Facult des Sciences - Rabat

Filire SVI - S6
Module de Gntique et Biologie Molculaire M21
Elment 2: Biologie Molculaire Pr. Bouchra BELKADI

Partie 1:
Biologie Molculaire Microbienne

Anne universitaire 2009 - 2010

Pr. Bouchra BELKADI

Biologie Molculaire?
Etude des gnes portant linformation
gntique et leurs transformations
* les macromolcules
* les complexes macromolculaires de lADN,
lARN et des protines
* la rplication, la transcription, la traduction

Comment a-t-on pu procder ces tudes?

Grce la technologie de lADN recombin ou gnie gntique, qui permet:

de prlever un fragment spcifique dADN

de manipuler ce fragment dans un tube essai

de le remettre dans un organisme (le mme ou un autre)

Production de fragments dADN

Liaison de ces fragments un support molculaire

(= vecteur)
Introduction du vecteur dans une cellule hte
pour en faire de multiples copies (= pour
lamplifier)
Slection du fragment que lon veut tudier

Ex. de dcouvertes ralises grce aux bactries:

- Recombinaison intragnique;
- Rplication de lADN;

- Code gntique;
- La rgulation (opron);
- Les enzymes de Biologie Molculaire: Enzymes
de restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN),
Polymrases thermostables (PCR), etc..

Quelles sont les consquences du

dveloppement de la biologie molculaire?
des connaissances dans le domaine fondamental
des applications pratiques:
-production de protines dintrt mdical
-vaccins
-diagnostic en mdecine
-plantes et animaux transgniques

I- Introduction
Les 3 domaines du vivant

Plantes

Cyanobacteria
Gram positif

Fungi

Animaux

Proteobacteria

Sulfolobus
Mthanognes

Archaea

Halophiles

Les 3 domaines du vivant

PROCARYOTE

EUCARYOTE

Procaryotes ou Bactries
Deux grands groupes, les eubactries et les
archaebactries avec des fonctionnements diffrents
au niveau molculaire mais une organisation similaire

Structure:
Petite taille gnralement (avec des exceptions)
Leur structure est trs simple, le plus souvent
sans cytosquelette ni rseau de membrane interne
Prsence d'une paroi complexe
Dans le cytoplasme, il y a prsence des ribosomes et
d'une masse "plus claire", le nuclode qui contient l'ADN
sous forme dun ou quelques chromosomes ( svt circulaire)

Procaryotes ou Bactries
Division binaire:
Par scissiparit (fission binaire): 1 cellule donne par
division 2 cellules filles gntiquement identiques (notion
de clone)
Pas d'individualisation de chromosomes visibles en
cytologie aucun moment de leur cycle de vie
Multiplication exponentielle:
Xn = 2n X0
X0 : nombre de cellules au dpart

Xn: nombre de cellules obtenues un temps donn

n: nombre de divisions ou de gnrations

 Temps de Gnration : 20 min (E.coli) dans des

conditions optimales quelques heures
Taux de croissance : 2 divisions / h ou moins
Echange gntique se fait par transferts horizontaux
(transformation, conjugaison, transduction)
0 min
cellule mre
18 heures
de croissance

109 bactries/ ml

20-30 min

2 cellules filles
identiques

Trs diversifies et prsentes dans TOUS

les milieux et Biotopes
Adaptation rapide diverses conditions et
divers environnements
Des plus dangereuses (pathognes) au plus
utiles et exploitables: Biotechnologies

Deinococcus radiodurans

Les lments gntiques dans une cellule

1- Le chromosome porte les gnes essentiels la
croissance
2- Les lments gntiques non chromosomiques,
principaux processus dvolution rapide des bactries
- Les plasmides
- Les transposons
Recombinaison gntique: change physique de gnes
entre les lments gntiques (chromosome, plasmide..)
(Recombinaison homologue : change rciproque entre
une paire de squence homologue dADN entre cellule
donneuse et receveuse)

Trois principaux mcanismes dchange gntique

chez les bactries

1- Transformation
Bactrie + ADN libre

2- Conjugaison
Bactrie + bactrie
3- Transduction
Bactrie + bactriophage

Bactrie
rceptrice

Exemple de dcouvertes ralises grce aux

bactries:
Recombinaison intragnique;
Rplication de lADN;
mRNA;
Code gntique;
La rgulation (opron);
Les enzymes de Biologie Molculaire : Enzymes de
restriction, Ligases, Polymrases (ADN et ARN),
Polymrases thermostables (PCR), etc..

