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2006
Cludia Isabel
Mtodos Espectroscpicos para o Estudo da
Rodrigues de Almeida Cerveja
Cludia Isabel
Mtodos Espectroscpicos para o Estudo da
Rodrigues de Almeida Cerveja
O jri
Presidente
Agradecimentos
Palavras-chave
Resumo
Keywords
Abstract
Duarte, I.F., Barros, A., Almeida, C., Spraul, M., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR
and FTIR Data as a Potential Tool for the Quality Control of Beer, Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 52, 1031-1038, 2004.
2.
Nilsson, M., Duarte, I.F., Almeida, C., Delgadillo, I., Goodfellow, B.J., Gil, A.M., Morris,
G.A., High Resolution NMR and Diffusion Ordered Spectroscopy of Port Wine, Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 52(12), 3736-3743, 2004.
3.
Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Rodrigues, J., Spraul, M., Gil, A.M., The composition
of beer by 1H NMR spectroscopy: the effects of brewing site and date of production,
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 54, 700-706, 2006.
PROCEEDINGS DE CONFERNCIAS:
1.
Duarte, I.F., Almeida, C., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR and FTIR
Data for the Quality Control of Beer, 6Th International Conference on Applications of
Magnetic Resonance to Food Science, Paris, France, 2002.
2.
Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate analysis of FTIR and NMR
data of beer as a potential tool for its quality control, 6 Encontro de Qumica de Alimentos,
Lisboa, Portugal, 2003.
3.
Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR and FTIR
Data of Beer as a Potential Tool for its Quality Control, 2 ELBRMN, Sintra, Portugal,
2003.
4.
Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Application of FTIR and NMR
Spectroscopy for the Determination of Origin and Date of Production of Beer, 7Th
International Conference on Applications of Magnetic Resonance to Food Science,
Copenhagen, Denmark, 2004.
5.
Almeida, C., Barros, A., Gil, A.M., Application of Outer Product-PCA for the
characterization of beers by FTIR and NMR Spectroscopy, CAC-2004, Chemometrics in
Analytical Chemistry, Lisboa, Portugal, 2004.
6.
Gil, A.M., Almeida, C, Duarte, I.F., Barros, A., Gonalves, C., Ferreira, A.A., Application
of NMR spectroscopy for the quality control of beer, 30th International EBC Congress,
Praga, Repblica Checa, 30th International European Brewing Convention (EBC) Congress,
Fachverlag Hans Carl, Netherlands, 2005.
ndice
Objectivos.................................................................................................................................. 5
Introduo Geral........................................................................................................................ 7
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
Referncias....................................................................................................................................... 39
3
Introduo .................................................................................................................................... 44
3.2
Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 45
3.3
3.4
Concluses ................................................................................................................................... 53
Referncias....................................................................................................................................... 53
4
Introduo .................................................................................................................................... 58
4.2
Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 60
4.3
4.4
4.5
Concluses ................................................................................................................................... 89
Referncias....................................................................................................................................... 91
5
Introduo .................................................................................................................................... 96
5.2
Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 96
5.3
5.4
5.5
Concluses ..................................................................................................................................115
Introduo...................................................................................................................................120
6.2
6.3
6.4
Concluses ..................................................................................................................................134
Abreviaturas e Smbolos
Abs
Absorvncia
ATR
DMS
DOSY
Diffusion-Ordered Spectroscopy
FID
FT-IR
GABA
HPLC
HSQC
INEPT
Constante de acoplamento
LB
Line Broadening
LC
MLEV-17
MS
PC
PCA
ppm
RMN
SNIF
TOCSY
TSP
U.A.
Unidades Arbitrrias
VDK
Objectivos
1 OBJECTIVOS
Pretende-se com esta dissertao avaliar o potencial das tcnicas espectroscpicas de
Infravermelho com Transformadas de Fourier (FT-IR) e Ressonncia Magntica Nuclear
de Alta Resoluo (RMN) acopladas com mtodos quimiomtricos, para a anlise de
amostras de cerveja, nomeadamente na seleco e identificao de compostos qumicos
que as possam caracterizar, principalmente a nvel qualitativo.
Os principais objectivos foram:
i) elaborar uma caracterizao detalhada da composio qumica da cerveja por
espectroscopia de RMN (1D e 2D);
ii) estudar a influncia da origem/local de fabrico na composio qumica da cerveja;
iii) identificar e avaliar as principais variaes de composio entre as cervejas produzidas
em diferentes datas;
iv) elaborar um estdio preliminar das variaes qumicas da cerveja nas diferentes etapas
do processo de fabrico da cerveja;
v) avaliar o potencial da espectroscopia de RMN, acoplada a mtodos estatsticos, para
aplicao rotineira na indstria, para controlo do produto e do processo.
cada vez mais premente desenvolver tcnicas rpidas de anlise que permitam o controlo
do processo de fabrico da cerveja, no s para garantir a segurana do consumidor final,
como para permitir a optimizao dos processos e consequente reduo de custos. No
entanto, a cerveja uma mistura complexa e, obviamente, o controlo de qualidade envolve
a determinao de muitos parmetros diferentes. Os mtodos de anlise padronizados mais
tradicionais requerem tempo e, normalmente, envolvem um pr-tratamento da amostra, por
exemplo, uma concentrao ou uma extraco. Assim, e uma vez que a espectroscopia de
FT-IR e RMN so tcnicas no destrutivas e que permitem a deteco e quantificao de
vrias famlias de compostos em simultneo, em apenas alguns minutos, pretendeu-se
aplicar estes mtodos, em conjunto com ferramentas multivariadas, no estudo da cerveja. A
necessidade destas ferramentas prende-se com o facto de, por um lado, os espectros
apresentarem sinais complexos, e por outro, devido ao elevado nmero de amostras a
2 INTRODUO GERAL
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
Referncias....................................................................................................................................... 39
Introduo Geral
aromatizada pelo lpulo e fermentada pela aco de leveduras. Foi porm no sculo XIX
que o fabrico da cerveja recebeu um maior impulso, atravs da resoluo de dois
problemas fundamentais: o isolamento das leveduras responsveis pela fermentao, o que
ficou a dever-se a Pasteur, e a possibilidade de manuteno dos tanques de fermentao e
as caves de guarda a temperaturas convenientemente baixas, durante todo o ano.
Hoje em dia, a histria da cerveja comea com o gro de cevada maduro, saudvel, com
um tamanho considervel e com um contedo de protenas moderado (para um cereal) de
10-12 %. O gro tem uma forma, aproximadamente, ovide, rodeado por camadas
protectoras de casca, com um pequeno embrio na ponta. Este embrio a parte que cresce
para dar origem nova planta (os primeiros rebentos verdes so denominados por
plmula), enquanto o endosperma persiste como fonte de alimento (Hughes e Baxter,
2001).
O processo de fabrico da cerveja envolve vrias etapas, que se encontram representadas, de
um modo geral, na Figura 2.1, e que so discutidas e comentadas no texto que se segue.
Todavia, consoante o tipo de cerveja, o diagrama de produo diferente, pois h certas
fases que so alteradas ou mesmo eliminadas, para conferir propriedades distintas
cerveja. Neste diagrama no se apresenta a maltagem (processo de germinao dos gros
de cevada), pois no constitui uma fase do diagrama de produo da cerveja.
O principal objectivo do processo de maltagem eliminar, na maior extenso possvel, as
-glucanas das paredes celulares e algumas protenas insolveis que possam obstruir o
acesso das enzimas ao interior dos grnulos de amido da farinha. Durante o processo
desenvolvem-se, tambm, enzimas especficas que vo converter o amido em acares
solveis (Lewis e Young, 1996).
Na maltagem, a cevada molhada de modo a que o seu teor de gua aumente de 12% para
cerca de 45% (Hughes e Baxter, 2001; Unio Cervejeira, 1993). O aumento do teor de
gua estimula a respirao do embrio e hidrata as fontes de amido do endosperma. Com
este aumento de actividade do embrio, produzem-se hormonas naturais que se difundem
para o interior da aleurona onde vo estimular a produo de enzimas hidrolticas, durante
a germinao. O gro hmido , ento, levado a germinar durante alguns dias. Durante este
10
Introduo Geral
Brassagem
Malte
Farinha
gua
Empastagem
Separao do mosto
Mosto doce + restos dos gros
Ebulio
Filtrao
Lpulo
Mosto amargo
Levedura
Fermentao
Cerveja imatura
Maturao
Estabilizao
Filtrao
CERVEJA
11
certo poder anti-sptico (Hughes e Baxter, 2001; Nord et al., 2003; Unio Cervejeira,
1993).
OH
R
O
R
HO
HO
HO
cidos-
OH
CO
R (cadeia lateral):
-COCH2CH(CH3)2 = Humulona
-COCH(CH3)2 = Cohumulona
-COCH(CH3)CH2CH3 = Adhumulona
cidos iso-
A maior parte dos compostos contidos no lpulo, e que so essenciais para o aroma da
cerveja, so volteis e podem-se perder na evaporao durante a ebulio. Assim, o
processo de ebulio deve ser controlado de modo a que a sua extenso seja suficiente para
coagular protenas e isomerizar os cidos do lpulo, mas, permitindo ainda reter
quantidades apreciveis dos compostos aromticos.
Durante a ebulio ocorrem, tambm, reaces de acastanhamento (browning) (Figura
2.3) entre os acares redutores e as aminas primrias do mosto, resultando num aumento
12
Introduo Geral
OH
NR
NHR
OH
OH
HO
HO
+RNH 2
HO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
-RNH 2
H
-H2O
CHO
+RNH 2
Pigmento
OH
CH2OH
OH
OH
OH
-H2O
CH2OH
+RNH 2
Pigmento
Finda a ebulio, o mosto separado das substncias coaguladas e dos resduos de lpulo,
por simples decantao, por centrifugao ou, ainda, por filtrao. Procede-se, de seguida,
ao seu arrefecimento at uma temperatura na ordem dos 7 C, arrefecimento este que
provoca a precipitao dos componentes proteino-tnicos. Uma vez clarificado e
refrigerado, o mosto lupulado est pronto para a operao seguinte (Unio Cervejeira,
1993).
A fermentao ocorre a 7-13 C nas cervejas lager e a 16-18 C nas cervejas ale. O
mosto clarificado e refrigerado bombeado para cubas de fermentao, sendo-lhe
adicionada a levedura de cultura apropriada ao tipo de cerveja que se quer produzir. Por
13
14
Introduo Geral
15
16
Introduo Geral
OH
R
O
2+
M
O
R
H
OH
O
Figura 2.4 Estrutura dos cidos iso- ligados a caties metlicos (Hughes e Baxter, 2001).
A presena do etanol aumenta a viscosidade da gua e por isso reduz a taxa de drenagem
do lquido da espuma. Os lpidos e lcoois de elevado peso molecular so exemplos de
espcies anfipticas, que conseguem adsorver na interface gua-gs. A sua adio cerveja
prejudicial espuma.
O dixido de carbono foi o nico componente utilizado no gs da espuma da cerveja at
aparecer a Guinness, que foi a primeira cerveja com azoto. Este o principal responsvel
pela sua espuma densa e cremosa caracterstica. O azoto muito pouco solvel na cerveja
e, por isso, a sua adio resulta numa elevada presso interna dentro da lata. Quando se
abre a lata de cerveja, esta presso liberta-se e o azoto capturado pelo pequeno
17
Tabela 2.1 Principais contribuintes qumicos para a cor da cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
Fonte
Componente
Melanides
Matria-prima
Malte e maltes especiais
Polifenis oxidados
Malte, lpulo
Processo
Ebulio / aquecimento do
mosto
Oxigenao, pasteurizao
Ferro, cobre
Riboflavina
gua, malte
Malte, levedura
Cor
Amarelo, mbar
Vermelho,
castanho
Amarelo
18
Introduo Geral
19
Tabela 2.2 Nveis de doura relativa e concentraes tpicas de alguns acares encontrados na
cerveja (a doura relativa da sacarose = 1,0) (Hughes e Baxter, 2001).
Acar
frutose
glucose
sacarose
maltose
maltotriose
Doura Relativa
1,1
0,7
1,0
0,5
< 0,5
20
Introduo Geral
desses cidos dependem do vigor da fermentao, pois eles so produzidos pela levedura.
Como se pode observar, o sabor/aroma dos cidos lctico e pirvico dificilmente
detectvel, enquanto que o cido 3-metilbutanico facilmente sentido.
Tabela 2.3 Principais cidos orgnicos encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
cido
actico
propanico
butanico
2-metilpropanico
pentanico
2-metilbutanico
3-metilbutanico
octanico
lctico
pirvico
succnico
Limite de percepo
sensorial (mg/L)
175
150
2,2
30
8
2,0
1,5
15
400
300
-
Concentrao na
cerveja (mg/L)
30-200
1-5
0,5-1,5
0,1-2
0,03-0,1
0,1-0,5
0,1-2
2-12
20-80
15-150
16-140
Descrio do
sabor/aroma
cido, vinagre
cido, vinagre, leite
Manteiga, queijo, suor
Suor, amargo, azedo
Suor, odor corporal
Queijo, lpulo, suor
Cabra
cido
cido, salgado, rao
-
Tabela 2.4 Principais compostos inorgnicos encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
Principais fontes
Efeito
potssio
sdio
clcio
Concentrao na
cerveja (mg/L)
200-450
20-350
25-120
Malte, adjuvantes
Instrumentao, gua
Instrumentao, gua
magnsio
50-90
Instrumentao, gua
cloro
120-500
sulfato
oxalato
fosfato
nitrato
100-430
5-30
170-600
0,5-2,0
gua
Malte
Malte, adjuvantes
gua, lpulo
Salgado
Enjoativo
Efeito favorvel no
sabor/aroma
Desagradvel quando
agregado ao sulfato
Cheio, doce, suave,
tenro
Seco
Turvao
Aumento da colorao
Io
21
a cabo durante a ebulio do mosto, com uma eficincia de 30% e, por isso, usam-se os
cidos- do lpulo para aumentar a quantidade dos cidos iso-.
