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Universidade de Aveiro Departamento de Qumica

2006

Cludia Isabel
Mtodos Espectroscpicos para o Estudo da
Rodrigues de Almeida Cerveja

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica


2006

Cludia Isabel
Mtodos Espectroscpicos para o Estudo da
Rodrigues de Almeida Cerveja

Dissertao apresentada Universidade de Aveiro para cumprimento dos


requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Qumica e Qualidade
dos Alimentos, realizada sob a orientao cientfica da Doutora Ana Maria
Pissarra Coelho Gil, Professora Associada do Departamento de Qumica da
Universidade de Aveiro e do Doutor Antnio de Sousa Barros, Investigador
Auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro.

Apoio financeiro da Bruker BioSpin


GmbH, Alemanha.

cidade de Aveiro e a tudo o que ela significa para mim

O jri
Presidente

Doutora Ivonne Delgadillo Giraldo


Professora Associada com Agregao da Universidade de Aveiro

Doutor Timothy Hogg


Professor Associado da Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Catlica Portuguesa,
Porto

Doutora Ana Maria Pissarra Coelho Gil (orientadora)


Professora Associada da Universidade de Aveiro

Doutor Antnio Csar da Silva Ferreira


Investigador da Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Catlica Portuguesa, Porto

Doutor Antnio de Sousa Barros (co-orientador)


Investigador Auxiliar da Universidade de Aveiro

Agradecimentos

Gostaria de expressar um especial e sincero agradecimento Doutora Ana


Gil e ao Doutor Antnio Barros, orientadores deste trabalho, pela
disponibilidade revelada para a discusso e esclarecimento de quaisquer
dvidas, bem como, o empenho, dedicao e disponibilidade demonstradas.
Iola Duarte, agradeo toda a partilha de conhecimentos, colaborao e
amizade.
Agradeo tambm ao Doutor Manfred Spraul, que acreditou no meu trabalho
e o tornou possvel, devido ao apoio financeiro concedido.
Este trabalho no teria sido possvel sem o apoio da UNICER, Bebidas de
Portugal, S.A., mais propriamente da Dra. Cristina Gonalves e Eng Maria
Manuel Dantas, que to gentilmente cederam algumas das amostras para o
estudo em questo e ajudaram a interpretar os resultados.
Agradeo igualmente a todos os meus colegas de trabalho do Laboratrio de
Bioqumica e Qumica Alimentar, assim como a todos os colegas do Mestrado
em Qumica e Qualidade dos Alimentos, especialmente Snia Regina,
Filomena, Carla, ao Gonalo e ao Nuno, pelo apoio constante, abertura
discusso e amizade.
Um especial agradecimento Andreia Dias, pela sua amizade e pelo apoio
incondicional.
A todos os meus amigos de Aveiro, pela compreenso, apoio e nimo que
foram transmitindo ao longo destes anos, em especial Joana, Brbara e
Teresa; sem eles teria sido bem mais difcil.
Aos meus pais por me terem apoiado com todo o seu carinho e compreenso
durante toda esta caminhada.
Ao Rui, o reconhecimento pelo seu apoio nos momentos mais difceis, a sua
compreenso e acima de tudo o seu amor.

Palavras-chave

cerveja, origem, controlo de qualidade, RMN, FTIR, espectroscopia, anlise


multivariada

Resumo

O trabalho apresentado nesta dissertao pretendeu desenvolver e aplicar


mtodos espectroscpicos, em especial, espectroscopia de Ressonncia
Magntica Nuclear (RMN) e espectroscopia de infravermelho com
Transformada de Fourier (FT-IR), acoplados com a anlise em componentes
principais (PCA), na caracterizao qumica da cerveja e consequente
correlao com variveis, tais como, origem/local (pas ou cidade) e data de
produo.
No captulo 1 esto apresentados os vrios objectivos deste trabalho
enquanto que no captulo 2 (Introduo Geral) se descrevem a origem, o
processo de fabrico e a composio qumica da cerveja, assim como os
fundamentos dos mtodos usados.
No captulo 3 mostram-se os resultados da aplicao da espectroscopia de
RMN no estudo da composio qumica da cerveja. O espectro de RMN de
1
H apresenta elevada complexidade e contm informao sobre uma vasta
gama de compostos. Recorrendo a espectros bidimensionais possvel
identificar vrios compostos, incluindo acares, aminocidos e cidos
orgnicos.
No captulo 4 apresenta-se um estudo sobre a determinao da origem e data
de produo de cervejas produzidas em diferentes pases. A espectroscopia
de FT-IR e a PCA permitiram distinguir algumas cervejas com base no seu
teor alcolico e contedo em maltose e dextrinas. Por sua vez, a
espectroscopia de RMN acoplada com a PCA detectou compostos (e.g. cido
pirvico, lctico e dextrinas) que possibilitam a separao por pas de origem
e data de fabrico. No captulo 5 so descritos os resultados da aplicao das
mesmas metodologias, mas em cervejas produzidas num mesmo pas.
Pretendeu-se averiguar se um controlo mais efectivo das diferentes variveis
(qualidade da gua, tipo de matrias-primas, condies ambientais e tipo de
equipamento) pode ainda provocar diferenas na composio qumica da
cerveja. No foi encontrada uma separao clara entre os locais de fabrico,
nem por espectroscopia de FT-IR nem por RMN. No entanto, esta ltima
permitiu a distino entre algumas cervejas produzidas em datas diferentes.
Esta separao deve-se, por exemplo, ao contedo em aminocidos e
nuclesidos, que pode estar relacionado com diferentes condies de
processamento, estado da levedura e tipo de equipamento.
Finalmente, no captulo 6 feita uma abordagem preliminar ao estudo do
processo de fabrico da cerveja por espectroscopia de RMN. Esta metodologia
poder ser uma mais valia no controlo de qualidade efectivo e rpido e
optimizao de processos industriais.

Keywords

beer, origin, quality control, NMR, FTIR, spectroscopy, multivariate analysis

Abstract

The work reported in this thesis aimed at developing and applying


spectroscopic methods, mainly nuclear magnetic resonance (NMR)
spectroscopy and Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, in tandem
with principal component analysis (PCA), for the thorough chemical
characterization of beer and its correlation with variables such as production
site (country or town) and date of production.
In chapter 1 the objectives of this work are presented while in chapter 2
(General Introduction) the origins, process of production and general chemical
composition of the beer are described, as well as the fundamentals of the
methods employed.
Chapter 3 presents the results of the application of high resolution NMR for the
characterisation of the chemical composition of beer. The 1H spectra show a
high complexity and contain information about many compounds. Spectral
assignment is carried out with basis on 1D and 2D NMR spectra, resulting in
the identification of many components, including sugars, amino acids and
organic acids.
Chapter 4 presents a study about the determination of production origin and
date of beers produced in different countries. FT-IR spectroscopy and PCA
allowed to distinguish some beers on basis of its ethanol, maltose and
dextrins content. Some compounds (e.g. pyruvic and lactic acids and dextrins)
have been detected by NMR spectroscopy and PCA and found to allow the
separation of samples by origin country and date of production. In chapter 5,
the results of the application of the same methodologies to beers produced
nationally are described. Here, the aim was to determine if even though a
more effective control of the different variables (water quality, kind of matters,
environmental conditions and kind of equipment) is possible, there still are
meaningful differences between samples. It wasnt found a clear separation
between production sites, neither by FT-IR or NMR spectroscopy. However,
NMR spectroscopy allowed the distinction between some beers produced in
different dates. It was observed that the differences found relate, for example,
to amino acids and nucleosides content, which may be related to variables
such as different conditions of processing, yeast age and type and equipment
conditions.
Finally, in chapter 6 a preliminary approach to the study of beer production by
NMR spectroscopy is made. This methodology could be valuable in the
effective and fast quality control and for the industrial processes optimization.

ARTIGOS EM REVISTAS INTERNACIONAIS COM ARBITRAGEM:


1.

Duarte, I.F., Barros, A., Almeida, C., Spraul, M., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR
and FTIR Data as a Potential Tool for the Quality Control of Beer, Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 52, 1031-1038, 2004.

2.

Nilsson, M., Duarte, I.F., Almeida, C., Delgadillo, I., Goodfellow, B.J., Gil, A.M., Morris,
G.A., High Resolution NMR and Diffusion Ordered Spectroscopy of Port Wine, Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 52(12), 3736-3743, 2004.

3.

Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Rodrigues, J., Spraul, M., Gil, A.M., The composition
of beer by 1H NMR spectroscopy: the effects of brewing site and date of production,
Journal of Agriculture and Food Chemistry, 54, 700-706, 2006.

PROCEEDINGS DE CONFERNCIAS:
1.

Duarte, I.F., Almeida, C., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR and FTIR
Data for the Quality Control of Beer, 6Th International Conference on Applications of
Magnetic Resonance to Food Science, Paris, France, 2002.

2.

Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate analysis of FTIR and NMR
data of beer as a potential tool for its quality control, 6 Encontro de Qumica de Alimentos,
Lisboa, Portugal, 2003.

3.

Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Multivariate Analysis of NMR and FTIR
Data of Beer as a Potential Tool for its Quality Control, 2 ELBRMN, Sintra, Portugal,
2003.

4.

Almeida, C., Duarte, I.F., Barros, A., Gil, A.M., Application of FTIR and NMR
Spectroscopy for the Determination of Origin and Date of Production of Beer, 7Th
International Conference on Applications of Magnetic Resonance to Food Science,
Copenhagen, Denmark, 2004.

5.

Almeida, C., Barros, A., Gil, A.M., Application of Outer Product-PCA for the
characterization of beers by FTIR and NMR Spectroscopy, CAC-2004, Chemometrics in
Analytical Chemistry, Lisboa, Portugal, 2004.

6.

Gil, A.M., Almeida, C, Duarte, I.F., Barros, A., Gonalves, C., Ferreira, A.A., Application
of NMR spectroscopy for the quality control of beer, 30th International EBC Congress,
Praga, Repblica Checa, 30th International European Brewing Convention (EBC) Congress,
Fachverlag Hans Carl, Netherlands, 2005.

ndice

Objectivos.................................................................................................................................. 5

Introduo Geral........................................................................................................................ 7
2.1

A Origem e o Processo de Fabrico da Cerveja.............................................................................. 8

2.2

Composio Qumica e Propriedades da Cerveja ....................................................................... 16

2.2.1

Compostos Responsveis pela Espuma, Cor e Turvao da Cerveja ...................................... 16

2.2.2

Compostos Responsveis pelo Sabor e Aroma da Cerveja...................................................... 20

2.3

Fundamentos dos Mtodos Usados .............................................................................................. 27

2.3.1

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) .............................. 27

2.3.2

Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de Alta Resoluo ..................... 31

2.3.3

Anlise em Componentes Principais (PCA) ............................................................................ 37

Referncias....................................................................................................................................... 39
3

Estudo da Composio Qumica da Cerveja por Espectroscopia de RMN ............................. 43


3.1

Introduo .................................................................................................................................... 44

3.2

Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 45

3.3

Anlise dos Espectros de RMN 1D e 2D ...................................................................................... 46

3.4

Concluses ................................................................................................................................... 53

Referncias....................................................................................................................................... 53
4

Determinao do Pas e Data de Fabrico de Cervejas Produzidas Internacionalmente........... 57


4.1

Introduo .................................................................................................................................... 58

4.2

Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 60

4.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR .......................................................................... 63

4.4

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN............................................................................ 66

4.5

Concluses ................................................................................................................................... 89

Referncias....................................................................................................................................... 91
5

Determinao do Local e Data de Fabrico de Cervejas Produzidas no mesmo Pas............... 95


5.1

Introduo .................................................................................................................................... 96

5.2

Materiais e Mtodos..................................................................................................................... 96

5.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR ...........................................................................98

5.4

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN ..........................................................................100

5.5

Concluses ..................................................................................................................................115

Referncias ..................................................................................................................................... 116


6

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do Processo de Fabrico da Cerveja.......... 119


6.1

Introduo...................................................................................................................................120

6.2

Materiais e Mtodos ...................................................................................................................121

6.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN ..........................................................................122

6.4

Concluses ..................................................................................................................................134

Referncias ..................................................................................................................................... 135


7

Concluses Finais e Propostas de Trabalho Futuro ............................................................... 139

Abreviaturas e Smbolos

Abs

Absorvncia

ATR

Reflexo Total Atenuada (Attenuated Total Reflection)

DMS

Sulfeto de dimetilo (Dimethyl sulfide)

DOSY

Diffusion-Ordered Spectroscopy

FID

Decaimento Livre Induzido (Free Induction Decay)

FT-IR

Infravermelho com Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared)

GABA

cido -aminobutrico (-Aminobutyric Acid)

HPLC

Cromatografia Lquida de Alta Presso (High-Performance Liquid


Chromatography)

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

INEPT

Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer

Constante de acoplamento

LB

Line Broadening

LC

Cromatografia Lquida (Liquid Chromatography)

MLEV-17

Malcom Levitts Composite-pulse Decoupling Sequence

MS

Espectrometria de Massa (Mass Spectrometry)

PC

Componente Principal (Principal Component)

PCA

Anlise em Componentes Principais (Principal Components Analysis)

ppm

Partes por milho

RMN

Ressonncia Magntica Nuclear

SNIF

Site-specific Natural Isotope Fractionation

TOCSY

Total Correlation Spectroscopy

TSP

3-(trimetilsilil)-propionato-2,2,3,3-d4 de sdio (sodium 3-(trimethylsilyl)propionate)

U.A.

Unidades Arbitrrias

VDK

Dicetonas Vicinais (Vicinal DiKetones)

Objectivos

1 OBJECTIVOS
Pretende-se com esta dissertao avaliar o potencial das tcnicas espectroscpicas de
Infravermelho com Transformadas de Fourier (FT-IR) e Ressonncia Magntica Nuclear
de Alta Resoluo (RMN) acopladas com mtodos quimiomtricos, para a anlise de
amostras de cerveja, nomeadamente na seleco e identificao de compostos qumicos
que as possam caracterizar, principalmente a nvel qualitativo.
Os principais objectivos foram:
i) elaborar uma caracterizao detalhada da composio qumica da cerveja por
espectroscopia de RMN (1D e 2D);
ii) estudar a influncia da origem/local de fabrico na composio qumica da cerveja;
iii) identificar e avaliar as principais variaes de composio entre as cervejas produzidas
em diferentes datas;
iv) elaborar um estdio preliminar das variaes qumicas da cerveja nas diferentes etapas
do processo de fabrico da cerveja;
v) avaliar o potencial da espectroscopia de RMN, acoplada a mtodos estatsticos, para
aplicao rotineira na indstria, para controlo do produto e do processo.
cada vez mais premente desenvolver tcnicas rpidas de anlise que permitam o controlo
do processo de fabrico da cerveja, no s para garantir a segurana do consumidor final,
como para permitir a optimizao dos processos e consequente reduo de custos. No
entanto, a cerveja uma mistura complexa e, obviamente, o controlo de qualidade envolve
a determinao de muitos parmetros diferentes. Os mtodos de anlise padronizados mais
tradicionais requerem tempo e, normalmente, envolvem um pr-tratamento da amostra, por
exemplo, uma concentrao ou uma extraco. Assim, e uma vez que a espectroscopia de
FT-IR e RMN so tcnicas no destrutivas e que permitem a deteco e quantificao de
vrias famlias de compostos em simultneo, em apenas alguns minutos, pretendeu-se
aplicar estes mtodos, em conjunto com ferramentas multivariadas, no estudo da cerveja. A
necessidade destas ferramentas prende-se com o facto de, por um lado, os espectros
apresentarem sinais complexos, e por outro, devido ao elevado nmero de amostras a

analisar, revelando-se inexequvel qualquer tentativa de extrair informao suficiente e til


de todos os dados.
Todavia, a aplicao da espectroscopia de RMN nas indstrias alimentares nacionais ainda
no uma realidade muito frequente, uma vez que os equipamentos representam um
esforo econmico demasiado elevado e, ao mesmo tempo, porque so necessrias pessoas
qualificadas para os operarem. Deste modo, seria importante tornar os mtodos mais
acessveis, recorrendo por exemplo, a modelos estatsticos e automao, de forma a
garantir a viabilidade tcnica e econmica numa indstria alimentar.

2 INTRODUO GERAL

2.1

A Origem e o Processo de Fabrico da Cerveja ................................................................ 8

2.2

Composio Qumica e Propriedades da Cerveja.......................................................... 16

2.2.1

Compostos Responsveis pela Espuma, Cor e Turvao da Cerveja ......................... 16

2.2.2

Compostos Responsveis pelo Sabor e Aroma da Cerveja ........................................ 20

2.3

Fundamentos dos Mtodos Usados ................................................................................ 27

2.3.1

Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) ................. 27

2.3.2

Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de Alta Resoluo........ 31

2.3.3

Anlise em Componentes Principais (PCA)............................................................... 37

Referncias....................................................................................................................................... 39

2.1 A Origem e o Processo de Fabrico da Cerveja


Uns gros cados numa pedra esburacada, uma chuva fina, seguida de uns dias tpidos e
o milagre da fermentao produz o primeiro dos antecessores do que hoje conhecemos por
cerveja
in O Mundo da Cerveja, 2001
A cerveja tem as suas origens em pocas anteriores presena do homem sobre a Terra.
Milhares de anos depois, j em pleno Neoltico, quando o homem comea a dar os
primeiros passos no pastoreio e agricultura, desenvolveram-se lentamente os processos de
elaborao da cerveja. Os Sumrios, 5000 anos antes de Cristo, foram os primeiros a impor
regras ao fabrico da cerveja. Chamavam-lhe sikaru e consideravam-na uma bebida
medicinal e sagrada. Os Babilnios que lhes sucederam, deixaram-nos j muitos
testemunhos de uma indstria cervejeira florescente. O mesmo acontece relativamente aos
Egpcios, onde a cerveja se tornou um verdadeira bebida nacional; bebiam-na o povo e os
reis, era oferecida a deuses, figurava nos tesouros dos sarcfagos notveis. Na Etipia, no
Norte de frica, entre os Gregos e os Persas, a cerveja aparece como bebida corrente, mas
foi o domnio romano que a espalhou pela Europa para combater uma grave crise na
cultura cerealfera. Atravs da Glia chega Gr-Bretanha, Escandinvia e Pennsula
Ibrica e depressa se torna a bebida favorita dos povos do Norte (Unio Cervejeira, 1993;
O Mundo da Cerveja, 2001).
A origem etimolgica da palavra cerveja encontra-se no latim cervesia, designao
especfica de bebida fermentada. Os Gauleses chamavam-lhe cerevisia, provavelmente
evocadores de Ceres, deusa das colheitas. O aproveitamento do final verbal da expresso
latina cervesiam bibere deve ter dado origem s palavras que noutras lnguas europeias
designam a cerveja (bire, bier, beer).
Naturalmente, que a cerveja ter tido, ao longo dos anos, diferentes caracterizaes, com o
trao comum, de ser uma bebida fermentada, obtida a partir dos cereais. S no incio do
sculo XVI, se precisou na Europa o contedo da palavra cerveja bebida constituda
pelo cozimento ou infuso de cevada germinada e gros crus de outros cereais,

Introduo Geral

aromatizada pelo lpulo e fermentada pela aco de leveduras. Foi porm no sculo XIX
que o fabrico da cerveja recebeu um maior impulso, atravs da resoluo de dois
problemas fundamentais: o isolamento das leveduras responsveis pela fermentao, o que
ficou a dever-se a Pasteur, e a possibilidade de manuteno dos tanques de fermentao e
as caves de guarda a temperaturas convenientemente baixas, durante todo o ano.
Hoje em dia, a histria da cerveja comea com o gro de cevada maduro, saudvel, com
um tamanho considervel e com um contedo de protenas moderado (para um cereal) de
10-12 %. O gro tem uma forma, aproximadamente, ovide, rodeado por camadas
protectoras de casca, com um pequeno embrio na ponta. Este embrio a parte que cresce
para dar origem nova planta (os primeiros rebentos verdes so denominados por
plmula), enquanto o endosperma persiste como fonte de alimento (Hughes e Baxter,
2001).
O processo de fabrico da cerveja envolve vrias etapas, que se encontram representadas, de
um modo geral, na Figura 2.1, e que so discutidas e comentadas no texto que se segue.
Todavia, consoante o tipo de cerveja, o diagrama de produo diferente, pois h certas
fases que so alteradas ou mesmo eliminadas, para conferir propriedades distintas
cerveja. Neste diagrama no se apresenta a maltagem (processo de germinao dos gros
de cevada), pois no constitui uma fase do diagrama de produo da cerveja.
O principal objectivo do processo de maltagem eliminar, na maior extenso possvel, as
-glucanas das paredes celulares e algumas protenas insolveis que possam obstruir o
acesso das enzimas ao interior dos grnulos de amido da farinha. Durante o processo
desenvolvem-se, tambm, enzimas especficas que vo converter o amido em acares
solveis (Lewis e Young, 1996).
Na maltagem, a cevada molhada de modo a que o seu teor de gua aumente de 12% para
cerca de 45% (Hughes e Baxter, 2001; Unio Cervejeira, 1993). O aumento do teor de
gua estimula a respirao do embrio e hidrata as fontes de amido do endosperma. Com
este aumento de actividade do embrio, produzem-se hormonas naturais que se difundem
para o interior da aleurona onde vo estimular a produo de enzimas hidrolticas, durante
a germinao. O gro hmido , ento, levado a germinar durante alguns dias. Durante este

tempo tem de se fazer um arejamento adequado para manter a temperatura a cerca de 16 C


e, assim, evitar as perdas de gua (Unio Cervejeira, 1993). De entre as enzimas
hidrolticas produzidas neste processo fazem parte: 1) as amilases, que quebram as cadeias
de amido; 2) as proteases, que atacam as protenas e 3) as enzimas celulticas, que
hidrolisam as paredes celulares. Tambm se produzem -glucanases que vo actuar sobre a
parede celular do endosperma permitindo, assim, que as restantes enzimas se difundam at
ao amido, onde comeam por quebrar a estrutura celular e as reservas de protenas, amido
e lpidos, com o objectivo de providenciar nutrientes nova planta. Este processo dura
cerca de 4 ou 5 dias, aps os quais, a maior parte das paredes celulares devero encontrarse hidrolisadas, para no causarem problemas numa fase posterior do processo. Parte das
protenas insolveis de elevado peso molecular devem estar hidrolisadas em pequenos
fragmentos (peptdeos e aminocidos) e uma quantidade suficiente de enzimas amilolticas
devem ter sido sintetizadas. Nesta altura, a maior parte do amido permanece intacto, com
excepo dos grnulos pequenos (cerca de 2 m de dimetro), que so os primeiros a
serem degradados durante o processo de maltagem. Se estes grnulos persistirem no malte
(nome dado cevada depois do processo de maltagem) podem causar problemas na
filtrao do mosto (Hughes e Baxter, 2001, Lewis e Young, 1996).
Quando a plmula atinge cerca de da dimenso do gro, o que acontece volta do 8 dia
de germinao, o processo interrompido (Unio Cervejeira, 1993). Os gros so secos a
cerca de 50 C para inibir actividades enzimticas e para produzir um material estvel, que
pode ser guardado. Este processo tambm remove componentes volteis responsveis pelo
aroma indesejvel a cereais e favorece o desenvolvimento de outros aromas mais
desejveis. Um aquecimento posterior, acima dos 85 C faz o malte atingir a colorao
pretendida e o aroma peculiar. Elevadas temperaturas (mais de 200 C) podem ser
aplicadas quando se pretende produzir maltes especiais com sabor e aroma a caf,
caramelo e/ou torrado. Os diferentes tipos de malte servem, depois, para produzir
diferentes tipos de cervejas, com aroma e sabor distintos.
O processo de fabrico da cerveja propriamente dito inicia-se com a transformao do malte
em farinha Brassagem (Figura 2.1). Esta farinha introduzida numa caldeira de
empastagem, onde misturada com gua a cerca de 65 C, durante 1 hora. A esta
temperatura, o amido gelatiniza e pode ser atacado pelas enzimas presentes na mistura,

10

Introduo Geral

previamente formadas durante a germinao. D-se, assim, a sacarificao do amido, passo


decisivo na obteno do mosto, xarope lquido e doce. Este lquido contm,
principalmente, maltose e glucose (acares fermentveis) e quantidades significativas de
pequenas cadeias de dextrinas (acares no fermentveis). O mosto tambm contm
protenas solveis, polipeptdeos e aminocidos. A mistura final segue depois para o filtro
ou cuba-filtro, onde so separados os resduos de malte (Lewis e Young, 1996, Unio
Cervejeira, 1993).

Brassagem

Malte

Farinha

gua

Empastagem
Separao do mosto
Mosto doce + restos dos gros
Ebulio
Filtrao

Lpulo

Mosto amargo
Levedura

Fermentao
Cerveja imatura
Maturao
Estabilizao
Filtrao
CERVEJA

Figura 2.1 Esquema simplificado de um diagrama de produo de cerveja (adaptado de Hughes e


Baxter, 2001).

De seguida, o mosto introduzido numa caldeira de ebulio onde so adicionados o


lpulo e o extracto de lpulo. A mistura levada a ferver vigorosamente durante cerca de 2
horas. A operao de ebulio tem as seguintes finalidades principais: esterilizao e
concentrao do mosto, reduzindo, por evaporao o volume de gua; destruio das

11

enzimas, evitando que os desdobramentos prossigam durante a fermentao; coagulao de


substncias azotadas instveis; extraco dos princpios aromticos (leos essenciais que
contribuem para o aroma da cerveja), da humulona e de outros cidos- do lpulo (Figura
2.2), que depois de isomerizados, conferem ao mosto o seu amargor caracterstico e um

certo poder anti-sptico (Hughes e Baxter, 2001; Nord et al., 2003; Unio Cervejeira,
1993).
OH
R
O
R

HO
HO

HO

cidos-

OH
CO

R (cadeia lateral):
-COCH2CH(CH3)2 = Humulona
-COCH(CH3)2 = Cohumulona
-COCH(CH3)CH2CH3 = Adhumulona

cidos iso-

Figura 2.2 Estrutura dos cidos do lpulo (Hughes e Baxter, 2001).

A maior parte dos compostos contidos no lpulo, e que so essenciais para o aroma da
cerveja, so volteis e podem-se perder na evaporao durante a ebulio. Assim, o
processo de ebulio deve ser controlado de modo a que a sua extenso seja suficiente para
coagular protenas e isomerizar os cidos do lpulo, mas, permitindo ainda reter
quantidades apreciveis dos compostos aromticos.
Durante a ebulio ocorrem, tambm, reaces de acastanhamento (browning) (Figura
2.3) entre os acares redutores e as aminas primrias do mosto, resultando num aumento

da cor e perda de algum azoto aminado (Hughes e Baxter, 2001).

