se procede a la remocin protica
contaminante con ayuda de Fenol as como la remocin de la carga lipdica con ayuda de
cloroformo para terminar de limpiar la muestra. Para la purificacin del DNA, se precipita
el DNA en alcohol ya que es insoluble en este; se puede usar etanol al 100% fro (4C) o
tambien isopropanol al 100% a temperatura ambiente. el uso de etanol hace que tarde
ms tiempo en precipitar el DNA, el isopropanol lo precipita inmediatamente aunque sea
un poco ms costoso. Por ltimo, se remueven las sales utilizando etanol al 70% y el DNA
es recuperado en agua mili Q. (Microbial, 2009; Falcn, 2004).

Diseo de primers
Para el diseo de primers, se decidi utilizar la herramienta PRIMER BLAST del NCBI.
Pero antes, fue necesario localizar la secuencia donde ocurre la mutacin puntual. Esta
mutacin ocurre especficamente en la cadena de la hemoglobina, ya que la mutacin
Glu6Val provoca que el gen HBB codifique una cadena defectuosa que al unirse en el
heterotetrmero (2 cadenas y 2 cadenas ) forma la hemoglobina S (Hb S), causante
de las clulas con anemia falciforme (Bender y Douthitt, 2014) . Por lo tanto, nuestro
inters fue encontrar el gen HBB, el cual se encuentra en el cromosoma 11 en Homo

sapiens (GeneBank U01317.1). Cabe mencionar que los genes codificantes de las
cadenas se encuentran en el cromosoma 16.
Una vez localizada la secuencia de la mutacin, se procedi a elegir una
secuencia especfica de alrededor de 310 nt, ya que nuestro producto de digestin deban
ser 2 fragmentos de 200 nt y 100 nt a partir del corte de restriccin en el sitio de la
mutacin. Para esto, elegimos 155 nt ro arriba y 155 nt ro abajo a partir de la
mutacin, y tras copiar el formato FASTA, accedimos a la herramienta PRIMER BLAST.
Especificamos que el producto de la PCR deba medir entre 290 y 310 pb y la herramienta
nos arroj 9 primers. De los cuales elegimos el siguiente debido a su % de G y C, y la
poca diferencia en la temperatura de alineamiento:

Figura 1. Primer elegido, propuesto por PRIMER BLAST

Adems, como se observa en la Figura 1, se le podan realizar pequeas

modificaciones como eliminar la timina al final del primero para facilitar el anclaje. Esto
con la finalidad de optimizar la PCR.

Amplificacin
Posteriormente se lleva a cabo una reaccin de la polimerasa en cadena (PCR) para
amplificar el segmento de DNA donde se encuentra la mutacin y que est flanqueado por
los primers diseados en el paso anterior. La PCR es un mtodo de diagnstico molecular
que permite obtener enzimticamente grandes cantidades de un fragmento especfico de
DNA a partir de un molde de DNA complejo (Arnheim y Erlich, 1992), para este caso el
DNA extrado de la sangre.
En esta reaccin, se utiliza una mezcla que contiene el juego de primers, la
muestra de DNA, desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sales, amortiguadores y una

DNA polimerasa, tpicamente proveniente de Thermus aquaticus. En el primer paso, la

doble hebra de DNA muestra se desnaturaliza por calor a 92-96 C. Una vez separada en
dos cadenas molde, la temperatura se baja a 55-60 C para permitir la hibridacin de los
primers en su secuencia complementaria. Este rango de temperatura da buenos
resultados para primers con un contenido GC de 50 %; en otro caso habra que ajustarlo
para evitar amplificar inespecificidades. En el siguiente paso, se eleva la temperatura para
permitir que la DNA polimerasa elongue la secuencia de inters. Tpicamente se utiliza
una DNA polimerasa proveniente del microorganismo Thermus aquaticus, esta enzima
permite que la elongacin ocurra a una temperatura elevada (72 C), lo que nos evita la
hibridacin de secuencias inespecficas. Los tres pasos recin mencionados conforman
un ciclo de PCR y se repiten hasta 50 veces para generar millones de copias del producto
de inters, denominado amplicn. (Arnheim y Erlich, 1992).
Enzimas de restriccin
Los amplicones sern procesados por una enzima de restriccin. Las enzimas de
restriccin son endonucleasas que identifican una secuencia especfica, llamada sitio
diana, en una doble hebra de DNA y escinden el DNA en ese punto. (Pingoud, Alves y
Geiger, 1993). En procariontes se ha detectado este sistema como un mecanismo de
defensa contra DNA exgeno; sin embargo, para el diagnstico molecular presente, se
aprovechan estas protenas para detectar la mutacin puntual que provoca la anemia
falciforme.
La mutacin se localiza en el sexto codn de la globina (GAG), por lo que se
prosigue a buscar una enzima que realice el corte en ese punto. Para esta tarea se utiliz
NEB Cutter . Al introducir la secuencia amplificada en esta herramienta, obtenemos
como resultado una lista de enzimas de restriccin, sus sitios de corte y los
amortiguadores a los que la actividad de la enzima es ptima. Como se muestra en la
Figura 2, la enzima ms conveniente es Bsu36I, ya que solo realizara el corte en las
secuencias de los pacientes normales (CCT GAG G). Al haber un timina en vez de
adenina en la secuencia mutante (CCT GTG G), Bsu36I no reconocera el sitio diana en
uno de los alelos de los portadores y ambos alelos de los afectados; el amplicn
permanecera en tal caso intacto. Estos resultados pueden visualizarse en un patrn
electrofortico.
Para detectar esta enfermedad se suele utilizar MstII. Aunque NEB Cutter no
sugiri en sus resultados esta enzima, Bsu36I se considera un isoesquizmero de MstII.

