PRACTICA No.

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FIJACIN, TINCION Y MONTAJE DE ESPECIMENES.
A. OBJETIVOS ESPECIFICOS

B.-

a.1.-

El alumno ser capaz de fijar, teir y montar parsitos con el objeto de realizar la observacin
ms tcnica y conservarlos de manera permanente.

a.2.-

Obtener preparados estables en su conservacin, para destinarlos a la formacin de la

coleccin del laboratorio de parasitologa, coma material didctico; as como material para
intercambio acadmica con otras escuela y universidades.

MATERIAL Y EQUIPO A UTILIZAR.

b.1.- Microscopio compuesto.
b.2.- Estufa bacteriolgica.
b.3.- Cajas de petri.
b.4.- Matraces, botes y varillas de vidrio.
b.5.- Porta objeto y cubre objetos.
b.6.- Mechero de gas o de alcohol.
b.7.- Formol al 10%.
b.8.- Solucin salina fisiolgica.
b.9.- Alcoholes de 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 96
b.10.- Glicerina.
b.11.- Alcohol ter.
b.12.- Alcohol acidificado (HCl).
b.13.- Papel filtro, etiquetas de papel engomado y clips.
b.11.- Blsamo de Canad
b.15.- Media de Berlese.
b.16.- Tincin de Haemalurnbre de Mayer.
b.17.- Xilol-fenicado-creosato.
b.18.- Carbonato de Litio.
b.19.- Tincin Tricrmica de Gmori.
b.20.- Fijador de Bouin o de Faurel.
b.21.- Parsitos colectados.

C.- PROCEDIMIENT0S.

c.1.- Montaje de tremtodos, cstodos, nemtodos.

Conservacin para observaciones macroscpica. Previo lavado de agua corriente y enjuagado con solucin
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fisiolgica formulada al 5 %, dentro de un frasco de boca ancha y con tapa esmerilada. Tambin pueden
conservarse sumergidos en alcohol de 70 (ver figura No. 3.1). Para facilitar la observacin macroscpica, los
grandes cestodos y nemtodos, se mantendrn enrollados sobre varillas, cilindros o lminas de vidrio color
Azul o negro, que por contraste permiten observar contornos, poros, genitales, etc. Los pequeos trematodos
debern conservarse en glicerina al 50% entre portaobjeto y cubre objetos, pegados con blsamo de canad.
Figura No. 3.1 Conservacin de parsitos en alcohol al 70% o formol al 10%

Fijacin de trematodos y cestodos para montaje a usar en el microscopio. La mayora de los trematodos y
cestodos son muy musculosos y reaccionan a los fijadores por contracciones y enrollamiento, a menos que
sean relajados o sostenidos por medios fsicos. El parsito recin colectado y lavado con S.S.F. se coloca
entre dos porta-objetos o placas de vidrio, dependiendo del tamao del parsito y se sostienen los portaobjetos con ligas de hule o clips, dando una ligera presin, de manera que el ejemplar quede extendido
completamente ( ver figura No. 3.2).
Se introduce en un fijador durante 24 hr (formol al 10% o fijador de Bouin), al cabo del cual sacar los
portaobjetos del fijador, se retiran los clips y se separan con agujas de diseccin, procurando que el parsito
queda adherido a una sola lmina para no romperlo. Luego se prepara utilizando pinceles del No. 2
humedecidos con agua. Los ejemplares pueden ser conservados por tiempo indefinido en el fijador o si se
desea, se pueden montar en placas de vidrio de tamao apropiado, de tal manera de que queden en frascos
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de boca ancha, El espcimen se fija al vidrio por medio de grenetina caliente, posteriormente de la
coagulacin se introduce en el frasco con el fijador. Si se desean teir para destacar sus estructuras internas,
se deben seguir las tcnicas de Haemalumbre de Mayer para tremtodos y la tcnica de Tricrmica de
Gmori para cestodos.
Figura No. 3.2 Montaje de parsitos. A.- Etiquetas. B.- Ejemplo de etiqueta. C.- Montaje en laminilla.
D.- Estilete o aguja de disecciones. E.- Atado de laminilla. F.- Montaje con soportes. G.- Montaje de
una tenia. H.- Doblado de un acantocfalo para montaje.

Tcnica de tincin con Haemalumbre de Mayer (para trematodos).