12

Introduo Geral

OH

NR

NHR

OH

OH

HO

HO

+RNH 2
HO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

CH2OH

CH2OH

CH2OH

-RNH 2
H

-H2O

CHO

+RNH 2

Pigmento

OH

CH2OH

OH

OH

OH

-H2O

CH2OH

+RNH 2

Pigmento

Figura 2.3 Reaces de acastanhamento (browning) ocorridas durante a ebulio do mosto


(Hughes e Baxter, 2001).

Finda a ebulio, o mosto separado das substncias coaguladas e dos resduos de lpulo,
por simples decantao, por centrifugao ou, ainda, por filtrao. Procede-se, de seguida,
ao seu arrefecimento at uma temperatura na ordem dos 7 C, arrefecimento este que
provoca a precipitao dos componentes proteino-tnicos. Uma vez clarificado e
refrigerado, o mosto lupulado est pronto para a operao seguinte (Unio Cervejeira,
1993).
A fermentao ocorre a 7-13 C nas cervejas lager e a 16-18 C nas cervejas ale. O
mosto clarificado e refrigerado bombeado para cubas de fermentao, sendo-lhe
adicionada a levedura de cultura apropriada ao tipo de cerveja que se quer produzir. Por

13

exemplo, nas cervejas lager a levedura do tipo fermentao baixa (bottom


fermenting), enquanto que nas cervejas ale a levedura do tipo fermentao alta (top
fermenting) (Lewis e Young, 1996). Durante a fermentao a levedura consome os
aminocidos e acares do mosto. Estes so metabolizados para produzir dixido de
carbono e etanol, segundo a reaco seguinte:
C6H12O6 2 CO2 + 2 C2H5OH
Os aminocidos so usados no crescimento celular e, por isso, no fim da fermentao a
massa celular deve ter aumentado cerca de 20 vezes. A levedura tambm produz
compostos volteis, principalmente lcoois e steres, que contribuem para o aroma e sabor.
Sendo assim, o tipo de levedura usado determinante para as caractersticas organolpticas
da cerveja.
A fermentao no incio tumultuosa, com abundante formao de espuma; torna-se
depois, progressivamente mais lenta, at que a levedura se deposita no fundo do tanque.
Realiza-se em cubas fechadas para que o anidrido carbnico em excesso possa ser
recuperado e mais tarde utilizado (aps depurao e liquefaco), quer na correco da
carbonatao da prpria cerveja, quer para a sua extraco do barril. Esta operao
corresponde fermentao de um tipo de cerveja designado por de fermentao baixa ou
lager. No caso de cervejas de fermentao alta ou ale, as clulas de levedura, em vez de
se depositarem nas cubas, sobrenadam na cerveja. Hoje em dia, com o avanar da
tecnologia, tanto as lager como as ale so fermentadas em cubas cilindro-cnicas
fechadas, que permitem uma separao fcil da levedura para uma possvel reutilizao
(Hughes e Baxter, 2001; Unio Cervejeira, 1993).
A maturao corresponde ao perodo de estacionamento da cerveja, a temperatura
adequada, com o objectivo de permitir a libertao dos componentes volteis indesejveis
s caractersticas finais da bebida. Durante este tempo, quantidades relativamente pequenas
de levedura permanecem em contacto com a cerveja, para produzirem mais dixido de
carbono, que permite a carbonatao da cerveja e a purga dos compostos volteis
indesejveis. As leveduras ajudam ainda na remoo de certos componentes activos do

14

Introduo Geral

sabor e aroma, catalisam, particularmente, a reduo das dicetonas vicinais, como o


diacetilo, em diis que no afectam o sabor/aroma (Hughes e Baxter, 2001).
A estabilizao a operao seguinte do ciclo de fabrico e consiste em deixar estabilizar o
lquido, a temperaturas entre os 0 C e -2 C, de modo a permitir que a cerveja se equilibre
coloidalmente. Esta estabilizao, que ocorre no mesmo tanque em que se realizou a
fermentao ou noutro de caractersticas idnticas, vai proporcionar a clarificao do
mosto, pois permite a deposio das clulas de levedura ainda existentes e dos cogulos
que ainda se possam formar devido ao arrefecimento. Ao mesmo tempo, o dixido de
carbono libertado durante a fermentao vai-se dissolvendo no lquido (Unio Cervejeira,
1993).
A filtrao ocorre logo que o tcnico cervejeiro julgue a cerveja suficientemente matura e
estabilizada. esta operao que d cerveja a sua limpidez cristalina, eliminando-se os
ltimos elementos de turvao, ainda em suspenso. Consiste em bombear o lquido
atravs de um meio filtrante adequado (Unio Cervejeira, 1993). A cerveja, agora, est
pronta!
O enchimento a ltima operao, aquela que permite aproximar a cerveja do consumidor
final, quer em garrafa, lata ou barril. Com o objectivo de assegurar um determinado nvel
de carbonatao da cerveja, esta operao processa-se em condies isobaromtricas, isto
, ter de haver presses iguais na enchedora e na embalagem a encher. Nesta fase final, h
que evitar a todo o custo a entrada de ar nas embalagens, pois isso provocaria posteriores
oxidaes e um envelhecimento precoce. que a cerveja, ao contrrio dos vinhos que
possuem grau alcolico bem mais elevado, s tem a perder com a idade (Unio Cervejeira,
1993).

15

2.2 Composio Qumica e Propriedades da Cerveja


2.2.1 Compostos Responsveis pela Espuma, Cor e Turvao da
Cerveja
A Espuma, a Cor e a Turvao da cerveja so trs parmetros, claramente, apreciados pelo
consumidor e de importncia vital para a sua seleco e satisfao. Deste modo,
necessrio conhec-los, saber o que os pode afectar e como se podem adaptar ao gosto do
cliente.
A Espuma um sistema coloidal constitudo por uma fase gasosa descontnua e uma fase
lquida ou slida contnua. A quantidade de lquido que se mantm na espuma ,
fortemente, dependente do tempo, o que complica o estudo deste sistema heterogneo. A
espuma da cerveja estabilizada pela presena de polipeptdeos e cidos, fornecidos pelo
lpulo, e que proporcionam o amargor caracterstico. No entanto, existem muitos outros
compostos, que contribuem para as caractersticas e propriedades da espuma.
Existe uma grande variedade de protenas na espuma, sendo a protena Z da cevada, aquela
que se encontra em maiores quantidades. Tambm existe uma poro significativa de
protenas derivada das clulas da levedura. As protenas glicosiladas no-enzimticas, as
glicoprotenas, as protenas de elevado ponto isoelctrico ou as protenas hidrofbicas, so
apontadas como grandes contribuintes para a estabilidade da espuma. Mais precisamente,
o seu carcter anfiptico, isto , a presena das duas regies, polar e apolar, na mesma
molcula, em vez da sua hidrofobicidade, que uma propriedade crucial para a actividade
da espuma (Hughes e Baxter, 2001).
Os polissacardeos so polares e por isso, isoladamente, no so estabilizadores da espuma
da cerveja. No entanto, quando associados a protenas (glicoprotenas), formam regies
polares que se podem estender para o interior das bolhas e assim aumentar a estabilidade
da espuma.
Os cidos iso- esto concentrados na espuma e so os maiores responsveis pelo amargor
das cervejas. Derivam do lpulo e a sua hidrofobicidade que influencia a separao da
espuma.

16

Introduo Geral

Alguns caties metlicos so indutores da formao de espuma. No passado, os sais de


ferro eram usados para melhorar a espuma das cervejas, at que se descobriu que, tambm,
eram responsveis pela deteriorao do sabor e do aroma. Em 1950 foi demonstrada uma
excelente correlao entre a estabilidade da espuma da cerveja e o contedo de cidos iso, aos quais se tinha adicionado cerca de 10 mg/L de Nquel (II) (Hughes e Baxter, 2001).
Uma possvel estrutura da associao dos cidos iso- com um catio metlico
apresentada na Figura 2.4.
(n-2)+

OH

R
O

2+

M
O

R
H

OH
O

Figura 2.4 Estrutura dos cidos iso- ligados a caties metlicos (Hughes e Baxter, 2001).

A presena do etanol aumenta a viscosidade da gua e por isso reduz a taxa de drenagem
do lquido da espuma. Os lpidos e lcoois de elevado peso molecular so exemplos de
espcies anfipticas, que conseguem adsorver na interface gua-gs. A sua adio cerveja
prejudicial espuma.
O dixido de carbono foi o nico componente utilizado no gs da espuma da cerveja at
aparecer a Guinness, que foi a primeira cerveja com azoto. Este o principal responsvel
pela sua espuma densa e cremosa caracterstica. O azoto muito pouco solvel na cerveja
e, por isso, a sua adio resulta numa elevada presso interna dentro da lata. Quando se
abre a lata de cerveja, esta presso liberta-se e o azoto capturado pelo pequeno

17

dispositivo mecnico que est no interior da lata, levando formao de espuma


abundante.
O pH um factor importante na estabilidade da espuma da cerveja. Verifica-se que quando
o pH baixo, a estabilidade da espuma maior, pois um nmero significativo de cidos,
provenientes do lpulo, indissocivel num intervalo pequeno de valores de pH. Isto
significa que estes cidos so mais hidrofbicos e podem adsorver na interface com mais
eficincia.
A Cor da cerveja uma propriedade determinante que permite aos consumidores distinguir
o tipo de cerveja, assim como os requisitos de controlo da produo. Em princpio, toda a
cor da cerveja se forma durante a produo do malte e do mosto, sendo responsveis 4
agentes principais: melanides, polifenis oxidados, metais vestigiais (ferro e cobre) e
riboflavina (Tabela 2.1).

Tabela 2.1 Principais contribuintes qumicos para a cor da cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
Fonte
Componente
Melanides

Matria-prima
Malte e maltes especiais

Polifenis oxidados

Malte, lpulo

Processo
Ebulio / aquecimento do
mosto
Oxigenao, pasteurizao

Ferro, cobre
Riboflavina

gua, malte
Malte, levedura

Cor
Amarelo, mbar
Vermelho,
castanho
Amarelo

O primeiro contribuinte para a cor da cerveja o grupo de compostos designados por


melanides, pigmentos solveis, com um intervalo de cores desde o mbar at ao amarelo,
formados a partir das Reaces de Maillard. Por serem formados a partir das reaces
trmicas entre acares e aminocidos livres, o contedo em protenas do malte e o regime
de mistura influenciam a quantidade e o perfil dos melanides que se formam. As reaces
de Maillard podem ocorrer durante a germinao e torra do malte, durante o aquecimento
da cevada para a produo de cervejas pretas, na brassagem, no aquecimento do mosto, na
separao dos resduos slidos e no arrefecimento do mosto. A formao de melanides
favorecida pelos processos a elevadas temperaturas. Estas temperaturas, usadas na
produo dos maltes muito torrados e cevada torrada, favorecem as reaces de

18

Introduo Geral

caramelizao. Os compostos resultantes tm uma cor vermelho-acastanhada intensa e so


usados na produo de cervejas pretas e ale (Hughes e Baxter, 2001; Lewis e Young,
1996).
A segunda fonte significativa para a cor da cerveja so os polifenis oxidados. Geralmente,
a cor vermelho-acastanhado pode ser formada a partir dos polifenis do malte. No entanto,
outros factores, como a moagem do malte e excessiva agitao, podem influenciar a
produo de polifenis. O oxignio tambm tem um papel importante na cor, pois o
arejamento ou oxigenao do mosto, enquanto permanece quente, resulta num
melhoramento da cor. A sua presena na embalagem favorece a formao da cor depois da
pasteurizao.
A terceira fonte de cor pode ser devida s interaces com metais vestigiais. Assim, o
cobre e o ferro podem estimular a oxidao de compostos (por exemplo dos polifenis).
Finalmente, a riboflavina (vitamina B2 presente nas clulas da levedura) pode contribuir,
significativamente, para a cor das cervejas do tipo pale lager (cervejas leves e plidas)
(Hughes e Baxter, 2001).
A Turvao da cerveja um parmetro fortemente apreciado pelo consumidor, que
depende das vrias etapas do processo de fabrico. O efeito visual pode ir desde um ligeiro
brilho at observao de partculas discretas.
O fabrico da cerveja , por natureza, um processo heterogneo, onde frequentemente
necessrio a separao de slidos e lquidos. No incio do processo de fabrico, o malte
modo misturado com gua, normalmente, numa proporo de 1:3 (p/p), para afectar a
actividade enzimtica e a extraco dos componentes de interesse. Nem todo o malte
solubilizado e por isso h necessidade de separar este material insolvel do mosto doce.
Esta separao pode ser feita por filtrao ou sedimentao da mistura. Nestes dois casos,
os slidos so lavados com gua quente (normalmente a 70 C) para recuperar algum
extracto residual. Um uso excessivo de gua durante o processo de separao, pode extrair
quantidades significativas de polifenis, que podem conferir uma potencial turvao ao
mosto. Este mosto depois fervido. O aquecimento vigoroso permite a remoo do
excesso de protenas e polifenis (e outros compostos minoritrios), que floculam. Se o
aquecimento no vigoroso, certos componentes responsveis pela turvao permanecem
na cerveja.

19

2.2.2 Compostos Responsveis pelo Sabor e Aroma da Cerveja


Para qualquer alimento ou bebida as caractersticas sensoriais so um parmetro vital para
a apreciao do produto pelo consumidor. Existem quatro sabores bsicos que so
detectados pela lngua: doce, salgado, cido e amargo. Alm disso, e com uma importncia
relevante para a cerveja, existe um nervo que responde a sabores irritantes, como o picante,
a cebola e o dixido de carbono. Este ltimo extremamente importante e desempenha um
papel fundamental na percepo sensorial da cerveja. A evoluo do teor de dixido de
carbono na cerveja pode afectar o perfil dos compostos volteis que esto presentes no
espao vazio, entre a cerveja e a cpsula da garrafa. O uso de azoto, como substituinte
parcial do dixido de carbono, confere um sabor/aroma suave e pode reduzir o impacto
sensorial dos componentes presentes (Lewis e Young, 1996).
A Doura da cerveja consequncia directa da presena de quantidades residuais de
hidratos de carbono no produto final. Estes acares podem ter tido origem no malte (e no
foram fermentados) ou podem ter sido adicionados como primers para estimular
fermentaes secundrias e assim aumentar os nveis de dixido de carbono na cerveja. A
contribuio dos acares mais importantes para a doura da cerveja apresentada na
Tabela 2.2. Como se pode ver, dos acares apresentados, aquele que est presente em

maior concentrao na cerveja a maltotriose. No entanto, a sua contribuio para a


doura baixa em relao, por exemplo, frutose.

Tabela 2.2 Nveis de doura relativa e concentraes tpicas de alguns acares encontrados na
cerveja (a doura relativa da sacarose = 1,0) (Hughes e Baxter, 2001).
Acar
frutose
glucose
sacarose
maltose
maltotriose

Doura Relativa
1,1
0,7
1,0
0,5
< 0,5

Concentrao na cerveja (g/L)


0 0,19
0,04 1,1
0 3,3
0,7 3,0
0,4 3,4

A Acidez da cerveja deve-se, obviamente, presena de cidos orgnicos na bebida final.


Tipicamente o pH das cervejas varia de 3,9 a 4,4, podendo este intervalo ser alargado. Os
principais cidos encontrados na cerveja esto apresentados na Tabela 2.3. Os nveis finais

20

Introduo Geral

desses cidos dependem do vigor da fermentao, pois eles so produzidos pela levedura.
Como se pode observar, o sabor/aroma dos cidos lctico e pirvico dificilmente
detectvel, enquanto que o cido 3-metilbutanico facilmente sentido.

Tabela 2.3 Principais cidos orgnicos encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
cido
actico
propanico
butanico
2-metilpropanico
pentanico
2-metilbutanico
3-metilbutanico
octanico
lctico
pirvico
succnico

Limite de percepo
sensorial (mg/L)
175
150
2,2
30
8
2,0
1,5
15
400
300
-

Concentrao na
cerveja (mg/L)
30-200
1-5
0,5-1,5
0,1-2
0,03-0,1
0,1-0,5
0,1-2
2-12
20-80
15-150
16-140

Descrio do
sabor/aroma
cido, vinagre
cido, vinagre, leite
Manteiga, queijo, suor
Suor, amargo, azedo
Suor, odor corporal
Queijo, lpulo, suor
Cabra
cido
cido, salgado, rao
-

O sabor a Salgado da cerveja est directamente relacionado com a presena de anies e


caties inorgnicos, por exemplo, potssio, sdio, cloro e fosfato (Tabela 2.4). A presena
destes ies depende, principalmente da qualidade da gua usada, podendo vir do malte.

Tabela 2.4 Principais compostos inorgnicos encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
Principais fontes

Efeito

potssio
sdio
clcio

Concentrao na
cerveja (mg/L)
200-450
20-350
25-120

Malte, adjuvantes
Instrumentao, gua
Instrumentao, gua

magnsio

50-90

Instrumentao, gua

cloro

120-500

gua, amido hidrolisado

sulfato
oxalato
fosfato
nitrato

100-430
5-30
170-600
0,5-2,0

gua
Malte
Malte, adjuvantes
gua, lpulo

Salgado
Enjoativo
Efeito favorvel no
sabor/aroma
Desagradvel quando
agregado ao sulfato
Cheio, doce, suave,
tenro
Seco
Turvao
Aumento da colorao

Io

O sabor a amargo ou Amargor fortemente atribudo a um grupo de compostos chamados


cidos iso-. Estes no ocorrem naturalmente na cerveja mas so resultado da isomerizao
de produtos que ocorrem naturalmente os cidos- (Figura 2.5). A isomerizao levada

21

a cabo durante a ebulio do mosto, com uma eficincia de 30% e, por isso, usam-se os
cidos- do lpulo para aumentar a quantidade dos cidos iso-.
OH

O
O

O
R1

H
R1

HO
HO

R2
R3

cido-

OH

cido iso-

Figura 2.5 Isomerizao dos cidos- em cidos iso- (Hughes e Baxter, 2001).

Devido complexidade da cerveja, o aroma no caracterizado por um ou alguns


compostos bem definidos. Na verdade, muitos compostos contribuem para o aroma,
individualmente, ou de modo sinergista ou antagonista. Os steres e os lcoois so dois dos
principais grupos de compostos que mais contribuem para o sabor e aroma da cerveja. Os
principais steres encontrados na cerveja esto apresentados na Tabela 2.5. Como se pode
ver, o acetato de etilo o que est presente em maior concentrao, mas o menos
detectvel, sendo a concentrao mnima necessria para se detectar o sabor/aroma de 30
mg/L. Dos compostos apresentados, aqueles que mais preocupam os cervejeiros, por
provocarem sabores e aromas desagradveis, so o acetato de etilo e o acetato de isoamilo,
que so uma mistura de acetatos de 2- e 3-metilbutilo. O nvel destes compostos
influenciado por vrios factores incluindo a densidade do mosto e a quantidade de oxignio
a que as leveduras so expostas. Este ltimo factor afecta o sabor e aroma da cerveja, pois
os steres so formados a partir dos lcoois produzidos, quando o grupo acetato est
disponvel mas no necessrio para a biossntese dos componentes das membranas das
leveduras. Assim, factores que promovem o crescimento celular, como elevados nveis de
oxignio e baixo contedo de lpidos no mosto, desfavorecem a produo de steres (Lewis
e Young, 1996).

22

Introduo Geral

Tabela 2.5 Principais steres encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).

acetato de etilo
acetato de isoamilo
hexanoato de etilo
octanoato de etilo

Concentrao na
cerveja (mg/L)
10-60
0,5-5,0
0,1-0,5
0,1-1,5

Limite de percepo
sensorial (mg/L)
30
1
0,2
0,5

acetato de 2-feniletil
nicotinato de etilo

0,05-2,0
1,0-1,5

3,0
2

ster

Descrio do
sabor/aroma
Solvente, suor
Banana, ster, solvente
Ma, frutado, suor
Ma, frutos tropicais,
suor
Rosas, mel, ma, suor
Perfume, granuloso

Na Tabela 2.6 apresentam-se os principais lcoois encontrados na cerveja. O lcool mais


importante e, que na maioria das cervejas, est presente duas vezes mais do que qualquer
outro lcool, o etanol. Este contribui directamente para o sabor/aroma da cerveja,
proporcionando um carcter quente bebida, desempenha um papel importante na
percepo de outros componentes e pode influenciar na sua distribuio pelo lquido, pela
espuma ou pelo espao vazio acima da cerveja (Lea e Piggott, 1995). O glicerol o
segundo lcool mais abundante. No entanto, a concentrao necessria para se detectar o
seu sabor e aroma cerca de 70 vezes inferior do etanol.

Tabela 2.6 Principais lcoois encontrados na cerveja (Hughes e Baxter, 2001).

metanol
etanol
1-propanol
2-propanol
2-metilbutanol
3-metilbutanol
2-feniletanol
1-octeno-3-ol

Concentrao na
cerveja (mg/L)
0,5-3,0
20000-80000
3-16
3-6
8-30
30-70
8-35
0,03

Limite de percepo
sensorial (mg/L)
10000
14000
700
1500
65
70
125
0,2

2-decanol
glicerol
tirosol

0,005
1200-2000
3-40

0,015
200

lcool

Descrio do
sabor/aroma
Alcolico, solvente
Alcolico, forte
Alcolico
Alcolico
Alcolico, vinoso, banana
Alcolico, vinoso, banana
Rosas, amargo, perfumado
Relva cortada de fresco,
perfume
Anis, coco
Doce, viscoso
Amargo, qumico

A produo de cervejas de baixo teor em lcool ou mesmo sem lcool, baseia-se em


mtodos de remoo do lcool, preveno da formao de quantidades significativas de
etanol ou modificaes no processo de modo a ajustar a falta de etanol. Os lcoois de peso
molecular elevado so precursores dos steres e por isso a sua produo tem de ser
controlada. So produzidos pela levedura, como metabolitos secundrios do metabolismo

23

dos aminocidos, mas tambm podem ser produzidos por outras vias, aumentando
excessivamente no mosto. As condies que favorecem o crescimento celular, como uma
excessiva oxigenao ou arejamento, promovem a formao de lcoois de elevado peso
molecular (Hughes e Baxter, 2001; Pollock, 1981).
Ao contrrio dos steres e dos lcoois, que so benficos para o sabor/aroma da cerveja, as
dicetonas vicinais (Vicinal DiKetones - VDK) so consideradas problemas e defeitos na
bebida. A principal VDK na cerveja a 2,3-butanodiona (diacetilo) mas tambm existem
quantidades significativas de 2,3-pentanodiona, produzida durante a fermentao. Estas
duas substncias derivam do -acetolactato e -acetohidroxibutirato, respectivamente, e
devem ser transformadas noutros compostos que afectem menos o sabor/aroma da cerveja
(2,3-butanodiol e 2,3-pentanodiol) (Figura 2.6).
OH

OH

TPP

hidroxietil TPP

OH
CO2H

CO2H

piruvato

oxobutirato

Reaces
intracelulares

2,3-butanodiol

OH

2,3-pentanodiol

O
OH

OH

CO2H

CO2H

acetohidroxibutirato

acetolactato

Oxidao

Reaces
extracelulares

2,3-pentanodiona

OH

acetona

-CO2; 2[H+]
O

OH

OH

hidroxipentanona

diacetilo

TPP - tiamina pirofosfato

Figura 2.6 Vias de formao e subsequente destruio das dicetonas vicinais na cerveja (Hughes e
Baxter, 2001).

24

Introduo Geral

A elevada temperatura no fim da fermentao facilita a rpida remoo das dicetonas


vicinais. Tambm possvel decompor os precursores aquecendo a cerveja, sem oxignio
(para no afectar as caractersticas) e usando a levedura imobilizada para consumir as
dicetonas vicinais livres. A adio da enzima acetolactato descarboxilase, que converte
directamente o acetolactato, tambm pode ser uma boa opo. Na Tabela 2.7 apresentam-se
as dicetonas vicinais referidas, assim como os produtos resultantes da sua degradao.
Tabela 2.7 Dicetonas vicinais e seus compostos reduzidos (Hughes e Baxter, 2001).
Dicetona Vicinal
2,3-butanodiona
3-hidroxi-2-butanona
2,3-butanodiol
2,3-pentanodiona
3-hidroxi-2-pentanona

Concentrao na
cerveja (mg/L)
0,01-0,4
1-10
50-150
0,01-0,15
0,05-0,07

Limite de percepo
sensorial (mg/L)
0,07-0,15
17
4500
0,9
-

Descrio do
sabor/aroma
Manteiga e caramelo
Frutado, mofo, madeira
Borracha, suor, quente
Manteiga, frutado
-

A maior parte das caractersticas aromticas da cerveja so devidas aos compostos


sulfurados. Nas cervejas do tipo ale normal aparecerem quantidades apreciveis de
sulfeto de hidrognio e isso contribui para as caractersticas da bebida. No entanto, devem
evitar-se nveis muito elevados para no aparecerem odores desagradveis. A levedura que
opera nas cervejas ale tem maior capacidade de reduzir o dixido de enxofre a sulfeto de
hidrognio. Este tem um ponto de ebulio a -60 C e por isso, o controlo do processo,
nomeadamente da evoluo do dixido de carbono, pode ajudar a baixar o composto para
nveis razoveis, sendo necessrio uma fermentao vigorosa (Hughes e Baxter, 2001). O
carcter sulfurado das cervejas lager mais complexo. O composto presente em maior
quantidade o sulfeto de dimetilo - DMS (Dimethyl sulfide), que originado na
degradao do malte e que quando no eliminado fornece cerveja um aroma
indesejvel, semelhante ao de couves cozidas. Durante a ebulio do mosto o DMS pode-se perder por evaporao.
A adio do lpulo cerveja no s contribui para o amargor caracterstico mas tambm
para o aroma a lpulo. So os constituintes do leo, extrado do lpulo, que contribuem
mais para o aroma da cerveja. Este leo constitudo por cerca de 40-80% de
hidrocarbonetos, principalmente, por terpenos. O mirceno o mais abundante (cerca de
30%) (Hughes e Baxter, 2001). Por outro lado, a secagem do malte ajuda a reduzir os

25

nveis de compostos responsveis pelo sabor/aroma desagradveis (por exemplo aldedos


hexanal). O grau de colorao obtido durante a secagem est relacionado com as reaces
de Maillard e consequentes produtos responsveis pelo sabor/aroma. As reaces qumicas
promovidas pelo calor incluem a degradao trmica dos cidos fenlicos, caramelizao
dos acares, reaces de Maillard (incluindo a degradao de Strecker dos aminocidos) e
degradao trmica dos cidos gordos oxigenados. Assim, um grande nmero de
compostos volteis produzido, como por exemplo, cidos gordos, aldedos, lcoois,
furanos, cetonas, fenis, pirazinas e compostos sulfurados. No entanto, muitos so perdidos
durante a ebulio do mosto, por evaporao, degradao qumica ou durante a
fermentao, por aco da levedura (Hughes e Baxter, 2001).

