Determinacin de xido-reductasas

en material biolgico
INDICE

INTRODUCCION

RESUMEN

PRINCIPIOS TEORICOS

PARTE EXPERIMENTAL
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

8
9

CONCLUSIONES

12

RECOMENDACIONES

12

APENDICE

TABLA

13

REACCIONES

15

BIBLIOGRAFIA

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INTRODUCCIN

La peroxidasa, es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos

orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno. Esta enzima
utiliza como co-factor el grupo hemo. Es utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los
ensayos para la determinacin y cuantificacin de metabolitos como glucosa, cido rico,
colesterol o triglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se
utiliza en inmuno ensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) causante del sida .La peroxidasa tambin se utiliza como
biocatalizador para la generacin de productos de inters biotecnolgico e industrial como resinas
fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y protectores de radiacin magntica, colorantes
alimentarios y componentes bioactivos de detergentes.
La calidad de la leche cruda se establece con base a parmetros higinicos, sanitarios y
composicionales. La calidad higinica resulta de especial importancia, por tratarse del contenido
microbiano que est presente en la leche cruda, el cual se transfiere en buena medida a los
productos que se elaboran a partir de ella en la industria lctea y que inciden de manera
representativa en la vida til tanto de la materia prima como del producto terminado.
El Azul de Metileno evala la cantidad aproximada de bacterias en la leche y, por tanto, la
capacidad de conservacin. El mecanismo del Azul de Metileno para valorar la calidad
microbiolgica est relacionado con la actividad reductora de las bacterias que en el proceso de
respiracin eliminan el Oxgeno disuelto en la leche y el colorante se reduce hasta que se elimina
totalmente.

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RESUMEN

La practica realizada tiene como objetivo la determinacin de oxido-reductasas (una de las seis
clases diferentes de enzimas) en material biolgico. As la determinacin de la aldehidoxidas en la
leche se llevo acabo a travs de un mtodo colorimtrico, observndose que el azul de metileno
se decolora por el formaldehdo en presencia de leche fresca, este proceso tiene lugar a travs de
la llamada enzima de Schardinger de la leche, una deshidrogenacin del hidrato de aldehdo a
acido carboxlico, con simultanea reduccin del colorante.
Tambin se llevo a cabo la determinacin de peroxidasas en papa, rbano, en un primer ensayo se
determino la presencia de peroxidasas colocando extractos de papa en tubos de ensayo, a cada
tubo se le aadieron gotas de solucin alcohlica de bencidina y una gota de H2O2, observndose
la formacin de un complejo de color verde azulado; este mtodo esta basado en la capacidad de
la enzima de catalizar la reaccin de oxidacin de bencidina a difenoquinoidiimina en presencia de
H2o2.
En los otros dos ensayos se procedi de la misma forma, solo que en lugar de aadir bencidina se
agrego pirogalol en el segundo ensayo observndose una coloracin pardo-oscura. Estos dos
ensayos se basan la capacidad de la peroxidasa de catalizar la oxidacin de ciertos compuestos
dadores de hidrogeno, cmo es el caso de los fenoles (pirogalol).

PRINCIPIOS TEORICOS
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IMPORTANCIA BIOMEDICA DE LAS ENZIMAS

Sin enzimas, no sera posible la vida que conocemos. Igual que la biocatlisis que regula la
velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiolgicos, las enzimas llevan a cabo funciones
definitivos relacionadas con salud y la enfermedad. En tanto que, en la salud todos los procesos
fisiolgicos ocurren de una manera ordenada y se conserva la homeostasis, durante los estados
patolgicos, esta ltima puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el dao tisular
grave que caracteriza a la cirrosis heptica pueden deteriorar de manera notable la propiedad de
las clulas para producir enzimas que catalizan procesos metablicos claves como la sntesis de
urea. La incapacidad celular para convertir el amoniaco txico a urea no txica es seguida por
intoxicacin con amoniaco y por ultimo coma heptico. Un conjunto de enfermedades genticas
raras, pero con frecuencia debilitantes y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos
dramticos de las drsticas consecuencias fisiolgicas que pueden seguir al deterioro de la
actividad enzimtica, inclusive de una sola enzima.
Despus del dao tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituracin de un
miembro) o siguiendo a multiplicacin celular descontrolada (por ejemplo, carcionoma
prostatico), las enzimas propias de tejidos especficos pasan a la sangre. Por lo tanto, la
determinacin de estas enzimas intracelulares en el suero sanguneo proporciona a los mdicos
informacin valiosa para el diagnostico y el pronostico.

CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS

Desde el punto de vista qumico, las enzimas estn formadas de carbono (C), Hidrgeno (H),
oxigeno (O), Nitrgeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero siempre con peso molecular bastante
elevado y comn propiedades catlicas especificas. Su importancia es tal que puede considerarse
la vida como un "orden sistemtico de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema
funcional son alterados de algn modo, cada organismo sufre ms o menos gravemente y el
trastorno puede ser motivado tanto por la falta de accin como por un exceso de actividad de
enzima.
Las enzimas son catalizadores de naturaleza protenica que regulan la velocidad a la cual se
realizan los procesos fisiolgicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las
deficiencias en la funcin enzimtica causan patologas.
Las enzimas, en los sistemas biolgicos constituyen las bases de las complejas y variadas
reacciones que caracterizan los fenmenos vitales. La fijacin de la energa solar y la sntesis de
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sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las
plantas. Los animales, a su vez, estn dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los
alimentos con fines energticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida
de relacin, como la locomocin, la excitabilidad, la irritabilidad, la divisin celular, la
reproduccin, etc. Estn regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las
reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de
energa a temperaturas fijas en un medio de pH, concentracin salina, etc.; prcticamente
constante.
A diferencia de un catalizador inorgnico que interviene en numerosas reacciones las enzimas
producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reaccin o solo una
reaccin determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcadas que en general actan
exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuracin precisa; por ejemplo, si solo atacan
a los aminocidos que tienen su carbono a , asimtrico, con estructura L-, no muestran la menor
actividad sobre formas idnticas de dichos aminocidos, pero que sean del tipo D-.
En los sistemas biolgicos se llevan a cabo diversas reacciones a partir de la misma sustancia; por
ejemplo algunos microorganismos convierten la glucosa en alcohol y bixido de carbono, al paso
que otros grmenes la convierten en cido lctico o cido pirvico o acetaldehido. Esto quiere
decir que la glucosa puede descomponerse en distintos productos y aunque todas las posibilidades
son tericas y prcticamente posibles la presencia de ciertas enzimas favorece uno de los caminos
que llevan a la acumulacin de determinados compuestos.
Las enzimas, por lo tanto, se consideran como catalizadores altamente especficos que:
Modifican la velocidad de los cambios promovidos por ellas.
Determinan que sustancias particulares, de preferencia a otras distintas son las que van a
sufrir los cambios.
Impulsan dentro de los distintos cambios posibles que pueda seguir una sustancia, cual de
ellos en especial, ser el utilizado.
Las enzimas representan las sustancias encargadas de graduar la velocidad de una
reaccin determinada en el interior de las clulas; como en las diversas clulas se realizan
infinidad de reacciones, ya que en una de ellas se encuentran varios miles de sustancias,
se deduce, tambin, la presencia de varios miles de enzimas. Es posible, por lo tanto, que
la mayor parte de esta estructura protenica celular est formada por enzimas, encargadas
de las diversas funciones de sntesis, degradacin, oxidacin, etc. caractersticas de la
actividad vital de los distintos organismos.

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Clasificacin de las Enzimas

1. Oxidorreductasas oxido - reduccin
2. Transferasas donador aceptor
3. Hidrolasas hidrlisis C C, C O, C N, P O.
4. Liasas molculas con enlaces dobles
5. Isomerasas cambios en la mol cambios en la molcula
6. Ligasas unin acoplada a consumo de ATP ADP + Pi

Una oxidoreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones desde una molcula
donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente oxidante). Por ejemplo, una enzima que
catalizara esta reaccin sera una oxidoreductasa:
A + B A + B
En el ejemplo, A es el reductor o donante de electrones y B es el oxidante o aceptor.
No obstante, en el metabolismo celular las reacciones de xido-reduccin pueden ser menos
patentes; consisten en la reduccin u oxidacin de grupos funcionales, y suelen implicar a
coenzimas que tambin cambian su estado redox, como pueden ser los pares NADH/NAD+,
NADPH/NADP+, FAD/FADH2 o FMN/FMNH2.