OH
O
O
O
R1
H
R1
HO
HO
R2
R3
cido-
OH
cido iso-
Figura 2.5 Isomerizao dos cidos- em cidos iso- (Hughes e Baxter, 2001).
22
Introduo Geral
acetato de etilo
acetato de isoamilo
hexanoato de etilo
octanoato de etilo
Concentrao na
cerveja (mg/L)
10-60
0,5-5,0
0,1-0,5
0,1-1,5
Limite de percepo
sensorial (mg/L)
30
1
0,2
0,5
acetato de 2-feniletil
nicotinato de etilo
0,05-2,0
1,0-1,5
3,0
2
ster
Descrio do
sabor/aroma
Solvente, suor
Banana, ster, solvente
Ma, frutado, suor
Ma, frutos tropicais,
suor
Rosas, mel, ma, suor
Perfume, granuloso
metanol
etanol
1-propanol
2-propanol
2-metilbutanol
3-metilbutanol
2-feniletanol
1-octeno-3-ol
Concentrao na
cerveja (mg/L)
0,5-3,0
20000-80000
3-16
3-6
8-30
30-70
8-35
0,03
Limite de percepo
sensorial (mg/L)
10000
14000
700
1500
65
70
125
0,2
2-decanol
glicerol
tirosol
0,005
1200-2000
3-40
0,015
200
lcool
Descrio do
sabor/aroma
Alcolico, solvente
Alcolico, forte
Alcolico
Alcolico
Alcolico, vinoso, banana
Alcolico, vinoso, banana
Rosas, amargo, perfumado
Relva cortada de fresco,
perfume
Anis, coco
Doce, viscoso
Amargo, qumico
23
dos aminocidos, mas tambm podem ser produzidos por outras vias, aumentando
excessivamente no mosto. As condies que favorecem o crescimento celular, como uma
excessiva oxigenao ou arejamento, promovem a formao de lcoois de elevado peso
molecular (Hughes e Baxter, 2001; Pollock, 1981).
Ao contrrio dos steres e dos lcoois, que so benficos para o sabor/aroma da cerveja, as
dicetonas vicinais (Vicinal DiKetones - VDK) so consideradas problemas e defeitos na
bebida. A principal VDK na cerveja a 2,3-butanodiona (diacetilo) mas tambm existem
quantidades significativas de 2,3-pentanodiona, produzida durante a fermentao. Estas
duas substncias derivam do -acetolactato e -acetohidroxibutirato, respectivamente, e
devem ser transformadas noutros compostos que afectem menos o sabor/aroma da cerveja
(2,3-butanodiol e 2,3-pentanodiol) (Figura 2.6).
OH
OH
TPP
hidroxietil TPP
OH
CO2H
CO2H
piruvato
oxobutirato
Reaces
intracelulares
2,3-butanodiol
OH
2,3-pentanodiol
O
OH
OH
CO2H
CO2H
acetohidroxibutirato
acetolactato
Oxidao
Reaces
extracelulares
2,3-pentanodiona
OH
acetona
-CO2; 2[H+]
O
OH
OH
hidroxipentanona
diacetilo
Figura 2.6 Vias de formao e subsequente destruio das dicetonas vicinais na cerveja (Hughes e
Baxter, 2001).
24
Introduo Geral
Concentrao na
cerveja (mg/L)
0,01-0,4
1-10
50-150
0,01-0,15
0,05-0,07
Limite de percepo
sensorial (mg/L)
0,07-0,15
17
4500
0,9
-
Descrio do
sabor/aroma
Manteiga e caramelo
Frutado, mofo, madeira
Borracha, suor, quente
Manteiga, frutado
-
25
26
Introduo Geral
Regio
Prximo
0,78 2,5
12800 - 4000
Mdio
2,5 50
4000 - 200
Longnquo
50 1000
200 - 10
27
Tabela 2.9 Valores de absoro no infravermelho para diferentes grupos funcionais (Stuart et al.,
1996).
Nmero de Onda (cm-1)
Grupo Funcional
3640-3610
O-H (livre)
3500-3070
N-H
2960-2850
C-H alifticos
1750-1740
C=O de steres
1740-1720
C=O de aldedos
1720-1700
C=O de cetonas
1675-1645
C=C
1590-1550
NH2
1470-1430
CH2
1390-1370
CH3
1420 e 1300-1200
1300-1020
C-O de steres
1200-1050
1155-1150
1024-998
920
O-H
28
Introduo Geral
29
30
Introduo Geral
31
(Figura 2.9a). Um desses ncleos o do tomo do hidrognio, 1H, ou seja, o proto, que
caracterizado por um valor de nmero quntico de spin I igual a 1/2. Se se colocar um
proto num campo magntico externo, o respectivo momento magntico pode orientar-se
de uma das duas maneiras seguintes: a favor ou contra o campo externo (Figura 2.9b). As
duas orientaes possveis dos ncleos de 1H correspondem a dois estados energticos
distintos, e ou 1/2. A Espectroscopia de RMN de 1H baseia-se na ocorrncia de
transies entre estes estados, por absoro de radiao na gama de frequncias das ondas
de rdio (60 a 750 MHz). O valor da energia absorvida fortemente dependente do
ambiente qumico em que o proto se encontra e esta dependncia traduzida por uma
quantidade denominada desvio qumico (Skoog et al., 1998; Claridge, 1999).
a)
b)
B0
z
orientao-
y
orientao-
Figura 2.9 a) Rotao do ncleo magntico causada pela aplicao de um campo magntico
esttico B0; b) as duas orientaes possveis do ncleo de 1H (n quntico de spin I=1/2) no campo
magntico.
32
Introduo Geral
Os espectros de RMN podem ser adquiridos com base numa tcnica de pulsos, com
aplicao da Transformada de Fourier (TF), que permite obter um espectro em apenas
alguns segundos. O mtodo consiste em irradiar a amostra com um pulso de radiao, que
tem a durao de alguns microsegundos e contm todas as frequncias de interesse,
provocando a excitao simultnea de todos os ncleos magnticos da amostra. A seguir ao
pulso, os ncleos comeam a perder a energia absorvida, num processo designado por
relaxao e que se regista num grfico denominado FID (Free Induction Decay), que
consiste num grfico de intensidade da radiao emitida em funo do tempo. O FID ,
ento, digitalmente monitorizado e guardado num computador. Passados alguns segundos,
aplica-se um novo pulso e o FID correspondente novamente monitorizado e adicionado
ao primeiro. Este processo repetido tantas vezes quanto desejado para obter a intensidade
de sinal necessria, e no final, o FID resultante convertido no espectro atravs do
processo matemtico de Transformada de Fourier (Figura 2.10) (Skoog et al., 1998, Harris,
1987).
FT
tempo
frequncia
33
uma abordagem complementar e necessria para a atribuio dos sinais, uma vez que a
informao distribuda por duas dimenses e a sobreposio espectral
significativamente reduzida.
Todas as sequncias de pulsos 2D tm o mesmo esquema bsico que pode ser subdividido
em 4 perodos bem definidos, denominados, preparao, evoluo, mistura e deteco
(Figura 2.11). Tipicamente, o perodo de preparao e de mistura compreendem um pulso
ou um aglomerado de pulsos e/ou perodos de tempo fixos. Os pormenores dependem da
natureza da experincia. O perodo de deteco inteiramente anlogo ao perodo de
deteco de qualquer experincia 1D, em que o espectrmetro adquire o FID dos spins
excitados. o perodo de evoluo que promove a chave da gerao da segunda dimenso.
O estado do sistema de spin depois de um certo tempo t1 , geralmente, alterado, pelo
menos, 1 pulso de rdio-frequncia. O sinal de ressonncia depois registado durante o
tempo de deteco subsequente, t2. A experincia inteira repetida com um incremento do
tempo de evoluo t1, pelo qual o estado inicial do sistema de spin nuclear, durante o
perodo de deteco a t2=0, muda consequentemente. Depois da compilao dos dados, os
FID so transformados na dimenso t2, de modo a obter um conjunto de espectros cujas
intensidades dos picos ou fases so moduladas como funo do intervalo t1. A
transformada de Fourier na dimenso t1 converte a modulao da frequncia em picos do
espectro 2D, geralmente representados como um mapa de contornos.
Preparao
Evoluo
t1
Mistura
t2
Tempo
34
Introduo Geral
qumico. Ambos os tipos de experincias foram usados neste trabalho com o objectivo de
auxiliar a atribuio/identificao espectral da cerveja analisada.
A experincia de TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) permite a correlao
homonuclear de spins acoplados escalarmente, mas tambm capaz de estabelecer
correlaes entre protes que apesar de no estarem acoplados entre si, se encontram no
mesmo sistema de spin e formam uma cadeia contnua de protes acoplados spin-spin
(Braunschweiler et al., 1983). Na Figura 2.12 observa-se uma representao esquemtica de
um espectro de TOCSY do etanol, onde se pode ver o acoplamento de protes.
t2
Spin-lock y
Figura 2.13 Sequncia de pulsos da experincia TOCSY usando um pulso contnuo de baixa
intensidade.
35
/2
H p=
180
90
180
90
180
/2
/2
t1
/2
(Decouple)
+1
0
-1
X p=
+1
0
-1
36
Introduo Geral
90
t1/2
t1/2
37
38
Introduo Geral
Referncias
Bodenhausen, G.; Ruben, D. Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced
heteronuclear spectroscopy Chemical Physics Letters; 69; 185-188; 1980.
Braunschweiler, L.; Bodenhausen, G.; Ernst, R. Coherence transfer by isotropic mixing:
application to proton correlation spectroscopy Journal of Magnetic Resonance; 53; 521528; 1983.
Claridge, T. D. W. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry Elsevier
science; Oxford; 1999.
Fan, T.W. Metabolite profiling by one and two-dimensional NMR analysis of complex
mixtures Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; 28; 161-219; 1996.
Harris, R. K. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 3rd Ed.; John Wiley &
Sons; New York; 1987.
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39
40
Introduo Geral
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Skoog, D. A.; Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5th
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Stuart, B.; George, B.; Mclntyre, P. Modern Infrared Spectroscopy Jonh Wiley &
Sons; UK; 1996.
Unio Cervejeira, E. P. A Cerveja Servio de Relaes Pblicas da UNICER. Lea
do Balio, 1993.
41
42
3.1
Introduo....................................................................................................................... 44
3.2
3.3
3.4
Concluses ...................................................................................................................... 53
Referncias....................................................................................................................................... 53
43
3.1 Introduo
A cerveja uma mistura complexa, cuja composio qumica depende de vrios factores,
incluindo a qualidade da gua, o tipo de malte, a levedura usada, o lpulo, assim como as
condies, quer ambientais (temperatura, humidade), quer mecnicas (tipo e estado do
equipamento) de todo o processo de fabrico (Hughes e Baxter, 2001). O estudo detalhado
dessa composio qumica e da sua relao com as propriedades da cerveja de extrema
importncia para se poder realizar um controlo de qualidade eficiente e melhorar as
caractersticas do produto final. Este , geralmente, avaliado atravs da sua aparncia (cor,
propriedades da espuma e turvao), do gosto (doce, salgado, cido e amargo) e do sabor e
aroma. No entanto, a relao destas propriedades com a composio qumica da cerveja
no inteiramente conhecida, facto que limita o controlo e conhecimento da bioqumica do
produto e consequente controlo das caractersticas finais. Isto implica, necessariamente,
uma caracterizao qumica detalhada e, embora diversas metodologias analticas sejam
aplicadas na indstria cervejeira, ainda requerida e desejvel uma anlise minuciosa, total
e em tempo real, da composio qumica da cerveja.
A espectroscopia de RMN permite detectar, simultaneamente, numa nica experincia,
vrias famlias de compostos, em diversas gamas de concentrao e j mostrou elevada
potencialidade no estudo da composio qumica de vrios produtos alimentares, tais
como, sumos de fruta (Belton et al., 1996; Belton et al., 1997; Le Gall et al., 2001), caf
(Bosco et al., 1999), azeite (Sacchi et al., 1996) e vinho (Ramos e Santos, 1999; Kosir e
Kidric, 2001; Brescia et al., 2002), com a vantagem de ser uma tcnica no-destrutiva (a
amostra usada directamente, sem qualquer tipo de pr-tratamento). No caso da cerveja,
suficiente desgaseificar a amostra e em poucos minutos podemos obter um espectro que
fornece informao detalhada sobre a sua composio qumica (Duarte et al., 2002). A
espectroscopia de RMN tem sido, maioritariamente, aplicada na resoluo de problemas
especficos, tais como, identificao e quantificao dos constituintes do malte e do lpulo,
por exemplo, polifenis (Friedrich e Galensa, 2002) e iso-humulonas (Nord et al., 2003) e
quantificao de cidos orgnicos e aminocidos na cerveja (Nord et al., 2004). No
entanto, estes estudos recorreram ao uso de extractos de cerveja, o que possibilitou,
44
45
noesypr1dsp, com saturao dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm).