Objectifs :
- Dfinir un plasmide ?
- Prciser les proprits biologiques codes par les
plasmides ?
- Les consquences mdicales de ce type de
transfert ?
- dfinir la transposition et le transposon ?

A- Les Plasmides
I- Introduction
Dfinition
Caractristiques gnrales
Structure et organisation
II- Mthodes dtude: extraction, purification et curage
des plasmides (TD)
III- Proprits des plasmides
IV- Diffrents types de plasmides et rles biologiques

B- Les transposons

A- Les Plasmides

A- Les Plasmides
I- Introduction
Chromosome
bactrien circulaire
4millions pb

Plasmides
Milliers pb

Bactrie
En gnral circulaire, le nombre de copies par cellule
peut varier de 1 quelques centaines.

1- Dfinition:
Molcules dADN double brin libres le plus
souvent circulaire, localisation extrachromosomique, capacit de rplication
autonome et procure un avantage slectif.

2- Caractristiques gnrales:
Ils possdent plusieurs proprits confrant aux
bactries une meilleure adaptation lenvironnement.
Ils sont porteurs de gnes non essentiels mais
utiles et donc non indispensables au mtabolisme
normal de la cellule hte.
Leur transmission naturelle au cours des divisions
cellulaires est stable et se fait habituellement par
conjugaison.

3- Structure et organisation:
Prsents chez la plupart des espces bactriennes:
Tailles trs variables entre 1Kb 1 mgabase

(gnralement infrieures 5% de celle du chromosome)

ADN double brin Superhlicale avec 3 formes:

Diffrentes formes des plasmides

Forme I: CCC: Circular
Covalently Closed
(circulaire, covalemment
ferm)
Forme II: OC: Open
Circular ( circulaire relch,
un des 2 brins coup)
Forme III: Linaire
(2 brins coups)

II- Mthodes d'tudes des

plasmides : TD

III- Proprits des plasmides:

Les plasmides sont des associations modulaires de gnes
regroups en units fonctionnelles.
Ils comportent une zone obligatoire de rplication:
Rplicon.
Rplication du plasmide indpendante de celle du
chromosome

Petit nombre de copies/

cellule (1 3) = Plasmide
Stringent / Rplication
stringente.
Grand nombre de copies/
cellule (20 2000) =
Plasmide relch /
Rplication relche

III- Proprits des plasmides:

Ils peuvent comporter aussi:
Une rgion de transfert (opron tra) chez les plasmides
conjugatifs codant pour: pili et protines de conjugaison
Des lments gntiques mobiles ou non (IS, Tn, Int)
Gnes divers (rsistance aux antibiotiques, etc)

1: Gne codant la rsistance un antibiotique

2: Gnes de transfert (Tra)
3: Origine de rplication
Schma d'un plasmide

IV- Type de plasmides et rles biologiques

Plasmides cryptiques: aucun rle connu
Les plasmides peuvent coder pour diverses fonctions
Quelques plasmides clbres:
Facteur R: Plasmides de rsistance aux
antibiotiques et aux mtaux lourds (conjugatifs le plus
souvent)
Facteur F: (fertilit) Prototype du gros plasmide
conjugatif petit nombre de copies, capacit de
synthse de Pili sexuels chez la bactrie dite F+ ou Hfr
par rapport F- (absent de la cellule)
pBR322: Vecteur de clonage trs utilis aux
premier temps du clonage et du gnie gntique

V- Gnes codant diffrentes fonctions

1- Les gnes impliqus dans la rplication
2- Les gnes de transfert: Plasmides conjugatifs
3- Les gnes confrant des proprits
supplmentaires la cellule hte

V 1- Les gnes impliqus dans la rplication :

La fonction ori : cest lorigine de la rplication (initiation), elle
est responsable du contrle du nombre de copies d'un mme
plasmide prsent dans une bactrie.
Ce systme de rgulation est lorigine
du phnomne dincompatibilit
Des plasmides incompatibles ne peuvent coexister dans la
mme cellule, car leur rplication est soumise au mme
systme de rgulation donc
>>> ils sont fortement apparents structuralement do
prsence de fortes homologies ADN/ADN
Ces plasmides sont ainsi classs en groupe
dincompatibilit ou groupe Inc.