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Por ejemplo:
Pi + gliceraldehdo-3-fosfato + NAD+ NADH + H+ + 1,3-bisfosfoglicerato
En esta reaccin, NAD+ es el oxidante o aceptor de electrones y el gliceraldehdo-3-fosfato, el
reductor o donante de electrones.

Clasificacin:
Las oxidorreductasas se clasifican con el nmero 1 segn el Comit de Nomenclatura de la Unin
Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular, teniendo las siguientes clases.
EC 1.1, actan con grupos CH-OH como donantes. (prostaglandina-F sintasa)
EC 1.2, actan con grupos aldehdo o cetona como donantes.
EC 1.3, actan con grupos CH-CH como donantes.
EC 1.4, actan con grupos CH-NH2 como donantes.
EC 1.5, actan con grupos CH-NH como donantes.
EC 1.6, actan en la NADH o NADPH.
EC 1.7, actan con otros compuestos nitrogenados como donantes.
EC 1.8, actan con grupos de azufre como donantes.
EC 1.9, actan con grupos hemo como donantes.
EC 1.10, actan con difenoles o compuestos relacionados como donantes.
EC 1.11, peroxidasas.
EC 1.12, actan con hidrgeno como donante.
EC 1.13, actan con un donante con la incorporacin de oxgeno molecular.
EC 1.14, actan con dos donantes con la incorporacin o reduccin de oxgeno molecular.
EC 1.15, actan con superxido como aceptor.
EC 1.16, actan oxidando iones metlicos.
EC 1.17, actan en grupos CH o CH2.
EC 1.18, actan con protenas de hierro-azufre como donantes.
EC 1.19, actan con flavodoxina reducida como donante.
EC 1.20, actan con fsforo o arsnico como donante.
EC 1.21, actan en enlaces x-H y y-H para formar un enlace x-y.
EC 1.97, Otras oxidorreductasas.

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PARTE EXPERIMENTAL
REACTIVOS:
Formaldehdo
Azul de metileno
Solucin alcoholica de bencidina
Perxido de hidrogeno
pirogalol

MATERIALES
leche fresca
jugo de papa
jugo de rbano
INSTRUMENTAL
termmetro, tubos de ensayo, probeta, bagueta, vasos, cocinilla.

PROCEDIMIENTO
Revelacin de aldehidoxidasa (aldehdo: O2-oxido reductasa) en la leche
En dos tubos de ensayo se colocaron 5mL de leche fresca respectivamente al primero se le agreg
1mL de agua y al segundo el mismo volumen pero, de formaldehdo. A ambos tubos se les aadi
1mL de azul de metileno, y se mezcl el contenido.
Los tubos se colocaron en un bao de agua, calentando hasta 37oC. Despus de 5-10 minutos se
compara el cambio de coloracin en ambas muestras. Luego se agita fuertemente el tubo de
ensayo.

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Revelacin de la peroxidasa (donador: H2O2-oxido reductasa) en la papa y en el rbano

En dos tubos; el tubo primero se agreg jugo de papa y en un segundo tubo jugo de rbano.
A estos dos tubos se les aadi 5 gotas de la solucin alcohlica de bencidina y una gota de
perxido de hidrogeno; y se observo la variacin de color.
A otros dos tubos se agreg jugo de papa y en un segundo tubo jugo de rbano; se aadi
pirogalol y luego gotas de perxido de hidrgeno; se observo la variacin del color.

RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Revelacin de aldehidoxidasa (aldehdo: O2-oxido reductasa) en la leche

El tubo n1 que contena, leche + agua y azul de metileno, no presento una decoloracin
acentuada con el calentamiento.
El tubo n2 que contena, leche + formaldehido y azul de metileno, se decoloro con el
calentamiento.
El mtodo est basado en la observacin visual sobre la decoloracin del azul de metileno (AM),
que liga el hidrgeno, que se desprende con la participacin de aldehidoxidasa del sustrato.