Foram usados 128 varrimentos e 32K pontos, com uma largura espectral de 8012 Hz. Os
espectros TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) foram registados usando o programa
lcmlevpcpstp (Bruker Library) e a sequncia de pulsos MLEV-17 para spin-lock.
Foram adquiridos 16 varrimentos para cada um dos 512 incrementos, usando uma largura
espectral de 5482,46 Hz, nas duas dimenses, um tempo de relaxao de 100 ms e um
tempo de mistura de 1,5 segundos. Os espectros de HSQC (Heteronuclear SingleQuantum Correlation) foram registados usando o programa invietgpsi que utiliza a
deteco inversa e o desacoplamento de
13
varrimentos para cada um dos 300 incrementos que foram adquiridos com uma largura
espectral de 5482,46 Hz e 25157,23 Hz, nas dimenses do proto e do carbono,
respectivamente. Os espectros J-resolved foram registados usando o programa lcjresps,
com 8182 pontos, 24 varrimentos para cada um dos 128 incrementos e uma largura
espectral de 8012,82 Hz, na dimenso do proto e 31,30 Hz na dimenso J.
46
H2O
EtOH
ppm
EtOH
1 ppm
Figura 3.1 Espectro 1D tpico de RMN de 1H de uma cerveja, registado a 500 MHz.
Para identificar a maior parte dos sinais presentes na Figura 3.1, foram combinados os
dados das experincias de TOCSY, Correlao 1H-13C (HSQC) e J-Resolved.
Na Figura 3.2 esto representados os espectros de RMN de 1H 1D e 2D (TOCSY) de uma
amostra de cerveja, adquiridos no mesmo espectrmetro que o espectro anterior e tambm
com supresso tripla. Podem-se observar sinais de vrios compostos, nomeadamente,
lcoois (isopentanol, isobutanol e propanol), aminocidos (prolina, histidina, fenilalanina e
alanina), cidos orgnicos (actico, pirvico, succnico, ctrico e mlico) e nuclesidos
(uridina, citidina, adenosina e inosina). Estes sinais foram identificados com base em
trabalhos anteriores (Duarte et al., 2002; Gil et al., 2003; Duarte et al., 2003) e encontramse na Tabela 3.1.
Aquando da interpretao de um espectro de TOCSY necessrio ter presente o espectro
1D da amostra respectiva e ir identificando os sinais de protes com acoplamento com
protes vizinhos, ou seja, os dupletos, tripletos, etc., pois s estes so visveis no TOCSY.
Em seguida necessrio encontrar os sistemas de spin respectivos, ou seja, o conjunto de
47
picos cruzados pertencentes a uma mesma molcula (ou sistema de spin) e ir consultando
as bases de dados que existem de vrios compostos orgnicos (Fan, 1996). A experincia
de TOCSY um dos mtodos mais teis na identificao de compostos pois permite a
deteco de acoplamentos escalares ao longo de vrias ligaes e assim a identificao de
vrios grupos de uma mesma molcula.
16
19
17 18
13
14
13
15
9.0
8.5
8.0
7.5
12
17
7.0
6.5
12
14
ppm
10,
11
98
7
1,2,3
6
ppm
1
2
3
19
14
11
13
6
15
16
7
8
9
9
ppm
Figura 3.2 Espectros de RMN 1H 1D e 2D (TOCSY) de uma cerveja (1-propanol, 2-isobutanol, 3isopentanol, 4-etanol, 5-H2O, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10-ctrico, 11-mlico,
12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina/tirosol, 17-histidina, 18fenilalanina, 19-polifenis).
48
Na Figura 3.3 est representada uma expanso do espectro de TOCSY onde se podem
observar os picos cruzados da zona aliftica (0-3 ppm) e da zona dos acares (3-5,5 ppm).
Na regio aliftica observam-se os sinais dos cidos orgnicos (actico, pirvico e
succnico), provenientes do ciclo de Krebs e de alguns aminocidos, estes em pequenas
quantidades, por serem consumidos pelo metabolismo das leveduras. Na regio dos
acares de notar a forte sobreposio de sinais e da a dificuldade de identificao. Na
zona anomrica (4,4-5,5 ppm) possvel identificar o dupleto a 4,64 ppm proveniente da
ligao H1 de acares redutores, enquanto que a 5,22 ppm se encontra o dupleto da
ligao H1. O sinal largo a 5,3-5,4 ppm caracterstico de dextrinas, que por serem
molculas maiores no so facilmente fermentveis pela levedura.
H2O
H1(14)
H1
EtOH
H1(16)
pirvico
actico
succnico
H1
ppm
1
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
6
ppm
49
50
c. pirvico
Uridina
100
Histidina
150
Citidina
ppm
50
Hz
-10
-5
10
15
ppm
Tabela 3.1 Desvios qumicos de 1H e 13C, multiplicidade e constante JHH dos compostos
identificados na cerveja. s: singuleto, d: dupleto, t: tripleto, q: quarteto, dd: duplo dupleto, m: multipleto, (a)
identificao possvel, n.i.: no identificado.
Composto
Atribuio
1H (ppm)
Multiplicidade
cido Actico
CH3
2,01
, CH
, CH
CH2
CH2
CH2
CH3
CH
CH
CH
CH
2,72
2,84
1,92
2,39
3,02
1,34
4,19
2,63
2,82
4,38
d
d
15,7
15,7
t
t
d
q
dd
dd
7,2
7,2
7,0
7,0
7,5;16,2
4,4;16,1
cido Pirvico
CH3
2,35
29,12
cido Succnico
, CH2
2,56
32,79
C4H, ribose
C3H, ribose
C2H, ribose
C1H, ribose
C8H, anel
C2H, anel
CH3
CH
4,27
4,41
4,79
6,06
8,27
8,35
1,48
3,77
cido Ctrico
cido -Aminobutrico
(GABA)
cido Lctico
cido Mlico
Adenosina/Inosina
Alanina
J (Hz)
13C (ppm)
23,82
46,50
26,28
32,28
41,83
22,48
70,87
42,78
71,20
d
s
s
d
7,2
51
Composto
Citidina
Etanol
Fenilalanina
Histidina
Isobutanol
Isoleucina
Isopentanol
Leucina
Malto-oligossacardeos
Polifenis (a)
Prolina
Propanol
Tirosina / Tirosol
Triptofano
Uridina
52
Atribuio
1H (ppm)
C1H, ribose
C6H, anel
C5H, anel
CH3
CH2
C3H, C5H, anel
C4H, anel
C2H, C6H, anel
C4H, anel
C2H, anel
CH3
CH
CH2OH
CH3
CH3
CH
CH
CH
CH
CH3
CH
CH2
CH2OH
, CH3
CH2, CH
C1H (red.)
C1H (red.)
C1H (1-6)
C1H (1-4)
n.i.
n.i.
CH2
CH
CH
CH
CH
CH
CH3
CH2
CH2OH
C3H, C5H, anel
C2H, C6H, anel
C5H, anel
C6H, anel
C7H, anel
C4H, anel
C4H
C3H
C2H
C5H, anel
C1H
C6H, anel
5,86
6,09
7,92
1,17
3,64
7,31
7,37
7,41
7,04
7,99
0,87
1,73
3,36
0,92
1,00
1,25
1,46
1,96
3,64
0,88
1,42
1,64
3,63
0,94
1,70
4,64
5,22
4,96
5,3-5,4
6,84
7,51
6,89
7,18
7,15
7,24
7,50
7,69
4,11
4,21
4,38
5,88
5,89
7,86
J (Hz)
13C (ppm)
d
d
t
q
7,9
7,9
7,2
7,2
98,36
145,72
19,56
60,19
119,00
140,62
s
s
d
6,6
6,5
t
d
6,6
d
d
8,0
3,7
m
m
m
2,00
2,06
2,33
3,32
3,41
4,11
0,88
1,53
3,54
6,81
7,11
Multiplicidade
t
m
t
d
d
7,5
5,8
8,5
8,5
24,60
98,50
94,58
101,28
~102
26,60
31,70
31,70
48,90
48,90
64,06
13,7
26,9
62,46
118,2 118,2
133,3 133,1
114,49
8,2
8,2
105,00
90,51
144,56
Pela anlise da tabela anterior podemos constatar que cerca de 25 compostos foram
identificados na cerveja em estudo, por RMN 1D e 2D. Alm disso, muitos outros
compostos (sistemas de spin) foram encontrados mas a sua identificao requer mais
investigao e recurso a outras tcnicas, nomeadamente, LC-NMR, LC-NMR/MS e
DOSY, devido no s fraca intensidade de alguns sinais, como forte sobreposio de
outros.
3.4 Concluses
Como se constatou ao longo deste captulo, a anlise detalhada de todos os picos presentes
num espectro de RMN de cerveja um processo moroso e que est longe do seu fim, uma
vez que ainda existem muitos picos no identificados. No entanto, este estudo essencial
para qualquer investigao/anlise de amostras de cerveja, pois permite a construo de
bases de dados e a caracterizao qumica/perfil de uma amostra, que iro facilitar a
interpretao dos resultados de PCA, por exemplo.
A anlise de espectros 1D e 2D exige o recurso a pessoas altamente especializadas, um
grande dispndio de tempo, o que torna o estudo oneroso. No entanto, depois de
construdas as bases de dados, a utilizao da tcnica de RMN poder tornar-se mais
acessvel, no sendo necessrio pessoas to especializadas, nem um dispndio de tempo to
grande. Alm disso, o uso de automao no registo dos espectros e o recurso a mtodos
estatsticos poder facilitar o acesso s indstrias.
Referncias
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high-field 1H NMR spectroscopy for the analysis of liquid foods Journal of Agricultural
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Segre, A. A high-field 1H nuclear magnetic resonance study of the minor components in
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56
4.1
Introduo....................................................................................................................... 58
4.2
4.3
4.4
4.5
Concluses ...................................................................................................................... 89
Referncias....................................................................................................................................... 91
57
4.1 Introduo
Hoje em dia, assegurar a autenticidade de um determinado produto de extrema
importncia, no s porque o consumidor final cada vez mais exigente, como tambm
porque a concorrncia cada vez mais desleal. Para garantir a autenticidade necessrio
ferramentas que permitam determinar/confirmar a origem/local de fabrico, assim como o
tipo de matrias-primas usadas e condies de processamento.
Vrias tcnicas tm sido usadas na determinao e classificao de alimentos lquidos,
nomeadamente, vinho, ch, vinagre e sumos de fruta, segundo a sua origem geogrfica.
Assim, por exemplo, a determinao por HPLC do contedo em catequinas, cidos
fenlicos e alcalides e a PCA foram usados para distinguir o ch (Fernndez et al., 2002)
segundo a sua origem geogrfica. A relao entre a concentrao de metais vestigiais no
ch,
determinada
por
ICP-AES
(inductively
coupled
plasma-atomic
emission
58
isotpica no aleatria, antes pelo contrrio, ela caracterstica de cada planta e de cada
regio. A razo Deutrio/Hidrognio, D/H, diminui medida que a latitude aumenta, e
tambm, com o aumento da distncia em relao ao mar. O vapor de gua pobre em
deutrio durante a formao das nuvens, relativamente gua do mar. Mas assim que o
vapor de gua se condensa, a chuva resultante torna-se rica em deutrio. Estes istopos vo
actuar como marcadores naturais dos acares biossintetizados nas plantas e funcionar
como uma impresso digital deixada no lcool proveniente da biofermentao desses
acares (Cross et al., 1998). A razo isotpica D/H nos grupos metilo e metileno do
etanol do vinho pode ser determinada por Site-specific Natural Isotope Fractionation
NMR (SNIF-NMR). A comparao da razo D/H com a razo (R) da intensidade dos
sinais do metilo e do metileno no espectro de deutrio possibilita a distino entre vinhos
naturais e vinhos enriquecidos em etanol e ainda a diferenciao baseada na origem
geogrfica (Koir et al., 2001). No entanto, com o avanar da tecnologia, vrias prticas
enolgicas surgiram de modo a despistar a deteco da adio de etanol por SNIF-NMR.
Assim, para atingir o mesmo objectivo, de aumentar o teor alcolico, passou-se a adicionar
sacarose proveniente da beterraba e da cana do acar. Mas esta adulterao tambm
detectvel atravs da determinao da razo
13
C/12C (
13
Spectrometry (IRMS). Comparando os dados das amostras analisadas, com uma base de
dados de parmetros isotpicos (D/H)I, (D/H)II, R e 13C de amostras autnticas, possvel
confirmar a adio de acares ao mosto ou ao vinho antes ou durante a fermentao. Este
mtodo foi aplicado aos vinhos produzidos na Eslovnia, onde os dados dos istopos
estveis foram analisados por PCA e LDA (linear discriminant analysis) (Ogrinc et al.,
2001; Koir et al., 2001).
H cerca de 25 anos atrs, tambm a razo isotpica de carbonos estveis foi determinada
na cerveja, com o objectivo de detectar a adio de malte de milho, proibida segundo as
leis alems de pureza de cerveja. Com o objectivo de determinar a origem do malte, foi
determinada a razo D/H do grupo metileno do etanol da cerveja, por ser considerada um
bom indicador da sua origem geogrfica (Rossmann, 2001).