V 2- Les gnes de transfert, Plasmides

conjugatifs:
Un plasmide conjugatif est autotransfrable
dune bactrie mle une autre femelle par
conjugaison.
Sa taille est suprieure 30 kb, chez
Escherichia coli 90 kb , dont 30 50 kb pour les
gnes ncessaires au transfert conjugatif.
Ces plasmides sont en faible nombre de copies
de 1 3 par cellule.

Principaux lments des

plasmides conjugatifs
Lopron tra code pour
les pili sexuels et pour
les protines
ncessaires la
conjugaison.

Rle trs important dans la dissmination de

linformation gntique et particulirement
des gnes de rsistance aux antibiotiques.

Transferts d'ADN par conjugaison

Le transfert entre les organismes donneur et accepteur de plasmide
se fait en 4 grandes tapes:

1- Reconnaissance entre donneur (F+)

et accepteur (F-) grce la synthse du
pili (tube creux)
2- Transfert d'un des deux brins du
plasmide
3- Synthse du brin complmentaire
chez l'accepteur
4- Re circulisation du plasmide chez
l'accepteur

Conjugaison
F+ X F- 2 F+

Bactrie Hfr (Haute frquence de recombinaison)

Grace la prsence des squences IS (Insertion
squences), le facteur F peut sintgrer dans le chromosome
dune bactrie F+, appels pisomes, donc leur rplication
est sous le contrle du chromosome.
IS

Bactrie F+

Bactrie Hfr

En effet, les squences IS du plasmide F ont des

squences homologues sur le chromosome. Linsertion se
fait par recombinaison site spcifique.

Conjugaison entre bactrie

Hfr et bactrie F-

Dans ce cas le plasmide peut mobiliser le transfert de lADN

chromosomique dune cellule vers une autre et tre incorpor dans le
chromosome par recombinaison entre les rgions homologues.

Plasmides conjugatifs: Diffusion plasmidique au sein

de la mme espce ou entre divers groupes
Escherichia

Serratia

Salmonella

Klesbsiella

Proteus

Enterobacter

Pseudomonas Acinetobacter

Transfrables dans une large gamme dhtes

- intra spcifique
- intra gnrique
- inter gnrique (phylogntiquement diffrentes)

Notions importantes retenir sur

le transfert conjugatif du plasmide
Contact direct entre les cellules est indispensable
Transfert est orient
- Commence toujours en un point fixe (OriT)
- Unidirectionnel: du donneur vers le receveur
Transfert accompagn par la rplication de lADN
transfr
Suite au transfert
- Le donneur garde sa copie du F
- Le receveur est transform en mle car il
porte une nouvelle copie du F
Aucun transfert des gnes chromosomiques par le biais
du plasmide F libre

Plasmide conjugatif

Transfert

Plasmide non conjugatif

Pas de transfert

Plasmides non conjugatifs

Ne sont pas autotransfrables.
Taille plus petite de 1 70 kb, souvent cryptiques, et en grand nombre
de copies ( > 10), du fait d'un contrle relch de leur rplication.
Transfrs une autre bactrie par deux autres mcanismes de
transfert : la transduction et mobilisation grce la prsence d'un
plasmide "mobilisateur".

V 3- Gnes confrant des proprits

supplmentaires la cellule hte
3a- Les gnes mtaboliques spciales
Gnes non indispensables la vie de la bactrie qui
peuvent tre une cause derreur pour lidentification des
souches.
Grand intrt sur le plan biotechnologique:
dgradation des produits chimiques (polluants toxiques).

Les gnes mtaboliques codent pour la synthse de

protines permettant lutilisation de nutriments
- chez E. coli, gnes dutilisation du citrate comme
source de carbone, production de soufre, hydrolyse de lure
- chez les Salmonelles, gnes de dgradation du lactose

3b- Les gnes de rsistance

Les gnes de rsistance peuvent tre ports par des
plasmides (svt conjugatif), des transposons ou des phages
Ce sont des plasmides de grande taille (> 200 kb).
Ils confrent une rsistance aux antibiotiques et
dautres inhibiteurs de croissance

Les plasmides R:
Rle de protection de la cellule
La synthse d'une protine de rsistance la substance
toxique: elle va neutraliser l'activit toxique de la
substance (en la dnaturant, hydrolysant, etc.)
La modification des proprits denveloppe de la cellule et
la rendre impermable la substance toxique (mtaux
lourds).

