Classificao e

Identificao de microrganismos

Ex. colnia isolada

(amostra clnica,
ambiental, alimentar,
etc)

Bioqumica

Biologia molecular
Fisiologia (ex. cidos nucleicos, protenas)

Morfologia

Ecologia

Compilao de
propriedades

Caracterizao do isolado

)
+
(
Identificao
TAXONOMIA

(-)

Comparao com propriedades

conhecidas de microrganismos
(disponiveis em bases de dados, manuais, etc)

Classificao

Descrio de
microrganismo novo*

Nomenclatura

*Espcie nova? - Descrio detalhada; em publicao cientfica internacional

Estirpe tipo depositada em coleces de culturas nacionais e/ou internacionais

 Taxonomia
a cincia que distribiu os organismos por categorias
taxonmicas ou taxa que traduzem o seu grau de
semelhana
Divide-se em:
classificao define a forma de distribuio dos
organismos em grupos taxonmicos (taxa; singular
taxon)
(com base em semelhana mtua ou relao evolutiva).

nomenclatura atribui nomes aos grupos taxonmicos

de acordo com regras pr-estabelecidas.
identificao o processo de determinar a que grupo
taxonmico pertence um determinado isolado.

Importncia da taxonomia
Permite organizar grandes quantidades de
informao
Permite fazer uma previso das caractersticas
de um determinado isolado
A criao de grupos com nomes precisos facilita
a comunicao cientfica
essencial para a identificao correcta dos
organismos

ESPCIE - unidade bsica da taxonomia microbiana.

conjunto de estirpes que partilham muitas caractersticas
estveis e diferem significativamente de outros grupos de
estirpes ( subjectivo);
conjunto de estirpes com composio G+C (genoma)
idntica, e em que a sequncia de nucleotdeos do DNA
apresenta 70% de semelhana.

GNERO grupo bem definido de uma ou mais espcies, claramente

separado de outros gneros.

Sistema binominal
para a designao da espcie

Shigella flexneri
S. flexneri

espcie

Gnero - Shigella

aceae - famlia

ales - ordem

Hierarquia taxonmica (exemplo)

Numero de
grupos taxonmicos
Conhecidos
(domnio Bacteria)
Filos - 25
Classes - 34

Ordens - 78
Familias - 230
Gneros - 1227
Espcies - 6740
(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

3 divises maiores:
domnios Bacteria, Archaea e Eukarya
Os microbiologistas usam muitas vezes nomes informais
- Por exemplo: bactrias purpra, bactrias metanotrficas (que oxidam metano), etc

ESTIRPE
populao de organismos que se distingue de outras dentro de
uma espcie
descende de um nico organismo ou cultura pura (isolado)
Estirpes de uma espcie podem variar ligeiramente de vrias
formas
biovar apresentam diferenas bioqumicas e fisiolgicas
morfovar diferem morfologicamente
serovar diferem nas propriedades antignicas
ESTIRPE TIPO

- primeira estirpe a ser estudada de uma espcie

- geralmente a mais bem caracterizada
- No necessariamente o membro mais representativo
da espcie

Caractersticas Usadas em Taxonomia, na

classificao e identificao de microrganismos

dois tipos:
clssicas

morfolgicas
fisiolgicas e metablicas
ecolgicas
anlise gentica

moleculares

cidos nucleicos

Protenas

Lpidos

Caractersticas fenotpicas

Caractersticas Clssicas

Caractersticas ecolgicas

Ciclo de vida
Relaes simbiticas
Capacidade de causar doenas em hospedeiros
Habitat preferencial
Factores que influenciam o crescimento

Anlise Gentica

Capacidade de troca de informao gentica por transformao ou

conjugao
estes processos esto geralmente confinados ao gnero

Existncia de plasmdeos
(embora a informao neles contida possa induzir em erro)

Exemplo - Identificao de um isolado de bactria entrica com base em

mtodos de classificao clssica.
O esquema aqui representado usa mtodos microbiolgicos clssicos e requere que uma populao
da bactria a identificar seja crescida em cultura pura.

TP. 6

Classificao fentica
Agrupa os organismos com base em semelhanas
fenotpicas mtuas;

As caractersticas fenotpicas testadas tm todas o

mesmo peso;

necessrio comparar um grande nmero de

propriedades (vrias dezenas ou centenas de tipos
diferentes: morfolgicas; bioqumicas; fisiolgicas)
de diferentes microrganismos.

Exemplo de utilizao de

taxonomia numrica em
Bacteriologia.
O dendrograma ao lado mostra a
distribuio de 105 estirpes de bactrias
Gram-negativas e fermentativas da familia
Enterobacteriaceae. Foram comparadas
238 caracterstica de cada estirpe.