A espectroscopia de RMN acoplada com outros mtodos, como o HPLC e a espectrometria
de massa tambm j demonstraram utilidade na distino e classificao, segundo a origem
geogrfica, de vinho, sumos de fruta e azeite (Brescia et al. 2002; Ogrinc et al., 2003). No
59
entanto, com este captulo, pretende-se avaliar o potencial das tcnicas espectroscpicas de
FT-IR e RMN acopladas com mtodos quimiomtricos, na anlise de amostras de cerveja,
com os principais objectivos de estudar a influncia da origem/local de fabrico da cerveja
na composio qumica e possvel identificao da data de produo (Almeida et al.,
2006). A abordagem pretendida diferente dos estudos anteriores relatados uma vez que se
pretende caracterizar minuciosamente a cerveja e depois relacionar essa caracterizao
com a origem e data de produo. Em cada local, mesmo que seja seguida uma mesma
receita (bioqumica e tcnica) difcil prever e detectar, em tempo til, variaes na
composio e propriedades gerais da cerveja, provocadas por alteraes das condies
ambientais, estado da levedura e dos equipamentos, etc. Assim, pretende-se tirar partido da
rapidez do RMN e da sua capacidade de registar um perfil geral da composio qumica da
cerveja para facilitar e promover um controlo de qualidade mais eficiente.
Codificao
A1a
A1b
A1c
A2a
A2b
A2c
A3a
A3b
A3c
60
Pas de Origem
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Data de Produo
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Abr-02
Abr-02
Abr-02
Fev-02
Fev-02
Fev-02
Garrafa
a
b
c
a
b
c
a
b
c
pH
4,37
4,35
4,35
4,35
4,38
4,37
4,40
4,41
4,39
Codificao
B1a
B1b
B1c
B2a
B2b
B2c
B3a
B3b
B3c
Pas de Origem
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Data de Produo
Mai-02
Mai-02
Mai-02
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Fev-02
Fev-02
Fev-02
Garrafa
a
b
c
a
b
c
a
b
c
pH
4,32
4,32
4,30
4,27
4,28
4,28
4,37
4,36
4,36
C1a
C1b
C1c
C2a
C2b
C2c
C3a
C3b
C3c
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Fev-02
Fev-02
Fev-02
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Abr-02
Abr-02
Abr-02
a
b
c
a
b
c
a
b
c
4,22
4,21
4,24
4,35
4,32
4,34
4,54
4,53
4,53
61
Os espectros de RMN 1D e 2D foram adquiridos num espectrmetro Bruker Avance DRX500, operando a 500,13 MHz para o proto e a 125,77 MHz para o carbono. Os espectros
de RMN 1D de 1H foram obtidos usando o programa de pulsos noesypr1dsp, com
saturao dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm). Foram usados 128
varrimentos e 32K pontos, com uma largura espectral de 8012 Hz. Para cada amostra
foram obtidos 3 espectros/rplicas. Os espectros TOCSY foram registados usando o
programa lcmlevpcpstp (Bruker Library) e a sequncia de pulsos MLEV-17 para
spin-lock. Foram adquiridos 16 varrimentos para cada um dos 512 incrementos, usando
uma largura espectral de 5482,46 Hz, nas duas dimenses, um tempo de relaxao de 100
ms e um tempo de mistura de 1,5 segundos. Os espectros de HSQC foram registados
usando o programa invietgpsi que aplica deteco inversa e desacoplamento de
13
durante a aquisio. Foram obtidos 64 varrimentos para cada um dos 300 incrementos que
foram adquiridos com uma largura espectral de 5482,46 Hz e 25157,23 Hz, nas dimenses
do proto e do carbono, respectivamente. Os espectros J-resolved foram registados usando
o programa lcjresps, com 8182 pontos, 24 varrimentos para cada um dos 128
incrementos e uma largura espectral de 8012,82 Hz, na dimenso do proto e 31,30 Hz na
dimenso J.
Para a Anlise em Componentes Principais (PCA) foram construdas matrizes dos
espectros das amostras, de diferentes dimenses. No caso dos espectros de FT-IR, a matriz
foi construda usando apenas a regio da impresso digital (fingerprint), isto , de 1200 a
980 cm-1. Cada linha da matriz (cada espectro) foi centrada e reduzida, antes da aplicao
da PCA. Na anlise dos espectros de RMN, foram usados os espectros inteiros (0,5 a 10,4
ppm), excluindo os sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,65 ppm), seguindo-se a
anlise das sub-regies dos espectros aliftica (3,1 0,5 ppm), acares (5,8 3,1 ppm) e
aromtica (10 5,8 ppm). Estas matrizes foram depois normalizadas e tratadas usando um
programa estatstico co-desenvolvido pela Universidade de Aveiro e o Institut National
Agronomique Paris-Grignon (Barros, 1999).
62
Abs. (U.A.)
gua
Regio da
impresso
digital
3600
3100
2600
2100
1600
1100
600
-1
63
a)
b)
Etanol
1045
Dextrinas
Dextrinas
Abs. (U.A.)
Etanol
1085
879
A3a
B3b
1041
1078
C1a
1151 1111
998
Maltose
1024
Dextrina
1250
1200
1150
1100
1050
1000
950
1200
1100
1000
900
-1 -1)
Nmero
de onda
(cm
Wavenumber
(cm
)
Figura 4.2 Regio da impresso digital dos espectros de FT-IR de: a) amostras de cerveja,
identificadas de acordo com a Tabela 4.1; b) solues aquosas de etanol, dextrina e maltose
(Duarte, 2003).
64
800
PC2 (8%)
PC1 (63%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.3 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da regio 1200-980 cm-1.
0,3
Contribuies Factoriais
1085-1072 cm-1
998 cm-1
0,1
PC1
0
1180
-0,1
1130
1080
1030
980
PC2
1151 cm-1
-0,2
-0,3
1070 cm-1
65
O perfil das contribuies factoriais de PC1 mostra valores positivos para bandas de
absoro caractersticas do etanol (1045 e 1085-1072 cm-1) e valores negativos para bandas
caractersticas das dextrinas (1151 cm-1 e 1024 cm-1), sugerindo que as cervejas produzidas
no pas B, localizadas na parte positiva do eixo de PC1, tenham teores mais elevados de
lcool e mais baixos de dextrinas, ao contrrio das amostras localizadas na parte negativa
do eixo de PC1. Por outro lado, o grfico de PC2 apresenta valores positivos para bandas
de absoro caractersticas de maltose (1160-1140 cm-1, 1045-1041 cm-1 e 998 cm-1)
(Duarte et al., 2004), sugerindo que a variao na composio de hidratos de carbono pode
ser o factor responsvel pela separao das amostras A3. Estas diferenas no foram
detectadas pela inspeco visual dos espectros, uma vez que o nmero elevado de amostras
dificulta a sua comparao. Deste modo, a anlise em componentes principais revelou-se
uma ferramenta til, na extraco de informao neste conjunto de dados.
A diferena nos teores de etanol e acares pode estar relacionada com a extenso da
fermentao, uma vez que, como se sabe, um maior consumo de acares leva a um
aumento no teor de etanol. No entanto, este assunto necessitaria de mais investigao,
nomeadamente, a caracterizao qumica mais detalhada (o que vai ser possvel atravs da
espectroscopia de RMN no ponto que se segue), determinao rigorosa do teor de etanol
(uma vez que a informao contida no rtulo das garrafas apenas uma aproximao) e de
acares redutores e estudo do grau de ramificao das dextrinas.
66
H2 O
12
TSP
18
15
15
7
1,2,3
B
17
13
17
13
9
6
C
16
14
14
10,11
ppm
Figura 4.5 Espectros de RMN de 1H de 3 cervejas da mesma marca, uma de cada pas (1-propanol,
2-isobutanol, 3-isopentanol, 4-etanol, 5-lctico, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10ctrico, 11-mlico, 12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina/tirosol,
17-histidina, 18-fenilalanina).
67
PC2 (19%)
PC1 (54%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.6 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 (LB 0,3 Hz).
Como se pode verificar, e semelhana dos resultados obtidos por FT-IR, as cervejas do
pas B (vermelho) encontram-se agrupadas e separadas das restantes, caracterizando-se por
valores de PC1 negativo e PC2 nulo. As cervejas C3 tambm se encontram agrupadas e
distanciadas das restantes amostras, apresentando valores positivos de PC2. As restantes
amostras encontram-se, principalmente, no quadrante com PC1 positivo e PC2 negativo,
mostrando uma maior disperso.
Para interpretar esta separao necessrio analisar o grfico das contribuies factoriais
de PC1 e PC2 (Figura 4.7). Como se pode ver, a anlise difcil devido, sobretudo, aos
efeitos do tipo de primeira derivada provocados por artefactos, tais como, diferenas de
pH, concentrao e/ou instabilidade instrumental. Uma vez que as rplicas da mesma
amostra so praticamente coincidentes, mostrando uma estabilidade instrumental e no so
esperadas grandes diferenas na concentrao dos compostos, o factor mais relevante para
o aparecimento desses efeitos do tipo de primeira derivada parece ser o pH (pH=0,33),
sendo necessrio em estudos semelhantes futuros, garantir uma homogeneidade dos
valores de pH, por exemplo, pela adio de um tampo (Lachenmeier et al., 2005).
68
Contribuies Factoriais
0,07
0,02
-0,03
8,7
6,7
4,7
2,7
0,7
-0,08
-0,13
Desvio qumico (ppm)
PC1
PC2
69
Lb 0,3 Hz
Lb 2 Hz
Lb 10 Hz
Lb 50 Hz
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
ppm
Figura 4.8 Espectros de RMN 1H de cerveja, 500 MHz, processados com diferentes valores de LB.
A Figura 4.9 mostra as coordenadas factoriais dos dois primeiros PCs, que expressam 85%
da variabilidade total. Como se pode ver, a disposio das amostras muito semelhante
obtida com os espectros originais (LB 0,3 Hz), no entanto, os grupos aparecem mais
agregados, uma vez que os pequenos desvios, devido s diferenas de pH, foram
minimizados.
70
PC2 (22%)
PC1 (63%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.9 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2, dos espectros processados com LB 10 Hz.
Analisando as contribuies factoriais respectivas (Figura 4.10), podemos ver que os efeitos
do tipo de primeira derivada so muito menores, mas devido ao elevado nmero de picos a
interpretao continua difcil. Tambm a anlise de toda a gama espectral no permite
detectar as variaes nos compostos minoritrios, pois sobressaem as variaes nos
compostos mais intensos, e por este motivo, a PCA foi aplicada por regies espectrais:
aliftica, acares e aromtica.
Contribuies Factoriais
0,04
0,02
0,00
-0,02
8,7
6,7
4,7
2,7
0,7
-0,04
-0,06
-0,08
Desvio Qumico (ppm)
PC1
PC2
Figura 4.10 Contribuies factoriais (PC1 e PC2), dos espectros processados com LB 10 Hz.
71
Na regio aliftica a PCA foi aplicada de 3,1-0,5 ppm, excluindo o sinal do etanol (1,17
ppm). A Figura 4.11 refere-se ao mapa das coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio
aliftica dos espectros de RMN de 1H (LB 0,3 Hz). Como se pode ver, existe uma
disperso considervel das amostras, embora exista uma tendncia para o agrupamento das
cervejas produzidas no pas A (a azul). No entanto, quando se compara os resultados da
PCA nesta regio, com os resultados da PCA aplicada ao espectro completo (Figura 4.6),
observam-se claramente diferenas, mostrando a importncia de avaliar as sub-regies
separadamente (anlise mais fina), de modo a obter informao adicional e complementar.
Para interpretar a separao das amostras no mapa das coordenadas factoriais, necessrio
analisar o grfico das respectivas contribuies factoriais (Figura 4.12). Como se pode ver,
existe um elevado nmero de picos, assim como efeitos do tipo de primeira derivada, que
indicam pequenos desvios qumicos dos sinais, causados principalmente, como j foi
mencionado, por pequenas diferenas do pH das amostras (Tabela 4.1), o que dificulta a sua
interpretao. Deste modo, mais uma vez, foi efectuada uma PCA da regio aliftica, dos
PC2 (20%)
PC1 (32%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.11 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aliftica dos espectros 1H de RMN (LB
0,3 Hz).
72
Contribuies Factoriais
0,13
0,08
0,03
-0,02
2,5
1,5
0,5
-0,07
-0,12
-0,17
Desvio qumico (ppm)
PC1
PC2
Figura 4.12 Contribuies factoriais (PC1 e PC2) da regio aliftica dos espectros de RMN de 1H.
Na Figura 4.13 apresentam-se os mapas das coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da PCA
quando aplicada regio aliftica dos espectros processados com diferentes valores de LB
(2, 5, 10, 30 e 50 Hz), excluindo o sinal do etanol. Como se pode verificar, com o aumento
do valor de LB, parece existir uma tendncia evolutiva para o agrupamento das amostras
em funo da sua origem. No entanto, para LB 30 e 50 Hz essa tendncia no se mantm,
verificando-se, novamente, uma grande disperso das amostras. O valor de LB 10 Hz
aquele que, aparentemente, confere os melhores resultados em termos de separao das
cervejas, por origem geogrfica e tambm por data de fabrico. Tambm de notar que no
so visveis diferenas entre as garrafas do mesmo lote de fabrico, denotando uma
estabilidade instrumental e homogeneidade das amostras, nem sobreposies de amostras
provenientes de pases diferentes, como acontecia no caso dos espectros com LB 0,3 Hz.
Sendo assim, a anlise ser focada nestes resultados.