26

Introduo Geral

2.3 Fundamentos dos Mtodos Usados


2.3.1 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FT-IR)
A Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier (FT-IR) baseia-se no
estudo da interaco da luz de infravermelho com a matria (Smith, 1996). A radiao no
infravermelho dividida em trs gamas, conforme a sua energia: longnquo, mdio e
prximo, sendo a mais popular e usada em qumica alimentar a do infravermelho prximo
(NIR) (Lachenal, 2000). A tabela seguinte define as regies referidas (Kellner et al., 1998).

Tabela 2.8 Regies do infravermelho.

Regio

Gama de Comprimentos de onda (m)

Nmero de onda (cm-1)

Prximo

0,78 2,5

12800 - 4000

Mdio

2,5 50

4000 - 200

Longnquo

50 1000

200 - 10

No processo de absoro de energia, as frequncias da radiao que se igualam com as


frequncias vibracionais naturais da molcula em questo, que tm origem nos modos de
extenso (simtrica e assimtrica) e de flexo, so absorvidas, aumentando a amplitude dos
movimentos vibracionais das ligaes na molcula. No entanto, nem todas as ligaes
numa molcula so capazes de absorver a energia de infravermelho, mesmo se a frequncia
da radiao for igual frequncia do movimento; apenas as ligaes que tm momento
dipolar, que se altera durante a vibrao, so capazes de absorver a radiao (Pavia et al.,
1996). A vibrao deve ser assimtrica e implicar uma variao do dipolo elctrico da
molcula. Quanto maior a simetria da molcula, menor o nmero de bandas observadas,
pois algumas ligaes absorvem mesma frequncia. A intensidade das bandas, alm de
depender da concentrao do composto na amostra, depende da natureza e da polaridade
das ligaes. Por exemplo, a ligao C=O, fortemente polar e composta por tomos
diferentes, absorve fortemente, enquanto que a ligao C=C tem, relativamente, fraca
absoro.

27

Os diferentes grupos funcionais de uma molcula absorvem a frequncias diferentes


(Tabela 2.9). Molculas com um mesmo grupo funcional apresentam nos seus espectros
bandas sensivelmente mesma frequncia, independentemente da sua cadeia atmica
principal, sendo esta absoro denominada frequncia de grupo. Estas frequncias
encontram-se a nmeros de onda superiores a 1300 cm-1.
A regio 1300-400 cm-1 contm bandas vibracionais que so mais dificilmente atribuveis a
grupos funcionais especficos, uma vez que as massas e as foras de ligao de cada uma
das espcies absorventes so muito similares. Tambm podemos encontrar combinaes de
frequncias de vibraes. No entanto, esta regio contm bandas com especial significado
para a molcula como um todo, sendo denominada por regio de impresso digital (Kellner
et al., 1998).

Tabela 2.9 Valores de absoro no infravermelho para diferentes grupos funcionais (Stuart et al.,
1996).
Nmero de Onda (cm-1)

Grupo Funcional

3640-3610

O-H (livre)

3500-3070

N-H

2960-2850

C-H alifticos

1750-1740

C=O de steres

1740-1720

C=O de aldedos

1720-1700

C=O de cetonas

1675-1645

C=C

1590-1550

NH2

1470-1430

CH2

1390-1370

CH3

1420 e 1300-1200

C-O de cidos carboxlicos

1300-1020

C-O de steres

1200-1050

C-O de lcoois e fenis

1155-1150

C-O de hidratos de carbono

1024-998

C-OH de hidratos de carbono

920

O-H

Apesar da espectroscopia de infravermelho ser til na elucidao estrutural de compostos,


tambm pode ser usada em anlises quantitativas, uma vez que as bandas de absoro no

28

Introduo Geral

infravermelho so proporcionais concentrao das espcies absorventes. No entanto, a


interpretao de um espectro de infravermelho de um sistema complexo, como o caso da
cerveja, no fcil, pois h bandas que podem sobrepor-se a outras. Tambm diferentes
absores secundrias (harmnicos) podem aparecer, exactamente, na mesma frequncia
de uma banda fundamental. A banda de absoro de certos grupos pode ser desviada por
vrias caractersticas estruturais (conjugao, atraco de electres por um grupo
substituinte vizinho, tenso angular, tenso de Van Der Walls, ligaes de hidrognio) e
ser tomada erradamente por uma banda de um grupo inteiramente diferente (Morrisson e
Boyd, 1992). Assim, por si s, o FT-IR, apresenta algumas dificuldades quando se quer
caracterizar uma amostra heterognea. No entanto, torna-se bastante til quando
combinado com mtodos estatsticos ou outras tcnicas de espectroscopia molecular, como
a espectroscopia de RMN, a espectrometria de massa, a espectroscopia de UV/VIS e
disperso de Raman, pois todas estas tcnicas proporcionam informaes diferentes acerca
da estrutura das molculas e em conjunto fornecem uma explicao poderosa e eficaz na
identificao de molculas.
O princpio bsico dos espectrmetros de FT-IR a deteco de mltiplos comprimentos
de onda em simultneo (multiplex), com vantagens energticas na intensidade do feixe,
reduo do rudo de fundo, preciso na determinao dos comprimentos de onda e reduo
do tempo de anlise (Perkins, 1986). A fonte de radiao usada neste tipo de
espectrmetros Globar (SiC) emite uma gama de comprimentos de onda que abrange
toda a gama do infravermelho mdio. O principal componente deste instrumento o
Interfermetro de Michelson, representado, esquematicamente, na Figura 2.7. A radiao
enviada pela fonte passa por um orifcio e interage com espelhos antes de chegar a um
divisor de feixe. A, uma parte da radiao segue na mesma direco, interagindo com um
espelho em movimento, enquanto que a outra parte da radiao reflectida para um
espelho fixo. Ambos os espelhos reflectem a radiao que chega novamente ao divisor de
feixe, sendo novamente dividida. Ento, uma parte, interfere com a amostra, reduzindo a
amplitude de algumas frequncias, e chega ao detector. O espelho mvel pode mover-se de
uma forma muito precisa e a uma velocidade determinada, de uma extremidade outra do
seu eixo. O movimento permite adquirir uma curva de intensidade da energia que chega ao
detector em funo do espao percorrido pelo espelho o interferograma. Adquirindo

29

diversos interferogramas e adicionando-os, pode-se diminuir o rudo. Tendo o


interferograma mdio, aplica-se a transformada de Fourier, obtendo-se um espectro de
transmitncia em funo da frequncia. Este pode ainda ser facilmente convertido num
espectro de absorvncia em funo da frequncia (ou do nmero de onda).

Figura 2.7 Esquema de um interfermetro de Michelson.

Existem diversos mtodos de amostragem para adquirir os espectros de infravermelho, que


se escolhem consoante o estado fsico da amostra e a aplicao que se pretende. A tcnica
de Reflexo Total Atenuada (ATR do ingls Attenuated Total Reflection) pode ser
usada no formato de reflexo mltipla (Figura 2.8) ou de reflexo nica (Golden-Gate)
como foi o acessrio usado neste trabalho. Esta consiste na aplicao da amostra numa
superfcie com um ndice de reflexo elevado (neste caso, um cristal de diamante),
conhecido como elemento de reflexo interna. Quando a radiao de infravermelho penetra
no cristal, com um ngulo abaixo do ngulo de incidncia crtico, a reflexo total interna
desta radiao incidente produz uma onda que se dissipa no limite entre o cristal e a
amostra. Este raio reflectido penetra atravs do cristal, podendo ser absorvido por materiais
em contacto com a sua superfcie. A profundidade de penetrao varia consoante o
material do elemento de reflexo interno e o comprimento de onda a que absorve. Como a

30

Introduo Geral

interaco com a amostra mais fraca e no h necessidade do feixe a atravessar, os


problemas com a anlise de solues aquosas (que podem ter valores fracos de
transmitncia, devido a baixa concentrao) diminuem. Alm disso, os espectros
apresentam valores absolutos semelhantes de absorvncia/transmitncia, em contraste com
a aquisio em transmisso, que depende da espessura da amostra. Esta tcnica permite a
anlise de slidos e de lquidos pouco ou muito viscosos.

Figura 2.8 Esquema de um dispositivo de ATR (adaptado de Perkins, 1987).

Existem mltiplos modelos de cristais de ATR, com especificidades diferentes, desde os


volumes de amostra maiores ou menores a uma profundidade regulvel de penetrao do
feixe na amostra, para se obterem maiores valores de absorvncia com substncias que
absorvem pouco. O tamanho do cristal influencia de forma decisiva o nmero de
interaces que o feixe tem com a amostra.

2.3.2 Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de


Alta Resoluo
A Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de Alta Resoluo uma
tcnica potencialmente importante para a anlise rpida e no destrutiva de sistemas
complexos, isto , que contm um grande nmero de compostos diferentes, presentes em
diversas gamas de concentrao.
Os ncleos de certos tomos consideram-se animados de spin, ou seja possuem a
capacidade de girar em torno do seu eixo. A rotao destas partculas carregadas
positivamente gera um momento magntico (), orientado segundo o eixo de spin, o que
significa que estes ncleos podem comportar-se como minsculas barras magnticas

31

(Figura 2.9a). Um desses ncleos o do tomo do hidrognio, 1H, ou seja, o proto, que
caracterizado por um valor de nmero quntico de spin I igual a 1/2. Se se colocar um
proto num campo magntico externo, o respectivo momento magntico pode orientar-se
de uma das duas maneiras seguintes: a favor ou contra o campo externo (Figura 2.9b). As
duas orientaes possveis dos ncleos de 1H correspondem a dois estados energticos
distintos, e ou 1/2. A Espectroscopia de RMN de 1H baseia-se na ocorrncia de
transies entre estes estados, por absoro de radiao na gama de frequncias das ondas
de rdio (60 a 750 MHz). O valor da energia absorvida fortemente dependente do
ambiente qumico em que o proto se encontra e esta dependncia traduzida por uma
quantidade denominada desvio qumico (Skoog et al., 1998; Claridge, 1999).
a)

b)

B0

z
orientao-

y
orientao-

Figura 2.9 a) Rotao do ncleo magntico causada pela aplicao de um campo magntico
esttico B0; b) as duas orientaes possveis do ncleo de 1H (n quntico de spin I=1/2) no campo
magntico.

A amostra contendo os ncleos magnticos excitada por absoro selectiva da radiao,


regressando depois ao estado inicial, com emisso de energia radiante no domnio das
radiofrequncias. A determinao precisa dos valores destas frequncias especficas
emitidas (ou dos correspondentes desvios qumicos, em ppm) e da velocidade com que a
amostra regressa ao estado de partida (relaxao), constituem a essncia da informao
pormenorizada que possvel obter, quer sobre a estrutura molecular da amostra, quer
sobre a dinmica interna global das suas molculas. Assim, a anlise qualitativa de uma
amostra, atravs do registo do seu espectro de RMN (grfico da absorvncia em funo do
desvio qumico), baseia-se na diferente localizao dos picos ao longo do espectro, uma
vez que a posio de cada um deles depende do ambiente qumico que rodeia o proto, ou
seja, do tipo de molcula em que se encontra. Para alm disso, a intensidade ou rea do
pico de absoro proporcional ao nmero de ncleos que originam esse pico, o que
possibilita a quantificao dos componentes da amostra em estudo (Skoog et al., 1998).

32

Introduo Geral

Os espectros de RMN podem ser adquiridos com base numa tcnica de pulsos, com
aplicao da Transformada de Fourier (TF), que permite obter um espectro em apenas
alguns segundos. O mtodo consiste em irradiar a amostra com um pulso de radiao, que
tem a durao de alguns microsegundos e contm todas as frequncias de interesse,
provocando a excitao simultnea de todos os ncleos magnticos da amostra. A seguir ao
pulso, os ncleos comeam a perder a energia absorvida, num processo designado por
relaxao e que se regista num grfico denominado FID (Free Induction Decay), que
consiste num grfico de intensidade da radiao emitida em funo do tempo. O FID ,
ento, digitalmente monitorizado e guardado num computador. Passados alguns segundos,
aplica-se um novo pulso e o FID correspondente novamente monitorizado e adicionado
ao primeiro. Este processo repetido tantas vezes quanto desejado para obter a intensidade
de sinal necessria, e no final, o FID resultante convertido no espectro atravs do
processo matemtico de Transformada de Fourier (Figura 2.10) (Skoog et al., 1998, Harris,
1987).

FT

tempo

frequncia

Figura 2.10 Transformada de Fourier do FID no correspondente espectro.

Geralmente, a primeira ferramenta usada para interpretar os sinais de RMN, consiste na


comparao dos desvios qumicos, da multiplicidade e das constantes de acoplamento (J),
medidas num espectros 1D, com dados compilados na literatura e com espectros de
referncia de compostos que so esperados estarem presentes na amostra (Pretsch et al.
1989; Nicholson e Foxall, 1995; Fan, 1996). No entanto, os espectros de 1H de alimentos e
amostras biolgicas so sempre muito complexos e a atribuio dos sinais dificultada
pelo alto grau de sobreposio dos sinais. Em alguns casos, no possvel observar todos
os sinais de uma molcula e a determinao da multiplicidade e constantes de acoplamento
no bvia. Por outro lado, os valores encontrados na literatura dependem de vrios
factores, tais como o pH, solvente e a referncia para o desvio qumico usada, e essas
condies, muitas vezes no so relatadas. Assim, o RMN Bidimensional (2D) fornece

33

uma abordagem complementar e necessria para a atribuio dos sinais, uma vez que a
informao distribuda por duas dimenses e a sobreposio espectral
significativamente reduzida.
Todas as sequncias de pulsos 2D tm o mesmo esquema bsico que pode ser subdividido
em 4 perodos bem definidos, denominados, preparao, evoluo, mistura e deteco
(Figura 2.11). Tipicamente, o perodo de preparao e de mistura compreendem um pulso
ou um aglomerado de pulsos e/ou perodos de tempo fixos. Os pormenores dependem da
natureza da experincia. O perodo de deteco inteiramente anlogo ao perodo de
deteco de qualquer experincia 1D, em que o espectrmetro adquire o FID dos spins
excitados. o perodo de evoluo que promove a chave da gerao da segunda dimenso.
O estado do sistema de spin depois de um certo tempo t1 , geralmente, alterado, pelo
menos, 1 pulso de rdio-frequncia. O sinal de ressonncia depois registado durante o
tempo de deteco subsequente, t2. A experincia inteira repetida com um incremento do
tempo de evoluo t1, pelo qual o estado inicial do sistema de spin nuclear, durante o
perodo de deteco a t2=0, muda consequentemente. Depois da compilao dos dados, os
FID so transformados na dimenso t2, de modo a obter um conjunto de espectros cujas
intensidades dos picos ou fases so moduladas como funo do intervalo t1. A
transformada de Fourier na dimenso t1 converte a modulao da frequncia em picos do
espectro 2D, geralmente representados como um mapa de contornos.

Preparao

Evoluo
t1

Mistura
t2

Tempo

Figura 2.11 Esquema geral de uma experincia 2D.

Existem, essencialmente, duas classes de experincias de RMN 2D: 1) Experincias de


correlao, nas quais a frequncia de ressonncia de um pico relacionada com a dos seus
vizinhos e, por isso, a conectividade molecular ou distncias entre tomos podem ser
determinadas; 2) Experincias de resoluo, nas quais o eixo das frequncias mostra duas
diferentes interaces. Por exemplo, no espectro 2D J-resolved, um eixo contm a
informao sobre a constante de acoplamento enquanto o outro tem os dados do desvio

34

Introduo Geral

qumico. Ambos os tipos de experincias foram usados neste trabalho com o objectivo de
auxiliar a atribuio/identificao espectral da cerveja analisada.
A experincia de TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) permite a correlao
homonuclear de spins acoplados escalarmente, mas tambm capaz de estabelecer
correlaes entre protes que apesar de no estarem acoplados entre si, se encontram no
mesmo sistema de spin e formam uma cadeia contnua de protes acoplados spin-spin
(Braunschweiler et al., 1983). Na Figura 2.12 observa-se uma representao esquemtica de
um espectro de TOCSY do etanol, onde se pode ver o acoplamento de protes.

Figura 2.12 Representao esquemtica do espectro de TOCSY do etanol.

A sequncia de pulsos permite que a magnetizao se propague ao longo da cadeia, por


transferncia de coerncia de um ponto para o outro. Utiliza uma sequncia de pulsos
(spin-lock) no perodo de mistura, em vez de um pulso nico, que tem por objectivo
executar a transferncia da magnetizao numa cadeia de spins (Figura 2.13).
90
m
t1

t2
Spin-lock y

Figura 2.13 Sequncia de pulsos da experincia TOCSY usando um pulso contnuo de baixa
intensidade.

35

Os mtodos originais para determinar correlaes heteronucleares baseavam-se na


observao do ncleo X de menor (razo magnetogrica), sendo o proto detectado
indirectamente (e aparecendo ao longo da dimenso f1). Na ltima dcada esta forma de
deteco alterou-se de modo a observar o ncleo com maior (1H) e detectar o
heteroncleo indirectamente. A este processo d-se o nome de correlao inversa e a
principal vantagem o aumento da sensibilidade permitindo, tambm, reduzir o tempo
experimental. A experincia HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation)
envolve magnetizao transversal durante o perodo t1, gerada por transferncia de
polarizao dos protes ligados via sequncia INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by
Polarization Transfer) (Figura 2.14). Consequentemente, os picos cruzados no espectro
HSQC no so alargados pelos acoplamentos homonucleares 1H-1H, ao longo de f1. Isto
resulta numa melhor resoluo nesta dimenso (Bodenhausen e Ruben, 1980).
90
1

/2

H p=

180

90

180

90

180
/2

/2

t1

/2

(Decouple)

+1
0
-1

X p=

+1
0
-1

Figura 2.14 Sequncia de pulsos da experincia HSQC e via de transferncia de coerncia.

Num espectro normal 1D de RMN 1H, os desvios qumicos e a informao do acoplamento


spin-spin podem estar obscurecidos pela sobreposio dos multipletos. Na experincia 2D
J-resolved, cuja sequncia de pulsos se apresenta na Figura 2.15-a, estes dois parmetros
esto separados e aparecem em eixos diferentes da matriz 2D. Na dimenso f2 aparece a

36

Introduo Geral

informao do desvio qumico, enquanto que na dimenso f1, s a informao do


acoplamento spin-spin (Figura 2.15-b).
180

90
t1/2

t1/2

Figura 2.15 a) Sequncia de pulsos da experincia J-resolved; b) representao esquemtica de um


espectro J-resolved.

2.3.3 Anlise em Componentes Principais (PCA)


A Anlise em Componentes Principais (PCA), usada na anlise dos espectros de FT-IR e
RMN, consiste numa factorizao matricial, cujo objectivo extrair as principais fontes de
variabilidade. Cada fonte de variabilidade concretiza-se na obteno de um eixo
(componente principal PC). Geometricamente, pode ser compreendida como uma
rotao/projeco dos eixos do espao multivariado de uma matriz, de forma a maximizar
a variao ao longo de cada eixo. Estes novos eixos so denominados componentes
principais ou variveis latentes. Matematicamente, este processo consiste numa simples
transformao linear das variveis de partida, para criar k variveis caractersticas
(componentes principais) das fontes de variabilidade (Jolliffe, 1986).
Como tcnica exploratria, permite a visualizao dos dados aps a projeco das amostras
(objectos) no espao multi-dimensional determinado pelos componentes principais. No
sendo supervisionada, no se prope nenhuma relao a priori entre os objectos e/ou as
variveis, procurando ela prpria as relaes entre os diferentes parmetros (objectos e
variveis), permitindo observar eventuais agrupamentos entre objectos ou variveis
A decomposio de uma matriz X(n,a) pela PCA pode ser formalizada da seguinte forma:
X (n,a) = T (n,k) . P (k,a) + E (n,a)

37

Figura 2.16 - Decomposio da matriz por PCA.

onde, P a matriz das contribuies factoriais (loadings), T a matriz das coordenadas


factoriais (scores), E a matriz de erro, n o nmero de amostras (objectos), a o nmero de
variveis e k o nmero de componentes principais. A matriz de contribuies factoriais
define o novo sistema de eixos e a de coordenadas factoriais representa a posio de cada
amostra (objecto) quando projectada nesse novo espao vectorial. As contribuies
factoriais so obtidas para cada uma das variveis (coluna) da matriz X e representam a
relao entre as variveis originais e os componentes principais. As coordenadas factoriais
projeco de cada amostra no espao dos componentes principais podem ser obtidos
para todos os objectos em todos os componentes principais, da seguinte forma:
T (n,k) = X (n,a) . P (a,k)

Figura 2.17 - Projeces dos dados nos componentes principais.

Os grficos das coordenadas factoriais podem mostrar relaes entre as amostras,


agrupando-as ou dispondo-as ao longo dos componentes principais. Relacionando os
grficos de disperso das coordenadas factoriais com os das contribuies factoriais
correspondentes s mesmas dimenses, pode estudar-se o comportamento das amostras
com as variveis que tm maior importncia em cada componente principal. Estas
dimenses so as que maximizam a variabilidade entre as amostras, devendo ser,
eventualmente, desprezadas as outras dimenses, que podem conter apenas variabilidade
no estruturada (rudo) ou no informativa.

38

Introduo Geral

Os componentes principais so mutuamente perpendiculares e a cada um destes est


associado um valor prprio (medida da sua variabilidade), sendo decrescente medida que
vo sendo calculados novos componentes.

Referncias
Bodenhausen, G.; Ruben, D. Natural abundance nitrogen-15 NMR by enhanced
heteronuclear spectroscopy Chemical Physics Letters; 69; 185-188; 1980.
Braunschweiler, L.; Bodenhausen, G.; Ernst, R. Coherence transfer by isotropic mixing:
application to proton correlation spectroscopy Journal of Magnetic Resonance; 53; 521528; 1983.
Claridge, T. D. W. High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry Elsevier
science; Oxford; 1999.
Fan, T.W. Metabolite profiling by one and two-dimensional NMR analysis of complex
mixtures Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; 28; 161-219; 1996.
Harris, R. K. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 3rd Ed.; John Wiley &
Sons; New York; 1987.
Hughes, P.S.; Baxter, E.D. Beer Quality, Safety and Nutritional Aspects The Royal
Society of Chemistry; Cambridge; 2001.
Jolliffe, I.T. Principal Component Analysis Springer-Verlag; New York; 1986.
Kellner, R.; Mermet, J. M.; Otto, M.; Widmer, H. M. Analytical Chemistry the
approved text to the FECS curriculum analytical chemistry Wiley-VCH, Germany,
1998.

39

Lachenal, G. Introduction la spectroscopie infrarouge Collection Sciences &


Technologies Agroalimentaires; Paris; 2000.
Lea, A. ; Piggott, J. Fermented Beverage Production Blackie Academic &
Professional; Glasgow; 1995.
Lewis, M. J.; Young, T. W. Brewing Chapman & Hall; London; 1996.
Morrisson, R.; Boyd, R. Qumica Orgnica 13 ed.; Fundao Calouste Gulbenkian;
Lisboa; 1992.
Nicholson, J.K.; Foxall, P.J. 750 MHz 1H and 1H-13C NMR Spectroscopy of human
blood plasma Analytical Chemistry; 67; 793-811; 1995.
Nord, L.; Sorensen, S.; Duus, J. Characterization of reduced iso--acids derived from
hops (Humulus lupulus) by NMR Magnetic Resonance in Chemistry; 41; 660-670;
2003.
O Mundo da Cerveja Ediciones Orbis, S.A.; Espanha; 2001.
Pavia, L.; Lampman, M.; Kriz, S. Introduction to Spectroscopy 2nd ed.; Harcourt
Brace College Publishers; 1996.
Perkins, W.D. Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Part I - Instrumentation
Journal of Chemical Education; 63; 1; 1986.
Perkins, W.D. Fourier Transform Infrared Spectroscopy: Part II e III Journal of
Chemical Education; 64; 11 e 12; 1987.
Pollock, J. R. A. Brewing Science Vol. 2; Academic Press; London, 1981.

40

Introduo Geral

Pretsch, E.; Clerc, T.; Seibl, J.; Simon, W. Spectral Data for Structure Determination of
Organic Compounds Springer-Verlag; Berlin; 1989.
Skoog, D. A.; Holler, F. J.; Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis 5th
ed.; Saunders College Publishing; U.S.A.; 1998.
Smith, B. C. Fundamentals of Fourier Transform Infrared Spectroscopy CRC Press;
1996.
Stuart, B.; George, B.; Mclntyre, P. Modern Infrared Spectroscopy Jonh Wiley &
Sons; UK; 1996.
Unio Cervejeira, E. P. A Cerveja Servio de Relaes Pblicas da UNICER. Lea
do Balio, 1993.

