1.

a) Se desea determinar protenas en una leche en polvo mediante el mtodo de

destilacin directa (mtodo de Kofranyi) que se utiliza para leche fluda. Describa los
fundamentos del mtodo, detallando pasos a seguir y reactivos utilizados.
b) Cul es el fundamento de la prueba del azul de metileno y de la determinacin de
fosfatasa alcalina?
c) Explique el fundamento del mtodo de determinacin de materia grasa en leche
(mtodo de Gerber).
d) Cmo preparara una solucin de NaOH Dornic? (1 ml de NaOH Dornic titulan 10
mg de cido lctico) Especifique cantidad de droga a pesar y volumen final. Justifique
con clculos. Exprese los grados Dornic de esta leche en g% de cido lctico.
a) MTODO DE KOFRANYL (LECHE FLUIDA)
FUNDAMENTO
Se fundamenta en la liberacin de NH3 amoniaco en una solucin de leche alcalina
en su punto de ebullicin, a continuacin se presentan los pasos para la determinacin
de protenas en leche:
1. Colocar un baln kjeldhal de 10 ml de leche, 20 ml de BaCl al 10% y 70 ml de
NaOH 70%, destilar durante 6 minutos exactamente medidos a partir del inicio de
la ebullicin, recogiendo sobre 100 ml de BO3H3 2%, titular el destilado con
SO4H2 0,1 N usando como indicador de 6 a 8 gotas de solucin de 0,016 % de
rojo de metilo y 0,083 % de verde de bromocresol en alcohol.
2. Seguidamente se calcula el % de protenas (p/p) lo cual se logra usando una curva
de calibrado. Se relaciona el % de protenas con los ml de H2SO4 0,1 N gastados.
La curva de calibrado se obtiene con el procedimiento anterior pero con muestras
de leche con contenidos de protenas conocidos. Para obtener las distintas
muestras de leche, se parte de leche entera a la cual se le mide el % de protena y
posteriormente se hacen diluciones o se adicionan casenas para obtener 5
muestras de protenas deseados. El contenido de protena que cubra el rango de
la curva de calibrado debe estar entre 1 y 4 % (p/v)1
b) DETERMINACIN DE LA MATERIA GRASA EN LA LECHE (MTODO DE
GERBER)
FUNDAMENTO
Se trata la fraccin proteica de la leche en el denominado butirometro con H2SO4
en caliente, separndose por centrifugacin la grasa de la leche liberada. La
adicin de acido amlico facilita la separacin de fases, de manera que luego de de
centrifugar El contenido de grasa se lee directamente en la escala del instrumento.
PROCEDIMIENTO.
Medir con pipeta de 10 ml de H2SO4 gerber (densidad 1,813-1,817 a 20 C
aproximadamente 90%) e introducirlos en un butirometro para leche, evitando no
mojar las paredes internas del cuello. Agregar con rapidez 11 ml de leche medidos
en pipetas de doble aforo, de manera que forme una capa sobre el acido sin
mezclarse con este. Agregar un ml de alcohol amlico y tapar con el tapn
correspondiente. Agitar suavemente pero en forma efectiva, teniendo en cuenta la
precaucin de tomar el butirometro con un reposador. Asegurar que la tapa este
bien sellada, colocar a bao de agua entre 65 y 70 C entre 5 y 10 minutos con el
tapn hacia abajo. Retirar del bao, centrifugar por 5 minutos, someter
nuevamente al bao por 5 minutos y leer inmediatamente el espesor de la capa de

grasa en la parte superior graduada del butirometro. Para ajustes adecuados de

tapn de cierre se puede hacer coincidir la base de la capa de grasa con el cero
de la escala y se lee directamente en el menisco l % de grasa de la leche.
c) PRUEBA DE AZUL DE METILENO
FUNDAMENTO
Mtodo usado en el control del estado y calidad de la leche conservacin de esta,
consiste en determinar la carga total microbiana de la leche, basado en que los
microorganismos crean reductasa en diferentes medios, la cual reduce el azul de
metileno.
Teniendo en cuenta el tiempo que tardan estos procesos de reduccin del metileno,
las leches las podemos clasificar en:

Muy mala. Para decoloraciones antes de los 20 minutos.

Mala. Para decoloraciones entre 20 y 120 minutos.
Media. Para decoloraciones entre 2 y 5 horas.
Buena. El color persiste por ms de 5 horas

PROCEDIMIENTO
Trabajar en condiciones de esterilidad y evitar la exposicin a la luz solar. Depositar
alrededor de 40 ml de leche en un tubo de ensayo de 4 cm de dimetro, agregar un
ml de solucin de azul de metileno, evitando tocar la leche con la pipeta. Tapar el tubo
con algodn y colocarlo a bao de agua de 37 a 38 C. asegures e de que el nivel de
agua supere el nivel de leche en el tubo. Mida el tiempo que tarda la leche en
decolorase.
d) FOSFATASA ALCALINA
FUNDAMENTO
Este consiste en incubar la muestra con sustrato de la enzima en condiciones de
temperatura y pH efectuados para la recuperacin enzimtica. El producto final se
determina por colorimetra. Advirtase trabajar con el ensayo en blanco.
e) SOLUCIN DE NAOH DORNIC
Para 1 ml de leche (0,001 L de leche)
0,1 g de acido lctico
C2H5OCOOH + NaOH
C2H5COONa
Los dos primeros compuestos de la reaccin estn en relacin 1 a 1, por lo tanto
M C2H5OCOOH = 90 g/mol
M NaOH = 40 g /mol
M: peso molecular
Calculo de las moles de
Moles = masa/M
Moles =0,01/90
Moles = 1,1x 10-4 de C2H5OCOOH
Concentraciones de NaOH = moles /volumen
Concentraciones de NaOH = 1,1x 10-4 /0,001 L
Concentraciones de NaOH = 0,11 moles por litro.
Para el clculo de NaOH basados en la relacin 1 a 1 de la reaccin tenemos que
Masa de NaOH = (M NaOH) (moles de NaOH)