Para tentar perceber as razes desta separao analisaram-se os mapas das contribuies
factoriais de PC1 e PC2 resultantes da PCA da regio aliftica dos espectros de RMN
processados com LB 10 Hz (Figura 4.14).
73
b) LB 5 Hz
PC2 (24%)
PC2 (22%)
a) LB 2 Hz
PC1 (53%)
PC1 (42%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
A1
C3
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
B3
C1
C2
C3
d) LB 30 Hz
PC2(18%)
PC2 (17%)
c) LB 10 Hz
A2
PC1 (54%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC1 (51%)
C1
C2
C3
A1
A2
A3
B1
B2
PC2 (12%)
e) LB 50 Hz
PC1 (68%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.13 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aliftica dos espectros de RMN de 1H
processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10, d) 30 e e) 50 Hz.
74
a)
0,06
Actico
Succnico
0,03
Alanina
Leucina
Leucina
0
3
2,5
-0,03
1,5
0,5
Lctico
-0,06
Pirvico
-0,09
Desvio Qumico (ppm)
b)
Contribuies Factoriais de PC2
0,06
0,03
GABA
Leucina
GABA
Alanina
Leucina
0
3
2,5
1,5
0,5
-0,03
Lctico
-0,06
-0,09
Succnico
Desvio Qumico (ppm)
As amostras produzidas no pas A (a azul) podem ser distinguidas das amostras do pas B
(a vermelho) ao longo do eixo de PC1, uma vez que apresentam valores opostos neste eixo.
Assim, pela inspeco do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 4.14a)
podemos sugerir que as amostras do pas A (PC1 positivo) apresentam teores mais
elevados de leucina e alanina, ao contrrio das amostras situadas na parte negativa do eixo
de PC1 (cervejas do pas B). Estas, por sua vez, apresentam concentraes maiores de
cido lctico e pirvico, como se pode ver na Figura 4.15. O cido pirvico um produto
intermedirio da biossntese do etanol pela levedura e sabido, que cervejas com nveis
75
elevados de piruvato, possam ter sido produzidas com leveduras que sofrem autlise
(destruio da clula depois da sua morte) durante a fermentao. possvel, portanto, que
esse contedo mais alto de cido pirvico e o seu produto de reduo, o cido lctico,
possam ser indicativos da qualidade mais pobre da levedura ou da aco de geraes mais
velhas.
c. actico
Alanina
A1
c. Pirvico (+)
B2
c. Lctico (+)
C1
c. succnico
C3
2.8
Alanina (+)
GABA
GABA
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
ppm
Figura 4.15 Regio aliftica dos espectros de RMN H de 4 cervejas diferentes, identificadas
segundo a Tabela 4.1.
76
observao da Tabela 4.2. Nesta tabela encontram-se as quantidades estimadas nas amostras
de cerveja, dos 3 cidos orgnicos mencionados (lctico, pirvico e succnico). As
concentraes foram obtidas por integrao do sinal relativamente rea do TSP
(referncia de intensidade). O sinal do TSP surge a 0,0 ppm e conta com a contribuio de
9 protes (3 grupos metilo). O valor da rea do sinal, medido em todos os espectros,
reflecte a concentrao adicionada (0,02 %) a cada amostra. A concentrao desconhecida
do composto Y, presente na cerveja, pode ser calculada de acordo com a seguinte equao:
CY = F (AY.MY / nY) (CTSP . nTSP / MTSP)
Onde, C a concentrao, F o factor de diluio, A a rea do sinal integrado, M a massa
molecular e n o nmero de protes que contribuem para o sinal integrado (Duarte et al.,
2003).
Para cada pas de origem, e a partir dos espectros, determinaram-se as concentraes nas 9
amostras e calculou-se a mdia, com excepo das amostras produzidas no pas C, onde se
verificou uma grande disperso entre as datas de fabrico, podendo mesmo serem divididas
em 2 grupos: o grupo das amostras produzidas nas datas 1 e 2 (Fevereiro e Maro de
2002), com PC1 negativo, e o grupo das amostras C3, com PC1 positivo. Como se pode
ver no grfico das contribuies factoriais e confirmado pela observao dos espectros e da
tabela seguinte, as amostras C1 e C2 apresentam teores mais elevados de cido pirvico e
lctico do que as amostras C3. Isto tambm consistente com os valores de pH,
relativamente mais elevados, das cervejas C3. Estes resultados sugerem que as variaes
dentro de um local de produo podem reflectir a qualidade varivel da levedura ao longo
do tempo ou, alternativamente, dado que a maioria dos fabricantes de cerveja substituem
periodicamente a cultura da levedura, que a que foi usada para produzir as cervejas C3
poderia ser mais nova, em termos do nmero de geraes, do que a usada para produzir C1
ou C2.
77
Tabela 4.2 Concentrao de alguns cidos orgnicos, consoante o pas de origem da cerveja.
Concentrao (mg/L)
Composto
Pas C
Pas A
Pas B
28,9 3,0
68,9 6,6
28,1 2,1
25,1
71,6 8,6
100,0 4,4
93,1 14,2
63,4
64,2 3,2
78,6 8,6
70,5 8,4
64,6
(C1+C2)
Pas C (C3)
Na regio dos acares a PCA foi aplicada de 5,8-3,1 ppm, excluindo os sinais da gua
(4,77 ppm) e do etanol (3,64 ppm). Na Figura 4.16 podemos ver o grfico das coordenadas
factoriais PC1 vs. PC2, que conjuntamente explicam 83% da variabilidade total. As
cervejas do pas B, localizadas na parte negativa do eixo de PC1, esto claramente
separadas das restantes. As cervejas produzidas nos pases A e C esto agrupadas mas
mostrando grande disperso ao longo do eixo de PC1, com excepo das amostras C3
PC2 (21%)
PC1 (62%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.16 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio dos acares dos espectros 1H de RMN
(LB 0,3 Hz).
78
Como se pode ver na Figura 4.17 a anlise das contribuies factoriais de PC1 e PC2
muito complicada, devido aos efeitos do tipo de primeira derivada, e por isso, os espectros
foram processados com valores mais elevados de LB, que em seguida foram analisados por
Contribuies Factoriais
PCA.
0,07
0,02
-0,03
5,6
5,1
4,6
4,1
3,6
3,1
-0,08
-0,13
Desvio qumico (ppm)
PC1
PC2
Figura 4.17 Contribuies factoriais (PC1 e PC2) da regio dos acares dos espectros de RMN de
1
Na Figura 4.18 pode-se verificar que a distribuio das amostras no mapa das coordenadas
factoriais semelhante para os vrios LBs (2, 5, 10 e 30 Hz), embora com LB 10 Hz os
grupos sejam mais uniformes e, como foi visto anteriormente, a anlise das contribuies
factoriais mais facilitada, pois os efeitos do tipo de primeira derivada so menos
significativos. Assim, tal como foi feito na regio aliftica, os resultados da PCA aplicada
aos espectros processados com LB 10 Hz, foram analisados com mais pormenor.
79
b) LB 5 Hz
PC2 (24%)
PC2 (27%)
a) LB 2 Hz
PC1 (61%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC1 (66%)
C1
C2
C3
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
d) LB 30 Hz
PC2 (17%)
PC2 (21%)
c) LB 10 Hz
A1
PC1 (67%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC1 (66%)
C1
C2
C3
A1
A2
A3
B1
B2
B3
Figura 4.18 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio dos acares dos espectros de RMN de
1
H processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10 e d) 30 Hz.
80
a)
0,06
H1 (1-4)
0,03
H1 (red)
H1 (red)
0,00
5,6
5,1
4,6
4,1
3,6
3,1
3,6
3,1
H1 (1-6)
-0,03
H1 (1-4)
-0,06
Desvio Qumico (ppm)
b)
0,09
H1 (1-4)
0,06
H1
0,03
0,00
5,6
5,1
-0,03
H1 (1-4)
4,6
H1 (1-6)
4,1
H1 (red)
-0,06
Desvio Qumico (ppm)
Figura 4.19 Contribuies factoriais de a) PC1 e b) PC2 (regio dos acares LB 10 Hz).
A anlise da Figura 4.19 revela que as cervejas que se encontram na parte negativa do eixo
de PC1 (Figura 4.18c), produzidas nos pases A e C, com excepo das C3, so
caracterizadas pelos sinais a 4,96 (H1, 16) e a 5,3-5,4 (H1, 14) ppm, caractersticos
das dextrinas ramificadas, sugerindo que estas amostras contm teores mais elevados deste
tipo de acares. Por sua vez, as amostras C3 situam-se no quadrante com PC1 e PC2
positivos. Observando o grfico das contribuies factoriais de PC1 e PC2, pode-se
verificar que os valores positivos so devidos aos sinais a 4,63 (H1 red), 5,21 (H1 red) e
5,37 (H1, 14) ppm, caractersticos de dextrinas lineares. Finalmente, as cervejas do pas
81
B apresentam valores positivos de PC1 e valores negativos de PC2. Como j foi referido,
os valores positivos de PC1 so devidos aos sinais localizados a 4,63, 5,21 e 5,37 ppm,
caractersticos de dextrinas lineares. No entanto, no grfico das contribuies factoriais de
PC2, encontram-se valores negativos a 4,94 (H1, 16) e a 5,30-5,35 (H1, 14) ppm,
caractersticos de dextrinas ramificadas. Estes resultados podem parecer contraditrios,
mas indicam que as dextrinas das cervejas do pas B tm um grau de ramificao
intermdio, comparando com as restantes. Na Figura 4.20 esto apresentadas as regies dos
acares de 3 espectros, um de cada pas de origem. Como se pode ver, o espectro do pas
A aquele que apresenta um sinal mais largo a 5,3-5,4 ppm, caracterstico de dextrinas
ramificadas, enquanto que o espectro das cervejas C3 apresenta um pico mais estreito,
caracterstico de dextrinas lineares.
gua
A1
H1 (1-4)
H1 (1-6)
B2
H1 (1-4)
C3
H1 (red)
H1 (red)
5.5
5.4
5.3
5.2
5.1
5.0
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
4.4
4.3
4.2
ppm
Figura 4.20 Regio dos acares dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, identificadas segundo
a Tabela 4.1.
82
Para confirmar estes resultados, foi necessrio fazer uma anlise mais detalhada dos
espectros de RMN de 1H, integrar os picos relevantes e a partir desses valores calcular o
nmero mdio de anis de glucose e de pontos de ramificao por molcula (Duarte et al.
2003). O nmero mdio de anis de glucose por molcula obtido atravs da razo das
reas dos sinais dos protes H1 nas posies (1-4) e (1-6), cujos sinais aparecem a 5,305,40 e 4,9-5,0 ppm, respectivamente, e das reas dos protes redutores H1 (5,22 e 4,63
ppm para os anmeros e , respectivamente). O nmero mdio de pontos de ramificao
por molcula estimado atravs da razo entre o integral do pico dos protes H1 na
posio (1-6) (sinal a 4,9-5,0 ppm) e o integral dos picos H1 na posio (1-4), cujos
sinais aparecem a 5,3-5,4 ppm, multiplicada pelo nmero total de ligaes. Os resultados
(Tabela 4.3) mostram que as cervejas do pas A e as C1 e C2 contm dextrinas com um
maior nmero de pontos de ramificao, enquanto que as C3 so aquelas que tm um
menor nmero. Com um grau intermdio de ramificao temos as cervejas do pas B,
confirmando-se, assim, os resultados obtidos na PCA. Uma explicao possvel para estas
diferenas no grau de ramificao baseada na actividade das enzimas e -amilases,
envolvidas no processo de fabrico da cerveja. A -amilase uma endo-enzima com uma
resistncia trmica elevada e, por isso, sob determinadas condies trmicas pode ter
actuado por mais tempo que a -amilase, promovendo a presena de segmentos menos
ramificados de dextrinas. Este parece ser o caso das cervejas produzidas no pas B, em
contraste com as dos pases A e C (C1 e C2). Alm disso, parecem existir variaes
significativas no processamento no pas C, o que conduz s diferenas no grau de
ramificao entre as vrias datas de produo. Assim, as cervejas C3 so aquelas que
apresentam um grau de ramificao menor, sugerindo, a presena de quantidades
significativas de acares mais simples, como o caso da glucose, trealose e/ou maltose.
Estes acares podem ter permanecido na cerveja devido ao facto da fermentao no ter
sido completa, o que pode ter sido causado por um arrefecimento precoce ou uma
floculao das leveduras (Hughes e Baxter, 2001).
83
Tabela 4.3 Resultados dos clculos do tamanho mdio e pontos de ramificao das dextrinas.
N mdio de molculas de
glucose/molcula
5,8
N mdio de
ramificaes/molcula
0,57
5,0
0,43
C1 e C2
5,8
0,54
C3
4,5
0,35
Amostra
PC2 (19%)
derivada nos grficos das contribuies factoriais de PC1 e PC2 (no apresentados).
PC1 (43%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.21 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aromtica dos espectros 1H de RMN
(LB 0,3 Hz).
Tal como foi feito nas regies anteriores, para tentar eliminar os efeitos dos desvios,
processaram-se os espectros com diferentes valores de LB (2, 5, 10, 30 e 50 Hz). Como se
pode ver na Figura 4.22, com o aumento do valor de LB, as amostras tm tendncia a
84
PC2 (18%)
PC2 (22%)
a) LB 2 Hz
PC1 (47%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC1 (55%)
C1
C2
C3
A1
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
d) LB 30 Hz
PC2 (11%)
PC2 (16%)
c) LB 10 Hz
A2
PC1 (63%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC1 (69%)
C1
C2
C3
A1
A2
A3
B1
B2
B3
PC2 (9%)
e) LB 50 Hz
PC1 (71%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 4.22 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aromtica dos espectros de RMN de 1H
processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10, d) 30 e e) 50 Hz.