Plasmide R100 de 94,3Kpb

Fonction de
rplication

inc

Rsistance :
Ori V

mer
tra
sul
str
cat

Ori T

tet

- Sulfamides,
-Streptomycine,
-Spectinomycine,
-Acide fusidique,
-Chloramphnicol,
-Ttracycline
-Mercure
- Prsence de gnes Inc: Exclusion de
tout autre facteur R du mme type.

- Prsence dun facteur R empche le

maintien dun autre plasmide apparent.

-Autres facteurs R, portant des gnes de rsistance :

Kanamycine,
Pnicilline,
Ttracycline,
Nomycine
- Plusieurs gnes de rsistance ports par les facteurs R
sont des lments transposables, appels aussi
TRANSPOSONS Tn
Marqueurs de slection
Mutagnse dirige
Rem: Lmergence de bactries rsistantes plusieurs antibiotiques a une
importance mdicale >>>>> cest corrle avec laugmentation de lutilisation
des antibiotiques pour le traitements des maladies infectieuses.

Les mcanismes de rsistance

aux antibiotiques
1- Rsistance chromosomique:
- Observe chez des mutants (spontans ou artificiels)
-Elle est due :
- aux changements de la permabilit de la
bactrie lantibiotique
- la modification de la cible ou du site
daction de lantibiotique.

Exemple de mode daction: Streptomycine

Mode daction: Inhibition de la traduction par fixation
sur la petite sous unit du ribosome
Site de
fixation

Strepto

PROTEINE

RIBOSOME ACTIF

RIBOSOME INACTIF

Mode de rsistance: Modification du site de fixation de

lantibiotique
Site de fixation
modifi

Strepto
RIBOSOME ACTIF

PROTEINE
RIBOSOME ACTIF

2- Rsistance plasmidique:
Gnes codant la synthse de nouvelles enzymes qui
soit:
Inactivent lantibiotique
Empchent sa pntration dans la cellule
Ou le rejettent activement en dehors de la
bactrie
Selon divers mcanismes en fonction de la souche et
le type de plasmide

Les antibiotiques possdant les aminoglycosides:

- Streptomycine,
-Nomycine,
-Kanamycine
-Spectinomycine

Production denzymes modifiant

chimiquement ces antibiotiques
Adnylation
Phosphorylation
Actylation

Perte dactivit antibiotique

Adnylation
Phosphorylation
Actylation

Diffrents types d enzymes

Modifiant les aminosides
Phospho-transfrases(APH):
aminoside-OH+ATP ---> aminoside-O-H2PO3+ADP

Adnosyl-transfrases(AAC):
aminoside-OH + ATP ---> aminoside-O-adnosine + Ppi

Actyl-transfrases(AAC):
aminoside-NH2 + actyl-CoA ---> aminoside-NH-CO-CH3 + CoA-SH

Exemple: Streptomycine
Mode de rsistance plasmidique: Phosphorylation ou
Adnylylation de lantibiotique et pour certains cas
Actylation
Site de fixation

Strepto
modifie

RIBOSOME ACTIF

PROTEINE

RIBOSOME ACTIF

Les antibiotiques -lactamines :

Cas de la pnicilline

-lactamase
(Pnicillinase)

Les plasmides R code une enzyme la -lactamase

(Pnicillinase) qui coupe le cycle -lactame
inactivant ainsi lantibiotique

Chloramphnicol
La rsistance est due une
enzyme Chloramphnicolactyltransfrase (CAT)
code par le gne plasmidique cat

Actylation
en 2 tapes

Plusieurs plasmides confrent des

rsistances multiples aux antibiotiques

Un simple plasmide R peut contenir

plusieurs gnes diffrents codant chacun
une enzyme dinactivation dantibiotique
diffrente.