41

42

3 ESTUDO DA COMPOSIO QUMICA DA CERVEJA POR


ESPECTROSCOPIA DE RMN

3.1

Introduo....................................................................................................................... 44

3.2

Materiais e Mtodos ....................................................................................................... 45

3.3

Anlise dos Espectros de RMN 1D e 2D ........................................................................ 46

3.4

Concluses ...................................................................................................................... 53

Referncias....................................................................................................................................... 53

43

3.1 Introduo
A cerveja uma mistura complexa, cuja composio qumica depende de vrios factores,
incluindo a qualidade da gua, o tipo de malte, a levedura usada, o lpulo, assim como as
condies, quer ambientais (temperatura, humidade), quer mecnicas (tipo e estado do
equipamento) de todo o processo de fabrico (Hughes e Baxter, 2001). O estudo detalhado
dessa composio qumica e da sua relao com as propriedades da cerveja de extrema
importncia para se poder realizar um controlo de qualidade eficiente e melhorar as
caractersticas do produto final. Este , geralmente, avaliado atravs da sua aparncia (cor,
propriedades da espuma e turvao), do gosto (doce, salgado, cido e amargo) e do sabor e
aroma. No entanto, a relao destas propriedades com a composio qumica da cerveja
no inteiramente conhecida, facto que limita o controlo e conhecimento da bioqumica do
produto e consequente controlo das caractersticas finais. Isto implica, necessariamente,
uma caracterizao qumica detalhada e, embora diversas metodologias analticas sejam
aplicadas na indstria cervejeira, ainda requerida e desejvel uma anlise minuciosa, total
e em tempo real, da composio qumica da cerveja.
A espectroscopia de RMN permite detectar, simultaneamente, numa nica experincia,
vrias famlias de compostos, em diversas gamas de concentrao e j mostrou elevada
potencialidade no estudo da composio qumica de vrios produtos alimentares, tais
como, sumos de fruta (Belton et al., 1996; Belton et al., 1997; Le Gall et al., 2001), caf
(Bosco et al., 1999), azeite (Sacchi et al., 1996) e vinho (Ramos e Santos, 1999; Kosir e
Kidric, 2001; Brescia et al., 2002), com a vantagem de ser uma tcnica no-destrutiva (a
amostra usada directamente, sem qualquer tipo de pr-tratamento). No caso da cerveja,
suficiente desgaseificar a amostra e em poucos minutos podemos obter um espectro que
fornece informao detalhada sobre a sua composio qumica (Duarte et al., 2002). A
espectroscopia de RMN tem sido, maioritariamente, aplicada na resoluo de problemas
especficos, tais como, identificao e quantificao dos constituintes do malte e do lpulo,
por exemplo, polifenis (Friedrich e Galensa, 2002) e iso-humulonas (Nord et al., 2003) e
quantificao de cidos orgnicos e aminocidos na cerveja (Nord et al., 2004). No
entanto, estes estudos recorreram ao uso de extractos de cerveja, o que possibilitou,

44

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

unicamente, o estudo detalhado de um grupo de compostos qumicos, como o caso dos


polifenis. de todo o interesse investigar mtodos que usem a cerveja intacta, no s para
simplificar o procedimento experimental, como para reduzir o tempo de anlise e aumentar
o nmero de compostos analisados. Assim, o RMN de Alta Resoluo acoplado com a
Cromatografia Lquida e com a Espectrometria de Massa (LC-NMR a LC-NMR/MS)
permitiu a identificao de oligossacardeos (Duarte et al., 2003) e compostos aromticos
(Gil et al., 2003). Mesmo usando tcnicas mais avanadas, como o caso do DOSY
(Diffusion-Ordered Spectroscopy) (Gil et al., 2004), a identificao de todos os picos
constantes de um espectro de RMN de cerveja intacta no ainda possvel, devido,
principalmente, forte sobreposio de sinais. Deste modo, o uso da anlise estatstica
multivariada (Duarte et al., 2004) pode ser uma ajuda na interpretao de to complexos
espectros. Recentemente, e com o objectivo de tornar o espectrmetro de RMN cada vez
mais automtico, foi explorado o sistema de injeco de fluxo, na troca das amostras de
cerveja, durante a anlise por RMN que, conjuntamente com uma base de dados de
espectros, pode vir a ser adaptado como um mtodo de anlise rotineiro na indstria
cervejeira (Lachenmeier et al., 2005).
Com este captulo pretende-se mostrar a metodologia usada durante esta dissertao, na
identificao dos picos constantes dos espectros de RMN de cerveja intacta. Para isso,
escolheu-se aleatoriamente, um conjunto de espectros 1D e 2D de uma amostra de cerveja
para ilustrar o processo de interpretao dos espectros.

3.2 Materiais e Mtodos


Amostra: Foi seleccionada, aleatoriamente, 1 garrafa de cerveja do tipo lager (4% v/v de
percentagem de lcool) que foi desgaseificada num banho ultra-snico, durante 10
minutos. A amostra foi preparada de modo a conter 10% de D2O e 0,02% de TSP (3(trimetilsilil)-propionato-2,2,3,3-d4 de sdio) como referncia de desvio qumico e de
intensidade.

45

Mtodos: Os espectros de RMN 1D e 2D foram adquiridos num espectrmetro Bruker


Avance DRX-500, operando a 500,13 MHz para o proto e a 125,77 MHz para o carbono.
Os espectros de RMN 1D de

H foram obtidos usando o programa de pulsos

noesypr1dsp, com saturao dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm).
Foram usados 128 varrimentos e 32K pontos, com uma largura espectral de 8012 Hz. Os
espectros TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) foram registados usando o programa
lcmlevpcpstp (Bruker Library) e a sequncia de pulsos MLEV-17 para spin-lock.
Foram adquiridos 16 varrimentos para cada um dos 512 incrementos, usando uma largura
espectral de 5482,46 Hz, nas duas dimenses, um tempo de relaxao de 100 ms e um
tempo de mistura de 1,5 segundos. Os espectros de HSQC (Heteronuclear SingleQuantum Correlation) foram registados usando o programa invietgpsi que utiliza a
deteco inversa e o desacoplamento de

13

C durante a aquisio. Foram obtidos 64

varrimentos para cada um dos 300 incrementos que foram adquiridos com uma largura
espectral de 5482,46 Hz e 25157,23 Hz, nas dimenses do proto e do carbono,
respectivamente. Os espectros J-resolved foram registados usando o programa lcjresps,
com 8182 pontos, 24 varrimentos para cada um dos 128 incrementos e uma largura
espectral de 8012,82 Hz, na dimenso do proto e 31,30 Hz na dimenso J.

3.3 Anlise dos Espectros de RMN 1D e 2D


A Figura 3.1 representa o espectro de RMN 1H 1D de uma amostra de cerveja, adquirido a
500 MHz, com supresso dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm), por
serem os compostos maioritrios. Como se pode ver, os trs sinais mais intensos reflectem
estes 2 compostos, enquanto que os sinais mais fracos so os da regio aromtica (5,8-10
ppm), que se encontra expandida na figura. Esta regio mostra um elevado nmero de
sinais provenientes de diversos compostos aromticos. A regio aliftica (0-3 ppm), onde
surgem, principalmente, sinais de cidos orgnicos e aminocidos, mostra sinais fracos,
com alguma sobreposio, enquanto que na regio dos acares (3-5,8 ppm) os sinais so
intensos e largos, com forte sobreposio, devido similaridade entre os ambientes
qumicos caracterizando os vrios protes.

46

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

Devido elevada complexidade do espectro e sobreposio de sinais, a identificao dos


mesmos no fcil e por isso necessrio recorrer a tcnicas 2D, tcnicas acopladas e
anlise estatstica multivariada (Duarte et al., 2002).

H2O

EtOH

ppm

EtOH

1 ppm

Figura 3.1 Espectro 1D tpico de RMN de 1H de uma cerveja, registado a 500 MHz.

Para identificar a maior parte dos sinais presentes na Figura 3.1, foram combinados os
dados das experincias de TOCSY, Correlao 1H-13C (HSQC) e J-Resolved.
Na Figura 3.2 esto representados os espectros de RMN de 1H 1D e 2D (TOCSY) de uma
amostra de cerveja, adquiridos no mesmo espectrmetro que o espectro anterior e tambm
com supresso tripla. Podem-se observar sinais de vrios compostos, nomeadamente,
lcoois (isopentanol, isobutanol e propanol), aminocidos (prolina, histidina, fenilalanina e
alanina), cidos orgnicos (actico, pirvico, succnico, ctrico e mlico) e nuclesidos
(uridina, citidina, adenosina e inosina). Estes sinais foram identificados com base em
trabalhos anteriores (Duarte et al., 2002; Gil et al., 2003; Duarte et al., 2003) e encontramse na Tabela 3.1.
Aquando da interpretao de um espectro de TOCSY necessrio ter presente o espectro
1D da amostra respectiva e ir identificando os sinais de protes com acoplamento com
protes vizinhos, ou seja, os dupletos, tripletos, etc., pois s estes so visveis no TOCSY.
Em seguida necessrio encontrar os sistemas de spin respectivos, ou seja, o conjunto de

47

picos cruzados pertencentes a uma mesma molcula (ou sistema de spin) e ir consultando
as bases de dados que existem de vrios compostos orgnicos (Fan, 1996). A experincia
de TOCSY um dos mtodos mais teis na identificao de compostos pois permite a
deteco de acoplamentos escalares ao longo de vrias ligaes e assim a identificao de
vrios grupos de uma mesma molcula.

16
19

17 18
13
14

13
15

9.0

8.5

8.0

7.5

12

17

7.0

6.5

12
14

ppm

10,
11

98

7
1,2,3
6

ppm
1
2
3

19

14

11

13

6
15

16

7
8
9
9

ppm

Figura 3.2 Espectros de RMN 1H 1D e 2D (TOCSY) de uma cerveja (1-propanol, 2-isobutanol, 3isopentanol, 4-etanol, 5-H2O, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10-ctrico, 11-mlico,
12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina/tirosol, 17-histidina, 18fenilalanina, 19-polifenis).

48

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

Na Figura 3.3 est representada uma expanso do espectro de TOCSY onde se podem
observar os picos cruzados da zona aliftica (0-3 ppm) e da zona dos acares (3-5,5 ppm).
Na regio aliftica observam-se os sinais dos cidos orgnicos (actico, pirvico e
succnico), provenientes do ciclo de Krebs e de alguns aminocidos, estes em pequenas
quantidades, por serem consumidos pelo metabolismo das leveduras. Na regio dos
acares de notar a forte sobreposio de sinais e da a dificuldade de identificao. Na
zona anomrica (4,4-5,5 ppm) possvel identificar o dupleto a 4,64 ppm proveniente da
ligao H1 de acares redutores, enquanto que a 5,22 ppm se encontra o dupleto da
ligao H1. O sinal largo a 5,3-5,4 ppm caracterstico de dextrinas, que por serem
molculas maiores no so facilmente fermentveis pela levedura.

H2O
H1(14)
H1

EtOH

H1(16)
pirvico
actico
succnico

H1

ppm
1

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

6
ppm

Figura 3.3 Expanso do espectro de TOCSY (0-6 ppm) de uma cerveja.

49

Na regio aromtica (5,8-9 ppm) os sinais so fracos e provenientes de compostos


aromticos, nomeadamente aminocidos (fenilalanina e tirosina), nuclesidos (citidina,
adenosina e uridina) e alcois (tirosol e feniletanol).
A Figura 3.4 representa um espectro de correlao heteronuclear 1H-13C (HSQC). Este tipo
de espectro mostra a correlao entre os desvios qumicos dos protes e dos carbonos que
lhes esto ligados. Permite, assim, a confirmao da identificao dos compostos,
adquirida pela anlise dos espectros 1D e TOCSY e especialmente til na identificao
de singuletos no espectro 1D.
ppm

50

c. pirvico

Uridina

100
Histidina

150

Citidina

ppm

Figura 3.4 Espectro de HSQC, 500 MHz de uma cerveja.

A experincia J-resolved particularmente til na determinao da constante de


acoplamento dos multipletos, que aparecem sobrepostos ou de baixa resoluo no espectro
1D. Na Figura 3.5 est representado um espectro J-resolved de uma cerveja, a ttulo
exemplificativo, para mostrar o tipo de informao fornecida.

50

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

Hz
-10

-5

10

15
ppm

Figura 3.5 Espectro J-resolved, 500 MHz de uma cerveja.

Tabela 3.1 Desvios qumicos de 1H e 13C, multiplicidade e constante JHH dos compostos
identificados na cerveja. s: singuleto, d: dupleto, t: tripleto, q: quarteto, dd: duplo dupleto, m: multipleto, (a)
identificao possvel, n.i.: no identificado.
Composto

Atribuio

1H (ppm)

Multiplicidade

cido Actico

CH3

2,01

, CH
, CH
CH2
CH2
CH2
CH3
CH
CH
CH
CH

2,72
2,84
1,92
2,39
3,02
1,34
4,19
2,63
2,82
4,38

d
d

15,7
15,7

t
t
d
q
dd
dd

7,2
7,2
7,0
7,0
7,5;16,2
4,4;16,1

cido Pirvico

CH3

2,35

29,12

cido Succnico

, CH2

2,56

32,79

C4H, ribose
C3H, ribose
C2H, ribose
C1H, ribose
C8H, anel
C2H, anel
CH3
CH

4,27
4,41
4,79
6,06
8,27
8,35
1,48
3,77

cido Ctrico
cido -Aminobutrico
(GABA)
cido Lctico
cido Mlico

Adenosina/Inosina

Alanina

J (Hz)

13C (ppm)
23,82
46,50
26,28
32,28
41,83
22,48
70,87
42,78
71,20

d
s
s
d

7,2

51

Composto
Citidina
Etanol
Fenilalanina
Histidina
Isobutanol

Isoleucina

Isopentanol

Leucina
Malto-oligossacardeos

Polifenis (a)

Prolina

Propanol
Tirosina / Tirosol
Triptofano

Uridina

52

Atribuio

1H (ppm)

C1H, ribose
C6H, anel
C5H, anel
CH3
CH2
C3H, C5H, anel
C4H, anel
C2H, C6H, anel
C4H, anel
C2H, anel
CH3
CH
CH2OH
CH3
CH3
CH
CH
CH
CH
CH3
CH
CH2
CH2OH
, CH3
CH2, CH
C1H (red.)
C1H (red.)
C1H (1-6)
C1H (1-4)
n.i.
n.i.
CH2
CH
CH
CH
CH
CH
CH3
CH2
CH2OH
C3H, C5H, anel
C2H, C6H, anel
C5H, anel
C6H, anel
C7H, anel
C4H, anel
C4H
C3H
C2H
C5H, anel
C1H
C6H, anel

5,86
6,09
7,92
1,17
3,64
7,31
7,37
7,41
7,04
7,99
0,87
1,73
3,36
0,92
1,00
1,25
1,46
1,96
3,64
0,88
1,42
1,64
3,63
0,94
1,70
4,64
5,22
4,96
5,3-5,4
6,84
7,51

6,89
7,18
7,15
7,24
7,50
7,69
4,11
4,21
4,38
5,88
5,89
7,86

J (Hz)

13C (ppm)

d
d
t
q

7,9
7,9
7,2
7,2

98,36
145,72
19,56
60,19

119,00
140,62

s
s
d

6,6

6,5

t
d

6,6

d
d

8,0
3,7

m
m
m

2,00
2,06
2,33
3,32
3,41
4,11
0,88
1,53
3,54
6,81
7,11

Multiplicidade

t
m
t
d
d

7,5
5,8
8,5
8,5

24,60

98,50
94,58
101,28
~102

26,60
31,70
31,70
48,90
48,90
64,06
13,7
26,9
62,46
118,2 118,2
133,3 133,1

114,49

8,2

8,2

105,00
90,51
144,56

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

Pela anlise da tabela anterior podemos constatar que cerca de 25 compostos foram
identificados na cerveja em estudo, por RMN 1D e 2D. Alm disso, muitos outros
compostos (sistemas de spin) foram encontrados mas a sua identificao requer mais
investigao e recurso a outras tcnicas, nomeadamente, LC-NMR, LC-NMR/MS e
DOSY, devido no s fraca intensidade de alguns sinais, como forte sobreposio de
outros.

3.4 Concluses
Como se constatou ao longo deste captulo, a anlise detalhada de todos os picos presentes
num espectro de RMN de cerveja um processo moroso e que est longe do seu fim, uma
vez que ainda existem muitos picos no identificados. No entanto, este estudo essencial
para qualquer investigao/anlise de amostras de cerveja, pois permite a construo de
bases de dados e a caracterizao qumica/perfil de uma amostra, que iro facilitar a
interpretao dos resultados de PCA, por exemplo.
A anlise de espectros 1D e 2D exige o recurso a pessoas altamente especializadas, um
grande dispndio de tempo, o que torna o estudo oneroso. No entanto, depois de
construdas as bases de dados, a utilizao da tcnica de RMN poder tornar-se mais
acessvel, no sendo necessrio pessoas to especializadas, nem um dispndio de tempo to
grande. Alm disso, o uso de automao no registo dos espectros e o recurso a mtodos
estatsticos poder facilitar o acesso s indstrias.

Referncias
Belton, P.; Delgadillo, I.; Holmes, E.; Nicholls, A.; Nicholson, J.; Spraul, M. Use of
high-field 1H NMR spectroscopy for the analysis of liquid foods Journal of Agricultural
and Food Chemistry; 44; 1483-1487; 1996.

53

Belton, P.; Delgadillo, I.; Gil, A.; Roma, P.; Casuscelli, F.; Colquhoun, I.; Dennos, M.;
Spraul, M. High field proton NMR studies of apple juices Magnetic Resonance in
Chemistry; 35; S52-S60; 1997.
Bosco, M.; Toffanin, R.; Palo, D.; Zatti, L.; Segre, A. High resolution 1H NMR
investigation of coffee Journal of the Science of Food and Agriculture; 79; 869-878;
1999.
Brescia, M.; Caldarola, V.; De Giglio, A.; Benedetti, D.; Fanizzi, F.; Sacco, A.
Characterization of the geographical origin of Italian red wines based on traditional and
nuclear magnetic resonance spectrometric determinations Analytica Chimica Acta;
458; 177-186; 2002.
Duarte, I.; Barros, A.; Belton, P.; Righelato, R.; Spraul, M.; Humpfer, E.; Gil, A. HighResolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and Multivariate Analysis for the
Characterization of Beer Journal of Agricultural and Food Chemistry; 50; 2475-2481;
2002.
Duarte, I.; Godejohann, M.; Braumann, U.; Spraul, M.; Gil, A. Application of NMR
Spectroscopy and LC-NMR/MS to the Identification of Carbohydrates in Beer Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 51; 4847-4852; 2003.
Duarte, I.; Barros, A.; Almeida, C.; Spraul, M.; Gil, A. Multivariate Analysis of NMR
and FT-IR Data as a Potential Tool for the Quality of Beer Journal of Agricultural and
Food Chemistry; 52; 1031-1038; 2004.
Fan, T. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex
mixtures Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; 28; 161-219; 1996.
Friedrich, W.; Galensa, R. Identification of a new flavanol glucoside from barley
(Hordeum vulgare L.) and malt European Food Research and Technology; 214; 388393; 2002.

54

Estudo da composio qumica da cerveja por espectroscopia de RMN

Gil, A.; Duarte, I., Godejohann, M.; Braumann, U.; Maraschin, M.; Spraul, M.
Characterization of the aromatic composition of some liquid foods by nuclear magnetic
resonance spectroscopy and liquid chromatography with nuclear magnetic resonance and
mass spectrometric detection Analytica Chimica Acta; 488; 35-51; 2003.
Gil, A.; Duarte, I.; Cabrita, E.; Goodfellow, B.; Spraul, M.; Kerssebaum, R. Exploratory
applications of Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) to liquid foods: an aid towards
spectral assignment Analytica Chimica Acta; 506(2); 215-223; 2004.
Hughes, P.S.; Baxter, E.D. Beer Quality, Safety and Nutritional Aspects The Royal
Society of Chemistry; Cambridge; 2001.
Kosir, I.; Kidric, J. Identification of amino acids in wines by one- and two-dimensional
nuclear magnetic resonance spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry;
49; 50-56; 2001.
Lachenmeier, D. W.; Frank, W.; Humpfer, E.; Schafer, H.; Keller, S.; Mortter, M.; Spraul,
M. Quality Control of Beer using High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy and Multivariate Analysis European Food Research and Technology; 220;
215-221; 2005.
Le Gall, G.; Puaud, M.; Colquhoun, I. Discrimination between orange juice and pulp
wash by

H nuclear magnetic resonance spectroscopy: Identification of marker

compounds Journal of Agricultural and Food Chemistry; 49; 580-588; 2001.


Nord, L.; Sorensen, S.; Duus, J. Characterization of reduced iso--acids derived from
hops (Humulus lupulus) by NMR Magnetic Resonance in Chemistry; 41; 660-670;
2003.
Nord, L.; Vaag, P.; Duus, J. Quantification of Organic and Amino Acids in Beer by 1H
NMR Spectroscopy - Analytical Chemistry; 76; 4790-4798; 2004.

55

Ramos, A.; Santos, H. NMR studies of wine chemistry and wine bacteria In Annual
Reports on NMR Spectroscopy; Webb, G.A. Ed.; Academic Press; London; 179-202;
1999.
Sacchi, R.; Patumi, M.; Fontanazza, G.; Barone, P.; Fiordiponti, P.; Mannina, L.; Rossi, E.;
Segre, A. A high-field 1H nuclear magnetic resonance study of the minor components in
virgin olive oils Journal of the American Oil Chemists Society; 73; 747-758; 1996.

56

4 DETERMINAO DO PAS E DATA DE FABRICO DE CERVEJAS


PRODUZIDAS INTERNACIONALMENTE

4.1

Introduo....................................................................................................................... 58

4.2

Materiais e Mtodos ....................................................................................................... 60

4.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR............................................................. 63

4.4

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN .............................................................. 66

4.5

Concluses ...................................................................................................................... 89

Referncias....................................................................................................................................... 91

57

4.1 Introduo
Hoje em dia, assegurar a autenticidade de um determinado produto de extrema
importncia, no s porque o consumidor final cada vez mais exigente, como tambm
porque a concorrncia cada vez mais desleal. Para garantir a autenticidade necessrio
ferramentas que permitam determinar/confirmar a origem/local de fabrico, assim como o
tipo de matrias-primas usadas e condies de processamento.
Vrias tcnicas tm sido usadas na determinao e classificao de alimentos lquidos,
nomeadamente, vinho, ch, vinagre e sumos de fruta, segundo a sua origem geogrfica.
Assim, por exemplo, a determinao por HPLC do contedo em catequinas, cidos
fenlicos e alcalides e a PCA foram usados para distinguir o ch (Fernndez et al., 2002)
segundo a sua origem geogrfica. A relao entre a concentrao de metais vestigiais no
ch,

determinada

por

ICP-AES

(inductively

coupled

plasma-atomic

emission

spectrometry) e por ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry) e a


origem geogrfica foram objecto de estudo no Reino Unido (Marcos et al., 1998). Estes
mtodos tambm serviram para classificar o vinho consoante a sua origem geogrfica
(Almeida et al., 2001; Baxter et al., 1997; Taylor et al., 2003).
A cromatografia de troca inica foi usada para classificar o vinho tinto e branco produzido
na Hungria, com base no contedo dos aminocidos livres e biognicos (Hberger et al.,
2003) enquanto que a cromatografia em fase gasosa capilar foi usada para determinar os
polialcois no vinagre, como um factor discriminante da sua origem (Antonelli et al.,
1997). Mas, estes mtodos requerem elevados tempos de preparao da amostra antes da
sua anlise. A separao, a derivatizao e a pr-concentrao, no caso dos compostos de
baixa concentrao, so geralmente etapas comuns no procedimento. Assim, importante
desenvolver mtodos que possam fornecer a informao rpida sobre vrios factores, tais
como, a origem geogrfica, condies de processamento e a composio qumica.
Nos vinhos frequente acontecerem adulteraes, nomeadamente a adio de acares
sintticos para aumentar o teor alcolico e consequente valor comercial do produto. Como
se sabe, de um modo geral, os tomos existem em mltiplas formas isotpicas. Alm disso,
os elementos mais abundantes como o hidrognio, carbono, oxignio e azoto, esto sempre
acompanhados de quantidades significativas dos seus istopos. Na natureza a distribuio

58

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

isotpica no aleatria, antes pelo contrrio, ela caracterstica de cada planta e de cada
regio. A razo Deutrio/Hidrognio, D/H, diminui medida que a latitude aumenta, e
tambm, com o aumento da distncia em relao ao mar. O vapor de gua pobre em
deutrio durante a formao das nuvens, relativamente gua do mar. Mas assim que o
vapor de gua se condensa, a chuva resultante torna-se rica em deutrio. Estes istopos vo
actuar como marcadores naturais dos acares biossintetizados nas plantas e funcionar
como uma impresso digital deixada no lcool proveniente da biofermentao desses
acares (Cross et al., 1998). A razo isotpica D/H nos grupos metilo e metileno do
etanol do vinho pode ser determinada por Site-specific Natural Isotope Fractionation
NMR (SNIF-NMR). A comparao da razo D/H com a razo (R) da intensidade dos
sinais do metilo e do metileno no espectro de deutrio possibilita a distino entre vinhos
naturais e vinhos enriquecidos em etanol e ainda a diferenciao baseada na origem
geogrfica (Koir et al., 2001). No entanto, com o avanar da tecnologia, vrias prticas
enolgicas surgiram de modo a despistar a deteco da adio de etanol por SNIF-NMR.
Assim, para atingir o mesmo objectivo, de aumentar o teor alcolico, passou-se a adicionar
sacarose proveniente da beterraba e da cana do acar. Mas esta adulterao tambm
detectvel atravs da determinao da razo

13

C/12C (

13

C) por Isotope Ratio Mass

Spectrometry (IRMS). Comparando os dados das amostras analisadas, com uma base de
dados de parmetros isotpicos (D/H)I, (D/H)II, R e 13C de amostras autnticas, possvel
confirmar a adio de acares ao mosto ou ao vinho antes ou durante a fermentao. Este
mtodo foi aplicado aos vinhos produzidos na Eslovnia, onde os dados dos istopos
estveis foram analisados por PCA e LDA (linear discriminant analysis) (Ogrinc et al.,
2001; Koir et al., 2001).
H cerca de 25 anos atrs, tambm a razo isotpica de carbonos estveis foi determinada
na cerveja, com o objectivo de detectar a adio de malte de milho, proibida segundo as
leis alems de pureza de cerveja. Com o objectivo de determinar a origem do malte, foi
determinada a razo D/H do grupo metileno do etanol da cerveja, por ser considerada um
bom indicador da sua origem geogrfica (Rossmann, 2001).
A espectroscopia de RMN acoplada com outros mtodos, como o HPLC e a espectrometria
de massa tambm j demonstraram utilidade na distino e classificao, segundo a origem
geogrfica, de vinho, sumos de fruta e azeite (Brescia et al. 2002; Ogrinc et al., 2003). No

59

entanto, com este captulo, pretende-se avaliar o potencial das tcnicas espectroscpicas de
FT-IR e RMN acopladas com mtodos quimiomtricos, na anlise de amostras de cerveja,
com os principais objectivos de estudar a influncia da origem/local de fabrico da cerveja
na composio qumica e possvel identificao da data de produo (Almeida et al.,
2006). A abordagem pretendida diferente dos estudos anteriores relatados uma vez que se
pretende caracterizar minuciosamente a cerveja e depois relacionar essa caracterizao
com a origem e data de produo. Em cada local, mesmo que seja seguida uma mesma
receita (bioqumica e tcnica) difcil prever e detectar, em tempo til, variaes na
composio e propriedades gerais da cerveja, provocadas por alteraes das condies
ambientais, estado da levedura e dos equipamentos, etc. Assim, pretende-se tirar partido da
rapidez do RMN e da sua capacidade de registar um perfil geral da composio qumica da
cerveja para facilitar e promover um controlo de qualidade mais eficiente.

4.2 Materiais e Mtodos


Amostras: Foram seleccionadas 27 garrafas de cerveja do tipo lager (4% v/v de
percentagem de lcool) e da mesma marca, produzidas em 3 pases (A, B e C) e em 3 datas
diferentes (1, 2 e 3), espaadas de 1-2 meses. De cada data de fabrico, seleccionaram-se 3
garrafas (a, b e c), como se pode ver na Tabela 4.1, de forma a, no decorrer do estudo,
avaliar e considerar a eventual variabilidade entre garrafas produzidas na mesma data. As
amostras foram armazenadas a 4C at sua anlise.

Tabela 4.1 Informao sobre as amostras de cerveja analisadas.