85
Apesar da disposio das amostras ser muito semelhante para os LBs 5, 10 e 30 Hz, notase uma ligeira melhoria quando a PCA aplicada aos espectros com LB 10 Hz e, por este
motivo, a anlise destes resultados foi feita em mais pormenor. Outro factor preponderante
nesta escolha o facto do grfico das contribuies factoriais desta PCA ser mais fcil de
analisar, ainda sem significativas perdas de informao espectral.
Analisando as contribuies factoriais de PC1 e PC2 (Figura 4.23), podemos verificar que
as amostras do pas A (PC2 positivo) so mais ricas em adenosina e/ou inosina (6,07, 8,26
e 8,35 ppm) e 2-feniletanol (7,32 e 7,38 ppm) e contm teores mais baixos de uridina (5,88
e 7,85 ppm), tirosina e/ou tirosol (6,88 e 7,17 ppm) e histidina (7,04 e 7,98 ppm), em
comparao com as cervejas produzidas no pas B (PC2 negativo). Em relao s cervejas
do pas B, nota-se uma ligeira variao em termos de datas de fabrico. Assim, as amostras
B2 esto na parte positiva do eixo de PC1 e distinguem-se das restantes por terem um teor
mais elevado de polifenis. Finalmente, as cervejas do pas C aparecem separadas
consoante a sua data de fabrico, ao longo do eixo de PC1. Este eixo sugere,
principalmente, variaes nas quantidades de 2-feniletanol (7,32 e 7,38 ppm), tirosina e/ou
tirosol e histidina (7,04 e 7,98 ppm). As amostras C3 (PC1 negativo) diferem das restantes
do pas C por serem mais ricas em 2-feniletanol e tirosina e/ou tirosol. A presena de
tirosol e 2-feniletanol na cerveja final pode ser devida degradao dos aminocidos.
Durante o processo de fabrico da cerveja, certos aminocidos so submetidos degradao
de Strecker e do origem a aldedos que, durante a fermentao, podem, enzimaticamente,
ser reduzidos aos seus lcoois correspondentes (Hughes e Baxter, 2001).
Estas observaes podem ser confirmadas atravs da anlise da Tabela 4.4, onde se
encontram as concentraes estimadas de alguns compostos que apresentam picos na
regio aromtica.
86
a)
Contribuies Factoriais de PC1
0,04
histidina
polifenis
0,02
uridina
citidina
citidina
0
9,8
8,8
7,8
6,8
5,8
-0,02
tirosina/
tirosol
-0,04
2-feniletanol
-0,06
b)
adenosina/
inosina
0,04
2-feniletanol
adenosina/
inosina
0,02
0
9,8
8,8
7,8
6,8
5,8
-0,02
histidina
-0,04
uridina
-0,06
tirosina/
tirosol
uridina
As concentraes dos vrios compostos, presentes na tabela, foram obtidas por integrao
do sinal respectivo, relativamente rea do TSP (Duarte et al., 2003). Tal como foi feito na
regio aliftica, para cada pas de origem, e a partir dos espectros, determinaram-se as
concentraes nas 9 amostras e calculou-se a mdia, com excepo das amostras C3, que
denotam demasiadas diferenas em relao s outras amostras do pas C.
Como se pode ver, as amostras do pas C apresentam teores mais elevados de citidina e
uridina, a amostras C1 e C2 contm os teores mais altos de adenosina/inosina enquanto que
as amostras C3 so mais ricas em 2-feniletanol, histidina e tirosina/tirosol.
87
Concentrao (mg/L)
Composto
Pas C
Pas A
Pas B
68,1 8,9
49,2 2,7
78,6 4,3
48,4
101,5 19,7
125,9 9,3
119,2 13,8
91,2
113,2 9,2
122,2 3,3
125,8 13,6
132,8
44,3 9,0
53,1 4,3
50,7 2,4
54,1
96/127
107/140
108/142
126/166
106,7 20,3
142,8 11,7
127,9 14,0
132,4
(C1+C2)
Pas C (C3)
Na Figura 4.24 esto apresentadas as regies aromticas dos espectros de RMN de cervejas,
dos vrios pases de origem. Nesta regio aparecem sinais de vrios compostos, muitos dos
quais sobrepostos, o que dificulta a sua interpretao e da a necessidade da PCA. Como se
pode ver, as amostras do pas A so mais ricas em adenosina/inosina e 2-feniletanol,
enquanto que as amostras do pas B contm teores mais elevados de uridina e
tirosina/tirosol. Quanto s amostras do pas C, nota-se claramente diferenas no perfil
aromtico consoante a data de fabrico, principalmente na zona 7,3-7,5 ppm (fenilalanina e
2-feniletanol) e 8,1-8,4 ppm, onde se encontram sinais de adenosina/inosina e alguns
compostos no identificados.
88
feniletanol
(+)
Adenosina/
inosina
A1
Tirosina/
Tirosol (+)
uridina (+)
B2
citidina
histidina
C1
C3
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
Figura 4.24 Regio aromtica dos espectros de RMN de 1H de 4 cervejas, identificadas segundo a
Tabela 4.1
4.5 Concluses
A anlise da regio da impresso digital dos espectros de FT-IR permitiu a deteco dos
compostos maioritrios da cerveja, nomeadamente acares e etanol. Deste modo, a
Anlise em Componentes Principais dos espectros mostraram, apenas, pequenas variaes
nestes compostos. Foi constatado que as cervejas produzidas no pas B apresentavam
teores mais elevados de etanol enquanto que as cervejas do pas A, produzidas na data 3,
apresentavam teores mais elevados de maltose e dextrinas. Estes resultados so
promissores, mas seria necessrio um estudo mais aprofundado afim de se poder
89
90
Referncias
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91
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93
94
5.1
Introduo....................................................................................................................... 96
5.2
5.3
5.4
5.5
Referncias..................................................................................................................................... 116
95
5.1 Introduo
Em Portugal, o consumo de cerveja elevado e, como sabemos, uma mesma marca de
cerveja pode ser produzida em vrios centros produtivos localizados em diferentes regies
do pas. Quando um consumidor bebe uma cerveja no norte ou no sul, espera que ela
apresente as mesmas caractersticas sensoriais, independentemente da regio onde foi
produzida.
Com este estudo pretendeu-se avaliar se a composio qumica de um mesmo tipo e marca
de cerveja, variam em funo do local e data de fabrico. Neste caso, as amostras foram
produzidas no mesmo pas, ao contrrio das amostras estudadas no captulo anterior, cujos
resultados foram publicados recentemente (Almeida et al., 2006), que foram produzidas
em diferentes pases. Assim, pretendeu-se avaliar o problema numa dimenso diferente e,
investigar se a proximidade dos centros produtivos permite o controlo mais efectivo das
diferentes variveis do processo, nomeadamente, tipo de levedura, qualidade do malte,
temperatura, qualidade da gua, tipo de equipamentos e modo operativo. Para isso,
seleccionaram-se amostras de 3 centros produtivos, cuja qualidade do malte igual. O
lpulo tambm seleccionado de igual modo para os 3 locais e para minimizar ainda mais
as diferenas, a gua tratada, quer por osmose inversa, quer por troca inica, para igualar
ou aproximar os nveis de sais nos diferentes processos de fabrico. As condies operativas
so iguais, mas, no entanto, podem existir diferenas a nvel da sala de fabrico, pois os
equipamentos podem ser ligeiramente diferentes.
96
Codificao
Cidade
Data de Produo
Garrafa
pH
A1a
A1b
A1c
A2a
A2b
A2c
A3a
A3b
A3c
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Nov-03
Nov-03
Nov-03
Jan-04
Jan-04
Jan-04
Mar-04
Mar-04
Mar-04
a
b
c
a
b
c
a
b
c
4,48
4,45
4,45
4,56
4,56
4,53
4,38
4,39
4,39
B1a
B1b
B1c
B2a
B2b
B2c
B3a
B3b
B3c
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Dez-03
Dez-03
Dez-03
Jan-04
Jan-04
Jan-04
Mar-04
Mar-04
Mar-04
a
b
c
a
b
c
a
b
c
4,35
4,36
4,37
4,41
4,47
4,39
4,65
4,63
4,63
C1a
C1b
C1c
C2a
C2b
C2c
C3a
C3b
C3c
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Dez-03
Dez-03
Dez-03
Fev-04
Fev-04
Fev-04
Abr-04
Abr-04
Abr-04
a
b
c
a
b
c
a
b
c
4,54
4,58
4,58
4,67
4,63
4,70
4,47
4,44
4,42
97
Abs. (U.A.)
gua
A1
Zona de
impresso
digital
3600
3100
2600
2100
1600
1100
B2
C1
600
-1
Figura 5.1 Espectros tpicos de FT-IR (4000-600 cm-1) de amostras de cerveja estudadas.
98
Dextrinas
Etanol
Abs. (U.A.)
Dextrinas
A1
B2
C1
1180
1130
1080
1030
980
Figura 5.2 Regio da impresso digital dos mesmos espectros de FT-IR apresentados na Figura
5.1.
PC2 (13%)
PC1 (33%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.3 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da regio da impresso digital dos espectros das
27 amostras de cerveja estudadas.
99
le1
A1
18
15
12
15
TSP
8
lo1
B1
1,2,3
17
17
13
13
9
16
sa3
C3
14
14
H2O
10,11
ppm
Figura 5.4 Espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada local de fabrico (1-propanol, 2isobutanol, 3-isopentanol, 4-etanol, 5-lctico, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10ctrico, 11-mlico, 12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina, 17histidina, 18-fenilalanina).
100
Como se pode observar, os sinais mais intensos so devidos ao etanol, enquanto que os
mais fracos so os da regio aromtica (5,8-10 ppm). Na regio dos acares (3-5,8 ppm)
observamos forte sobreposio de sinais devido similaridade entre os ambientes qumicos
caracterizando os vrios protes. Podemos, ainda, encontrar diversos sinais, tais como,
lcoois (isopentanol, isobutanol e propanol), aminocidos (prolina, histidina, fenilalanina e
alanina), cidos orgnicos (actico, pirvico, succnico, ctrico e mlico) e nuclesidos
(uridina, citidina, adenosina e inosina).
Por simples inspeco visual dos espectros no possvel detectar diferenas, que possam
ser relacionadas com o local de fabrico ou a data de produo, devido no s ao elevado
nmero de picos e suas sobreposies, bem como grande complexidade de cada sinal.
Assim, com o objectivo de procurar as principais fontes de variabilidade dos espectros de
RMN de 1H das amostras de cerveja analisadas, realizou-se uma PCA comeando pela
anlise apenas da regio aliftica (0,5-3,1 ppm) dos espectros e excluindo o sinal do etanol
(1,17 ppm).
O estudo por PCA foi feito sistematicamente por regies espectrais, de forma a tentar
detectar as variaes nos compostos minoritrios, especificamente de natureza aliftica e
aromtica. Na regio aliftica observam-se contribuies de sinais de lcoois, aminocidos
PC2 (19%)
e cidos orgnicos alifticos. A Figura 5.5 mostra o resultado obtido, na regio em estudo.
PC1 (32%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.5 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aliftica dos espectros de RMN
de 1H (LB 0,3 Hz) das 27 amostras estudadas.
101
0,2
Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. actico
Contribuies Factoriais
0,15
0,1
0,05
0
-0,05
2,9
2,6
2,3
1,7
1,4
1,1
0,8
0,5
-0,1
-0,15
c. actico
Desvio Qumico (ppm)
PC1
PC2
No entanto, a anlise do grfico da Figura 5.6 mostra que as principais diferenas se devem
a alteraes de desvio qumico causadas por diferenas de pH (pH = 0,35) entre as
amostras, alteraes essas que originam efeitos do tipo de primeira derivada no grfico das
contribuies factoriais. Na figura indica-se um exemplo deste efeito para o sinal do cido
actico a 2,0 ppm. Para tentar minimizar estes efeitos, que no reflectem alteraes de
composio, os espectros de RMN foram processados com factores de LB superiores (2, 5
e 10 Hz), o que faz diminuir a resoluo espectral, diminuindo, em princpio, a influncia
dos artefactos. Na Figura 5.7 podemos ver o resultado da PCA aplicada tambm regio
aliftica desses espectros.
102
a) LB 2 Hz
b) LB 5 Hz
PC2 (16%)
PC2 (19%)
1
2
PC1 (43%)
A1
A2
A3
B1
B2
PC1 (57%)
B3
C1
C2
C3
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
PC2 (24%)
c) LB 10 Hz
PC1 (57%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.7 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aliftica dos espectros de RMN
de 1H a) LB 2 Hz, b) LB 5 Hz e c) LB 10 Hz.
Como se pode observar a melhor separao das amostras, em funo do local de fabrico,
ocorre quando se usam os espectros processados com LB 5 Hz (Figura 5.7-b). Por exemplo,
de notar a aproximao das amostras B1 e B3, pertencentes ao grupo B, assim como as
amostras A2 e C2. Assim, podem considerar-se 3 grupos, onde j no se verifica a
separao por lote de fabrico, ou seja, no h separao entre garrafas produzidas na
mesma data, como na PCA dos espectros processados com LB 0,3 Hz. Isto parece sugerir
que as diferenas entre amostras de garrafas produzidas na mesma data correspondem a
pequenas diferenas de pH. A separao evidenciada pelos grupos 1, 2 e 3 indicados acima
revela-se de maior importncia como explicado a seguir.