Masa de NaOH = (40g/mol) (1,1x 10-4)

Masa de NaOH = 0,0044 g
Pregunta 5
5. A partir de una leche en polvo cuya composicin es la siguiente: 3% de humedad,
28% de grasa, 27% de protenas, 37% de lactosa y 5% de cenizas, se prepar 1 litro
de leche fluida, de manera que esta ltima tuviera un 12% de slidos.
a) Cmo se prepar la leche fluida? Especificar cantidades.
b) Cul es la composicin de la leche fluida?
c) Esta leche se utiliz para hacer un ensayo de coagulacin con distintos volmenes
de solucin coagulante. La mezcla de incubacin consisti en leche, KCl, CaCl2 y
solucin de renina. El ensayo se realiz a 37oC. Trazar la curva esperada de tiempo de
coagulacin vs. 1/vol de solucin de enzima.

BALANCE DE MASA

Partiendo de las relaciones anteriores calculamos la cantidad de agua necesaria para

llevar la leche en polvo concentrada a leche fluida con un 88% de agua
m1 + m2 = m3
m1 + m2 = 0,65
m2 = 0,65-m1
(1)

BALANCE DE AGUA

m1 w1a + m2 = m3 w3a (2)

Reemplazando 1 en 2
m1 w1a + (0,65-m1) = m3 w3a
m1 = 0.123
a. m1 es el volumen de leche en polvo en litros, necesaria para la disolucin de leche
fluida
Remplazando este valor en (1) tenemos
m2 = 0,877 volumen de agua en litros necesarios para la disolucin de la leche fluida
b. la composicin de la leche fluida viene dada por los siguientes balances de
componentes, expresados en P/V

BALANCE DE GRASA
w3g = ((0,123) (0,28)/1)*100
w3g= 3,44%

BALANCE DE PROTENAS
w3g = ((0,123) (0,27)/1)*100
w3g= 3,3%

BALANCE DE LACTOSA
w3g = ((0,123) (0,37)/1)*100
w3g= 4,5%

BALANCE DE CENIZAS
w3g = ((0,123) (0,05)/1)*100
w3g= 0,615%

c. Para esta experimentacin esperamos que el tiempo de coagulacin sea cada vez
menor cada vez que la solucin de enzima coagulante aumente. Esto quiere decir
que al aumentar la relacin inversa del volumen (un volumen cada vez ms
pequeo) se prevn tiempos moderadamente largos.
La curva esperada de tiempo de coagulacin vs. 1/vol de solucin de enzima, puede
estar por los siguientes casos.

Caso I
El tiempo de coagulacin de la leche a medida que experimenta mayores
concentraciones de enzima (volmenes mayores de coagulante) es cada vez menor.
La curva descrita puede ser lineal con pendiente constante negativa, tal como lo indica
la grafica 1. De esta forma al graficar el inverso del volumen, el comportamiento de la
curva es creciente con pendiente positiva variable (vase figura 2)

Figura 1. Vol de enzima Vs tiempo

Figura 2. 1/Vol de enzima Vs tiempo

Caso II
El tiempo de coagulacin de la leche a medida que experimenta mayores
concentraciones de enzima (volmenes mayores de coagulante) es cada vez menor.
La curva descrita puede ser no lineal con pendiente variable positiva, tal como lo indica
la grafica 3. De esta forma al graficar el inverso del volumen, el comportamiento de la
curva es decreciente con pendiente negativa constante (vase figura 4)

Figura 3. Vol de enzima Vs tiempo

Figura 4. 1/Vol de enzima Vs tiempo

7. Se estudi el mecanismo de accin de dos proteasas de microorganismos con el

objeto de utilizarlas en la elaboracin de queso. Para ello se hicieron dos series de
experimentos con cada enzima, a una temperatura de incubacin de 37oC.
En la primera serie, la mezcla de incubacin consisti en leche, CaCl2, KCl y distintos
volmenes de solucin de enzima. Se determin el tiempo de coagulacin a partir del
agregado de solucin de enzima.
En la segunda serie, los tubos de incubacin conteniendo leche, KCl y distintos
volmenes de solucin de enzima, pero sin el agregado de CaCl2, se incubaron una
hora a 37oC y se midi el tiempo. Transcurrido este tiempo, se le adicion CaCl2 a
cada tubo y se midi el tiempo de coagulacin a partir del agregado de CaCl2.
En base a los resultados obtenidos se propusieron los siguientes mecanismos:

Enzima A + CaCl2

CaCl2

sustrato ---------------------> producto ------------>cogulo

Enzima B

CaCl2

sustrato ---------------------> producto ------------>cogulo

a) Cmo espera que hayan dado los grficos de tiempo vs 1/vol de solucin de
enzima para cada enzima en cada serie de experimentos?
b) Qu caractersticas espera que tenga una enzima destinada a la elaboracin de
quesos?