(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

Taxonomia Numrica
Usada para estabelecer um sistema de classificao
(comparao de grande n de caractersticas de diferentes
microrganismos; frequentemente > 50 caractersticas)

Passos principais:
Todas as propriedades testadas tm o mesmo peso:

1 = Presente;

0 = Ausente

Determinao dos coeficientes de semelhana

Usa computadores para comparar organismos
Construio de matrizes de similaridade
Construo de dendogramas que relacionam os microrganismos
entre si

Coeficiente de semelhana
Coeficiente simple
matching
Com base em todas as
caractersticas, quer
estejam presentes ou
ausentes

Coeficiente de Jaccard
Ignora as caractersticas
ausentes nos dois
organismos.

Coeficientes variam entre

0 (sem semelhana) e
1 (100% semelhana)
(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

 dendrograma diagrama em rvore

um grupo de organismos com um grau de semelhana
superior a 80% = espcie bacteriana
matriz de
similaridade
(a)

Clustering (b)

(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

Dendrograma (c)

Kits comerciais para identificao de microrganismos

(Ex. diagnstico de patognicos em amostras clnicas ou em alimentos;
em amostras ambientais (ex. anlise de gua))

- Baseados principalmente em caractersticas fisiolgicas e

bioqumicas
- Sistemas automatizados
- Perfis de caractersticas observadas so comparadas com perfis
disponveis em bases de dados
- Requer cultivo dos microrganismos em cultura pura

- API e mini-API
- Vitek

BIOLOG

ability of the cell to metabolize all major
classes of biochemicals;

physiological properties such as pH, salt, and lactic acid tolerance, reducing power,
and chemical sensitivity;

> 1900 species couverage (bacteria, yeast, filamentous fungi)

Identificao de espcies bacterianas com base na

composio das clulas em cidos gordos: FAME
FAME Fatty Acid Methyl Ester
Mais de 200 cidos gordos diferentes
foram descobertos em procariotas
do domnio Bacteria.

CLASSIFICAO MOLECULAR
- Anlise molecular de componentes celulares especficos
Comparao de protenas
Comparao da composio dos cidos nucleicos
- Ex. contedo G + C do DNA
(determina-se com base no valor da temperatura de fuso, Tm)
Hibridao de cidos nucleicos
Comparao de sequncias de bases de cidos nucleicos
- Ex. do RNA ribossmico - rRNA (Filogenia ou

classificao filogentica)

Comparao de protenas
comparao da mobilidade electrofortica
comparao de propriedades enzimticas
determinao da sequncia de aminocidos,
alinhamento de sequncias
(ferramentas de Bioinformtica)

Composio de bases dos cidos nucleicos

Contedo G + C
Mol% G + C = (G + C)/(G + C + A + T)
Variao dentro de um gnero geralmente < 20%
- % G+C s tem valor taxonmico quando aliado a outras caractersticas fenotpicas
e/ou moleculares

DNA cadeia
simples

DNA cadeia
dupla

(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

HIBRIDAO DNA:DNA como ferramenta taxonmica

Mede o grau de similaridade (ou, homologia) no DNA de dois organismos

espera-se que duas molculas de DNA desnaturadas (em cadeia simples)

hibridizem uma com a outra (i.e. emparelhem, estabelecendo pontes de H
entre bases homlogas) proporcionalmente complementaridade das
sequncias de bases nos seus genes (i.e. similaridade dos seus genes).
um mtodo sensvel para revelar diferenas subtis nos genes de dois
organismos; til para distinguir organismos ao nvel da espcie.

EXEMPLO (figuras seguintes):

1. DNA de um dos microrganismos marcado com istopo de fsforo radioactivo.
2. DNA dos 2 microrganismos desnaturado e depois misturado.
(Geralmente, o DNA de um dos microrganismos est fixado a uma membrana
de Nylon ou nitrocelulose);
3. No final, removido o DNA no ligado e medida a quantidade de radioactividade
sobre a membrana.

HIBRIDAO DNA:DNA como ferramenta taxonmica

(T > Tm)
In general, the DNA of
organism 2 (non-radioactive)
is attached to a membrane
(made of Nylon or nitrocelulose)

(T < Tm)

1x1 positive control

> 70% DNA similarity

+
< 5% diference in Tm (% G+C)

Probably, same species

(in Prescott, Harley, Klein, Microbiology, 5th ed.)

EVOLUTION and
SPECIATION
- Mutations
- Horizontal gene transfer
(conjugation, transformation,
transduction)
- Adaptation / new ecotype
Ecotype population of cells that
compete for the same resource
New species population of cells
genetically different from the cells of the
original ecotype.

