PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS,

TINCIONES Y MORFOLOGIA MICROSCOPICA DE COLONIAS

PRACTICA 2

Jennifer aroca
Jeison Cuitiva
Natalia Diaz
Lizeth Gutierrez
Sergio Valencia

Ficha: 662078
Qumica Aplicada a la Industria

RESUMEN
En la prctica de laboratorio pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismo, tincin
y morfologa microscpica de colonias, se realizo en primer lugar una tincin Gram con cristal
violeta para reconocer entre la Escherichia coli y Staphylococcus aureus, la cual se encontr Gram
negativa escherichia coli y Gram positiva Staphylococcus aureus.
Despus de esto se realizaron unas pruebas bioqumicas en diferentes pruebas, TSI (agar de hierro
triple azucarado), LIA (agar de hierro y lisina), prueba de citrato, y Prueba de Voges Proskauer; en
los cuales las pruebas TSI, LIA, y citrato, dieron positivo; en e l caldo al realizarle la prueba con rojo
de metileno dio positiva ya que se torno de color rojo pero al realizar la prueba con perxido dio
negativo ya que no se noto ningn cambio.
PALABRAS CLAVES

Pruebas
Bioqumicas
Identificacin
Microorganismos
Tincin
Morfologa
Colonias
Tincin Gram
Cristal violeta
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Gram positiva
Gram negativa
TSI
LIA
Citrato
Caldo (Prueba Voges Proskauer)
Rojo de metilo
Perxido

ABSTRACT
In biochemical lab for identification of microorganism
KEY WORDS

Testing
Biochemical
Identification

Microorganisms
Staining
Morphology
Colonies
Gram stain
Crystal Violet
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Gram Positive
Gram negative
Citrate
Broth ( Voges Proskauer test )
Methyl red
Peroxide

INTRODUCCION
La tincin Gram fue desarrollada
empricamente por Christian Gram en 1884,
a pesar del tiempo transcurrido la tincin
apenas se ha modificado y es uno de los
primeros pasos que se realiza para cualquier
identificacin bacteriana. Desde entonces las
tinciones Gram son muy utilizadas en el
laboratorio para la identificacin temprana y
definitiva del microorganismo, adems de
que nos da la forma que tiene, su agrupacin
y el grupo taxonmico al que pertenece.
Desde el siglo XIX se comenz a direccionar
una buena parte de la biologa y la qumica a
la creacin de una nueva disciplina
integradora: la qumica fisiolgica o la
bioqumica. Pero la aplicacin de la
bioqumica y su conocimiento,
probablemente comenz hace 5000 aos
con la produccin de pan usando levaduras
en un proceso conocido como fermentacin.
A partir de esta nueva rama se investigaron
y sacaron nuevas pruebas para la
identificacin de las bacterias como lo son las

pruebas bioqumica, tales como el Citrato,

TSI, LIA, y Caldo (Voges Proskauer).
METODOLOGIA
PARA LA TINCIN DIFERENCIAL (TINCIN
GRAM).
1. Preparacin del frotis
En un portaobjetos previamente
desengrasado y limpio se colocaron unas
gotas de agua esterilizada, despus con el
asa esterilizada se tomo una pequea
muestra del crecimiento bacteriano (para
esta lamina se utiliz la bacteria Escherichia
coli proveniente del agar de los tubos
inclinados, se coloco sobre la gota de agua y
con ayuda del asa se distribuyo en la
superficie tratando de que la muestra
estuvieran bien dispersa y no acumulada
para lograr una mejor visualizacin en el
microscopio. Se procedi a dejar secar en el
aire y luego pasando la lamina rpidamente
por la flama del mechero se fijo la muestra a
la lamina (se llevo a cabo este procedimiento
5 veces).

Previamente se procedi a hacer lo mismo

con otra lamina porta objetos con la
diferencia que se manej la bacteria
Staphylococcus aureus.
2. Tincin:
Se tomo las laminas portaobjetos fijadas con
las dos diferentes bacterias y se colocaron en
un puente de coloracin (fig. 1), se le echo el
cristal violeta y se dejo actuar por un minuto;
despus se escurri la muestra y se lavo con
agua del grifo, se cubri con solucin de lugol
y se dejo quieto por un minutos, despus de
este se escurri el exceso e inclinando el
portaobjetos se le agrego alcohol acetona y
se dejo escurrir hasta que no se vio
segregacin del cristal violeta. Al termino de
lo anterior se lavo con agua de la llave y se
coloco safranina y se dejo actuar por 15
segundos; se volvi a lavar con del grifo,
previamente bien escurrido y dejndolo
secar al aire se procedi a la observacin en
el microscopio.

Fig.1
Cuando se llevo a cabo la observacin en el
microscopio se observo primero con un
objetivo de 10x y otro de 40x y luego se
observo con objetivo de inmersin (objetivo
100x).

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

Se distribuyeron las diferentes pruebas en la
gradilla del siguiente orden (fig. 2): Citrato
(Simmons Citrato Agar), TSI (agar de hierro
triple azucarado), LIA (agar de hierro y lisina)
y el caldo (Prueba de Voges Proskauer).