Los isoesquizmeros son enzimas de restriccin que comparten el mismo sitio diana
(Pingoud, Alves y Geiger, 1993).

Figura 2. Enzimas de restriccin sugeridas por NEB Cutter

Electroforesis del producto de la PCR despus del corte con enzimas de restriccin
Se realiz una electroforesis en gel (ver Figura 3) para separar las molculas de DNA
obtenidas posterior a la amplificacin de los fragmentos de inters generados por una
PCR convencional y a partir de los cortes producidos por accin endonucleasa (enzima de
restriccin). La electroforesis es una tcnica que permite la separacin, identificacin, y
purificacin de macromolculas en funcin a su tamao, propiedades elctricas y otras
propiedades fsicas. (Somma, M. s.f.).

El patrn de bandeo se lleva a cabo en un gel polimrico, se decidi trabajar con

agarosa porque el producto a separar eran cidos nuclicos y el tamao de los poros en
agarosa es mayor en comparacin con poliacrilamida, lo cual permite una migracin ms
rpida de la macromolcula. (Somma, M. s.f.). La concentracin utilizada de agarosa fue
de 1.4 X lo cual incrementa la resolucin de las bandas debido a que los productos
amplificados eran cercanos en nmero de pares de bases.
Se utiliz un control negativo, cuyo patrn de bandas corresponda a un individuo
sano, se esperaba observar dos bandas debido al corte generado por MstII uno de 100 pb
y otro de 191 pb, la cual es altamente especfica por lo que slo reconocer la secuencia
correspondiente al alelo sano. Asimismo se realiz el patrn de bandeo de un individuo
heterocigoto para la enfermedad. En este caso el patrn de bandas observado
corresponder a tres fragmentos con una resolucin de bandas menor al control negativo,
una de las bandas corresponde al alelo que no fue cortado por MstII (291 pb) debido a la
presencia de la mutacin, y las otras dos bandas (100 pb y 191 pb) corresponden al corte
generado por MstII en el alelo sano. El siguiente patrn de bandas corresponde a un
individuo homocigoto para la enfermedad, en cuyo caso MstII no reconoce la secuencia
de inters, de tal manera que slo se observar una banda de 291 pb.

Figura 3. Resultado del gel de electroforesis.

Para validar el patrn de bandeo se utiliz un marcador de peso molecular. Como

alternativa se decidi utilizar pUC18 debido a que es un plsmido barato en trminos

econmicos, posee numerosos sitios de restriccin y el tamao de su genoma es de 2686

pb. (Yanisch-Perron, C.,1985). La enzima utilizada para cortar el plsmido fue SFC1, ya
que genera cinco bandas cuyos tamaos se aproximan a los generados por MstII. La
metodologa electrofortica se llev a cabo in silico utilizando la herramienta de NEBcutter
para simular la electroforesis en gel de agarosa con una concentracin de 1.4 X.

