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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA- MICROBIOLOGA

PRACTICA 9
AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM SPP.

CURSO

ECOLOGA MICROBIANA

PROFESOR

CSAR CCEDA QUIROZ

PRESENTADO POR :

LISSET PACCO VELASQUEZ


2010 35454

FIORELA SALAZAR TORREBLANCA


2010 35439

RUTH MIRIAN MAMANI CONTRERAS


2007-30737

TACNA - PER
2014
1

PRCTICA 9
AISLAMIENTO DE Rhizobium spp.
INTRODUCCIN
Bijerinck en 1988 obtuvo el primer cultivo bacteriano puro de un ndulo de raz
de leguminosa y lo llamo Bacillus radiccola. Posteriormente, Frank propuso el
nombre Rhizobium para estos aislados. Basada en la especificidad de los
huspedes para 1929 ya se haban reconocido seis especies: Rhizobium
leguminosarum, Rhizobium trifolii, Rhizobium phaseoli, Rhizobium meliloti,
Rhizobium japonicum, Rhizobium lupini. En esta clasificacin, cada especie se
compona de cepas que compartan un grupo de leguminosas husped.
Trabajos posteriores desafiaron esta designacin de especies basada en la
especificidad del husped.
El gnero Rhizobium son bacilos que miden 0,5 1,0 por 1,2 3,0 um. Se
mueven por medio de 1-6 flagelos que pueden ser peritricales. Las colonias
generalmente son blancas o de colores beige, circulares, convexos,
semitranslcidos u opacos y mucilaginosos; generalmente miden 2 4 mm de
dimetro a los 3-5 das de incubacin en agar BYMA. El crecimiento en medio
de carbohidratos generalmente est acompaado de reaccin cida y
abundante
cantidad
de
gelatina
polisacrido
extracelular.
Son
quimioorganotrficas, utilizando una gran variedad de carbohidratos y cidos
orgnicos. Algunas cepas requieren biotina, cido nicotnico o tiamina como
factores de crecimiento.

I.

OBJETIVOS

II.

Aislar Rhizobium sp a partir de ndulos de leguminosas.

MATERIAL Y MTODOS
Material Biolgico

Plantas de leguminosas con ndulos

Material de Laboratorio

Tubos de ensayo
Placas Petri
Pinzas
Asa de kolle
Lminas portaobjeto estriles
2

Viales
Microscopio ptico
Matraz de 250 ml

Medios de Cultivo:

Agar Levadura Manitol: Medio BYMA (Tabla 1)

Tabla 1. Composicin del medio BYMA

Fuente: Daz 2010

Soluciones:

III.

Etanol al 95%
Solucin de HgCl2 o Hipoclorito de Sodio
Kit de coloracin Gram
Agua destilada estril
Rojo de Congo

PROCEDIMIENTO

3.1.- EXTRACCIN Y LAVADO DE LOS NDULOS

Extraer plantas enteras de leguminosas con ndulos en sus races.


Lavar las races con cuidado.
Extraer los ndulos de las races.
Colocar los ndulos en un vial estril para que sean lavados con
agua estril por 8 minutos enrgicamente repitiendo esta operacin 3
veces.
Secar la superficie de los ndulos con papel estril.
Sumergir los ndulos en etanol al 95% por 30 segundos.
Sumergir los ndulos a una solucin de Hipoclorito de Sodio por un
tiempo de 3 a 4 minutos.
Repetir el paso anterior por dos veces.
Lavar los ndulos con agua estril 10 veces enrgicamente.
Transferir los ndulos a una lmina portaobjeto estril.

3.2.- TINCIN DE BACTEROIDES


Presionar los ndulos con otra lmina portaobjetos estril hasta
obtener una suspensin de color lechoso.
Realizar la extensin en una lmina portaobjetos, para su coloracin.
3.3.- SIEMBRA EN MEDIO BYMA
Presionar los ndulos con otra lmina portaobjetos estril hasta
obtener una suspensin de color lechoso.
Tomar una asada de la suspensin color lechoso. Sembrarlo en Agar
Levadura Manitol (BYMA). Incubar a 22C por 5 a 10 das.

Nota: Para purificar an ms la cepa, una vez que haya crecido en la


Placa, se procede a sembrar en otra solo en la mitad, y llevar a incubar;
luego nuevamente volver a sembrar en el resto de placa que no fue
sembrada.

IV.

RESULTADOS
Observar microscpicamente formas X, Y, V (de gran tamao
llamados bacteroides) y formas bacilares tanto en los ndulos como
en las colonias previa coloracin.
Observar microscpicamente despus de la incubacin colonias
incoloras, mucosas, irregulares y brillantes.
Luego de haber incubado, proceder a realizar la tincin Gram para
las colonias que hayan crecido, confirmar si son bacilos Gram
negativos.

V.

BIBLIOGRAFA
PROCESOS MICROBIANOS: Gua de Prctica
FRIONI, L.
Editorial de la Fundacin Universidad Nacional de Ro Cuarto
Argentina.
Villanueva E, Quintana A. Aislamiento y seleccin de bacterias
nativas de rizobios fijadores de nitrgeno, a partir de ndulos
radiculares de Phaseolus vulgaris . REBIOL Vol 32, N 1, EneroJunio, 2012, pp. 24-103. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo.
Per
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Simbiosis
leguminosa-Rizobio. Manual de evaluacin, seleccin y manejo
agronmico. Cali, Colombia. 1987.
Daz Alcntara Cesar. Aislamiento, caracterizacin y seleccin de
rhizobia autctonos que nodulan habichuela roja (Phaseolus vulgaris
L.), en la Repblica Dominicana. Universidad de Len.
DEPARTAMENTO DE INGENIERA Y CIENCIAS AGRARIAS.
Instituto de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Biodiversidad
TESIS DOCTORAL 2010.
Jorge L. Hernndez et. al. Aislamiento de cepas de Rhizobium spp.,
asociados a dos leguminosas forrajeras en el Centro Biotecnolgico
del Caribe. Revista Colombiana de Microbiologa Tropical. Vol. 2 N
2. Enero Junio 2012.