Codificao
A1a
A1b
A1c
A2a
A2b
A2c
A3a
A3b
A3c

60

Pas de Origem
A
A
A
A
A
A
A
A
A

Data de Produo
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Abr-02
Abr-02
Abr-02
Fev-02
Fev-02
Fev-02

Garrafa
a
b
c
a
b
c
a
b
c

pH
4,37
4,35
4,35
4,35
4,38
4,37
4,40
4,41
4,39

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Codificao
B1a
B1b
B1c
B2a
B2b
B2c
B3a
B3b
B3c

Pas de Origem
B
B
B
B
B
B
B
B
B

Data de Produo
Mai-02
Mai-02
Mai-02
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Fev-02
Fev-02
Fev-02

Garrafa
a
b
c
a
b
c
a
b
c

pH
4,32
4,32
4,30
4,27
4,28
4,28
4,37
4,36
4,36

C1a
C1b
C1c
C2a
C2b
C2c
C3a
C3b
C3c

C
C
C
C
C
C
C
C
C

Fev-02
Fev-02
Fev-02
Mar-02
Mar-02
Mar-02
Abr-02
Abr-02
Abr-02

a
b
c
a
b
c
a
b
c

4,22
4,21
4,24
4,35
4,32
4,34
4,54
4,53
4,53

Imediatamente antes da anlise por RMN, as amostras de cerveja foram desgaseificadas


num banho ultra-snico, durante 10 minutos e preparadas de modo a conterem 10% de
D2O e 0,02% de TSP, como referncia de desvio qumico e de intensidade. As mesmas
amostras desgaseificadas foram armazenadas a 4C, durante 3-4 dias, at serem analisadas
por FT-IR.
Mtodos: Para a anlise por Espectroscopia de FT-IR, as amostras de cerveja
desgaseificadas foram colocadas directamente sob a clula de FT-IR-ATR (Golden Gate,
equipada com um cristal de diamante, que permite uma reflexo nica). Os espectros de
FT-IR foram registados num espectrmetro Bruker IFS55, usando uma resoluo de 4 cm-1
e 256 varrimentos para cada amostra. De cada amostra obtiveram-se 5 espectros/rplicas
(para verificar a repetibilidade experimental dos resultados), que depois foram tratados por
Anlise em Componentes Principais (PCA). Entre cada anlise, o cristal foi limpo
cuidadosamente com acetona e gua destilada e efectuou-se um background, ou seja, foi
adquirido um branco da amostra. Os espectros das amostras foram registados
aleatoriamente.

61

Os espectros de RMN 1D e 2D foram adquiridos num espectrmetro Bruker Avance DRX500, operando a 500,13 MHz para o proto e a 125,77 MHz para o carbono. Os espectros
de RMN 1D de 1H foram obtidos usando o programa de pulsos noesypr1dsp, com
saturao dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm). Foram usados 128
varrimentos e 32K pontos, com uma largura espectral de 8012 Hz. Para cada amostra
foram obtidos 3 espectros/rplicas. Os espectros TOCSY foram registados usando o
programa lcmlevpcpstp (Bruker Library) e a sequncia de pulsos MLEV-17 para
spin-lock. Foram adquiridos 16 varrimentos para cada um dos 512 incrementos, usando
uma largura espectral de 5482,46 Hz, nas duas dimenses, um tempo de relaxao de 100
ms e um tempo de mistura de 1,5 segundos. Os espectros de HSQC foram registados
usando o programa invietgpsi que aplica deteco inversa e desacoplamento de

13

durante a aquisio. Foram obtidos 64 varrimentos para cada um dos 300 incrementos que
foram adquiridos com uma largura espectral de 5482,46 Hz e 25157,23 Hz, nas dimenses
do proto e do carbono, respectivamente. Os espectros J-resolved foram registados usando
o programa lcjresps, com 8182 pontos, 24 varrimentos para cada um dos 128
incrementos e uma largura espectral de 8012,82 Hz, na dimenso do proto e 31,30 Hz na
dimenso J.
Para a Anlise em Componentes Principais (PCA) foram construdas matrizes dos
espectros das amostras, de diferentes dimenses. No caso dos espectros de FT-IR, a matriz
foi construda usando apenas a regio da impresso digital (fingerprint), isto , de 1200 a
980 cm-1. Cada linha da matriz (cada espectro) foi centrada e reduzida, antes da aplicao
da PCA. Na anlise dos espectros de RMN, foram usados os espectros inteiros (0,5 a 10,4
ppm), excluindo os sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,65 ppm), seguindo-se a
anlise das sub-regies dos espectros aliftica (3,1 0,5 ppm), acares (5,8 3,1 ppm) e
aromtica (10 5,8 ppm). Estas matrizes foram depois normalizadas e tratadas usando um
programa estatstico co-desenvolvido pela Universidade de Aveiro e o Institut National
Agronomique Paris-Grignon (Barros, 1999).

62

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

4.3 Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR


Na Figura 4.1 est representado um espectro tpico de FT-IR de uma amostra de cerveja.
Como se pode verificar, para alm das fortes bandas de absoro da gua (extenso - 3320
cm-1 e toro - 1640 cm-1), os espectros de FT-IR das cervejas apresentam alguns picos na
zona de 1500-900 cm-1 (zona da impresso digital), originados essencialmente por hidratos
de carbono (1155-1151 cm-1e 1024-998 cm-1) e etanol (1087 cm-1, 1045 cm-1 e 880 cm-1),

Abs. (U.A.)

como se pode consultar na Tabela 2.9.

gua
Regio da
impresso
digital

3600

3100

2600

2100

1600

1100

600

-1

Nmero de onda (cm )

Figura 4.1 Espectro tpico de FT-IR (4000-600 cm-1) de cerveja.

Na Figura 4.2a, apresentam-se ampliaes da regio da impresso digital, dos espectros de


trs amostras de cerveja, uma de cada pas, produzidas no mesmo ms, como se pode ver
na Tabela 4.1. Na figura, agora possvel identificar as bandas caractersticas do etanol
(1087 cm-1, 1045 cm-1) e das dextrinas (1151 cm-1, 1078 cm-1 e 1024 cm-1), tendo por base
a Figura 4.2b (Duarte, 2003).

63

a)
b)
Etanol

1045

Dextrinas

Dextrinas

Abs. (U.A.)

Etanol

1085
879

A3a
B3b

1041
1078

C1a

1151 1111

998

Maltose

1024

Dextrina
1250

1200

1150

1100

1050

Nmero de onda (cm -1)

1000

950
1200

1100

1000

900

-1 -1)
Nmero
de onda
(cm
Wavenumber
(cm
)

Figura 4.2 Regio da impresso digital dos espectros de FT-IR de: a) amostras de cerveja,
identificadas de acordo com a Tabela 4.1; b) solues aquosas de etanol, dextrina e maltose
(Duarte, 2003).

Numa primeira observao dos espectros no so visveis diferenas assinalveis, ao nvel


da composio qumica, entre as vrias amostras. Com o objectivo de procurar e analisar as
possveis fontes de variabilidade dos espectros de FT-IR das amostras de cerveja
analisadas, realizou-se uma PCA usando, a regio de 1200-980 cm-1 dos espectros das 27
amostras, por ser uma regio de interesse que permite detectar perfis de composio
qumica.
Na Figura 4.3, esto representadas as coordenadas factoriais dos dois primeiros
componentes principais, PC1 e PC2. Como se pode verificar, as cervejas do pas B (a
vermelho) encontram-se agrupadas na parte positiva do eixo PC1. Tambm possvel
observar um agrupamento parcial das amostras do pas A (a azul), sendo este efeito apenas
visvel para as amostras produzidas na data 3, isto , o subgrupo A3. Este subgrupo situa-se
na parte positiva do eixo de PC2 e ronda o nulo do eixo de PC1. As restantes amostras
encontram-se dispersas, no havendo uma tendncia para o agrupamento consoante o pas
de origem.

64

800

PC2 (8%)

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

PC1 (63%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.3 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da regio 1200-980 cm-1.

No intuito de caracterizar esta separao, sugerida pelo diagrama de coordenadas


factoriais, recorreu-se anlise dos grficos das contribuies factoriais de PC1 e de PC2
(Figura 4.4).

0,3

Contribuies Factoriais

1045 cm-1 (etanol)


0,2

1085-1072 cm-1

998 cm-1

0,1
PC1

0
1180
-0,1

1130

1080

1030

980

PC2

1151 cm-1

-0,2
-0,3

1070 cm-1

1024 cm-1 (dextrinas)

Nmero de onda (cm -1)

Figura 4.4 Contribuies factoriais de PC1 e PC2.

65

O perfil das contribuies factoriais de PC1 mostra valores positivos para bandas de
absoro caractersticas do etanol (1045 e 1085-1072 cm-1) e valores negativos para bandas
caractersticas das dextrinas (1151 cm-1 e 1024 cm-1), sugerindo que as cervejas produzidas
no pas B, localizadas na parte positiva do eixo de PC1, tenham teores mais elevados de
lcool e mais baixos de dextrinas, ao contrrio das amostras localizadas na parte negativa
do eixo de PC1. Por outro lado, o grfico de PC2 apresenta valores positivos para bandas
de absoro caractersticas de maltose (1160-1140 cm-1, 1045-1041 cm-1 e 998 cm-1)
(Duarte et al., 2004), sugerindo que a variao na composio de hidratos de carbono pode
ser o factor responsvel pela separao das amostras A3. Estas diferenas no foram
detectadas pela inspeco visual dos espectros, uma vez que o nmero elevado de amostras
dificulta a sua comparao. Deste modo, a anlise em componentes principais revelou-se
uma ferramenta til, na extraco de informao neste conjunto de dados.
A diferena nos teores de etanol e acares pode estar relacionada com a extenso da
fermentao, uma vez que, como se sabe, um maior consumo de acares leva a um
aumento no teor de etanol. No entanto, este assunto necessitaria de mais investigao,
nomeadamente, a caracterizao qumica mais detalhada (o que vai ser possvel atravs da
espectroscopia de RMN no ponto que se segue), determinao rigorosa do teor de etanol
(uma vez que a informao contida no rtulo das garrafas apenas uma aproximao) e de
acares redutores e estudo do grau de ramificao das dextrinas.

4.4 Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN


Na Figura 4.5 esto representados os espectros de RMN de 3 amostras de cerveja da mesma
marca, uma de cada pas, produzidas no mesmo ms. Como se pode ver, pela simples
observao dos espectros no possvel encontrar variaes que possam ser
correlacionadas com o pas de origem ou data de produo, devido no s ao elevado
nmero de picos, bem como grande complexidade de cada sinal.

66

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

H2 O

12

TSP

18
15
15
7

1,2,3

B
17

13

17

13

9
6

C
16
14

14

10,11

ppm

Figura 4.5 Espectros de RMN de 1H de 3 cervejas da mesma marca, uma de cada pas (1-propanol,
2-isobutanol, 3-isopentanol, 4-etanol, 5-lctico, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10ctrico, 11-mlico, 12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina/tirosol,
17-histidina, 18-fenilalanina).

Com o objectivo de procurar as principais caractersticas que definem os espectros RMN


de 1H das amostras de cerveja analisadas, realizou-se uma PCA usando, inicialmente, a
regio de 0,5-10,4 ppm, excluindo os sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,65
ppm). Os dois primeiros PCs (Figura 4.6) expressam 73% da variabilidade total, o que
significa que uma grande parte dos factores responsveis pela separao explicada por
estes PCs.

67

PC2 (19%)

PC1 (54%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.6 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 (LB 0,3 Hz).

Como se pode verificar, e semelhana dos resultados obtidos por FT-IR, as cervejas do
pas B (vermelho) encontram-se agrupadas e separadas das restantes, caracterizando-se por
valores de PC1 negativo e PC2 nulo. As cervejas C3 tambm se encontram agrupadas e
distanciadas das restantes amostras, apresentando valores positivos de PC2. As restantes
amostras encontram-se, principalmente, no quadrante com PC1 positivo e PC2 negativo,
mostrando uma maior disperso.
Para interpretar esta separao necessrio analisar o grfico das contribuies factoriais
de PC1 e PC2 (Figura 4.7). Como se pode ver, a anlise difcil devido, sobretudo, aos
efeitos do tipo de primeira derivada provocados por artefactos, tais como, diferenas de
pH, concentrao e/ou instabilidade instrumental. Uma vez que as rplicas da mesma
amostra so praticamente coincidentes, mostrando uma estabilidade instrumental e no so
esperadas grandes diferenas na concentrao dos compostos, o factor mais relevante para
o aparecimento desses efeitos do tipo de primeira derivada parece ser o pH (pH=0,33),
sendo necessrio em estudos semelhantes futuros, garantir uma homogeneidade dos
valores de pH, por exemplo, pela adio de um tampo (Lachenmeier et al., 2005).

68

Contribuies Factoriais

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

0,07

0,02

-0,03

8,7

6,7

4,7

2,7

0,7

-0,08

-0,13
Desvio qumico (ppm)
PC1

PC2

Figura 4.7 Contribuies factoriais de PC1 e PC2 (LB 0,3 Hz).

De forma a minimizar estes artefactos, os espectros de RMN foram processados com um


factor de LB (line-broadening) superior (LB 10 Hz), ou seja o FID inicial foi multiplicado
exponencialmente por um factor de 10. Este tratamento dos espectros torna-se vantajoso,
principalmente para a anlise multivariada, uma vez que, ao alargar os picos, reduz
significativamente ou elimina os desvios, possibilitando a comparao entre os vrios
espectros e a deteco das similaridades/diferenas reais entre as vrias amostras. No
entanto, tem como contrapartida a diminuio da resoluo espectral, o que provoca a
perda de informao, principalmente nas regies onde os picos so menos intensos e onde
se encontram muito prximos uns dos outros (aromtica e aliftica), como se pode ver na
Figura 4.8. A PCA foi aplicada nova matriz obtida, usando espectros com LB 10 Hz,

excluindo a regio da gua e etanol.

69

Lb 0,3 Hz

Lb 2 Hz

Lb 10 Hz

Lb 50 Hz

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

ppm

Figura 4.8 Espectros de RMN 1H de cerveja, 500 MHz, processados com diferentes valores de LB.

A Figura 4.9 mostra as coordenadas factoriais dos dois primeiros PCs, que expressam 85%
da variabilidade total. Como se pode ver, a disposio das amostras muito semelhante
obtida com os espectros originais (LB 0,3 Hz), no entanto, os grupos aparecem mais
agregados, uma vez que os pequenos desvios, devido s diferenas de pH, foram
minimizados.

70

PC2 (22%)

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

PC1 (63%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.9 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2, dos espectros processados com LB 10 Hz.

Analisando as contribuies factoriais respectivas (Figura 4.10), podemos ver que os efeitos
do tipo de primeira derivada so muito menores, mas devido ao elevado nmero de picos a
interpretao continua difcil. Tambm a anlise de toda a gama espectral no permite
detectar as variaes nos compostos minoritrios, pois sobressaem as variaes nos
compostos mais intensos, e por este motivo, a PCA foi aplicada por regies espectrais:
aliftica, acares e aromtica.

Contribuies Factoriais

0,04
0,02
0,00
-0,02

8,7

6,7

4,7

2,7

0,7

-0,04
-0,06
-0,08
Desvio Qumico (ppm)
PC1

PC2

Figura 4.10 Contribuies factoriais (PC1 e PC2), dos espectros processados com LB 10 Hz.

71

Na regio aliftica a PCA foi aplicada de 3,1-0,5 ppm, excluindo o sinal do etanol (1,17
ppm). A Figura 4.11 refere-se ao mapa das coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio
aliftica dos espectros de RMN de 1H (LB 0,3 Hz). Como se pode ver, existe uma
disperso considervel das amostras, embora exista uma tendncia para o agrupamento das
cervejas produzidas no pas A (a azul). No entanto, quando se compara os resultados da
PCA nesta regio, com os resultados da PCA aplicada ao espectro completo (Figura 4.6),
observam-se claramente diferenas, mostrando a importncia de avaliar as sub-regies
separadamente (anlise mais fina), de modo a obter informao adicional e complementar.
Para interpretar a separao das amostras no mapa das coordenadas factoriais, necessrio
analisar o grfico das respectivas contribuies factoriais (Figura 4.12). Como se pode ver,
existe um elevado nmero de picos, assim como efeitos do tipo de primeira derivada, que
indicam pequenos desvios qumicos dos sinais, causados principalmente, como j foi
mencionado, por pequenas diferenas do pH das amostras (Tabela 4.1), o que dificulta a sua
interpretao. Deste modo, mais uma vez, foi efectuada uma PCA da regio aliftica, dos

PC2 (20%)

espectros com valores mais elevados de LB.

PC1 (32%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.11 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aliftica dos espectros 1H de RMN (LB
0,3 Hz).

72

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Contribuies Factoriais

0,13
0,08
0,03
-0,02

2,5

1,5

0,5

-0,07
-0,12
-0,17
Desvio qumico (ppm)
PC1

PC2

Figura 4.12 Contribuies factoriais (PC1 e PC2) da regio aliftica dos espectros de RMN de 1H.

Na Figura 4.13 apresentam-se os mapas das coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da PCA
quando aplicada regio aliftica dos espectros processados com diferentes valores de LB
(2, 5, 10, 30 e 50 Hz), excluindo o sinal do etanol. Como se pode verificar, com o aumento
do valor de LB, parece existir uma tendncia evolutiva para o agrupamento das amostras
em funo da sua origem. No entanto, para LB 30 e 50 Hz essa tendncia no se mantm,
verificando-se, novamente, uma grande disperso das amostras. O valor de LB 10 Hz
aquele que, aparentemente, confere os melhores resultados em termos de separao das
cervejas, por origem geogrfica e tambm por data de fabrico. Tambm de notar que no
so visveis diferenas entre as garrafas do mesmo lote de fabrico, denotando uma
estabilidade instrumental e homogeneidade das amostras, nem sobreposies de amostras
provenientes de pases diferentes, como acontecia no caso dos espectros com LB 0,3 Hz.
Sendo assim, a anlise ser focada nestes resultados.
Para tentar perceber as razes desta separao analisaram-se os mapas das contribuies
factoriais de PC1 e PC2 resultantes da PCA da regio aliftica dos espectros de RMN
processados com LB 10 Hz (Figura 4.14).

73

b) LB 5 Hz

PC2 (24%)

PC2 (22%)

a) LB 2 Hz

PC1 (53%)

PC1 (42%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

A1

C3

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

B3

C1

C2

C3

d) LB 30 Hz

PC2(18%)

PC2 (17%)

c) LB 10 Hz

A2

PC1 (54%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC1 (51%)

C1

C2

C3

A1

A2

A3

B1

B2

PC2 (12%)

e) LB 50 Hz

PC1 (68%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.13 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aliftica dos espectros de RMN de 1H
processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10, d) 30 e e) 50 Hz.

74

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

a)

Contribuies Factoriais de PC1

0,06

Actico

Succnico
0,03

Alanina
Leucina

Leucina

0
3

2,5

-0,03

1,5

0,5

Lctico

-0,06

Pirvico

-0,09
Desvio Qumico (ppm)

b)
Contribuies Factoriais de PC2

0,06

0,03

GABA

Leucina

GABA

Alanina

Leucina

0
3

2,5

1,5

0,5

-0,03

Lctico

-0,06

-0,09

Succnico
Desvio Qumico (ppm)

Figura 4.14 Contribuies factoriais de a) PC1 b) PC2 (LB 10 Hz).

As amostras produzidas no pas A (a azul) podem ser distinguidas das amostras do pas B
(a vermelho) ao longo do eixo de PC1, uma vez que apresentam valores opostos neste eixo.
Assim, pela inspeco do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 4.14a)
podemos sugerir que as amostras do pas A (PC1 positivo) apresentam teores mais
elevados de leucina e alanina, ao contrrio das amostras situadas na parte negativa do eixo
de PC1 (cervejas do pas B). Estas, por sua vez, apresentam concentraes maiores de
cido lctico e pirvico, como se pode ver na Figura 4.15. O cido pirvico um produto
intermedirio da biossntese do etanol pela levedura e sabido, que cervejas com nveis

75

elevados de piruvato, possam ter sido produzidas com leveduras que sofrem autlise
(destruio da clula depois da sua morte) durante a fermentao. possvel, portanto, que
esse contedo mais alto de cido pirvico e o seu produto de reduo, o cido lctico,
possam ser indicativos da qualidade mais pobre da levedura ou da aco de geraes mais
velhas.

c. actico
Alanina

A1

c. Pirvico (+)

B2

c. Lctico (+)

C1

c. succnico

C3

2.8

Alanina (+)
GABA

GABA

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

ppm

Figura 4.15 Regio aliftica dos espectros de RMN H de 4 cervejas diferentes, identificadas
segundo a Tabela 4.1.

Em relao s amostras do pas C, localizadas na parte positiva do eixo de PC2, pela


anlise do grfico das contribuies factoriais deste eixo (Figura 4.14b) pode-se sugerir que
estas contm maiores teores de leucina, alanina e GABA e menores teores de cido lctico
e succnico. Parte destas afirmaes, e uma vez que no foi possvel quantificar o teor dos
aminocidos referidos, devido sobreposio de sinais, podem ser confirmadas pela

76

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

observao da Tabela 4.2. Nesta tabela encontram-se as quantidades estimadas nas amostras
de cerveja, dos 3 cidos orgnicos mencionados (lctico, pirvico e succnico). As
concentraes foram obtidas por integrao do sinal relativamente rea do TSP
(referncia de intensidade). O sinal do TSP surge a 0,0 ppm e conta com a contribuio de
9 protes (3 grupos metilo). O valor da rea do sinal, medido em todos os espectros,
reflecte a concentrao adicionada (0,02 %) a cada amostra. A concentrao desconhecida
do composto Y, presente na cerveja, pode ser calculada de acordo com a seguinte equao:
CY = F (AY.MY / nY) (CTSP . nTSP / MTSP)
Onde, C a concentrao, F o factor de diluio, A a rea do sinal integrado, M a massa
molecular e n o nmero de protes que contribuem para o sinal integrado (Duarte et al.,
2003).
Para cada pas de origem, e a partir dos espectros, determinaram-se as concentraes nas 9
amostras e calculou-se a mdia, com excepo das amostras produzidas no pas C, onde se
verificou uma grande disperso entre as datas de fabrico, podendo mesmo serem divididas
em 2 grupos: o grupo das amostras produzidas nas datas 1 e 2 (Fevereiro e Maro de
2002), com PC1 negativo, e o grupo das amostras C3, com PC1 positivo. Como se pode
ver no grfico das contribuies factoriais e confirmado pela observao dos espectros e da
tabela seguinte, as amostras C1 e C2 apresentam teores mais elevados de cido pirvico e
lctico do que as amostras C3. Isto tambm consistente com os valores de pH,
relativamente mais elevados, das cervejas C3. Estes resultados sugerem que as variaes
dentro de um local de produo podem reflectir a qualidade varivel da levedura ao longo
do tempo ou, alternativamente, dado que a maioria dos fabricantes de cerveja substituem
periodicamente a cultura da levedura, que a que foi usada para produzir as cervejas C3
poderia ser mais nova, em termos do nmero de geraes, do que a usada para produzir C1
ou C2.

77

Tabela 4.2 Concentrao de alguns cidos orgnicos, consoante o pas de origem da cerveja.

Concentrao (mg/L)
Composto

Pas C

Pas A

Pas B

cido Lctico (1,34 ppm)

28,9 3,0

68,9 6,6

28,1 2,1

25,1

cido Pirvico (2,35 ppm)

71,6 8,6

100,0 4,4

93,1 14,2

63,4

cido Succnico (2,54 ppm)

64,2 3,2

78,6 8,6

70,5 8,4

64,6

(C1+C2)

Pas C (C3)

Na regio dos acares a PCA foi aplicada de 5,8-3,1 ppm, excluindo os sinais da gua
(4,77 ppm) e do etanol (3,64 ppm). Na Figura 4.16 podemos ver o grfico das coordenadas
factoriais PC1 vs. PC2, que conjuntamente explicam 83% da variabilidade total. As
cervejas do pas B, localizadas na parte negativa do eixo de PC1, esto claramente
separadas das restantes. As cervejas produzidas nos pases A e C esto agrupadas mas
mostrando grande disperso ao longo do eixo de PC1, com excepo das amostras C3

PC2 (21%)

(Abril de 2002), que se encontram na parte positiva do eixo PC2.

PC1 (62%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.16 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio dos acares dos espectros 1H de RMN
(LB 0,3 Hz).

78

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Como se pode ver na Figura 4.17 a anlise das contribuies factoriais de PC1 e PC2
muito complicada, devido aos efeitos do tipo de primeira derivada, e por isso, os espectros
foram processados com valores mais elevados de LB, que em seguida foram analisados por

Contribuies Factoriais

PCA.

0,07
0,02
-0,03

5,6

5,1

4,6

4,1

3,6

3,1

-0,08
-0,13
Desvio qumico (ppm)
PC1

PC2

Figura 4.17 Contribuies factoriais (PC1 e PC2) da regio dos acares dos espectros de RMN de
1

H (LB 0,3 Hz).

Na Figura 4.18 pode-se verificar que a distribuio das amostras no mapa das coordenadas
factoriais semelhante para os vrios LBs (2, 5, 10 e 30 Hz), embora com LB 10 Hz os
grupos sejam mais uniformes e, como foi visto anteriormente, a anlise das contribuies
factoriais mais facilitada, pois os efeitos do tipo de primeira derivada so menos
significativos. Assim, tal como foi feito na regio aliftica, os resultados da PCA aplicada
aos espectros processados com LB 10 Hz, foram analisados com mais pormenor.

79

b) LB 5 Hz

PC2 (24%)

PC2 (27%)

a) LB 2 Hz

PC1 (61%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC1 (66%)
C1

C2

C3

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

C1

C2

C3

d) LB 30 Hz

PC2 (17%)

PC2 (21%)

c) LB 10 Hz

A1

PC1 (67%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC1 (66%)

C1

C2

C3

A1

A2

A3

B1

B2

B3

Figura 4.18 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio dos acares dos espectros de RMN de
1
H processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10 e d) 30 Hz.

Analisando as contribuies factoriais de PC1 e PC2 (Figura 4.19), resultantes da aplicao


da PCA aos espectros processados com LB 10 Hz, muito mais simplificadas que as obtidas
a partir da PCA dos espectros com LB 0,3 Hz (Figura 4.17), podemos retirar alguma
informao em termos de picos responsveis pela separao das amostras. No entanto,
como se sabe, nesta regio no fcil identificar os compostos, devido forte sobreposio
de picos e por isso, a anlise ser focada na regio onde aparecem os picos anomricos dos
acares (4,6 5,6 ppm).

80

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

a)

Contribuies Factoriais de PC1

0,06

H1 (1-4)
0,03

H1 (red)

H1 (red)

0,00
5,6

5,1

4,6

4,1

3,6

3,1

3,6

3,1

H1 (1-6)

-0,03

H1 (1-4)
-0,06
Desvio Qumico (ppm)

b)

Contribuies Factoriais de PC2

0,09

H1 (1-4)
0,06

H1

0,03
0,00
5,6

5,1

-0,03

H1 (1-4)

4,6

H1 (1-6)

4,1

H1 (red)

-0,06
Desvio Qumico (ppm)

Figura 4.19 Contribuies factoriais de a) PC1 e b) PC2 (regio dos acares LB 10 Hz).