Despus de haber fijado el espcimen con formol al 10% corno se indic anteriormente, lavar con agua
corriente 5 a 10 minutos. Colocar un crculo de papel filtro en el fondo de una caja de petri. Colocar el
espcimen sobre el papel filtro.
Cubrir totalmente con el colorante los parsitos y dejar que acte durante 24-48 hr (dejar la caja de petri
tapada). Decantar el colorante, filtrarlo para su posterior uso. Lavar los especimenes varias veces con agua,
hasta que este quede claro. Iniciar la deshidratacin con la serie alcohlica mediante pases sucesivos en
alcohol de 40, 50, 60 y 70. Decolorar con alcohol cido (alcohol etlico al 70% con 5% de cido clorhdrico),
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unos minutos hasta obtener la coloracin deseada. Lavar varias veces con alcohol al 70% para quitar todas
los residuos de cido. Continuar la deshidratacin con alcohol al 80, 90 , 96 y absoluto en cada pase 12 - 24
Hrs. como mnimo. Aclarar los especimenes con Xilofenicadocreosotado (ms o menos 20 minutos). Montar
entre portaobjetos y cubreobjetos con una pequea cantidad de blsamo de canad. Hacer presin con un
clip, adaptado coma pinza (vase figura No. 3.3). Dejar en la estufa para su secado o a temperatura
ambiente, limpiar y etiquetar.

Figura No. 3.3 Fijacin entre laminillas de un parsito

Tcnica de Tricrmica de Gmori (para cstodos).

Aplanar el parsito limpio y vivo, colocndolo entre dos portaobjetos o placas de vidrio, sujetndolo con ligas o
hilaza (ver figura No. 3.2 E). Para que el ejemplar no se salga por capilaridad, se debe colocar seco entre las
laminillas de vidrio. Para fijar se colocan los portaobjetos con el parsito en una caja de petri o en un frasco
de boca ancha y se cubre totalmente con el fijador de Bouin (o formol al 10% durante 24 Hrs.), conservarse
cerrados. Se sacan los portaobjetos del fijador y se separan con agujas de diseccin, procurando que el
parsito quede adherido a un solo portaobjetos para no romperlo, para ello se separa de ste utilizando
pinceles del No. 2 humedecidos con agua. Se quita el exceso del fijador con agua destilada, haciendo varios
cambios (5), de 5 minutos cada uno, en cajas de petri, y si el parsito queda amarillo se debe poner en una
solucin acuosa de carbonato de Litio al 30%, hasta que desaparezca el color amarillo, esto puede tardar
varias horas. Lavar con agua destilada el parsito (2 cambios) una vez que ha quedado blanco. Deshidratar
con alcoholes sucesivos de concentracin ascendente, desde 30, 50, 70, 96 y absoluto (12 a 24 Hrs. en cada
paso). Teir con tricrmica de Gmori, una gota de solucin madre por 2 c.c. de alcohol de 96% durante 3 a 5
Hrs. Quitar el exceso de colorante mediante alcohol acidulado al 2% (HCl.), hasta que los bordes estn
blancos, esto ltimo es muy necesario. Se lava el alcohol acidulado con alcohol del 96%, dos cambios de
cinco minutos. Para terminar de deshidratar, se introduce la preparacin en alcohol absoluto. Aclarar con
Xilolfenicadocreosotado. Montar en blsamo de canad.

Montaje de Nematodos.
Los gusanos colectados deben colocarse en recipiente con suero fisiolgico, lavarse varias veces y antes de
24 Hrs. fijarse v colocarse en una solucin conservadora. La fijacin se lleva a cabo colocando a los gusanos
vivos y limpios en alcohol etlico al 70% caliente (6070C). Cuando el material se encuentra muerto se
puede fijar en alcohol 70% o en formol al 5 o 10 % o bien en solucin Barbagayo. El aclarado se hace
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colocando a los ejemplares fijados en una caja de petri o en un vidrio de reloj, luego se cubren con lactofenol,
glicerina o

creosota. Para preparaciones rpidas, pueden montarse en grenetina, en Faur o bien en

Berlese; estas preparaciones duran algunos meses. Para preparaciones permanentes se puede seguir la
tcnica de Hemalumbre de Mayer.
c.2.- Montaje de huevecillos.
Debern utilizarse los de reciente emisin y previa identificacin montndose luego. Los huevos de tenia
podrn obtenerse presionando un progltido maduro, sobre un portaobjeto, en el sentido de uno de los
orificios genitales, recogindolos con un asa, extendindolos sobre el portaobjeto para examinarlos al
microscopio. La conservacin puede efectuarse en tubos de ensaye o en preparaciones microscpicas entre
porta y cubreobjetos. En el primer caso, colocar el sedimento o el sobrenadante, segn el mtodo empleado,
en un tubo conteniendo solucin de formol al 5% en solucin

fisiolgica, glicerinada al 10%. Para la

conservacin mediante preparados microscpicos, se colocar una gota del material fijado, previamente
identificado sobre un portaobjeto limpio, desengrasado con alcoholter, agregar una gota de lanolina
fundida, emulsionar y colocar inmediatamente encima un cubreobjeto limpio y seco, pegndolos con blsamo
de canad.