Fig. 2
Esterilizando el asa circular y la boquilla del
tuno inclinado que tena el crecimiento
bacteriano de la escherichia coli, se procedi
(con el asa) a tomar una muestra de este,
luego se volvi a esterilizar la boquilla del
tubo inclinado y se cerro, se abri el tubo de
la prueba de citrato se esterilizo la boquilla y
se estri el pico de flauta con el asa, se volvi
a esterilizar la boquilla y el asa y se cerr el
tubo.
En las pruebas TSI y LIA se procedi de la
misma forma: Se esterilizo el asa recta, se
abri el tubo con el crecimiento bacteriano
con la que anteriormente se haba
procedido, se esterilizo la boquilla y se
punciono desde la mitad hacia el fondo del
tubo.
Se esterilizo la boquilla del tuno del
crecimiento y se cerro, se abri el tubo con
las pruebas TSI/LIA se esterilizo la boquilla y
se punciono con el asa recta de la misma

manera con la cepa; se esterilizo la boquilla y

se cerr.

TINCION GRAM
PRUEBAS BIOQUIMICAS

Y finalmente con el caldo; tomamos el asa

circula la esterilizamos, con esta sacamos
una muestra del crecimiento procediendo de
la misma manera como en los casos
anteriores (se estri), y con el tubo que
tena el caldo se abri, se esterilizo la oquilla
se introdujo el asa y se inoculo el caldo; para
cerrar el tubo se procedo primero a
esterilizar la boquilla.

PRUEBA
BIOQUIMICA
TSI
LIA
CITRATO
VOGES PROSKAUER
ROJO DE METILO
PEROXIDO

RESULTADOS

Esquema:

BACTERIA

GRAM
POSITIVA
(MORADO)

Escherichia Coli
Staphylococcus
Aureus

COLONIA
Escherichia Coli
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo

GRAM
NEGATIVA
(ROJO)

x
x

Gram Positiva
Staphylococcus
Aureus
Su agrupacion es
diplobacilos.

Gram Negativa
Escherichia Coli
Su agrupacion es
micrococo

1:

ANALISIS Y DISCUSIN
En el laboratorio microbiologa la
identificacin de bacterias es muy
importante, sobre todo en el sector de la
salud. Hay muchas pruebas que sirven para
la identificacin de las bacterias como lo son
las tinciones diferenciales y las pruebas
bioqumicas
La tincin Gram es una gran forma de
identificar a los microorganismos y
determinar su grupo taxonmico. Cuando
una bacteria retiene el colorante cristal
violeta- se clasifican como bacterias Gram
positivas aunque se le hay colocado
decolorante, pero cuando la bacterias
despus de haberle agregado el decolorante
pierde el color violeta y retiene un color
roso, son clasificadas como Gram negativas.
Esto sucede ya que las bacterias Gram
positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano , adems de dos clases de
cido teicoico. Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana
plasmtica, se encuentra el acodo
lipteicoico y en la superficie, el cido
teicoico que est anclado solamente en el
peptidoglucan. Por el contrario, la capa de
peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmtica exterior por medio de
lipoprotenas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana
exterior por lipoprotenas La membrana
exterior est hecha de protena, fosfolpido y
lipopolisacrido. El peptidoglucano o
murena, ya que es el material que confiere
su rigidez a la pared celular bacteriana, y las
Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas. Por lo

tanto, ambos tipos de bacterias se tien de

manera distinta debido a estas direrencias
constitutivas de su pared.
La diferencia que se observa en la resistencia
a la decoloracin, es debido a que la
membrana externa de las Gram negativas es
soluble en solventes orgnicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La
capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener
el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una
pared celular ms resistente y con mayor
proporcin de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la accin del solvente
orgnico, sino que este acta deshidratando
los poros cerrndolos, lo que impide que
pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin
azul-violcea.
Por ello encontramos que las bacterias
Escherichia coli contienen el peptidoglucano
contiene una rigidez menor que a las
bacterias Staphylococcus Aureus; en
copnsecuencia de esto enconteramos Gram
negativas a las bacterias Escherichia Coli y
Gram negativas a las bacteria Staphylococcus
Aureus.
Las pruebas bioqumicas son otros mtodos
para la identificacin de bacterias con los
procesos metablicos que utilizan; en
general el microorganismo se cultiva en
medios que contienen una sustancia
nutritiva especfica o sustrato y despus de la

incubacin del cultivo se examina para ver

los cambios qumicos que hayan ocurrido.
En nuestra practica de laboratorio utilizamos
4 pruebas diferentes, las cuales fueron:
citrato, TSI (agar de hierro triple azucarado),
LIA (agar de hierro y lisina), Caldo (Voges
Proskauer). Las cuales las pruebas citrato,
TSI, LIA nos dieron positivo al examinarlas ya
que nos demostraban crecimiento a lo largo
del lugar donde se estrio o punso la muestra
de cultivo (fig 3, fig 4, fig 5)

Fig. 5 LIA

BIBLIOGRAFIA
http://es.slideshare.net/josemagarinos/tinci
o
http://es.wikipedia.org/wiki/Identificaci%C3
%B3n_bacteriana
http://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%AD
mica
Fig. 3
Citrato

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_
de_Gram
http://www.revistaciencias.com/publicacion
es/EElpZEVkykPMncqxmd.php
http://es.slideshare.net/roberchavez/medios
-de-cultivo-y-pruebas-bioquimicapresentation

Fig. 4 TSI