A anlise da Figura 4.19 revela que as cervejas que se encontram na parte negativa do eixo
de PC1 (Figura 4.18c), produzidas nos pases A e C, com excepo das C3, so
caracterizadas pelos sinais a 4,96 (H1, 16) e a 5,3-5,4 (H1, 14) ppm, caractersticos
das dextrinas ramificadas, sugerindo que estas amostras contm teores mais elevados deste
tipo de acares. Por sua vez, as amostras C3 situam-se no quadrante com PC1 e PC2
positivos. Observando o grfico das contribuies factoriais de PC1 e PC2, pode-se
verificar que os valores positivos so devidos aos sinais a 4,63 (H1 red), 5,21 (H1 red) e
5,37 (H1, 14) ppm, caractersticos de dextrinas lineares. Finalmente, as cervejas do pas

81

B apresentam valores positivos de PC1 e valores negativos de PC2. Como j foi referido,
os valores positivos de PC1 so devidos aos sinais localizados a 4,63, 5,21 e 5,37 ppm,
caractersticos de dextrinas lineares. No entanto, no grfico das contribuies factoriais de
PC2, encontram-se valores negativos a 4,94 (H1, 16) e a 5,30-5,35 (H1, 14) ppm,
caractersticos de dextrinas ramificadas. Estes resultados podem parecer contraditrios,
mas indicam que as dextrinas das cervejas do pas B tm um grau de ramificao
intermdio, comparando com as restantes. Na Figura 4.20 esto apresentadas as regies dos
acares de 3 espectros, um de cada pas de origem. Como se pode ver, o espectro do pas
A aquele que apresenta um sinal mais largo a 5,3-5,4 ppm, caracterstico de dextrinas
ramificadas, enquanto que o espectro das cervejas C3 apresenta um pico mais estreito,
caracterstico de dextrinas lineares.
gua

A1

H1 (1-4)
H1 (1-6)

B2

H1 (1-4)

C3
H1 (red)

H1 (red)

5.5

5.4

5.3

5.2

5.1

5.0

4.9

4.8

4.7

4.6

4.5

4.4

4.3

4.2

ppm

Figura 4.20 Regio dos acares dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, identificadas segundo
a Tabela 4.1.

82

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Para confirmar estes resultados, foi necessrio fazer uma anlise mais detalhada dos
espectros de RMN de 1H, integrar os picos relevantes e a partir desses valores calcular o
nmero mdio de anis de glucose e de pontos de ramificao por molcula (Duarte et al.
2003). O nmero mdio de anis de glucose por molcula obtido atravs da razo das
reas dos sinais dos protes H1 nas posies (1-4) e (1-6), cujos sinais aparecem a 5,305,40 e 4,9-5,0 ppm, respectivamente, e das reas dos protes redutores H1 (5,22 e 4,63
ppm para os anmeros e , respectivamente). O nmero mdio de pontos de ramificao
por molcula estimado atravs da razo entre o integral do pico dos protes H1 na
posio (1-6) (sinal a 4,9-5,0 ppm) e o integral dos picos H1 na posio (1-4), cujos
sinais aparecem a 5,3-5,4 ppm, multiplicada pelo nmero total de ligaes. Os resultados
(Tabela 4.3) mostram que as cervejas do pas A e as C1 e C2 contm dextrinas com um
maior nmero de pontos de ramificao, enquanto que as C3 so aquelas que tm um
menor nmero. Com um grau intermdio de ramificao temos as cervejas do pas B,
confirmando-se, assim, os resultados obtidos na PCA. Uma explicao possvel para estas
diferenas no grau de ramificao baseada na actividade das enzimas e -amilases,
envolvidas no processo de fabrico da cerveja. A -amilase uma endo-enzima com uma
resistncia trmica elevada e, por isso, sob determinadas condies trmicas pode ter
actuado por mais tempo que a -amilase, promovendo a presena de segmentos menos
ramificados de dextrinas. Este parece ser o caso das cervejas produzidas no pas B, em
contraste com as dos pases A e C (C1 e C2). Alm disso, parecem existir variaes
significativas no processamento no pas C, o que conduz s diferenas no grau de
ramificao entre as vrias datas de produo. Assim, as cervejas C3 so aquelas que
apresentam um grau de ramificao menor, sugerindo, a presena de quantidades
significativas de acares mais simples, como o caso da glucose, trealose e/ou maltose.
Estes acares podem ter permanecido na cerveja devido ao facto da fermentao no ter
sido completa, o que pode ter sido causado por um arrefecimento precoce ou uma
floculao das leveduras (Hughes e Baxter, 2001).

83

Tabela 4.3 Resultados dos clculos do tamanho mdio e pontos de ramificao das dextrinas.

N mdio de molculas de
glucose/molcula
5,8

N mdio de
ramificaes/molcula
0,57

5,0

0,43

C1 e C2

5,8

0,54

C3

4,5

0,35

Amostra

Com o objectivo de tentar maximizar tambm a contribuio dos compostos minoritrios


identificados na regio aromtica (10,4-5,8 ppm), realizou-se a PCA desta regio dos
espectros de RMN de 1H processados com LB 0,3 Hz. Como se pode ver na Figura 4.21, a
separao das amostras, segundo a sua origem geogrfica, no muito clara. Mais uma
vez, esta disperso pode ter a ver com as variaes de pH das amostras, que causam
pequenas alteraes nos desvios qumicos, fazendo aparecer efeitos do tipo de primeira

PC2 (19%)

derivada nos grficos das contribuies factoriais de PC1 e PC2 (no apresentados).

PC1 (43%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.21 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aromtica dos espectros 1H de RMN
(LB 0,3 Hz).

Tal como foi feito nas regies anteriores, para tentar eliminar os efeitos dos desvios,
processaram-se os espectros com diferentes valores de LB (2, 5, 10, 30 e 50 Hz). Como se
pode ver na Figura 4.22, com o aumento do valor de LB, as amostras tm tendncia a

84

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

agrupar-se consoante a sua origem geogrfica. No entanto, com LB 50 Hz, os resultados


no so to satisfatrios, no sendo possvel retirar qualquer tipo de informao relevante
acerca das amostras.
b) LB 5 Hz

PC2 (18%)

PC2 (22%)

a) LB 2 Hz

PC1 (47%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC1 (55%)

C1

C2

C3

A1

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

C1

C2

C3

d) LB 30 Hz

PC2 (11%)

PC2 (16%)

c) LB 10 Hz

A2

PC1 (63%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC1 (69%)
C1

C2

C3

A1

A2

A3

B1

B2

B3

PC2 (9%)

e) LB 50 Hz

PC1 (71%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 4.22 Coordenadas factoriais PC1 vs. PC2 da regio aromtica dos espectros de RMN de 1H
processados com diferentes LBs: a) 2, b) 5, c) 10, d) 30 e e) 50 Hz.

85

Apesar da disposio das amostras ser muito semelhante para os LBs 5, 10 e 30 Hz, notase uma ligeira melhoria quando a PCA aplicada aos espectros com LB 10 Hz e, por este
motivo, a anlise destes resultados foi feita em mais pormenor. Outro factor preponderante
nesta escolha o facto do grfico das contribuies factoriais desta PCA ser mais fcil de
analisar, ainda sem significativas perdas de informao espectral.
Analisando as contribuies factoriais de PC1 e PC2 (Figura 4.23), podemos verificar que
as amostras do pas A (PC2 positivo) so mais ricas em adenosina e/ou inosina (6,07, 8,26
e 8,35 ppm) e 2-feniletanol (7,32 e 7,38 ppm) e contm teores mais baixos de uridina (5,88
e 7,85 ppm), tirosina e/ou tirosol (6,88 e 7,17 ppm) e histidina (7,04 e 7,98 ppm), em
comparao com as cervejas produzidas no pas B (PC2 negativo). Em relao s cervejas
do pas B, nota-se uma ligeira variao em termos de datas de fabrico. Assim, as amostras
B2 esto na parte positiva do eixo de PC1 e distinguem-se das restantes por terem um teor
mais elevado de polifenis. Finalmente, as cervejas do pas C aparecem separadas
consoante a sua data de fabrico, ao longo do eixo de PC1. Este eixo sugere,
principalmente, variaes nas quantidades de 2-feniletanol (7,32 e 7,38 ppm), tirosina e/ou
tirosol e histidina (7,04 e 7,98 ppm). As amostras C3 (PC1 negativo) diferem das restantes
do pas C por serem mais ricas em 2-feniletanol e tirosina e/ou tirosol. A presena de
tirosol e 2-feniletanol na cerveja final pode ser devida degradao dos aminocidos.
Durante o processo de fabrico da cerveja, certos aminocidos so submetidos degradao
de Strecker e do origem a aldedos que, durante a fermentao, podem, enzimaticamente,
ser reduzidos aos seus lcoois correspondentes (Hughes e Baxter, 2001).
Estas observaes podem ser confirmadas atravs da anlise da Tabela 4.4, onde se
encontram as concentraes estimadas de alguns compostos que apresentam picos na
regio aromtica.

86

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

a)
Contribuies Factoriais de PC1

0,04

histidina
polifenis

0,02

uridina
citidina

citidina

0
9,8

8,8

7,8

6,8

5,8

-0,02

tirosina/
tirosol

-0,04

2-feniletanol

-0,06

Desvio Qumico (ppm)

b)
adenosina/
inosina

Contribuies Factoriais de PC2

0,04

2-feniletanol

adenosina/
inosina

0,02
0
9,8

8,8

7,8

6,8

5,8

-0,02

histidina
-0,04

uridina

-0,06

tirosina/
tirosol

uridina

Desvio Qumico (ppm)

Figura 4.23 Contribuies factoriais de a) PC1 e b) PC2 (regio aromtica LB 10 Hz).

As concentraes dos vrios compostos, presentes na tabela, foram obtidas por integrao
do sinal respectivo, relativamente rea do TSP (Duarte et al., 2003). Tal como foi feito na
regio aliftica, para cada pas de origem, e a partir dos espectros, determinaram-se as
concentraes nas 9 amostras e calculou-se a mdia, com excepo das amostras C3, que
denotam demasiadas diferenas em relao s outras amostras do pas C.
Como se pode ver, as amostras do pas C apresentam teores mais elevados de citidina e
uridina, a amostras C1 e C2 contm os teores mais altos de adenosina/inosina enquanto que
as amostras C3 so mais ricas em 2-feniletanol, histidina e tirosina/tirosol.

87

Tabela 4.4 Concentrao de alguns compostos, consoante o pas de origem da cerveja.

Concentrao (mg/L)
Composto

Pas C

Pas A

Pas B

Adenosina e/ou Inosina (8,35 ppm)

68,1 8,9

49,2 2,7

78,6 4,3

48,4

Citidina (7,89 ppm)

101,5 19,7

125,9 9,3

119,2 13,8

91,2

2-Feniletanol (7,30 ppm)

113,2 9,2

122,2 3,3

125,8 13,6

132,8

Histidina (7,04 ppm)

44,3 9,0

53,1 4,3

50,7 2,4

54,1

Tirosina/Tirosol (6,85/6,88 ppm)

96/127

107/140

108/142

126/166

Uridina (7,86 ppm)

106,7 20,3

142,8 11,7

127,9 14,0

132,4

(C1+C2)

Pas C (C3)

Na Figura 4.24 esto apresentadas as regies aromticas dos espectros de RMN de cervejas,
dos vrios pases de origem. Nesta regio aparecem sinais de vrios compostos, muitos dos
quais sobrepostos, o que dificulta a sua interpretao e da a necessidade da PCA. Como se
pode ver, as amostras do pas A so mais ricas em adenosina/inosina e 2-feniletanol,
enquanto que as amostras do pas B contm teores mais elevados de uridina e
tirosina/tirosol. Quanto s amostras do pas C, nota-se claramente diferenas no perfil
aromtico consoante a data de fabrico, principalmente na zona 7,3-7,5 ppm (fenilalanina e
2-feniletanol) e 8,1-8,4 ppm, onde se encontram sinais de adenosina/inosina e alguns
compostos no identificados.

88

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

feniletanol
(+)
Adenosina/
inosina

A1

Tirosina/
Tirosol (+)

uridina (+)

B2

citidina

histidina

C1

C3

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

Figura 4.24 Regio aromtica dos espectros de RMN de 1H de 4 cervejas, identificadas segundo a
Tabela 4.1

4.5 Concluses
A anlise da regio da impresso digital dos espectros de FT-IR permitiu a deteco dos
compostos maioritrios da cerveja, nomeadamente acares e etanol. Deste modo, a
Anlise em Componentes Principais dos espectros mostraram, apenas, pequenas variaes
nestes compostos. Foi constatado que as cervejas produzidas no pas B apresentavam
teores mais elevados de etanol enquanto que as cervejas do pas A, produzidas na data 3,
apresentavam teores mais elevados de maltose e dextrinas. Estes resultados so
promissores, mas seria necessrio um estudo mais aprofundado afim de se poder

89

caracterizar quimicamente as cervejas e detectar pequenas variaes ao nvel dos


compostos minoritrios.
A Espectroscopia de RMN em conjunto com a Anlise em Componentes Principais,
mostrou ser um potencial mtodo para detectar diferenas na composio qumica de
cervejas produzidas em diferentes pases e em diferentes datas.
Em relao composio aliftica, detectou-se que o contedo dos cidos lctico e
pirvico variam significativamente na cerveja, consoante o pas de origem. Esta variao
pode reflectir a qualidade e/ou o nmero de geraes da levedura. Em relao s datas de
produo, no se observaram diferenas entre as amostras do pas A mas o mesmo no
aconteceu com as amostras dos pases B e C, mostrando que existem diferenas no
processo de fabrico que provocam diferenas na composio qumica.
A anlise da regio dos acares dos espectros de RMN permitiu detectar que existem
diferenas no grau de ramificao das dextrinas consoante o pas de origem e no caso do
pas C, tambm consoante a data de fabrico. As dextrinas lineares predominam nas
cervejas do pas B enquanto que as dextrinas ramificadas predominam nas cervejas
produzidas nos pases A e C. No caso do pas C, como j foi referido, existe uma fraca
reprodutibilidade entre as datas de fabrico, pois as amostras C3 so as que apresentam
teores mais baixos de dextrinas ramificadas. Estas variaes podem ser correlacionadas
com as condies de processamento, principalmente da maltagem e da brassagem, que
influenciam a actividade das enzimas.
Finalmente, todos os locais de produo podem ser distinguidos com base no contedo em
adenosina/inosina, uridina, tirosina/tirosol e 2-feniletanol e, mais uma vez, a
reprodutibilidade entre as datas de fabrico pobre no caso do pas C. A presena de tirosol
e 2-feniletanol na cerveja final pode ser indicativa da degradao de Strecker de alguns
aminocidos.
As diferenas encontradas na composio qumica, podem ter origem em pequenas
variaes nas condies do processo de fabrico, nomeadamente, temperatura ambiente,
qualidade da gua, condies e mtodos de trabalho, tipo de equipamento, etc. O mtodo
de PCA/RMN pode, consequentemente, ser um mtodo til para monitorizar e controlar o
processo de fabrico da cerveja.

90

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Referncias
Almeida, C.; Duarte, I.; Barros, A.; Rodrigues, J., Spraul, M.; Gil, A. Composition of
Beer by 1H NMR Spectroscopy: Effects of Brewing Site and Date of Production Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 54; 700-706; 2006.
Almeida, C. M.; Vasconcelos, M. T. ICP-MS determination of strontium isotope ratio in
wine in order to be used as a fingerprint of its regional origin Journal of Analytical
Atomic Spectrometry; 16; 607-611; 2001.
Antonelli, A.; Zeppa, G.; gerbi, V.; Carnacini, A. Polyalcohols in vinegar as an origin
discriminator Food Chemistry; 60; 403-407; 1997.
Barros, A.S. Contribution la selection et la comparaison de variables caractristiques
Ph.D. Thesis; Institut National Agronomique Paris-Grignon; France; 1999.
Baxter, M.; Crews, H.; Dennis, M.; Goodall, I.; Anderson, D. The determination of the
authenticity of wine from its trace element composition Food Chemistry; 60; 443-450;
1997.
Brescia, M.; Caldarola, V.; Giglio, A.; Benedetti, D.; Fanizzi, F.; Sacco, A.
Characterization of the geographical origin of Italian red wines based on tradicional and
nuclear magnetic resonante spectrometric determination Analytica Chimica Acta; 458;
177-186; 2002.
Cross, J.; Gallaher, T.; Leary, J. The Application of Site-Specific Natural Isotope
Fractionation-Nuclear Magnetic Resonance (SNIF-NMR) to the Analysis of Alcoholic
Beverages The Chemical Educator; vol.3; No. 5; Springer-Verlag New York, Inc.;
1998.

91

Duarte, I. Application of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and Vibrational


Spectroscopy for the Characterisation of Fruit Products and Beverages Ph.D. Thesis,
Universidade de Aveiro; 2003.
Duarte, I.; Godejohann, M.; Braumann, U.; Spraul, M.; Gil, A. Application of NMR
Spectroscopy and LC-NMR/MS to the Identification of Carbohydrates in Beer Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 51; 4847-4852; 2003.
Duarte, I.; Barros, A.; Almeida, C.; Spraul, M.; Gil, A. Multivariate Analysis of NMR
and FT-IR Data as a Potential Tool for the Quality of Beer Journal of Agricultural and
Food Chemistry; 52; 1031-1038; 2004.
Fernndez, P.L.; Pablos, F.; Martn, M.; Gonzlez, A. G. Study of Catechin and
Xanthine Tea Profiles as Geographical Tracers Journal of Agricultural and Food
Chemistry; 50; 1833-1839; 2002.
Hberger, K.; Csoms, E. ; Simon-Sarkadi, L. Principal Component and Linear
Discriminant Analyses of Free Amino Acids and Biogenic Amines in Hungarian Wines
Journal of Agricultural and Food Chemistry; 51; 8055-8060; 2003.
Hughes, P.S.; Baxter, E.D. Beer Quality, Safety and Nutritional Aspects The Royal
Society of Chemistry; Cambridge; 2001.
Koir, I., Kocjani, M.; Ogrinc, N.; Kidri, J. Use of SNIF-NMR and IRMS in
combination with chemometric methods for the determination of chaptalisation and
geograpbhical origin of wines (the example of Slovenian wines) Analytica Chimica
Acta; 429; 195-206; 2001.
Lachenmeier, D. W.; Frank, W.; Humpfer, E.; Schafer, H.; Keller, S.; Mortter, M.; Spraul,
M. Quality Control of Beer using High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy and Multivariate Analysis European Food Research and Technology; 220;
215-221; 2005.

92

Determinao do pas e data de fabrico de cervejas produzidas internacionalmente

Marcos, A.; Fisher, A.; Rea, G.; Hill, S. Preliminary study using trace element
concentrations and a chemometrics approach to determine the geographical origin of tea
Journal of Analytical Atomic Spectrometry; 13; 521-525; 1998.
Ogrinc, N.; Koir, I.; Kocjani, M.; Kidri, J. Determination of Authenticy, Regional
Origin, and Vintage of Slovenian Wines using a combination of IRMS and SNIF-NMR
Analysis Journal of Agricultural and Food Chemistry; 49; 1432-1440; 2001.
Ogrinc, N.; Koir, I.; Spangenberg, J.; Kidri, J. The application of NMR and MS
methods for detection of adulteration of wine, fruit juices, and olive oil. A review
Analytical and Bioanalytical Chemistry; 376; 424-430; 2003.
Rossmann, A. Determination of Stable Isotope Ratios in Food Analysis Food
Reviews International; 17(3); 347-381; 2001.
Taylor, V.; Longerich, H.; Greenough, J. Multielement Analysis of Canadian Wines by
Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) and Multivariate Statistics
Journal of Agricultural and Food Chemistry; 51; 856-860; 2003.

93

94

5 DETERMINAO DO LOCAL E DATA DE FABRICO DE CERVEJAS


PRODUZIDAS NO MESMO PAS

5.1

Introduo....................................................................................................................... 96

5.2

Materiais e Mtodos ....................................................................................................... 96

5.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR............................................................. 98

5.4

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN ............................................................ 100

5.5

Concluses .................................................................................................................... 115

Referncias..................................................................................................................................... 116

95

5.1 Introduo
Em Portugal, o consumo de cerveja elevado e, como sabemos, uma mesma marca de
cerveja pode ser produzida em vrios centros produtivos localizados em diferentes regies
do pas. Quando um consumidor bebe uma cerveja no norte ou no sul, espera que ela
apresente as mesmas caractersticas sensoriais, independentemente da regio onde foi
produzida.
Com este estudo pretendeu-se avaliar se a composio qumica de um mesmo tipo e marca
de cerveja, variam em funo do local e data de fabrico. Neste caso, as amostras foram
produzidas no mesmo pas, ao contrrio das amostras estudadas no captulo anterior, cujos
resultados foram publicados recentemente (Almeida et al., 2006), que foram produzidas
em diferentes pases. Assim, pretendeu-se avaliar o problema numa dimenso diferente e,
investigar se a proximidade dos centros produtivos permite o controlo mais efectivo das
diferentes variveis do processo, nomeadamente, tipo de levedura, qualidade do malte,
temperatura, qualidade da gua, tipo de equipamentos e modo operativo. Para isso,
seleccionaram-se amostras de 3 centros produtivos, cuja qualidade do malte igual. O
lpulo tambm seleccionado de igual modo para os 3 locais e para minimizar ainda mais
as diferenas, a gua tratada, quer por osmose inversa, quer por troca inica, para igualar
ou aproximar os nveis de sais nos diferentes processos de fabrico. As condies operativas
so iguais, mas, no entanto, podem existir diferenas a nvel da sala de fabrico, pois os
equipamentos podem ser ligeiramente diferentes.

5.2 Materiais e Mtodos


Amostras: Foram seleccionadas 27 cervejas do mesmo tipo e marca, produzidas em 3
locais/cidades (A, B e C) e em 3 datas diferentes (1, 2 e 3), espaadas de 1-2 meses. De
cada data de fabrico adquiriram-se 3 garrafas (a, b e c), como se pode ver na Tabela 5.1. As
amostras foram armazenadas a 4 C at sua anlise. Imediatamente antes da anlise por
RMN, as garrafas de cerveja foram abertas e desgaseificadas num banho ultra-snico,
durante 10 minutos e preparadas de modo a conterem 10% de D2O e 0,02% de TSP, como

96

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

referncia de desvio qumico e de intensidade. As mesmas amostras desgaseificadas foram


armazenadas a 4C, durante 3-4 dias, at serem analisadas por FT-IR.

Tabela 5.1 Identificao das amostras de cerveja analisadas.

Codificao

Cidade

Data de Produo

Garrafa

pH

A1a
A1b
A1c
A2a
A2b
A2c
A3a
A3b
A3c

A
A
A
A
A
A
A
A
A

Nov-03
Nov-03
Nov-03
Jan-04
Jan-04
Jan-04
Mar-04
Mar-04
Mar-04

a
b
c
a
b
c
a
b
c

4,48
4,45
4,45
4,56
4,56
4,53
4,38
4,39
4,39

B1a
B1b
B1c
B2a
B2b
B2c
B3a
B3b
B3c

B
B
B
B
B
B
B
B
B

Dez-03
Dez-03
Dez-03
Jan-04
Jan-04
Jan-04
Mar-04
Mar-04
Mar-04

a
b
c
a
b
c
a
b
c

4,35
4,36
4,37
4,41
4,47
4,39
4,65
4,63
4,63

C1a
C1b
C1c
C2a
C2b
C2c
C3a
C3b
C3c

C
C
C
C
C
C
C
C
C

Dez-03
Dez-03
Dez-03
Fev-04
Fev-04
Fev-04
Abr-04
Abr-04
Abr-04

a
b
c
a
b
c
a
b
c

4,54
4,58
4,58
4,67
4,63
4,70
4,47
4,44
4,42

Mtodos: Os espectros de FT-IR e os espectros de RMN de 1H foram obtidos nos mesmos


equipamentos e segundo as mesmas condies referidas no captulo anterior. A Anlise em
Componentes Principais foi feita de igual modo e usando um programa co-desenvolvido
pela Universidade de Aveiro e o Institut National Agronomique Paris-Grignon (Barros,
1999).

97

5.3 Anlise dos Dados de Espectroscopia de FT-IR


Na Figura 5.1 esto representados espectros tpicos de FT-IR, adquiridos com 128
varrimentos, de 3 amostras de cerveja, uma de cada local de fabrico, escolhidas
aleatoriamente. Como se pode verificar, para alm das fortes bandas de absoro da gua
(extenso - 3320 cm-1 e toro - 1640 cm-1), os espectros de FT-IR das cervejas apresentam
alguns picos na zona de 1500-900 cm-1 (zona da impresso digital), originados
essencialmente por hidratos de carbono (1155-1151 cm-1e 1024-998 cm-1) e etanol (1087
cm-1, 1045 cm-1 e 880 cm-1), como se pode consultar na Tabela 2.9. Numa primeira
observao dos espectros no so visveis diferenas entre as amostras.

Abs. (U.A.)

gua
A1

Zona de
impresso
digital

3600

3100

2600

2100

1600

1100

B2
C1

600

-1

Nmero de Onda (cm )

Figura 5.1 Espectros tpicos de FT-IR (4000-600 cm-1) de amostras de cerveja estudadas.

Na Figura 5.2, apresentam-se ampliaes da regio da impresso digital, dos mesmos


espectros, identificando-se agora as bandas caractersticas do etanol (1087 cm-1, 1045 cm-1)
e das dextrinas (1151 cm-1, 1078 cm-1 e 1024 cm-1). Mais uma vez, no possvel
percepcionar diferenas significativas entre os espectros, pela simples observao dos
mesmos. Ento, com o objectivo de detectar potenciais diferenas entre os espectros, no
detectveis por simples observao dos mesmos, realizou-se uma PCA da regio 1200-800
cm-1 dos espectros das 27 amostras.

98

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

Dextrinas

Etanol
Abs. (U.A.)

Dextrinas

A1
B2
C1

1180

1130

1080

1030

980

Nmero de onda (cm -1)

Figura 5.2 Regio da impresso digital dos mesmos espectros de FT-IR apresentados na Figura
5.1.

Na Figura 5.3, esto representadas as coordenadas factoriais dos dois primeiros


componentes principais, PC1 e PC2. As amostras foram identificadas conforme a Tabela
5.1. Ao analisar o mapa das coordenadas factoriais no bvio qualquer agrupamento

especfico de amostras, o que pode sugerir duas hipteses: ou realmente no existem


diferenas significativas entre as amostras de cerveja analisadas, ou ento o FT-IR no a
tcnica adequada para detectar essas diferenas, se existirem, pelo menos nesta regio e

PC2 (13%)

com as condies usadas.