3c- Les gnes codant des toxines et

dautres facteurs de virulence
-La pathognicit des micro-organismes est lie des
mcanismes physiologiques et gntiques leur permettant
de coloniser les htes et de provoquer linfection.
-2 processus majeures impliqus dans la virulence des
pathognes:
lattachement et colonisation de tissus spcifiques
production de substances (toxines, enzymes et
autres)

Exemples:
1- les souches entropathognes de E. coli (intestin grle):
-Facteur de colonisation : protine code/plasmide =
Antigne K, capacit dattachement aux cellules pithliales
- leffet pathogne : production dau moins 2 toxines:
- lhmolysine (lyse les globules rouges)
- lentrotoxine (diarrhes= excrtion deau +sels)
2- les souches Staphylococcus aurus
- Coagulases
- hmolysines
- fibrinolysines
- entrotoxines

3d- Les plasmides de bactriocines

Les bactriocines, protines agissant sur des fonctions
vitales de la bactrie en les inhibant ou en les tuant.
Ces plasmides codent
-la synthse d'une premire protine extracellulaire dont
la biosynthse est ltale pour la bactrie productrice
ainsi que pour les autres bactries non-productrices
environnantes.
- une deuxime protine intracellulaire de rsistance
la premire toxine.

E. coli
Diffrentes catgories de bactriocines : colicines codes
par les plasmides col:
- formation de pores dans la membrane cellulaire
causant des fuites des ions potassium et de
protons >>> perte de la capacit produire de lnrgie
- le gne colE2 code une endonuclase
- le gne colE3, une ribonuclase qui inactive les
ribosomes.

bactries lactiques
Bactriocine Nisin A inhibant la croissance
dautres bactries

Applications en agro-alimentaire:
- Eliminer les bactries pathognes telles
que listeria monocythogenes
-Utilise comme conservateur

VI- Utilisation des plasmides

VI 1- Les plasmides sont utiliss comme vecteur de clonage
Intgration dun fragment dADN dans un plasmide
par recombinaison in vitro: P. recombin ou P. chimre.
L'ensemble des descendants d'une telle cellule
constitue un clone: Clonage dun fragment d'ADN
Intgration de gnes dorigines trs varies qui
permet le transfert de matriel gntique en
franchissant les barrires despces

VI 2- Les plasmides sont utiliss comme vecteur

d'expression

LADN clon dans un plasmide peut exprimer les gnes

qu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli
Transcription et
traduction du messager

Faire fabriquer E. coli des protines trangres

( l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine)

VI 3- Les plasmides sont utiliss comme vecteur

pour la transformation de cellules eucaryotes
Introduire et faire exprimer de l'ADN dans des cellules
eucaryotes
- levure, cellules de Mammifres en culture,
- cellules rsultant des premires divisions de
l'uf d'un mammifre par exemple
aprs un clonage dans Escherichia coli
Rintroduire le gne clon dans des cellules eucaryotes

Expression

Conclusion
Les plasmides confrent aux bactries qui les
hbergent de nombreux caractres gntiques par un
mcanisme d'addition et non par un mcanisme de
substitution.
Ils reprsentent un lment essentiel
d'adaptation bactrienne.
Ils sont responsables d'pidmies de gnes
(notamment de rsistance aux antibiotiques), qui sont
la base de la dcouverte des transposons, appels
encore gnes sauteurs ou mobiles.

B- Les lments gntiques mobiles:

les transposons (Tn)
Dfinition:
Squences d'ADN capables de changer de localisation
dans le gnome sans jamais apparatre l'tat libre.
Ils ne peuvent se rpliquer mais codent pour les
dterminants de la transposition et ceux d'autres fonctions
telle la rsistance aux antibiotiques et aux mtaux lourds .
bta-lactamines,
aminosides, phnicols,
cyclines, rythromycine,
sulfamides et
trimthoprime

Transposition :
Mcanisme d'volution rapide, cest l'addition
dune squence de gnes (ADN) de taille dfinie
au sein d'un gnome (chromosome bactrien ou
plasmide) et en l'absence d'homologie de
squence nuclotidique par recombinaison
illgitime.
appels transposons (Tn)

Structure des transposons

Le transposon est constitu d'un fragment d'ADN limit
de part et d'autre par des squences rptitives inverses
(IR) appartenant des squences d'insertion (IS).
IS1
IRL

768 pb

IRR

Les squences d'insertion portent les gnes ncessaires

la transposition, transposase (lments rgulateurs de la
transposition) et les marqueurs spcifiques ( ex:
rsistance aux antibiotiques).

RLE INTRT
Les transposons constituent un gnome collectif ou un
patrimoine gntique commun, dans lequel puisent les
bactries en fonction de leur ncessit d'adaptation ou de la
pression de slection.
Ces lments sont la preuve du "gnie gntique in vivo".
Il sont trs utiliss en mutagnse in vitro, ou encore par
les bactries elles-mmes pour moduler l'expression d'un
gne.