Mtodo de Loose.- Diluir material que contenga huevos en agua corriente, filtrar a travs de un colador de
alambre de malla fina, fijar en alcohol de 70 glicerinado al 5%, calentar a 70C, enfriar y agregar alcohol
glicerinado fresco, evaporar a la estufa de cultivos y montar en glicerina gelatinada. El material que se destine
a colecciones no deber obtenerse por mtodos de enriquecimiento que contengan soluciones saturadas de
sales o azcares ya que los cristales que forman estas sustancias, alteran la morfologa de los huevos.
c.3.- Fijacin, tincin y montaje de Artrpodos.
Fijacin.- El mtodo ms simple consiste en cubrir el artrpodo vivo a muerto por anestesia a una mezcla da
alcoholter, con una gota grande de cloral o Faur, cuya frmula es la siguiente:
Agua destilada........................................50 cc.
Cloral hidratado......................................50 gr.
Goma arbiga.........................................30 gr.
Glicerina..................................................20 cc.
Se recubre con una laminilla v se deja secar. Hay que lavar con agua las objetos y no ponerlas directamente
con alcohol.
Tincin.- Algunas veces es til hacerlo para teir artrpodos con tegumento incoloro, se emplea carmn
Haemalumbre o mejor an cido Piroglico, segn el de Racovitza: 30 minutos en la solucin al 1% de cido
Piroglico en agua destilada o alcohol del 70%, glicerina y se les deja que viren con la luz durante algunas
horas, se pueden montar con la glicerina simple o con grenetina o blsamo, pero el medio no debe ser cido.
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Linguatlidos. Las ninfas o paracfalos se deben fijar mediante el alcohol caliente, luego se montan entre
porta y cubreobjetos, previa evaporacin del alcohol, pegndolos con blsamo de canad.
caros de sarna. El material que puede contenerlos (pelos, costras secrecin sebcea, etc). Se colocar
sobre un portaobjeto, se agrega una gota de lega de sodio o de potasio al 10% dejndola actuar en fro
durante unos minutos. Si el material no se desintegrara lo suficiente para permitir la observacin del parsito,
se calienta suavemente sobre la llama del mechero hasta desprendimiento de vapores o la formacin de
burbujas. La clarificacin del material en la forma expresada deber verificarse bajo observacin
microscpica. Para montaje deber eliminarse la leja, mediante el lactofenol de Amman, colocando blsamo
de canad cerrando con un cubreobjeto.
Garrapatas. Muertas por el alcohol de 95% se dejan evaporar y se montan con blsamo de canad , entre
porta y cubreobjetos, debiendo disecarse previamente eliminando los rganos internos y la sangre ingerida.
Se separa la regin ventral de la dorsal y se montan separadamente.
Piojos.- Mtodo de Berlese, modificado por Borges Ferreira, cuyo medio es:
cido actico glacial .......................................................3 ml.
Hidrato de cloral .............................................................74 gr.
Colofonia pulverizada ......................................................8 gr.
Solucin de glucosa al 98% ........................................... 5 ml.
Agua destilada ..............................................................10 ml.
Mezclar en fro el agua destilada, el cido actico y el hidrato de cloral, se agitan varias veces hasta la
dilucin completa, agregar los otros componentes; agitar nuevamente la mezcla, colocar en autoclave,
calentando a 60C durante una hora. Colocar el parsito previamente pasado por los alcoholes, dejar
evaporar, agregar una a dos gotas del medio descrito, colocar el cubreobjeto y mantener en posicin
horizontal hasta que el material se haya endurecido. El reemplazo de la goma arbiga del mtodo original por
colofonia, proporciona un preparado mas compacto que al cabo de tres horas del montaje se vuelve ntido.
D.- EJERCICIOS
d.1 El alumno realizar el montaje y tincin de los parsitos recolectados en el campo, observando los
especimenes al microscopio e identificndolos.

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