PC1 (33%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.3 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da regio da impresso digital dos espectros das
27 amostras de cerveja estudadas.

99

5.4 Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN


Na Figura 5.4 esto representados os espectros de RMN de 1H de cervejas, escolhidas
aleatoriamente para cada um dos 3 locais de fabrico.
4

le1
A1

18
15
12

15

TSP
8

lo1
B1

1,2,3

17
17

13

13
9

16

sa3
C3

14
14
H2O
10,11

ppm

Figura 5.4 Espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada local de fabrico (1-propanol, 2isobutanol, 3-isopentanol, 4-etanol, 5-lctico, 6-prolina, 7-actico, 8-pirvico, 9-succnico, 10ctrico, 11-mlico, 12-dextrinas, 13-uridina, 14-adenosina/inosina, 15-citidina, 16-tirosina, 17histidina, 18-fenilalanina).

100

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

Como se pode observar, os sinais mais intensos so devidos ao etanol, enquanto que os
mais fracos so os da regio aromtica (5,8-10 ppm). Na regio dos acares (3-5,8 ppm)
observamos forte sobreposio de sinais devido similaridade entre os ambientes qumicos
caracterizando os vrios protes. Podemos, ainda, encontrar diversos sinais, tais como,
lcoois (isopentanol, isobutanol e propanol), aminocidos (prolina, histidina, fenilalanina e
alanina), cidos orgnicos (actico, pirvico, succnico, ctrico e mlico) e nuclesidos
(uridina, citidina, adenosina e inosina).
Por simples inspeco visual dos espectros no possvel detectar diferenas, que possam
ser relacionadas com o local de fabrico ou a data de produo, devido no s ao elevado
nmero de picos e suas sobreposies, bem como grande complexidade de cada sinal.
Assim, com o objectivo de procurar as principais fontes de variabilidade dos espectros de
RMN de 1H das amostras de cerveja analisadas, realizou-se uma PCA comeando pela
anlise apenas da regio aliftica (0,5-3,1 ppm) dos espectros e excluindo o sinal do etanol
(1,17 ppm).
O estudo por PCA foi feito sistematicamente por regies espectrais, de forma a tentar
detectar as variaes nos compostos minoritrios, especificamente de natureza aliftica e
aromtica. Na regio aliftica observam-se contribuies de sinais de lcoois, aminocidos

PC2 (19%)

e cidos orgnicos alifticos. A Figura 5.5 mostra o resultado obtido, na regio em estudo.

PC1 (32%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.5 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aliftica dos espectros de RMN
de 1H (LB 0,3 Hz) das 27 amostras estudadas.

101

A distribuio das amostras no parece, no entanto, estar relacionada com o local de


fabrico nem to pouco com a data de produo. de notar que, aparentemente se observam
diferenas entre as garrafas do mesmo lote de fabrico, por exemplo, os grupos de amostras
A2, B2, C1 e C2. Para investigar melhor esta observao, a anlise do correspondente
grfico das contribuies factoriais (Figura 5.6), pode ajudar a explicar a origem das
aparentes variaes entre amostras, visveis no grfico de coordenadas factoriais (Figura
5.5).

0,2

Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. actico

Contribuies Factoriais

0,15
0,1
0,05
0
-0,05

2,9

2,6

2,3

1,7

1,4

1,1

0,8

0,5

-0,1
-0,15

c. actico
Desvio Qumico (ppm)
PC1

PC2

Figura 5.6 Contribuies factoriais de PC1 e PC2 (LB 0,3 Hz).

No entanto, a anlise do grfico da Figura 5.6 mostra que as principais diferenas se devem
a alteraes de desvio qumico causadas por diferenas de pH (pH = 0,35) entre as
amostras, alteraes essas que originam efeitos do tipo de primeira derivada no grfico das
contribuies factoriais. Na figura indica-se um exemplo deste efeito para o sinal do cido
actico a 2,0 ppm. Para tentar minimizar estes efeitos, que no reflectem alteraes de
composio, os espectros de RMN foram processados com factores de LB superiores (2, 5
e 10 Hz), o que faz diminuir a resoluo espectral, diminuindo, em princpio, a influncia
dos artefactos. Na Figura 5.7 podemos ver o resultado da PCA aplicada tambm regio
aliftica desses espectros.

102

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

a) LB 2 Hz

b) LB 5 Hz

PC2 (16%)

PC2 (19%)

1
2

PC1 (43%)
A1

A2

A3

B1

B2

PC1 (57%)

B3

C1

C2

C3

A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

PC2 (24%)

c) LB 10 Hz

PC1 (57%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.7 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aliftica dos espectros de RMN
de 1H a) LB 2 Hz, b) LB 5 Hz e c) LB 10 Hz.

Como se pode observar a melhor separao das amostras, em funo do local de fabrico,
ocorre quando se usam os espectros processados com LB 5 Hz (Figura 5.7-b). Por exemplo,
de notar a aproximao das amostras B1 e B3, pertencentes ao grupo B, assim como as
amostras A2 e C2. Assim, podem considerar-se 3 grupos, onde j no se verifica a
separao por lote de fabrico, ou seja, no h separao entre garrafas produzidas na
mesma data, como na PCA dos espectros processados com LB 0,3 Hz. Isto parece sugerir
que as diferenas entre amostras de garrafas produzidas na mesma data correspondem a
pequenas diferenas de pH. A separao evidenciada pelos grupos 1, 2 e 3 indicados acima
revela-se de maior importncia como explicado a seguir.

103

O grupo 1, constitudo pelas amostras A1, A3, C1 e C2, est situado no PC1 negativo e
analisando o grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 5.8), verifica-se que estas
amostras apresentam um contedo mais elevado de cido pirvico, que as restantes. Como
se sabe, na fermentao alcolica das leveduras, o cido pirvico , numa primeira etapa,
descarboxilado em dixido de carbono e acetaldedo, sob aco da enzima piruvato
descarboxilase, que tem por coenzima o pirofosfato de tiamina (ou vitamina B1), que
contm zinco (Zn2+) (Campos, 1998; Ricardo e Teixeira, 1993). Se o cido pirvico est
em excesso, porque houve alguma deficincia na sua descarboxilao. Isso pode ter
acontecido, caso a filtrao do mosto tenha provocado uma reteno elevada de
micronutrientes, neste caso, do zinco, e realmente, tanto no centro produtivo A, como em
C, o equipamento de filtrao semelhante e provoca reteno de mais micronutrientes
que no centro produtivo B. de salientar ainda que as cervejas deste grupo obtiveram
todas uma classificao no satisfatria no controlo da estabilidade organolptica
(informao fornecida pelo laboratrio da indstria fornecedora das amostras), o que
mostra que a PCA detectou diferenas nestas cervejas, tambm detectveis pelo painel de
provadores que as avaliaram. As diferenas podem estar relacionada com o descrito
anteriormente ou com outras propriedades no identificveis.

0,08

0,04

Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. succnico

0,02

Prolina

Contribuies Factoriais de PC1

0,06

Efeito do tipo de
1 derivada sinal
do c. actico
Alanina

0
-0,02

2,5

1,5

0,5

-0,04
-0,06

c. pirvico

-0,08
-0,1
Desvio qumico (ppm)

Figura 5.8 Contribuies factoriais de PC1 (Regio aliftica LB 5 Hz).

104

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

O grupo 2, constitudo pelas amostras B1 e B3, est situado no PC2 negativo e


caracterizado por um teor mais elevado de cido actico e cido succnico (Figura 5.9).
Neste caso, a extenso do ciclo de Krebs foi maior, uma vez que temos maior teor destes
compostos (Campos, 1998). Este resultado est de acordo com o esperado, uma vez, que
no centro produtivo B, o equipamento de filtrao, permite que o mosto seja mais
concentrado em lpidos, nomeadamente, cidos gordos insaturados, que podem ser
incorporados directamente pela levedura, levando a um arranque mais rpido da
fermentao (Hughes e Baxter, 2001).

0,08

Contribuies Factoriais de PC2

0,06
0,04
0,02
0,00
-0,02

2,5

1,5

0,5

-0,04
-0,06

c. succnico

-0,08
-0,10
-0,12

c. actico
Desvio qumico (ppm)

Figura 5.9 Contribuies factoriais de PC2 (Regio Aliftica LB 5 Hz).

Por sua vez, o grupo 3, localizado na parte positiva do eixo de PC1, constitudo pelas
amostras A2, B2 e C3, que so caracterizadas por terem um teor mais elevado de alanina e
prolina. Tanto no centro produtivo A como em C, a velocidade de fermentao e de
agitao bastante rpida, o que dificulta o controlo do processo. Deste modo, de esperar
que o teor de aminocidos possa variar em funo da fermentao local. A amostra B2
parece ser uma amostra atpica, uma vez que no encaixa nas explicaes dos diferentes
grupos.
De forma a confirmar os resultados obtidos pela PCA, comparou-se a regio aliftica dos
espectros de 3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e 3). Verificou-se, que a amostra A1
105

apresenta teores mais elevados de cido pirvico, a amostra B1 contm maiores


quantidades de cidos succnico e actico enquanto que a amostra C3 apresenta picos mais
intensos de alanina e prolina, confirmando assim os resultados da PCA.

c. pirvico
(+)

A1
(Grupo 1)

c. actico
(+)

c. succnico
(+)

B1
(Grupo 2)

C3

(Grupo 3)

3.0

2.8

alanina
(+)

prolina
(+)

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

ppm

Figura 5.10 Regio aliftica dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e
3).

Em suma, embora no se consiga uma separao de amostras correlacionvel com o local


de fabrico, pode ver-se, claramente, a variabilidade existente entre algumas datas de
produo. Assim, as amostras produzidas na cidade A, em Janeiro de 2004 (A2) so
diferentes das produzidas nas outras duas datas (A1 e A3 veja-se a Tabela 5.1 para
identificao dessas datas), uma vez que se encontram em grupos distintos. Tambm
acontece o mesmo com as cervejas produzidas em Janeiro de 2004, mas no centro

106

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

produtivo B (B2), que esto separadas das restantes produzidas nesse centro, agrupadas no
grupo 2. Com as amostras do centro C, tambm se verifica que uma data se diferencia das
restantes duas. Essas amostras foram produzidas em Abril de 2004 (C3) e esto contidas no
grupo 3. A razo para estas diferenas de composio entre as amostras fabricadas em
datas distintas poder ter a ver com as condies de fermentao, nomeadamente, estado
da levedura, temperatura ambiente, controlo de parmetros especficos do processamento,
equipamento usado na sala de fabrico, entre muitos outros, o que se reflecte na estabilidade
organolptica das cervejas. Deste modo, no existem diferenas correlacionveis com o
local de fabrico, mas sim diferenas casuais, relacionveis com as condies de
processamento.
De seguida, a PCA foi aplicada regio dos acares (3,1-5,8 ppm), onde tal como o nome
indica, se encontram sinais de acares (dextrinas, essencialmente) e tambm de alguns
lcoois.
Na Figura 5.11 esto representadas as coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da PCA
aplicada a esta regio dos espectros de RMN de 1H, processados com LB 0,3 Hz (espectros
originais). Nesta figura, podemos observar 3 grupos, onde se nota uma grande disperso
das amostras, ou seja, todos os grupos contm contribuies de todos os locais de fabrico.
Uma vez mais, o efeito do tipo de primeira derivada, observado nas contribuies
factoriais (no mostradas), pareceu condicionar os resultados observados. Por este motivo,
processaram-se os espectros com diferentes valores de LB, tendo-se seleccionado os
resultados obtidos com o LB 5 Hz para discusso.

107

PC2 (10%)

PC1 (73%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.11 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 0,3 Hz).

Na Figura 5.12 esto representadas as coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) da PCA
aplicada regio dos acares dos espectros de RMN de 1H, processados com LB 5 Hz.

PC2 (28%)

PC1 (57%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.12 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).

108

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

Como se pode observar, por comparao da Figura 5.11 com a Figura 5.12, a distribuio
das amostras semelhante. Isto confirma que, tendo em conta a composio em acares,
no possvel, agrupar as amostras em termos de local de fabrico, mas que parece haver
grande variabilidade, em todos os locais, em termos de data de fabrico. Veja-se, por
exemplo, as amostras do centro de produo A: as produzidas em Novembro de 2003 (A1)
esto contidas no grupo B, as Janeiro de 2004 (A2), esto dispersas pelos grupos A e C e as
de Maro de 2004 (A3) esto no grupo C. Isto significa que a variabilidade na composio
em acares, originada por datas diferentes de produo, mais importante que variaes
entre locais de fabrico, mostrando que no existem diferenas efectivas entre os centros de
produo e que as diferenas so pontuais, talvez causadas por variaes nas condies de
processamento.
Analisando o grfico das contribuies factoriais (Figura 5.13), para tentar perceber o
porqu da separao, verificamos que o grupo 1, com PC1 negativo, caracterizado por
serem amostras com maior teor de acares simples e pequenos, como o caso da glucose
e da maltose (sinais caractersticos a 4,63 (H1 red), 5,21 (H1 red) e 5,37 (H1, 14)
ppm). Em contrapartida, os grupos 2 e 3, com PC1 positivo, tm maior teor de acares
ramificados, como o caso das dextrinas (sinais caractersticos a 4,96 (H1, 16) e a 5,35,4 (H1, 14) ppm). O que separa o grupo 2 do 3 o PC2: para um PC2 positivo (grupo
2) temos um maior teor de glucose (sinais caractersticos a 5,37 (H1, 14) e 5,21 (H1
red) ppm).

109

a)

Contribuies Factoriais de PC1

0,08
0,06

H1 (1-4)

0,04

H1 (1-6)
0,02
0,00
5,5

4,5

-0,02

-0,06

3,5

3,5

H1 (red)

H1 (red)

-0,04

H1 (1-4)
Desvio Qumico (ppm)

b)
0,06

Contribuies Factoriais de PC2

H1 (1-4)
0,04

H1 (red)

0,02
0,00
5,5

4,5

-0,02
-0,04
-0,06
Desvio Qumico (ppm)

Figura 5.13 Contribuies factoriais de a) PC1 e b) PC2 (regio dos acares LB 5 Hz).

Na Figura 5.14 esto apresentadas as regies dos acares dos espectros de RMN de 1H de
3 cervejas, uma de cada grupo (1, 2 e 3). Como se pode ver, pela simples observao dos
espectros no so detectveis diferenas, que possam estar relacionadas com a separao
das amostras.

110

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

gua
(supresso do
sinal)

A1
(Grupo 2)

H1 (red)

H1 (red)

B1
(Grupo 3)

H1 (16)

H1 (14)

C3
(Grupo 1)

5.7

5.6

H1 (11)

5.5

5.4

5.3

5.2

5.1

5.0

4.9

4.8

4.7

4.6

4.5

4.4

4.3

4.2

ppm

Figura 5.14 Regio dos acares dos espectros de RMN de 1H de 3 cervejas, uma de cada grupo
(1, 2 e 3).

Verifica-se tambm que na disposio das amostras no grfico das coordenadas factoriais
de PC1 vs. PC3 (Figura 5.15), se pode agora, observar claramente, a separao das amostras
por local de produo (azul-A, vermelho-B e verde-C) no eixo PC3. No entanto, a
variabilidade explicada por este PC apenas de 9%, confirmando que as diferenas entre
os locais de fabrico so muito tnues. A explicao destas diferenas, com base na
contribuio factorial PC3 (Figura 5.16) no muito clara, mas o suficiente para se poder
dizer que as amostras do centro produtivo C (PC3 negativo) tm maior teor de acares
ramificados que as do B e isso poder ser devido a, mais uma vez, diferenas das
condies de fermentao, estado da levedura, diferenas a nvel de equipamento da sala
de fabrico, etc. Uma explicao para tal, pode ser o facto de em B, o arranque da
fermentao ser mais rpido, e por isso, a levedura mais eficiente. Em contrapartida, o
processo mais lento na sala de fabrico, possibilitando um tempo de hidrlise mais

111

elevado, ou seja, a -amilase pode hidrolisar um maior nmero de acares e por isso que

PC3 (9%)

as amostras do centro B tm acares menos ramificados (Hughes e Baxter, 2001).

PC1 (57%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.15 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC3) usando a regio dos acares dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).

0,04

H1(red)

Contribuies Factoriais de PC3

0,03

H1(red)

0,02
0,01
0
-0,01

5,5

4,5

3,5

-0,02
-0,03
-0,04

H1(14)

-0,05
Desvio Qumico (ppm)

Figura 5.16 Contribuio factorial de PC3 (regio dos acares LB 5 Hz).

112

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

de notar tambm uma grande disperso das amostras ao longo do eixo de PC1, que volta
a mostrar a variabilidade em termos de data de fabrico. Tambm se observa variabilidade
entre garrafas do mesmo lote, que pode ser devida a fermentaes que ocorram no interior
das garrafas, causadas pela presena de quantidades vestigiais de leveduras selvagens, que
tenham contaminado as amostras aquando da sua preparao e anlise por RMN. Estas vo
consumindo os acares e por isso que, principalmente, nesta regio se observa a
variabilidade entre garrafas.

Procedeu-se de seguida anlise da regio aromtica (5,8-10,3 ppm), que mostra


ressonncias provenientes de compostos aromticos, nomeadamente, aminocidos e
nuclesidos. A aplicao da PCA a esta regio mostra a separao das amostras em 2
grupos principais: grupo 1 (amostras B2 e B3) e grupo 2, contendo as restantes amostras,
como se pode ver na Figura 5.17, isto , no h alteraes significativas da composio
aromtica em termos de local de produo, notando-se apenas para uma ligeira diferena
para as amostras do centro B, produzidas em Janeiro e Maro de 2004 (B2 e B3).

PC2 (29%)

PC1 (33%)
A1

A2

A3

B1

B2

B3

C1

C2

C3

Figura 5.17 Coordenadas factoriais (PC1 vs. PC2) usando a regio aromtica dos espectros de
RMN de 1H (LB 5 Hz).

113

Da anlise do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 5.18), podemos concluir
que as cervejas do grupo 1, com PC1 negativo, so caracterizadas por terem teores mais
elevados de tirosina/tirosol e fenilalanina e teores menores de uridina, citidina e histidina,
relativamente s restantes cervejas. Esta diferena poder estar relacionada, com o facto de
no centro produtivo B, a levedura ser mais eficiente, ou ento a agitao ter sido maior, o
que levou utilizao da terceira famlia de aminocidos, tirosina, triptofano e
fenilalanina, para produzir tirosol, triptofol e feniletanol, respectivamente.

PC1
0,08

Contribuies Factoriais

0,06
0,04

citidina

0,02
0
10,3
-0,02
-0,04

9,8

9,3

8,8

8,3

uridina

histidina

uridina

citidina

7,8

7,3

Fenilalanina

6,8

6,3

5,8

Tirosina/
Tirosol

-0,06
-0,08
Desvio Qumico (ppm)

Figura 5.18 Contribuio factorial de PC1 (regio aromtica LB 5 Hz).

Na Figura 5.19 esto representadas as regies aromticas dos espectros de RMN de 1H de


duas cervejas produzidas no mesmo local, em datas diferentes (B1 e B3) e que se
encontram em grupos distintos no mapa das coordenadas factoriais PC1 vs. PC2. Devido
elevada complexidade dos espectros nesta regio, no fcil percepcionar diferenas que
possam explicar a separao. No entanto, pode-se notar uma intensidade maior nos picos
da fenilalanina, no espectro da amostra B3, enquanto que o pico da histidina (7,04 ppm)
mais intenso no espectro da amostra B1, confirmando assim alguns resultados da PCA.

114

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

tirosina/
tirosol
fenilalanina

B3
(Grupo 1)

histidina
citidina

B1
(Grupo 2)

uridina

uridina
citidina

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

Figura 5.19 Regio aromtica dos espectros de RMN de 1H de 2 cervejas: B3 (grupo 1) e B1


(grupo 2).

5.5 Concluses
Como se viu, a Anlise em Componentes Principais (PCA) dos espectros de FT-IR das
amostras de cerveja produzidas no mesmo pas no mostrou separao, nem em termos de
local de fabrico, nem em termos de data de produo. Este facto pode sugerir duas
hipteses: ou realmente no existem diferenas entre as amostras de cerveja analisadas, ou
ento o FT-IR no a tcnica adequada para detectar essas diferenas. Mas, face aos
resultados obtidos por RMN sugere-se que, realmente, existem diferenas entre as
amostras, principalmente em termos de data de fabrico, consequncia de pequenas
variaes nas condies de processamento.
A Anlise em Componentes Principais da regio aliftica (isto em termos de composio
em compostos alifticos) dos espectros de RMN de 1H sugere a separao das amostras em
3 grupos, que, no entanto, no correspondem aos 3 locais de fabrico. Verifica-se sim, uma
variabilidade importante, para cada local de produo, entre algumas datas de produo, o
que poder significar que as diferenas entre as amostras se devem a diferentes condies
de fermentao, e processamento, nomeadamente, ao nvel dos equipamentos da sala de
fabrico.

115

A anlise da regio dos acares tambm mostrou a separao das amostras em 3 grupos,
mostrando estes, grande variabilidade em termos de local e data de fabrico. Essa separao
deve-se diferente composio e teor de acares. A anlise do componente principal PC3
permitiu a separao das amostras por local de fabrico, mostrando que as amostras do
centro produtivo C tm maior teor de acares mais ramificados que as do B, e isso poder
ser devido a, mais uma vez, diferenas nas condies de fermentao, estado da levedura e,
principalmente, diferenas no equipamento da sala de fabrico dos diferentes centros.
Nesta regio tambm se observa variabilidade entre garrafas do mesmo lote, que pode ser
devida a alteraes dentro da prpria garrafa, causadas por vestgios de leveduras
selvagens, que, porventura, tenham contaminado as amostras aquando da preparao e
anlise das mesmas.
A PCA na regio aromtica separa as amostras em 2 grupos, com base nos teores de alguns
aminocidos e nuclesidos. No entanto, no existem indcios que a separao tenha a ver
com o local de fabrico. Quanto data de produo, verifica-se que as amostras produzidas
em B, em Janeiro e Maro (B2 e B3), se distanciam das restantes, no mapa das
coordenadas factoriais, apresentando teores mais elevados de fenilalanina, tirosina e
tirosol.
Em suma, os resultados mostraram que dentro do mesmo pas, as diferenas mais
significativas entre as amostras, no tm a ver com o local de produo, mas sim com a
data de fabrico. Verificaram-se alteraes que podem estar relacionadas com as condies
de processamento, nomeadamente temperatura, estado da levedura e condies de
armazenamento.

Referncias
Almeida, C.; Duarte, I.; Barros, A.; Rodrigues, J., Spraul, M.; Gil, A. Composition of
Beer by 1H NMR Spectroscopy: Effects of Brewing Site and Date of Production Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 54; 700-706; 2006.

116

Determinao do local e data de fabrico de cervejas produzidas no mesmo pas

Barros, A.S. Contribution la selection et la comparaison de variables caractristiques


Ph.D. Thesis; Institut National Agronomique Paris-Grignon; France; 1999.
Campos, L.S. Entender a Bioqumica o metabolismo fundamental em animais e
plantas; Escolar Editora; Lisboa; 1998.
Hughes, P.S.; Baxter, E.D. Beer Quality, Safety and Nutritional Aspects The Royal
Society of Chemistry; Cambridge; 2001.
Ricardo, C.; Teixeira, A. Molculas Biolgicas estrutura e propriedades Didctica
Editora, Lisboa, 1993.

117

118

6 APLICAO DA ESPECTROSCOPIA DE RMN AO ESTUDO DO


PROCESSO DE FABRICO DA CERVEJA

6.1

Introduo..................................................................................................................... 120

6.2

Materiais e Mtodos ..................................................................................................... 121

6.3

Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN ............................................................ 122

6.4

Concluses .................................................................................................................... 134

Referncias..................................................................................................................................... 135

119

6.1 Introduo
Tal como foi referido na introduo, a produo de cerveja foi uma das primeiras
aplicaes da biotecnologia. A transformao da cevada em malte, a extraco das
matrias-primas na brassagem e a bio-converso das substncias nutritivas do mosto pela
levedura (lcool e outros metabolitos) so a resultante de reaces bioqumicas. A
actividade das enzimas catalizadoras daquelas reaces e a sua formao dependem das
caractersticas genticas da cevada, da estirpe da levedura e da sua expresso fenotpica,
tendo em conta as variaes do meio e a tecnologia utilizada.
Contrariamente ao vinho, o mosto da cerveja fabricado e a sua composio pode ser
regulada, dentro de certos limites.
O objectivo da fermentao , em primeiro lugar, produzir uma cerveja com o perfil de
aroma e gosto que corresponda aos desejos do consumidor. Este aspecto do problema
difcil de atingir e manter, necessitando de longos estudos das regulaes bioqumicas
implicadas. Actualmente, podemos dizer que a maior parte daquelas regulaes esto
compreendidas, os compostos resultantes da fermentao e participantes no aroma e gosto
da cerveja podem ser apreciados sensorialmente, apesar do limite de percepo ser por
vezes muito baixo, mantendo-se, no entanto, difcil e morosa a sua quantificao analtica.
Apesar dos mecanismos bioqumicos estarem hoje elucidados, a indstria cervejeira
continua, assim, a utilizar os mesmos organismos que a indstria do passado e a praticar a
fermentao descontnua, no agitada e a baixa temperatura, excepo da capacidade e
geometria dos fermentadores que evoluiu.
Vrias metodologias analticas tm sido aplicadas ao estudo da fermentao,
nomeadamente, cromatografia lquida, espectroscopia de infravermelho, espectrometria de
massa, cromatografia gasosa e mais, recentemente por Membrane Inlet Mass
Spectrometry (MIMS), que um mtodo especfico e sensvel para a anlise de
compostos orgnicos volteis em amostras lquidas e gasosas (Tarkiainen et al., 2005).
Mas estas tcnicas so limitadas a certos grupos de compostos e necessitam de um prtratamento da amostra, o que por vezes moroso. Deste modo, torna-se imperioso, estudar
mtodos alternativos que possam dar respostas mais rpidas.

120

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

A espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear j mostrou potencial na


caracterizao qumica de cerveja (Lachenmeier et al., 2005; Duarte et al., 2002; Duarte et
al., 2003; Duarte et al., 2004 e Gil et al., 2003). Como tal, o objectivo principal deste
captulo estudar a potencialidade desta tcnica na indstria cervejeira, nomeadamente, no
controlo de qualidade das vrias fases da produo.
So apresentados os resultados preliminares da aplicao do RMN, associado
quimiometria, ao estudo do processo de fabrico de cerveja. Em trabalhos futuros ser
necessrio expandir esta anlise a vrios mtodos de fabrico e a vrios tipos de cerveja.