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Revelacin de la peroxidasa (donador: H2O2-oxido reductasa) en la papa y en el rbano

La peroxidasa es una protena grande que consiste de cientos de aminocidos y que tiene un ion
hierro localizado en su sitio activo. Catalizan reacciones bisustrato de carcter redox, utilizando
un perxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de caractersticas
reductoras que es oxidado por el perxido. La papa, el rbano y el pednculo del pimiento
contienen una gran cantidad de esta enzima.
La funcin normal de la peroxidasa es convertir el perxido de hidrogeno (H2O2), produciendo en
ciertas reacciones metablicas, en agua (H2O) y oxigeno (O2).

Con bencidina:

El tubo n1, que contena jugo de papa+ bencidina; al agregar

el perxido el contenido del tubo tomo un color verde
azulado con efervescencia.

El tubo n2, que contena jugo de rabanito+ bencidina;

cuando se agrego el perxido de hidrgeno tomo un
color verde azulado con efervescencia.

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Con pirogalol:

El tubo n1, que contena jugo de papa+ pirogalol; al agregar el perxido el contenido del tubo
tomo un color pardo-oscuro con efervescencia.
El tubo n2, que contena jugo de rabanito+ pirogalol; cuando se agrego el perxido de hidrgeno
tomo un color pardo-oscuro con efervescencia.
El tubo n2 que contena jugo de rabanito presento mas efervescencia que el tubo n1que
contena jugo de papa.

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CONCLUSIONES
Las enzimas oxido-reductasas, se combinan con el oxigeno y se aprovechan de este, para
acelerar la reaccin.
Se pudo observar que las peroxidasas, se hallen principalmente en races, como fue el jugo
de papa y rbano.
La demostracin de la enzima se basa en la accin oxidante de la aldehidoxidasa sobre el
sustrato, formaldehido, produciendo un acido carboxlico en presencia del indicador de
azul de metileno en la cual se hace positiva la reaccin debido a su decoloracin (AM).

RECOMENDACIONES
Tener cuidado en no elevar la temperatura por encima del punto de ebullicin, para no
obtener errores en los resultados.
Los reactivos como el azul de metilo, no debe estar descontinuado.
No confundir los tubos al preparar las pruebas.

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REACCIONES
Enzima aldehdoxidasa

HC=O + H2O + FAD

aldehidooxidasa

HC=O + FADH2

II
H

I
OH

FADH2

+ O2

HC=O + H2O +
I
H

aldehidooxidasa

FAD + H2O2

aldehidooxidasa

FAD

AMH2
(Forma leico)

FAD H2

HC=O
I
OH

AM
(coloracin azul)

Revelacin de la peroxidasa

+H2O2

Bencidina

+2H2O

Difenoquinoidiimina

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TABLA

ENZIMA

SUSTRATO

REVELADO

(DONADOR)

Leche fresca

aldehidoxidasa

formaldehido

O2

Azul de metileno

Decoloracin del
azul de metileno

Jugo de papa

Peroxidasa

bencidina

H2O2

Bencidina
(difenoquiboidimina)

Se torna de color
verde-azulado

Jugo de
rbano

Peroxidasa

bencidina

H2O2

Bencidina
(difenoquiboidimina)

Se torna de color
verde-azulado

Jugo de papa

Peroxidasa

pirogalol

H2O2

Pirogalol
(purpuragalina)

Se torna de color
pardo oscuro

Jugo de
rbano

Peroxidasa

pirogalol

H2O2

Pirogalol
(purpuragalina)

Se torna de color
pardo oscuro

MATERIALES

ACEPTOR

INDICADOR DE LA
REACCIN

RESULTADOS

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BIBLIOGRAFIA

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/anexo_21.htm

http://es.scribd.com/doc/19046859/HIDROLISIS-ACIDA-Y-ENZIMATICA-DEL-ALMIDON
http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art38.pdf
http://members.tripod.com/biol_uprponce/images/pdfs/ag04/Lab_06_Prop_Enzimas_s.pdf
http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/index.html

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