Diagnstico Molecular
La utilizacin de un mtodo de corte por enzimas de restriccin permite un
diagnstico efectivo y temprano para enfermedades con etiologa gentica. Para el caso
particular de anemia falciforme el diagnstico molecular supone una alternativa de
tratamiento efectiva, sensible y temprana. El hecho de que sea una enfermedad de
carcter mendeliano permite conocer si la descendencia puede tener predisposicin, o no,
a padecer la enfermedad. Para conocer las posibles recombinaciones de la anemia
falciforme, se simul un cruzamiento gentico entre dos padres heterocigotos para la
enfermedad. Las posibles opciones de manifestacin del padecimiento gentico son 50%
de probabilidad de que el individuo sea heterocigoto para la enfermedad. Para este caso
el individuo es sano, sin embargo una centsima parte de sus eritrocitos son falciformes,
por lo cual deber llevar a cabo medidas preventivas para no agravar los posibles
sntomas. Se tiene un 25% de probabilidad de que el individuo sea homocigoto silvestre y
no presente la enfermedad o ninguno de sus sntomas, y el otro 25% de probabilidad
corresponde a un individuo homocigoto mutante, de forma que ambos alelos tendrn la
mutacin y por lo tanto la enfermedad se manifestar.
A pesar de la eficacia de un diagnstico molecular, no se puede afirmar con
completa seguridad que la anemia falciforme se presentar en todos los casos en los
cuales se tenga el alelo mutante para la enfermedad, ya que representa un padecimiento
multifactorial que se puede aliviar o agravar dependiendo del contexto de desarrollo y los
hbitos de salud del paciente afectado.

Enfoque con Southern Blot (SB)

Otra forma de realizar el diagnstico de la anemia falciforme es el uso de enzimas de
restriccin y el SB. Para lograrlo, se usan primero enzimas de restriccin cuyo sitio diana
es el sitio de mutacin (por ejemplo, MstII). A los costados de dicho sitio de corte, se

encuentra uno ro arriba a 1.2 kb y otro ro abajo a 2 kb, por lo que el corte del fragmento
total (1.4 kb), producir 2 fragmentos de 1.2 kb y 2 kb. No obstante, una vez que se
realiza la digestin, existirn miles de fragmentos producto de la digestin con MstII, por lo
que es necesario identificar aquellos de nuestro inters. Para esto, todos los fragmentos
digeridos son separados por tamao en un gel de agarosa tras realizar una electroforesis.
Posteriormente se transfiere el resultado a un filtro de nitrocelulosa. Finalmente, mediante
el uso de una sonda complementaria al fragmento de 1.2 kb, podemos detectar el
fragmento al que pertenece la sonda tras visualizarlo en rayos X (Fibla, 2006).
Obteniendo los siguientes resultados:

Figura 4.Posibles resultados del diagnstico de anemia falciforme mediante Southern Blot (Fibla,
2006).

Como se observa, en la Figura 4, hay 3 posibles resultados, los cuales son descritos a
continuacin:
1. Normal: La primera columna corresponde a un paciente sin mutacin en sus 2 alelos, por
lo que la sonda se uni al fragmento de 1.2 kb, ya que s se realiz el corte de restriccin
por MstII.
2.

Portador: La segunda columna corresponde a un paciente portador, es decir, que la

mutacin slo ocurre en uno de sus alelos por lo que observamos que la sonda se uni a
ambos fragmentos (1.2 y 1.4 kb) ya que la enzima de restriccin slo cort en el alelo
salvaje.

3. Afectado: La tercera columna corresponde a un paciente afectado, ya que la sonda se

uni slo al fragmento de 1.4 kb por lo que no se present corte con enzima de restriccin
ya que sta no reconoci el sito, debido a que hay una mutacin.

PCR en tiempo real con taqman

Una tercera alternativa para detectar esta
mutacin es usando PCR en tiempo real con
sondas taqman, como se observa en la Figura
5. El polimorfismo en un solo nucletido se
detecta con dos sondas especficas. A bajas
temperaturas, se hibrida la mutacin y a veces
se

puede

generar

un

mismatch

(A).

Al

incrementar la temperatura slo las sondas que

son totalmente complementarias se hibridan en
sus sitios respectivos (B). En la elongacin, las
sondas se degradan por la polimerasa con lo
que se libera el reportero y el quencher. La otra sonda
permanece intacta, por lo que el reportero y el quencher se

Figura 5. Deteccin de mutaciones

con sonda taqman.

encuentran cercanos (C). Al excitar al reportero con una luz a su respectiva longitud de
onda, se puede medir la emisin del reportero libre. Por otro lado, la emisin del reportero
que no se ha liberado se trasmite va FRET al quencher adyacente y no se detectar la
seal. Esta deteccin se repite despus de cada ciclo y como resultado la intensidad del
reportero libre muestra un crecimiento exponencial por unidad de tiempo (D).

Conclusin
En breve, el diagnstico molecular es una herramienta de gran utilidad para el tratamiento
de enfermedades genticas, tal es el caso de la anemia falciforme. Existen mltiples
formas de abordar el problema, como el uso de polimorfismos de longitud de fragmentos
de restriccin, el cual se describi en este trabajo. No obstante, las posibilidades dentro
de este campo son tantas y van desde las ms simples hasta las ms complejas, (como el
uso de sondas Taqman). Todo depende del enfoque que se le quiera dar al problema y
los recursos disponibles.

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