6.2 Materiais e Mtodos


Amostras: Diferentes tipos de amostras foram recolhidos ao longo do processo de fabrico
de uma cerveja lager, de acordo com a Tabela 6.1.

Tabela 6.1 Informao sobre as amostras analisadas.

Amostra

Etapa

pH

Empastagem do Malte

5,72

Empastagem com Gritz

5,83

Caldeira de sacarificao

5,51

Incio de ebulio

5,34

Fim de ebulio

5,12

Incio de fermentao

4,63

Fim de fermentao

4,69

Cerveja Filtrada

4,54

As amostras com mais resduos slidos foram centrifugadas a 20000 rpm, durante 15 min.
a 10C e depois filtradas antes da anlise por espectroscopia de RMN (e.g. amostras 1, 2 e
3). As amostras 4, 5 e 6 foram apenas filtradas, enquanto que as amostras 7 e 8 foram
desgaseificadas, num banho ultra-snico, durante 10 min.

121

Mtodos: Os espectros de RMN de 1H foram adquiridos num espectrmetro Bruker


Avance DRX-500, operando a 500,13 MHz para o proto e usando o programa de pulsos
zgpr, com saturao do sinal da gua (4,77 ppm). Para as amostras 7 e 8 tambm se
adquiriram espectros de RMN de 1H, usando o programa de pulsos noesypr1dsp, com
saturao dos sinais da gua (4,77 ppm) e do etanol (1,17 e 3,64 ppm), uma vez que estas
amostras continham elevadas quantidades de etanol. Foram usados 128 varrimentos e 32K
pontos, com uma largura espectral de 8012 Hz. Em todas as amostras foi adicionada uma
soluo de 10% de D2O e 0,02% de TSP como referncia de desvio qumico e de
intensidade.
Para a Anlise em Componentes Principais (PCA) foram construdas matrizes dos
espectros das amostras, referentes s 3 regies do espectro aliftica (3,1 0,5 ppm);
acares (5,8 3,1 ppm) e aromtica (10 5,8 ppm). Estas matrizes foram comprimidas
(esta compresso de variveis consiste na integrao e consequente reduo do nmero de
pontos do espectro - Holmes et al., 1998a,b), para eliminar os pequenos desvios e
consequentes efeitos do tipo de primeira derivada, normalizadas e tratadas usando um
software estatstico co-desenvolvido pela Universidade de Aveiro e o Institut National
Agronomique Paris-Grignon (Barros, 1999). O objectivo desta abordagem o mesmo da
aplicao de valores superiores de LB aos espectros. No entanto muito mais rpida, pois
no preciso processar os espectros com diferentes valores de LB. Tambm evita erros de
processamento atribudos calibrao, linha de base e fase, relacionados com o operador.

6.3 Anlise dos Dados de Espectroscopia de RMN


de notar que algumas das amostras estudadas so extremamente instveis, uma vez que
os processos bioqumicos continuam a ocorrer depois da amostragem. o caso das
amostras 1, 2, 3, 4 e 6. No entanto, e dado que este estudo ainda preliminar, analisaramse todas as amostras para ter uma ideia do tipo de compostos que caracteriza o espectro de
cada fase do processo de fabrico. Numa abordagem futura, ser necessrio fazer uma
recolha ao longo do tempo, em cada uma das etapas para se poder caracterizar
adequadamente a evoluo da composio qumica em cada fase.

122

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

Na Figura 6.1 est representada a Regio Aliftica (0,5 3,1 ppm) dos espectros de RMN
de 1H das vrias amostras recolhidas ao longo do processo de fabrico da cerveja.

GABA

alanina

leucina

isoleucina

prolina

Etanol

actico
6

succnico

pirvico

lcoois

8
ctrico/
malico

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

ppm

Figura 6.1 Regio aliftica dos espectros de RMN de 1H de amostras do processo de fabrico da
cerveja.

123

Nas primeiras etapas do processamento de notar uma maior quantidade de aminocidos,


provenientes da hidrlise enzimtica das protenas do malte, que vo ser, posteriormente,
metabolizados pela levedura. A partir da etapa 5 (fim da ebulio) j se comea a notar o
sinal do etanol e no incio da fermentao (6) j se destaca o sinal do cido actico. A
amostra 7 apresenta um maior teor de cidos orgnicos (actico, pirvico e succnico),
resultantes do metabolismo dos acares (Ciclo de Krebs). de notar ainda o elevado teor
em etanol (sinal a 1,17 ppm), proveniente da fermentao. Os espectros das amostras 7 e 8
so muito semelhantes uma vez que s se procedeu filtrao da amostra.
Se tivesse sido possvel considerar a anlise de espectros 2D (TOCSY, HSQC e JResolved) haveria certamente mais informao a relatar, pois como se poder ver na figura,
existem vrios compostos minoritrios (no identificveis) que variam ao longo do
processo de fabrico.
Para complementar e confirmar os resultados anteriores aplicou-se a PCA matriz
construda a partir da regio aliftica dos espectros de RMN de 1H das vrias amostras
recolhidas ao longo do processo de fabrico da cerveja, retirando a regio do etanol. Esta
matriz foi comprimida, por integrao de 61 pontos sucessivos, de modo a ficar com 255
pontos (desvios qumicos). Na Figura 6.2 pode-se observar as coordenadas factoriais
respeitantes aos primeiros componentes principais. No PC1 negativo aparecem as amostras
iniciais (1-5), enquanto que no PC1 positivo se encontram as amostras, 6, 7 e 8 ou seja,
desde o incio da fermentao at cerveja final filtrada.

1
2
PC2 (14%)

8
7

6
PC1 (69%)

Figura 6.2 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio aliftica.

124

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

O grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 6.3) mostra que as contribuies
positivas so devidas, principalmente aos cidos orgnicos, nomeadamente cido
succnico, pirvico, actico, ctrico e mlico, e isoleucina. Assim, as amostras finais (6, 7
e 8), tal como era de esperar, apresentam maiores teores destes compostos, uma vez que
eles so produtos do metabolismo das leveduras (Campos, 1998). Tambm se observa,
perfeitamente, que a amostra 6 (incio da fermentao) a que apresenta os menores
teores, pois tem um valor de PC1 mais baixo, em relao s amostras 7 e 8.
Em relao s amostras iniciais, localizadas na parte negativa do eixo de PC1, pode-se
dizer que tm maior teor de aminocidos, tais como, alanina, leucina, GABA e prolina. Tal
facto era esperado, uma vez que a levedura ainda no comeou a metabolizar os nutrientes
disponveis, no consumindo, portanto, os aminocidos presentes no meio, provenientes da
hidrlise enzimtica das protenas do malte.

Contribuies Factoriais de PC1

0,6

actico
0,4

succnico

isoleucina

pirvico

0,2

ctrico/
malico

0
3
-0,2

2,5

1,5

0,5

leucina
GABA

prolina
GABA

alanina

-0,4
Desvio qumico (ppm)

Figura 6.3 Contribuies factoriais de PC1.

Na Figura 6.4 pode-se observar os espectros de RMN de 1H das 2 amostras com maior
diferena em termos de composio qumica (1 - empastagem do malte e 7 - fim da
fermentao) e assim confirmar os resultados da PCA. A amostra 1 mais rica em
aminocidos enquanto que a amostra 7 apresenta teores mais elevados de cidos orgnicos
e etanol.

125

Face ao nmero reduzido das amostras estudadas, a aplicao da PCA tem um interesse
relativo, pois a informao que se retira tambm facilmente detectada pela anlise dos
espectros. No entanto, e dado que esta tcnica exploratria, pode permitir analisar um
maior nmero de espectros, num curto espao de tempo e assim facilitar o controlo do
processo de fabrico.
Depois se serem analisadas mais amostras, em diversas fases do processo e ao longo do
tempo, este mtodo pode permitir a identificao concreta do passo do processo de fabrico
em que determinada amostra se encontra e assim, a optimizao das condies de
processamento, de modo a tornar mais rentvel e mais fivel o fabrico de cerveja.
alanina

Amostra 1

isoleucina

prolina
GABA
leucina

GABA

3.0

2.5

Amostra 7

2.0

1.5

EtOH

1.0

0.5

ppm

1.0

0.5

ppm

actico

pirvico

succnico

ctrico/
malico

3.0

2.5

2.0

1.5

Figura 6.4 Espectros de RMN de 1H das amostras 1 (empastagem do malte) e 7 (fim da


fermentao).

126

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

Nos espectros da Regio dos Acares (3,1-5,8 ppm), representados na Figura 6.5, pode-se
observar que a principal diferena reside na quantidade e tipo de acares.
H1 (1-4)

H1 (red)

H1 (red)

EtOH

7
H1 (1-6)

H2O

8
H1 (1-1)

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

ppm

Figura 6.5 Regio dos acares dos espectros de RMN de H das vrias amostras do processo de
fabrico da cerveja.

127

Assim, na amostra inicial, a quantidade de acares simples muito mais elevada, pois os
sinais dos protes redutores so mais abundantes (H1 red e H1 red). Estes acares, tal
como vimos na introduo geral, provm da hidrlise enzimtica dos grnulos de amido,
que ocorre durante o processo da maltagem. Por sua vez, durante o processo de
fermentao, a levedura consome os aminocidos e os acares simples do mosto para
produzir dixido de carbono e etanol, e por isso, no final do processo, os acares que
permanecem em maior quantidade, so os acares mais ramificados, nomeadamente
dextrinas, que no foram metabolizadas pela levedura (Hughes e Baxter, 2001). Estes
compostos apresentam sinais mais largos a 3,7-4,0 ppm e a 5,3-5,4 ppm, como se pode ver
nos espectros das amostras 7 e 8.
Tal como na regio anterior, a PCA foi aplicada regio dos acares comprimida, por
integrao de 59 pontos sucessivos, de modo a ficar com 250 desvios qumicos, retirando
os sinais da gua e do etanol. Na Figura 6.6 esto representadas as coordenadas factoriais de
PC1 vs. PC2 da anlise da regio dos acares. Novamente, as amostras 7 e 8 esto
separadas das restantes, o que j era de esperar, uma vez que so amostras recolhidas aps
a fermentao, cuja composio em acares totalmente diferente da inicial.

PC2 (26%)

4
8
7

5
3
6
PC1 (62%)

Figura 6.6 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio dos acares.

128

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

A anlise do grfico das contribuies factoriais de PC1 (Figura 6.7) revela que os sinais
positivos advm da contribuio de protes anomricos (H1 red e H1 red),
caractersticos dos acares simples, mono e dissacardeos, o que demonstra o elevado teor
destes acares antes do incio da fermentao. Em contrapartida, os sinais negativos,
caractersticos das amostras 7 e 8, so devidos a picos que advm de ligaes H1 (1-4) e
H1 (1-6), responsveis pelas ramificaes dos acares. Estes acares permanecem na
cerveja pois no conseguem ser metabolizados pela levedura (Hughes e Baxter, 2001;
Campos, 1998).

Contribuies Factoriais de PC1

0,4

H1 (1-4)
H1 (red)

0,3
0,2

H1 (red)

0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3

5,6

5,1

4,6

4,1

3,6

3,1

H1 (1-1)
H1 (1-4)

H1 (1-6)

-0,4
Desvio Qumico (ppm)

Figura 6.7 Contribuies factoriais de PC1.

Na Figura 6.8 podemos observar os espectros de RMN de 1H das 2 amostras com maior
diferena em termos de composio qumica (1 - empastagem do malte e 7 - fim da
fermentao) e assim confirmar os resultados da PCA. A amostra 1 mais rica em
acares simples fermentveis, enquanto que a amostra 7 apresenta teores mais elevados
de acares maiores e ramificados, como o caso das dextrinas.

129

H1 (1-4)
Amostra 1

H1 (red)

H1 (1-6)

5.8

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

H1 (red)

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

ppm

3.6

3.4

ppm

EtOH
H1 (1-4)

Amostra 7

H2O

H1 (1-1)

5.8

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

Figura 6.8 Espectros de RMN de 1H das amostras 1 (empastagem do malte) e 7 (fim da


fermentao).

Na Figura 6.9 esto apresentados os espectros da Regio Aromtica (5.8-10 ppm) das
amostras do processo de fabrico da cerveja. Como se pode ver, os espectros das amostras
iniciais so mais simples, revelando o baixo teor em compostos aromticos. Estes
compostos so resultantes de vrias etapas do processamento. Por exemplo, os lcoois
aromticos superiores so produzidos pelo metabolismo secundrio das leveduras na
degradao dos aminocidos. Assim, a degradao da fenilalanina e da tirosina do origem
ao feniletanol e ao tirosol, respectivamente (Hughes e Baxter, 2001).

130

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

Fenilalanina

Histidina

Uridina/
Citidina

Tirosina
3

Feniletanol
Histidina

Polifenis

9.0

8.5

Tirosol

Citidina

Uridina

Histidina

Uridina

Citidina

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

Figura 6.9 Regio aromtica dos espectros de RMN de 1H das vrias amostras do processo de
fabrico da cerveja.

de notar a maior quantidade de aminocidos (tirosina, fenilalanina e histidina) nas


amostras iniciais e a presena de polifenis e nuclesidos (uridina, citidina, adenosina) nas

131

amostras finais. A biossntese destes compostos pode utilizar o dixido de carbono


formado no ciclo de Krebs (Weil, 2000).
A Figura 6.10 representa o resultado da aplicao da PCA matriz da regio aromtica dos
espectros das amostras em causa, reduzida por integrao de 98 pontos consecutivos, de
modo a ficar com 250 pontos. Com base no PC1 pode-se explicar uma grande parte da
variabilidade (75 %). As amostras 7 e 8 continuam separadas das restantes, mostrando que,
realmente, a sua composio aromtica bastante diferente das amostras iniciais. Este
facto deve-se, mais uma vez, ao metabolismo das leveduras, que produzem compostos
aromticos, que contribuem para o sabor e aroma da cerveja. Assim, o tipo de levedura
usado determinante para as caractersticas sensoriais da cerveja (Hughes e Baxter, 2001).
Tambm existem etapas do processo de fabrico, que devido s condies a que o mosto
submetido, contribuem para a produo de compostos aromticos a partir da degradao de
outros compostos produzidos em etapas iniciais.

PC2 (12%)

3 4

5
8

2
1
PC1 (75%)

Figura 6.10 Coordenadas factoriais de PC1 vs. PC2 da anlise da regio aromtica.

A anlise do grfico das contribuies factoriais (Figura 6.11), mostra que as amostras de 1
a 5, situadas no PC1 negativo do mapa das coordenadas factoriais, contm teores mais
elevados de citidina, tirosina e fenilalanina. Em contrapartida, as amostras 7 e 8 (situadas
no eixo de PC1 positivo), apresentam teores mais elevados de tirosol, histidina, feniletanol,

132

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

uridina e polifenis. A identificao destes compostos dificultada, mesmo com o recurso


a tcnicas de RMN multidimensionais, por vrias razes, nomeadamente, a baixa
concentrao presente na cerveja o que provoca uma fraca intensidade espectral, forte
sobreposio com outros sinais e pela inerente falta de informao sobre o acoplamento
escalar. Normalmente, do origem a sinais largos no espectro por serem molculas
grandes, de elevada massa molecular. Recentemente, a espectroscopia de RMN, acoplada
com a cromatografia lquida e a espectrometria de massa (LC-NMR/MS) foram aplicadas
no estudo destes compostos (Gil et al., 2003).

Contribuies Factoriais de PC1

0,4

Tirosol
Feniletanol
0,2

Polifenis

Uridina

Histidina

0
9,8

8,8

7,8

6,8

Citidina

5,8

Citidina

-0,2

Fenilalanina
-0,4

Tirosina
Desvio Qumico (ppm)

Figura 6.11 Contribuies factoriais de PC1.

Na Figura 6.12 esto apresentados os espectros, da regio aromtica, das amostras 1 e 7, por
serem as amostras com maior diferena a nvel da composio aromtica. Como se pode
ver, o perfil aromtico da amostra 1 muito mais simples, uma vez que ainda no ocorreu
a fermentao, enquanto que o da amostra 7 apresenta muito mais compostos,
nomeadamente polifenis, nuclesidos e lcoois, confirmando assim os resultados da PCA.

133

Tirosina
Fenilalanina

Amostra 1

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

Histidina
2-Feniletanol

Amostra 7
Histidina

Polifenis

Tirosol

Citidina
Uridina

Citidina

9.0

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

ppm

Figura 6.12 Espectros de RMN de 1H das amostras 1 (empastagem do malte) e 7 (fim da


fermentao).

6.4 Concluses
Em primeiro lugar, este estudo permitiu demonstrar que a espectroscopia de Ressonncia
Magntica Nuclear, associada a mtodos quimiomtricos, pode ter aplicabilidade no
controlo de qualidade do processo de fabrico da cerveja. Assim, possvel acompanhar a
composio qumica do mosto ao longo das vrias etapas e detectar eventuais anomalias. O
controlo efectivo do processo permite a optimizao das condies de fabrico com vista
rentabilizao e qualidade e segurana do produto final. No entanto, para a tcnica ter
maior aplicabilidade e fiabilidade necessrio ajustar o modo de quantificao dos

134

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

diferentes compostos, objecto de estudo de trabalhos futuros. Feito isto, as vantagens


podero passar pela elevada rapidez de aquisio de resultados, uma vez que se conseguem
quantificar, em simultneo, vrios compostos, pertencentes a diferentes famlias, sem
qualquer tipo de pr-tratamento da amostra e usando uma quantidade reduzida.
O pr-tratamento estatstico usado na compresso das matrizes, antes da anlise por PCA
poder apresentar vantagens, em relao ao processamento dos espectros com diferentes
valores de LB, usado nos captulos anteriores. Assim, a simplicidade e rapidez com que se
obtm as matrizes contribui para a elevada potencialidade desta tcnica na aplicabilidade
na indstria cervejeira. A possibilidade de ocorrerem erros relacionados com o operador
diminuta, uma vez que a sua interveno reduzida, unicamente, aos espectros iniciais,
adquiridos pelo espectrmetro.
O facto de ser possvel obter resultados fiveis usando a abordagem de integrao de
pontos sucessivos, que simulam os espectros obtidos em espectrmetros de campo mais
baixo, significa que a perda de informao no significativa. Isto poder sugerir que a
utilizao de espectrmetros de campo mais reduzido (e.g.: 300 MHz), no controlo de
qualidade da cerveja, ter potencialidade futura, o que de extrema importncia, uma vez
que os custos associados so extremamente mais baixos. No entanto, e como j foi
referenciado, este trabalho necessita de mais desenvolvimentos e confirmaes.

Referncias
Barros, A.S. Contribution la selection et la comparaison de variables caractristiques
Ph.D. Thesis; Institut National Agronomique Paris-Grignon; France; 1999.
Campos, L.S. Entender a Bioqumica o metabolismo fundamental em animais e
plantas; Escolar Editora; Lisboa; 1998.
Duarte, I.; Barros, A.; Belton, P.; Righelato, R.; Spraul, M.; Humpfer, E.; Gil, A. HighResolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy and Multivariate Analysis for the

135

Characterization of Beer Journal of Agricultural and Food Chemistry; 50; 2475-2481;


2002.
Duarte, I.; Godejohann, M.; Braumann, U.; Spraul, M.; Gil, A. Application of NMR
Spectroscopy and LC-NMR/MS to the Identification of Carbohydrates in Beer Journal
of Agricultural and Food Chemistry; 51; 4847-4852; 2003.
Duarte, I.; Barros, A.; Almeida, C.; Spraul, M.; Gil, A. Multivariate Analysis of NMR
and FT-IR Data as a Potential Tool for the Quality of Beer Journal of Agricultural and
Food Chemistry; 52; 1031-1038; 2004.
Gil, A.; Duarte, I., Godejohann, M.; Braumann, U.; Maraschin, M.; Spraul, M.
Characterization of the aromatic composition of some liquid foods by nuclear magnetic
resonance spectroscopy and liquid chromatography with nuclear magnetic resonance and
mass spectrometric detection Analytica Chimica Acta; 488; 35-51; 2003.
Holmes, E.; Nicholls, A. W.; Lindon, J. C.; Ramos, S.; Spraul, M.; Neidig, P.; Connor, S.
C.; Connelly, J.; Damment, S. J. P.; Haselden, J. and Nicholson, J. K. Development of a
model for classification of toxin-induced lesions using 1H NMR spectroscopy of urine
combined with pattern recognition NMR in Biomedicine; 11; 235244; 1998.
Holmes, E.; Nicholson, J. K.; Nicholls, A. W.; Lindon, J. C.; Connor, S. C.; Polley, S.;
Connelly, J. The identification of novel biomarkers of renal toxicity using automatic
data reduction techniques and PCA of proton NMR spectra of urine - Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems; 44; 245255; 1998.
Hughes, P.S.; Baxter, E.D. Beer Quality, Safety and Nutritional Aspects The Royal
Society of Chemistry; Cambridge; 2001.
Lachenmeier, D. W.; Frank, W.; Humpfer, E.; Schafer, H.; Keller, S.; Mortter, M.; Spraul,
M. Quality Control of Beer using High-Resolution Nuclear Magnetic Resonance

136

Aplicao da Espectroscopia de RMN ao estudo do processo de fabrico da cerveja

Spectroscopy and Multivariate Analysis European Food Research and Technology; 220;
215-221; 2005.
Tarkiainen, V.; Kotiaho, T.; Mattila, I.; Virkajarvi, I.; Aristidou, A.; Ketola, R. One-line
monitoanel of continuous beer fermentation process using automatic membrane inlet
spectrometric system Talanta; 65; 1254-1263; 2005.
Weil, J. H. Bioqumica Geral 2 edio; Fundao Calouste Gulbenkian; Lisboa;
2000.

137

138

Concluses Finais e Trabalho Futuro

7 CONCLUSES FINAIS E PROPOSTAS DE TRABALHO FUTURO


O potencial de tcnicas espectroscpicas, como o FT-IR e o RMN, no estuda da cerveja foi
explorado nesta dissertao. Verificou-se que a espectroscopia de FT-IR permitiu a
separao de algumas cervejas, produzidas em diferentes pases, essencialmente com base
nos teores relativos de etanol e de dextrinas. Esta tcnica simples, apenas permite detectar
bandas caractersticas das famlias dos compostos e pode ter um potencial elevado, quando
os seus dados so complementados com dados de outras tcnicas. Como tal, o objecto de
trabalhos futuros ser aplicar mtodos estatsticos, nomeadamente OPA (outer product
analysis) a espectros de FT-IR e RMN. A espectroscopia de RMN possibilita a aquisio
de elevada quantidade de informao, mas uma tcnica cara, que necessita de mo-deobra especializada e elevados custos de manuteno. Assim, se for possvel combinar as
duas tcnicas, de modo a extrair o mximo de informao do RMN e aplic-la
informao do FT-IR, as indstrias podero usar a tcnica mais barata e mais simples, o
FT-IR, com resultados semelhantes aos obtidos por RMN. No entanto, esta uma tarefa
rdua, que necessita de grande investigao.
Por seu lado, a espectroscopia de RMN, em conjunto com a Anlise em Componentes
Principais, pode ter aplicabilidade no controlo de qualidade da cerveja, nomeadamente
distinguir entre locais e datas de produo, com base nos teores de alguns compostos. Foi
possvel detectar diferenas na composio qumica de cervejas do mesmo tipo e marca,
produzidas em diferentes pases, mostrando que poder haver diferenas para uma mesma
marca de cerveja. As diferenas podem estar relacionadas com a qualidade da gua, com a
variedade das matrias-primas, com o clima e mesmo com pequenas variaes no
equipamento.
No captulo 5 foi feito um estudo semelhante mas, usando cervejas produzidas no mesmo
pas, porm em locais/cidades e datas diferentes. Deste modo, pretendia-se minimizar as
diferenas relacionadas com a qualidade da gua e restantes matrias-primas e condies
climatricas. Mesmo assim, a espectroscopia de RMN e a PCA conseguiram detectar
pequenas diferenas na composio qumica, que podem ser relacionadas, principalmente
com as condies de processamento, nomeadamente, tipo de equipamento, temperatura,

139

estado da levedura e condies de armazenamento. No entanto, ser necessrio continuar


estes estudos, usando um maior nmero de cervejas, de diferentes tipos e/ou marcas,
recolhidas ao longo do tempo.
Como se sabe, os desvios qumicos dos espectros de RMN so extremamente sensveis a
variaes de pH e, quando se aplica a Anlise em Componentes Principais, essas pequenas
diferenas so detectadas. Para eliminar esses efeitos e ressaltar somente as diferenas
relacionadas com a composio qumica, necessrio alinhar os espectros. Neste trabalho
foram usados dois mtodos diferentes com resultados semelhantes: o processamento dos
espectros com valores superiores de LB e a compresso de variveis. Ambos alargam os
sinais, diminuindo a resoluo espectral. No entanto, e como se viu, possvel obter
resultados interessantes, sugerindo que a utilizao de espectrmetros de campo mais baixo
poder ter aplicabilidade no estudo da cerveja, o que de extrema importncia, uma vez
que os custos associados so menores.
No futuro poder ser interessante investigar a adio de um tampo s amostras de cerveja,
de modo a uniformizar os valores de pH e assim diminuir os efeitos do tipo de primeira
derivada na anlise por PCA. Esta metodologia poder dispensar o alinhamento dos
espectros, o que trar vantagens em termos de tempo dispendido e em termos de resoluo,
que ser mantida.
Apesar dos processos bioqumicos, que ocorrem no fabrico da cerveja, estarem bastante
elucidados, com o avanar da tecnologia, torna-se imperioso explorar novas tcnicas de
anlise de cerveja e mosto que permitam controlar a qualidade de uma maneira mais
segura, rpida e eficaz. A espectroscopia de RMN j tinha mostrado potencial em trabalhos
anteriores e foi aplicada a diferentes amostras recolhidas ao longo do processo de fabrico
de uma cerveja. Foi possvel seguir as alteraes na composio qumica do mosto,
resultantes das transformaes fsicas e bioqumicas. No entanto, este estudo ainda
preliminar e necessrio analisar mais amostras, ao longo do tempo e de diferentes tipos
de cerveja.
Poder ser interessante seguir o processo de fermentao de uma cerveja por
espectroscopia de RMN, nomeadamente identificar e controlar as alteraes bioqumicas
que ocorrem, e relacion-las com as caractersticas sensoriais da cerveja final. Este estudo

140

Concluses Finais e Trabalho Futuro

poder proporcionar um controlo mais efectivo do processo, permitindo a optimizao das


condies de fabrico, com vista rentabilizao, qualidade do produto final e ao
desenvolvimento de novos produtos.
Em suma, os resultados obtidos abrem a possibilidade da espectroscopia de RMN,
associada a mtodos quimiomtricos, ser aplicada no controlo de qualidade da cerveja,
nomeadamente de forma a fornecer informaes, tais como, o local e data de fabrico e a
qualidade de matrias primas e condies de processamento.

141

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