UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA
LABORATORIO DE INGENIERA DE LAS FERMENTACIONES

Profesor:

Ing. Cecilia Carpio

Prctica # 5

Ayudante: Ing. Juan Pablo Peafiel

Semestre: Sptimo Bioqumica

Fecha: (01/08/2014)

CRECIMIENTO DE S. cereviciae EN SISTEMA POR LOTE ALIMENTADO

INTRODUCCIN

Una decisin importante a tomar cuando se desarrolla un bioproceso est relacionada con la seleccin
de la configuracin que debe tener el sistema de reaccin. La seleccin del reactor y de la estrategia de
operacin determina la concentracin del producto, el grado de conversin, rendimiento, etc.
Los microorganismos crecen en diferentes sistemas de cultivo: cultivo discontinuo o batch, cultivo
continuo y cultivo por lote alimentado o fed-batch. El trmino de cultivo fed-batch se utiliza para describir
un cultivo por lote al cual se aade, ya sea de forma continua o semicontinua, medio fresco, sin la
eliminacin del cultivo crecido, lo cual generalmente implica un aumento de volumen del cultivo. En los
procesos por lote alimentado, la velocidad de alimentacin puede ser cambiada durante la operacin de
acuerdo a un patrn predeterminado, por ejemplo la alimentacin puede ser constante incrementada
exponencialmente.
En el presente trabajo prctico se estudiar el comportamiento de una fermentacin por lote alimentado
de S.crerevisiae en relacin a la produccin de biomasa y al consumo de sustrato.
OBJETIVOS

1. Estudiar el comportamiento de una fermentacin por lote alimentado en relacin a la sntesis de

biomasa y consumo de sustrato.

2. Contrastar los resultados obtenidos con lo esperado segn la teora para el volumen de cultivo y X.
MATERIALES Y REACTIVOS
Medio: YEPD/l

Materiales

Medio lquido
Extracto de levadura, 10 g
Peptona, 20 g
Dextrosa, 20 g
Agua destilada
Otros materiales
Cultivo de levadura (caja petri o en medio
lquido).
Etanol al 70%

Medidor de pH o papel para medir pH

Pipetas estriles de 1 ml y 10 ml
Asa metlica
Mechero bunsen
Estufa para secado a 60-80C
Erlenmeyer o frascos de tapa rosca de 125,
500 y 1000 ml
Equipo de venoclisis.
Plancha de agitacin
Agitador magntico
Centrfuga
Tubos para centrfuga
Espectrofotmetro/Colormetro
Celdas de metacrilato

Tapones de caucho
Fermentador
Frasco estril (reservorio de sustrato)
Cronmetro.

4. PROCEDIMIENTO
4.1 Preparacin del medio YEPD
a) Medio lquido (1200 ml):
Disolver los componentes del medio en agua caliente, enfriar y regular el pH del medio con HCl 1M hasta
un valor final de 5.4. Separar una porcin de 30 ml para preparar el inculo, y otra de 120 ml para iniciar
el cultivo en sistema por lote. La cantidad restante para el tanque de alimentacin al fermentador.
Esterilizar en un autoclave por 20 minutos a 15 libras de presin.
Condiciones de cultivo
Temperatura de crecimiento: 20C (T ambiente), pH 5.4, velocidad de agitacin alta (agitador
magntico), velocidad de alimentacin para el sistema por lote alimentado: 0,5 ml/min.
4.2 Obtencin del inculo
Con un asa estril tomar una porcin de clulas de levadura (obtenida en prcticas anteriores) e inocular
30 ml del medio de cultivo estril. Tapar con papel aluminio, e incubarlo a T ambiente (aproximadamente
20C) desde las 10:00 a las 18:00 con agitacin mediante una plancha de agitacin magntica (para
airearlo adecuadamente).
4.3 Crecimiento de la levadura en cultivo por lote alimentado

1a Etapa: el cultivo se inicia al inocular aspticamente el medio (120 ml) contenido en el fermentador
estril con 30 ml del cultivo preparado como se describe en 4.2. Inmediatamente accionar el cronmetro
y el agitador; extraer 2 muestras de 10 ml para la determinacin de X0 (tiempo cero): por centrifugacin y
posterior secado. Extraer tambin las alcuotas correspondientes a 14 h de crecimiento de la levadura en
sistema por lote.
2a Etapa: una vez que han transcurrido 14 horas de crecimiento en sistema por lote, iniciar la
alimentacin al reactor, a un flujo de 0.5 ml/min hasta completar las 24 horas de cultivo (Figura). Durante
el proceso, extaer las muestras correspondientes (10 ml) cada 2 hs en tubos de centrfuga tarados.