103
O grupo 1, constitudo pelas amostras A1, A3, C1 e C2, est situado no PC1 negativo e
analisando o grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 5.8), verifica-se que estas
amostras apresentam um contedo mais elevado de cido pirvico, que as restantes. Como
se sabe, na fermentao alcolica das leveduras, o cido pirvico , numa primeira etapa,
descarboxilado em dixido de carbono e acetaldedo, sob aco da enzima piruvato
descarboxilase, que tem por coenzima o pirofosfato de tiamina (ou vitamina B1), que
contm zinco (Zn2+) (Campos, 1998; Ricardo e Teixeira, 1993). Se o cido pirvico est
em excesso, porque houve alguma deficincia na sua descarboxilao. Isso pode ter
acontecido, caso a filtrao do mosto tenha provocado uma reteno elevada de
micronutrientes, neste caso, do zinco, e realmente, tanto no centro produtivo A, como em
C, o equipamento de filtrao semelhante e provoca reteno de mais micronutrientes
que no centro produtivo B. de salientar ainda que as cervejas deste grupo obtiveram
todas uma classificao no satisfatria no controlo da estabilidade organolptica
(informao fornecida pelo laboratrio da indstria fornecedora das amostras), o que
mostra que a PCA detectou diferenas nestas cervejas, tambm detectveis pelo painel de
provadores que as avaliaram. As diferenas podem estar relacionada com o descrito
anteriormente ou com outras propriedades no identificveis.
0,08
0,04
Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. succnico
0,02
Prolina
0,06
Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. actico
Alanina
0
-0,02
2,5
1,5
0,5
-0,04
-0,06
c. pirvico
-0,08
-0,1
Desvio qumico (ppm)
104
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
-0,02
2,5
1,5
0,5
-0,04
-0,06
c. succnico
-0,08
-0,10
-0,12
c. actico
Desvio qumico (ppm)
Por sua vez, o grupo 3, localizado na parte positiva do eixo de PC1, constitudo pelas
amostras A2, B2 e C3, que so caracterizadas por terem um teor mais elevado de alanina e
prolina. Tanto no centro produtivo A como em C, a velocidade de fermentao e de
agitao bastante rpida, o que dificulta o controlo do processo. Deste modo, de esperar
que o teor de aminocidos possa variar em funo da fermentao local. A amostra B2
parece ser uma amostra atpica, uma vez que no encaixa nas explicaes dos diferentes
grupos.
De forma a confirmar os resultados obtidos pela PCA, comparou-se a regio aliftica dos
espectros de 3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e 3). Verificou-se, que a amostra A1
105
c. pirvico
(+)
A1
(Grupo 1)
c. actico
(+)
c. succnico
(+)
B1
(Grupo 2)
C3
(Grupo 3)
3.0
2.8
alanina
(+)
prolina
(+)
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
ppm
Figura 5.10 Regio aliftica dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e
3).
106
produtivo B (B2), que esto separadas das restantes produzidas nesse centro, agrupadas no
grupo 2. Com as amostras do centro C, tambm se verifica que uma data se diferencia das
restantes duas. Essas amostras foram produzidas em Abril de 2004 (C3) e esto contidas no
grupo 3. A razo para estas diferenas de composio entre as amostras fabricadas em
datas distintas poder ter a ver com as condies de fermentao, nomeadamente, estado
da levedura, temperatura ambiente, controlo de parmetros especficos do processamento,
equipamento usado na sala de fabrico, entre muitos outros, o que se reflecte na estabilidade
organolptica das cervejas. Deste modo, no existem diferenas correlacionveis com o
local de fabrico, mas sim diferenas casuais, relacionveis com as condies de
processamento.
De seguida, a PCA foi aplicada regio dos acares (3,1-5,8 ppm), onde tal como o nome
indica, se encontram sinais de acares (dextrinas, essencialmente) e tambm de alguns
lcoois.
Na Figura 5.11 esto representadas as coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da PCA
aplicada a esta regio dos espectros de RMN de 1H, processados com LB 0,3 Hz (espectros
originais). Nesta figura, podemos observar 3 grupos, onde se nota uma grande disperso
das amostras, ou seja, todos os grupos contm contribuies de todos os locais de fabrico.
Uma vez mais, o efeito do tipo de primeira derivada, observado nas contribuies
factoriais (no mostradas), pareceu condicionar os resultados observados. Por este motivo,
processaram-se os espectros com diferentes valores de LB, tendo-se seleccionado os
resultados obtidos com o LB 5 Hz para discusso.
107
PC2 (10%)
PC1 (73%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.11 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 0,3 Hz).
Na Figura 5.12 esto representadas as coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da PCA
aplicada regio dos acares dos espectros de RMN de 1H, processados com LB 5 Hz.
PC2 (28%)
PC1 (57%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.12 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).
108
Como se pode observar, por comparao da Figura 5.11 com a Figura 5.12, a distribuio
das amostras semelhante. Isto confirma que, tendo em conta a composio em acares,
no possvel, agrupar as amostras em termos de local de fabrico, mas que parece haver
grande variabilidade, em todos os locais, em termos de data de fabrico. Veja-se, por
exemplo, as amostras do centro de produo A: as produzidas em Novembro de 2003 (A1)
esto contidas no grupo B, as Janeiro de 2004 (A2), esto dispersas pelos grupos A e C e as
de Maro de 2004 (A3) esto no grupo C. Isto significa que a variabilidade na composio
em acares, originada por datas diferentes de produo, mais importante que variaes
entre locais de fabrico, mostrando que no existem diferenas efectivas entre os centros de
produo e que as diferenas so pontuais, talvez causadas por variaes nas condies de
processamento.
Analisando o grfico das contribuies factoriais (Figura 5.13), para tentar perceber o
porqu da separao, verificamos que o grupo 1, com PC1 negativo, caracterizado por
serem amostras com maior teor de acares simples e pequenos, como o caso da glucose
e da maltose (sinais caractersticos a 4,63 (H1 red), 5,21 (H1 red) e 5,37 (H1, 14)
ppm). Em contrapartida, os grupos 2 e 3, com PC1 positivo, tm maior teor de acares
ramificados, como o caso das dextrinas (sinais caractersticos a 4,96 (H1, 16) e a 5,35,4 (H1, 14) ppm). O que separa o grupo 2 do 3 o PC2: para um PC2 positivo (grupo
2) temos um maior teor de glucose (sinais caractersticos a 5,37 (H1, 14) e 5,21 (H1
red) ppm).
109
a)
0,08
0,06
H1 (1-4)
0,04
H1 (1-6)
0,02
0,00
5,5
4,5
-0,02
-0,06
3,5
3,5
H1 (red)
H1 (red)
-0,04
H1 (1-4)
Desvio Qumico (ppm)
b)
0,06
H1 (1-4)
0,04
H1 (red)
0,02
0,00
5,5
4,5
-0,02
-0,04
-0,06
Desvio Qumico (ppm)
Figura 5.13 Contribuies factoriais de a) PC1 e b) PC2 (regio dos acares LB 5 Hz).
Na Figura 5.14 esto apresentadas as regies dos acares dos espectros de RMN de 1H de
3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e 3). Como se pode ver, pela simples observao dos
espectros no so detectveis diferenas, que possam estar relacionadas com a separao
das amostras.
110
gua
(supresso do
sinal)
A1
(Grupo 2)
H1 (red)
H1 (red)
B1
(Grupo 3)
H1 (16)
H1 (14)
C3
(Grupo 1)
5.7
5.6
H1 (11)
5.5
5.4
5.3
5.2
5.1
5.0
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
4.4
4.3
4.2
ppm
Figura 5.14 Regio dos acares dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada grupo
(1, 2 e 3).
Verifica-se tambm que na disposio das amostras no grfico das coordenadas factoriais
de PC1 vs. PC3 (Figura 5.15), se pode agora, observar claramente, a separao das amostras
por local de produo (azul-A, vermelho-B e verde-C) no eixo PC3. No entanto, a
variabilidade explicada por este PC apenas de 9%, confirmando que as diferenas entre
os locais de fabrico so muito tnues. A explicao destas diferenas, com base na
contribuio factorial PC3 (Figura 5.16) no muito clara, mas o suficiente para se poder
dizer que as amostras do centro produtivo C (PC3 negativo) tm maior teor de acares
ramificados que as do B e isso poder ser devido a, mais uma vez, diferenas das
condies de fermentao, estado da levedura, diferenas a nvel de equipamento da sala
de fabrico, etc. Uma explicao para tal, pode ser o facto de em B, o arranque da
fermentao ser mais rpido, e por isso, a levedura mais eficiente. Em contrapartida, o
processo mais lento na sala de fabrico, possibilitando um tempo de hidrlise mais
111
elevado, ou seja, a -amilase pode hidrolisar um maior nmero de acares e por isso que
PC3 (9%)
PC1 (57%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.15 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC3) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).
0,04
H1(red)
0,03
H1(red)
0,02
0,01
0
-0,01
5,5
4,5
3,5
-0,02
-0,03
-0,04
H1(14)
-0,05
Desvio Qumico (ppm)
112
de notar tambm uma grande disperso das amostras ao longo do eixo de PC1, que volta
a mostrar a variabilidade em termos de data de fabrico. Tambm se observa variabilidade
entre garrafas do mesmo lote, que pode ser devida a fermentaes que ocorram no interior
das garrafas, causadas pela presena de quantidades vestigiais de leveduras selvagens, que
tenham contaminado as amostras aquando da sua preparao e anlise por RMN. Estas vo
consumindo os acares e por isso que, principalmente, nesta regio se observa a
variabilidade entre garrafas.
PC2 (29%)
PC1 (33%)
A1
A2
A3
B1
B2
B3
C1
C2
C3
Figura 5.17 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aromtica dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).
113
Da anlise do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 5.18), podemos concluir
que as cervejas do grupo 1, com PC1 negativo, so caracterizadas por terem teores mais
elevados de tirosina/tirosol e fenilalanina e teores menores de uridina, citidina e histidina,
relativamente s restantes cervejas. Esta diferena poder estar relacionada, com o facto de
no centro produtivo B, a levedura ser mais eficiente, ou ento a agitao ter sido maior, o
que levou utilizao da terceira famlia de aminocidos, tirosina, triptofano e
fenilalanina, para produzir tirosol, triptofol e feniletanol, respectivamente.
PC1
0,08
Contribuies Factoriais
0,06
0,04
citidina
0,02
0
10,3
-0,02
-0,04
9,8
9,3
8,8
8,3
uridina
histidina
uridina
citidina
7,8
7,3
Fenilalanina
6,8
6,3
5,8
Tirosina/
Tirosol
-0,06
-0,08
Desvio Qumico (ppm)
114
tirosina/
tirosol
fenilalanina
B3
(Grupo 1)
histidina
citidina
B1
(Grupo 2)
uridina
uridina
citidina
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
5.5 Concluses
Como se viu, a Anlise em Componentes Principais (PCA) dos espectros de FT-IR das
amostras de cerveja produzidas no mesmo pas no mostrou separao, nem em termos de
local de fabrico, nem em termos de data de produo. Este facto pode sugerir duas
hipteses: ou realmente no existem diferenas entre as amostras de cerveja analisadas, ou
ento o FT-IR no a tcnica adequada para detectar essas diferenas. Mas, face aos
resultados obtidos por RMN sugere-se que, realmente, existem diferenas entre as
amostras, principalmente em termos de data de fabrico, consequncia de pequenas
variaes nas condies de processamento.
A Anlise em Componentes Principais da regio aliftica (isto em termos de composio
em compostos alifticos) dos espectros de RMN de 1H sugere a separao das amostras em
3 grupos, que, no entanto, no correspondem aos 3 locais de fabrico. Verifica-se sim, uma
variabilidade importante, para cada local de produo, entre algumas datas de produo, o
que poder significar que as diferenas entre as amostras se devem a diferentes condies
de fermentao, e processamento, nomeadamente, ao nvel dos equipamentos da sala de
fabrico.
115
A anlise da regio dos acares tambm mostrou a separao das amostras em 3 grupos,
mostrando estes, grande variabilidade em termos de local e data de fabrico. Essa separao
deve-se diferente composio e teor de acares. A anlise do componente principal PC3
permitiu a separao das amostras por local de fabrico, mostrando que as amostras do
centro produtivo C tm maior teor de acares mais ramificados que as do B, e isso poder
ser devido a, mais uma vez, diferenas nas condies de fermentao, estado da levedura e,
principalmente, diferenas no equipamento da sala de fabrico dos diferentes centros.
Nesta regio tambm se observa variabilidade entre garrafas do mesmo lote, que pode ser
devida a alteraes dentro da prpria garrafa, causadas por vestgios de leveduras
selvagens, que, porventura, tenham contaminado as amostras aquando da preparao e
anlise das mesmas.
A PCA na regio aromtica separa as amostras em 2 grupos, com base nos teores de alguns
aminocidos e nuclesidos. No entanto, no existem indcios que a separao tenha a ver
com o local de fabrico. Quanto data de produo, verifica-se que as amostras produzidas
em B, em Janeiro e Maro (B2 e B3), se distanciam das restantes, no mapa das
coordenadas factoriais, apresentando teores mais elevados de fenilalanina, tirosina e
tirosol.