Registrar el peso del fermentador antes de tomar las muestras. Al final del proceso por lote extraer 2
muestras la una para cuantificar X0.
4.4 Determinacin de la biomasa
Centrifugacin: colocar las alcuotas de 10 ml en tubos de centrfuga tarados y pesar. Calentarlos a
ebullicin por 5 min. A continuacin enfriar los tubos con su contenido a 4C y centrifugar a 5950 rpm
(OJO: si no se puede centrifugar inmediatamente, colocar las muestras en el congelador hasta su
utilizacin). Separar el sobrenadante y mantenerlo en congelacin hasta la determinacin del
contenido de azcares reductores; lavar el precipitado resuspendindolo con 4 ml de agua destilada
y volver a centrifugar. Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado a 60-80C hasta peso
constante (aproximadamente 60 h). Registrar los pesos.
Determinacin del consumo de sustrato: Diluir los sobrenadantes (obtenidos como se indica en
4.3) de las muestras tomadas a los tiempos especificados y determinar el contenido de azcares
reductores con solucin de DNS.
Cuantificacin de azcares reductores
a) Preparacin de la solucin de DNS (100 ml): disolver 1 g de DNS (slido) en 40 ml de agua destilada
con ayuda de un agitador magntico. Aadir 20 ml de solucin de NaOH 2M. A continuacin agregar
lentamente 30 g de tartrato de sodio y potasio. Agitar hasta que se disuelva. Si es necesario (cuando
se forma un precipitado) agregar ms agua destilada y calentar ligeramente. Finalmente aforar la
solucin a 100 ml.
b) Determinacin del contenido de azcares reductores: colocar 0.6 ml de los sobrenadantes (diluidos
si es necesario) en tubos de vidrio resistentes al calor, aadir 0,6 ml de solucin de DNS y mezclar
bien. Hervir la mezcla por 5 minutos exactos en un bao mara a ebullicin, transcurrido este tiempo,
enfriarlos en un bao de agua fra. Diluir la solucin con 6 ml de agua destilada, agitar bien y leer la
absorbancia a 540 nm.
Clculos
Curva estndar de glucosa: el factor de dilucin se obtiene a partir de la relacin entre el peso total
(Glc+H20) y el peso de cada alcuota de glucosa. Para determinar la concentracin de glucosa de cada
estndar, dividir la concentracin de la solucin madre para cada factor de dilucin. Con estos valores y
las absorbancias respectivas construir la curva estndar Absorbancia vs concentracin y determinar la
ecuacin que la describe la cual permitir la cuantificacin de la concentracin de glucosa en las
muestras de sobrenadante.
Crecimiento Celular: Determinar el peso seco de la levadura y comparar con los valores obtenidos a
partir de la ecuacin 1 (Ec. 1).
Clculo de los valores de S0 y S en cultivo por lote: A partir de los datos de absorbancia determinar S0 y
S al inicio y al final del sistema por lote y durante la operacin en modalidad lote alimentado.
Clculo del rendimiento celular (YX/S): Utilizar la relacin apropiada para la cuantificacin del rendimiento
de X en funcin del sustrato (S) consumido.
Estimar el valor de Xmx con la expresin:
Xmx = YX/S S0

5. RESULTADOS Y DISCUSIN

Elaborar tablas: a) con los valores de concentracin de glucosa en los sobrenadantes y b) con los
valores del peso seco de la levadura.

Establecer si se produce aumento de la poblacin celular con el flujo de alimentacin seleccionado,

durante el cultivo por lote alimentado. Determinar la cantidad total de clulas y la concentracin
celular con la ecuacin correspondiente y establecer la similitud entre los valores terico y
experimental.

M
Xt X0t FYX/S
S0 t

Ec. 1

Calcular a partir de la ecuacin 1 el valor de YX/SM con los valores de Xt y t.

Estimar el volumen terico y contrastarlo con el valor experimental.

PRESENTAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN FORMA DE ARTCULO.
REFERENCIAS

[1]
[2]
[3]
[4]

MILLER, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.
Analytical Chemistry. 31 (3): 426 428.
Becker, J.M., Caldwell, G.A. and Zachgo, E.A. Biotecnologa: Curso de prcticas de
laboratorio. Editorial Acribia, S.A., Zaragoza, Espaa, pp. 23-27; 203-204.
NIELSEN, J. 2001. Microbial Process kinetics. In: Basic Biotechnology. C. Ratledge and B.
Kristiansen. eds. 2nd Edition. Cambridge University Press. Cambridge. pp. 127-135.
https://www.ucursos.cl/ingenieria/2007/1/BT52A/1/material_docente/previsualizar?id_material=131549. Fedbatch techniques in microbial processes Tsuneo Yaman and Shoichi Shimizu. Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology, 1984, Volume 30/1984, 147-194, DOI:
10.1007/BFb0006382.