Em suma, os resultados mostraram que dentro do mesmo pas, as diferenas mais
significativas entre as amostras, no tm a ver com o local de produo, mas sim com a
data de fabrico. Verificaram-se alteraes que podem estar relacionadas com as condies
de processamento, nomeadamente temperatura, estado da levedura e condies de
armazenamento.
Referncias
Almeida, C.; Duarte, I.; Barros, A.; Rodrigues, J., Spraul, M.; Gil, A. Composition of
Beer by 1H NMR Spectroscopy: Effects of Brewing Site and Date of Production Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 54; 700-706; 2006.
116
117
118
6.1
Introduo..................................................................................................................... 120
6.2
6.3
6.4
Referncias..................................................................................................................................... 135
119
6.1 Introduo
Tal como foi referido na introduo, a produo de cerveja foi uma das primeiras
aplicaes da biotecnologia. A transformao da cevada em malte, a extraco das
matrias-primas na brassagem e a bio-converso das substncias nutritivas do mosto pela
levedura (lcool e outros metabolitos) so a resultante de reaces bioqumicas. A
actividade das enzimas catalizadoras daquelas reaces e a sua formao dependem das
caractersticas genticas da cevada, da estirpe da levedura e da sua expresso fenotpica,
tendo em conta as variaes do meio e a tecnologia utilizada.
Contrariamente ao vinho, o mosto da cerveja fabricado e a sua composio pode ser
regulada, dentro de certos limites.
O objectivo da fermentao , em primeiro lugar, produzir uma cerveja com o perfil de
aroma e gosto que corresponda aos desejos do consumidor. Este aspecto do problema
difcil de atingir e manter, necessitando de longos estudos das regulaes bioqumicas
implicadas. Actualmente, podemos dizer que a maior parte daquelas regulaes esto
compreendidas, os compostos resultantes da fermentao e participantes no aroma e gosto
da cerveja podem ser apreciados sensorialmente, apesar do limite de percepo ser por
vezes muito baixo, mantendo-se, no entanto, difcil e morosa a sua quantificao analtica.
Apesar dos mecanismos bioqumicos estarem hoje elucidados, a indstria cervejeira
continua, assim, a utilizar os mesmos organismos que a indstria do passado e a praticar a
fermentao descontnua, no agitada e a baixa temperatura, excepo da capacidade e
geometria dos fermentadores que evoluiu.
Vrias metodologias analticas tm sido aplicadas ao estudo da fermentao,
nomeadamente, cromatografia lquida, espectroscopia de infravermelho, espectrometria de
massa, cromatografia gasosa e mais, recentemente por Membrane Inlet Mass
Spectrometry (MIMS), que um mtodo especfico e sensvel para a anlise de
compostos orgnicos volteis em amostras lquidas e gasosas (Tarkiainen et al., 2005).
Mas estas tcnicas so limitadas a certos grupos de compostos e necessitam de um prtratamento da amostra, o que por vezes moroso. Deste modo, torna-se imperioso, estudar
mtodos alternativos que possam dar respostas mais rpidas.
120
Amostra
Etapa
pH
Empastagem do Malte
5,72
5,83
Caldeira de sacarificao
5,51
Incio de ebulio
5,34
Fim de ebulio
5,12
Incio de fermentao
4,63
Fim de fermentao
4,69
Cerveja Filtrada
4,54
As amostras com mais resduos slidos foram centrifugadas a 20000 rpm, durante 15 min.
a 10C e depois filtradas antes da anlise por espectroscopia de RMN (e.g. amostras 1, 2 e
3). As amostras 4, 5 e 6 foram apenas filtradas, enquanto que as amostras 7 e 8 foram
desgaseificadas, num banho ultra-snico, durante 10 min.
121
122
Na Figura 6.1 est representada a Regio Aliftica (0,5 3,1 ppm) dos espectros de RMN
de 1H das vrias amostras recolhidas ao longo do processo de fabrico da cerveja.
GABA
alanina
leucina
isoleucina
prolina
Etanol
actico
6
succnico
pirvico
lcoois
8
ctrico/
malico
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
ppm
Figura 6.1 Regio aliftica dos espectros de RMN de 1H de amostras do processo de fabrico da
cerveja.
123
1
2
PC2 (14%)
8
7
6
PC1 (69%)
Figura 6.2 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio aliftica.
124
O grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 6.3) mostra que as contribuies
positivas so devidas, principalmente aos cidos orgnicos, nomeadamente cido
succnico, pirvico, actico, ctrico e mlico, e isoleucina. Assim, as amostras finais (6, 7
e 8), tal como era de esperar, apresentam maiores teores destes compostos, uma vez que
eles so produtos do metabolismo das leveduras (Campos, 1998). Tambm se observa,
perfeitamente, que a amostra 6 (incio da fermentao) a que apresenta os menores
teores, pois tem um valor de PC1 mais baixo, em relao s amostras 7 e 8.
Em relao s amostras iniciais, localizadas na parte negativa do eixo de PC1, pode-se
dizer que tm maior teor de aminocidos, tais como, alanina, leucina, GABA e prolina. Tal
facto era esperado, uma vez que a levedura ainda no comeou a metabolizar os nutrientes
disponveis, no consumindo, portanto, os aminocidos presentes no meio, provenientes da
hidrlise enzimtica das protenas do malte.
0,6
actico
0,4
succnico
isoleucina
pirvico
0,2
ctrico/
malico
0
3
-0,2
2,5
1,5
0,5
leucina
GABA
prolina
GABA
alanina
-0,4
Desvio qumico (ppm)
Na Figura 6.4 pode-se observar os espectros de RMN de 1H das 2 amostras com maior
diferena em termos de composio qumica (1 - empastagem do malte e 7 - fim da
fermentao) e assim confirmar os resultados da PCA. A amostra 1 mais rica em
aminocidos enquanto que a amostra 7 apresenta teores mais elevados de cidos orgnicos
e etanol.
125
Face ao nmero reduzido das amostras estudadas, a aplicao da PCA tem um interesse
relativo, pois a informao que se retira tambm facilmente detectada pela anlise dos
espectros. No entanto, e dado que esta tcnica exploratria, pode permitir analisar um
maior nmero de espectros, num curto espao de tempo e assim facilitar o controlo do
processo de fabrico.
Depois se serem analisadas mais amostras, em diversas fases do processo e ao longo do
tempo, este mtodo pode permitir a identificao concreta do passo do processo de fabrico
em que determinada amostra se encontra e assim, a optimizao das condies de
processamento, de modo a tornar mais rentvel e mais fivel o fabrico de cerveja.
alanina
Amostra 1
isoleucina
prolina
GABA
leucina
GABA
3.0
2.5
Amostra 7
2.0
1.5
EtOH
1.0
0.5
ppm
1.0
0.5
ppm
actico
pirvico
succnico
ctrico/
malico
3.0
2.5
2.0
1.5
126
Nos espectros da Regio dos Acares (3,1-5,8 ppm), representados na Figura 6.5, pode-se
observar que a principal diferena reside na quantidade e tipo de acares.
H1 (1-4)
H1 (red)
H1 (red)
EtOH
7
H1 (1-6)
H2O
8
H1 (1-1)
5.6
5.4
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
ppm
Figura 6.5 Regio dos acares dos espectros de RMN de H das vrias amostras do processo de
fabrico da cerveja.
127
Assim, na amostra inicial, a quantidade de acares simples muito mais elevada, pois os
sinais dos protes redutores so mais abundantes (H1 red e H1 red). Estes acares, tal
como vimos na introduo geral, provm da hidrlise enzimtica dos grnulos de amido,
que ocorre durante o processo da maltagem. Por sua vez, durante o processo de
fermentao, a levedura consome os aminocidos e os acares simples do mosto para
produzir dixido de carbono e etanol, e por isso, no final do processo, os acares que
permanecem em maior quantidade, so os acares mais ramificados, nomeadamente
dextrinas, que no foram metabolizadas pela levedura (Hughes e Baxter, 2001). Estes
compostos apresentam sinais mais largos a 3,7-4,0 ppm e a 5,3-5,4 ppm, como se pode ver
nos espectros das amostras 7 e 8.
Tal como na regio anterior, a PCA foi aplicada regio dos acares comprimida, por
integrao de 59 pontos sucessivos, de modo a ficar com 250 desvios qumicos, retirando
os sinais da gua e do etanol. Na Figura 6.6 esto representadas as coordenadas factoriais de
PC1 vs. PC2 da anlise da regio dos acares. Novamente, as amostras 7 e 8 esto
separadas das restantes, o que j era de esperar, uma vez que so amostras recolhidas aps
a fermentao, cuja composio em acares totalmente diferente da inicial.
PC2 (26%)
4
8
7
5
3
6
PC1 (62%)
Figura 6.6 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio dos acares.
128
A anlise do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 6.7) revela que os sinais
positivos advm da contribuio de protes anomricos (H1 red e H1 red),
caractersticos dos acares simples, mono e dissacardeos, o que demonstra o elevado teor
destes acares antes do incio da fermentao. Em contrapartida, os sinais negativos,
caractersticos das amostras 7 e 8, so devidos a picos que advm de ligaes H1 (1-4) e
H1 (1-6), responsveis pelas ramificaes dos acares. Estes acares permanecem na
cerveja pois no conseguem ser metabolizados pela levedura (Hughes e Baxter, 2001;
Campos, 1998).
0,4
H1 (1-4)
H1 (red)
0,3
0,2
H1 (red)
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
5,6
5,1
4,6
4,1
3,6
3,1
H1 (1-1)
H1 (1-4)
H1 (1-6)
-0,4
Desvio Qumico (ppm)
Na Figura 6.8 podemos observar os espectros de RMN de 1H das 2 amostras com maior
diferena em termos de composio qumica (1 - empastagem do malte e 7 - fim da
fermentao) e assim confirmar os resultados da PCA. A amostra 1 mais rica em
acares simples fermentveis, enquanto que a amostra 7 apresenta teores mais elevados
de acares maiores e ramificados, como o caso das dextrinas.
129
H1 (1-4)
Amostra 1
H1 (red)
H1 (1-6)
5.8
5.6
5.4
5.2
5.0
4.8
H1 (red)
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
ppm
3.6
3.4
ppm
EtOH
H1 (1-4)
Amostra 7
H2O
H1 (1-1)
5.8
5.6
5.4
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
Na Figura 6.9 esto apresentados os espectros da Regio Aromtica (5.8-10 ppm) das
amostras do processo de fabrico da cerveja. Como se pode ver, os espectros das amostras
iniciais so mais simples, revelando o baixo teor em compostos aromticos. Estes
compostos so resultantes de vrias etapas do processamento. Por exemplo, os lcoois
aromticos superiores so produzidos pelo metabolismo secundrio das leveduras na
degradao dos aminocidos. Assim, a degradao da fenilalanina e da tirosina do origem
ao feniletanol e ao tirosol, respectivamente (Hughes e Baxter, 2001).
130
Fenilalanina
Histidina
Uridina/
Citidina
Tirosina
3
Feniletanol
Histidina
Polifenis
9.0
8.5
Tirosol
Citidina
Uridina
Histidina
Uridina
Citidina
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
Figura 6.9 Regio aromtica dos espectros de RMN de 1H das vrias amostras do processo de
fabrico da cerveja.
131
PC2 (12%)
3 4
5
8
2
1
PC1 (75%)
Figura 6.10 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio aromtica.
A anlise do grfico das contribuies factoriais (Figura 6.11), mostra que as amostras de 1
a 5, situadas no PC1 negativo do mapa das coordenadas factoriais, contm teores mais
elevados de citidina, tirosina e fenilalanina. Em contrapartida, as amostras 7 e 8 (situadas
no eixo de PC1 positivo), apresentam teores mais elevados de tirosol, histidina, feniletanol,
132
0,4
Tirosol
Feniletanol
0,2
Polifenis
Uridina
Histidina
0
9,8
8,8
7,8
6,8
Citidina
5,8
Citidina
-0,2
Fenilalanina
-0,4
Tirosina
Desvio Qumico (ppm)
Na Figura 6.12 esto apresentados os espectros, da regio aromtica, das amostras 1 e 7, por
serem as amostras com maior diferena a nvel da composio aromtica. Como se pode
ver, o perfil aromtico da amostra 1 muito mais simples, uma vez que ainda no ocorreu
a fermentao, enquanto que o da amostra 7 apresenta muito mais compostos,
nomeadamente polifenis, nuclesidos e lcoois, confirmando assim os resultados da PCA.
133
Tirosina
Fenilalanina
Amostra 1
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
Histidina
2-Feniletanol
Amostra 7
Histidina
Polifenis
Tirosol
Citidina
Uridina
Citidina
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
ppm
6.4 Concluses
Em primeiro lugar, este estudo permitiu demonstrar que a espectroscopia de Ressonncia
Magntica Nuclear, associada a mtodos quimiomtricos, pode ter aplicabilidade no
controlo de qualidade do processo de fabrico da cerveja. Assim, possvel acompanhar a
composio qumica do mosto ao longo das vrias etapas e detectar eventuais anomalias. O
controlo efectivo do processo permite a optimizao das condies de fabrico com vista
rentabilizao e qualidade e segurana do produto final. No entanto, para a tcnica ter
maior aplicabilidade e fiabilidade necessrio ajustar o modo de quantificao dos
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Referncias
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