FILOGENIA ou CLASSIFICAO FILOGENTICA

 Traduz a histria evolutiva de um grupo de organismos.
 A hierarquia taxonmica revela relaes evolutivas ou filogenticas
a rea da taxonomia que estuda as relaes evolutivas entre os organismos vivos
( a base da classificao moderna)

Evoluo alteraes numa linhagem de descendncia

ao longo do tempo conduzindo a novas
variedades e espcies.
FILOGENIA grego: phylon tribo, raa; genesis - origem

As relaes evolutivas so mostradas em rvores filogenticas

rvores filogenticas

N =
unidade
taxonmica
(e.g., espcie ou
um gene)

Ramos:
O comprimento representa a distncia evolutiva ou o grau
de relacionamento evolutivo entre os organismos

B
B

C
D

C
D

E
Ns internos:
Representam organismos
ancestrais

E
N externo:
Representam organismos
conhecidos, actuais

Combinao de mtodos de Biologia Molecular e

Anlise Computacional, com base em Algoritmos
Matemticos
Bioinformtica

rvore com raztem um n que

corresponde ao
ancestral
comum

A rvore filogentica universal (Carl Woese, 1977)

(Bacteria that gave

rise to mitochondria)

(Bacteria that gave

rise to chloroplasts)

Universal
ancestor(s)

CLASSIFICAO FILOGENTICA
Baseia-se na comparao directa das sequncias de material gentico
(genes) ou dos seus produtos (protenas)

RIBOSSOMAS

Molculas de RNA ribossomal (rRNA)

so excelentes ferramentas para determinar
relaes evolutivas entre organismos
CRONMETROS EVOLUTIVOS

PORQUE:
- So universais (esto presentes em todos os organismos vivos e
com a mesma funo);
- A sua funo no se alterou ao longo do processo evolutivo;
- Contm vrias regies em que a sequncia de nucleotdeos
conservada em todos os tipos de clulas;
-- Sequncias assinatura / grupos taxonmicos especficos

rRNA 16S (procariotas)

rRNA18S (eucariotas)
Ribossomas
(procariotas)

rRNA 16S
(domnio Bacteria)

SSU Small Subunit

rRNA 16S
(domnio Archaea)

rRNA 18S
(domnio Eukarya)

A sequncia de bases nestas molculas de rRNA muito

conservada ao longo do processo evolutivo

OBTENO DE RVORES FILOGENTICAS COM BASE

BNA SEQUNCIA DE NUCLEOTDEOS DO rRNA - RNA RIBOSSOMAL

(a) extraco do DNA de clulas de cada um dos microrganismos que se

pretende comparar
(neste exemplo, so 3 bactrias, designadas por 1, 2 e 3);
(b) Obteno de muitas cpias do gene que codifica o 16S rRNA em cada um
dos microrganismos (tcnica de PCR)

PCR Polymerase chain reaction - reaco em cadeia

pela polimerase
(Kary Mullis 1993)
- Primers
- DNA polymerase de bactrias
termfilas ou hipertermfilos.

Permite obter
muitas cpias
iguais de um
gene especfico.

Base de dados Ribossomal Database Project

Onde est depositada uma coleco de mais de
850 000 sequncias de 16S rRNAs de Archaea e Bacteria
dados de Maio 2009).

Comparao:
1 vs. 2 3 diferenas;
1 vs. 3 2 diferenas;
2 vs. 3 4 diferenas

Algoritmo comparaes e
clculo de distncias evolutivas

http://rdp.cme.msu.edu/

Michigam State University

- Filogenia molecular / biologia evolutiva

- Identificao de bactrias
- Caracterizao de populaes bacterianas
- Compreenso da biodiversidade e da
ecologia bacteriana

Sequncias assinatura no rRNA

sequncias curtas de nucelotdeos que ocorrem na maior parte ou em todos
os membros de um grupo filogentico

nicas podem servir de diagnstico de um organismo particular ou de
um grupo de organismos particulares;

Por exemplo, so conhecidas:

+ conservadas

- Sequncias assinatura especficas para cada um dos trs domnios

(i.e., so conservadas no rRNA de todas as espcies de cada um dos
domnios);
- Sequncias assinatura que definem um grupo de organismos dentro de 1
domnio (so conservadas entre todos os gneros e espcies desse grupo);

+ variveis

- Sequncias assinatura que esto presentes nos organismos

pertencentes a um certo gnero ou a uma certa espcie (p.ex., so mais
variveis, isto , diferem entre os organismos de grupo mais amplo )


O conhecimento sobre sequncias assinatura especficas pode ser usado para gerar
sondas filogenticas teis no dignstico de microrganismos ou na anlise de
comunidades microbianas
(Ex. tcnica FISH Fluorescent in situ hybridization).

SEQUNCIAS ASSINATURA SO A BASE PARA A IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS

ATRAVS DE:
- COMPARAO DA SEQUNCIA DE NUCLEOTDEOS EM REGIES DO rRNA QUE
SEJAM ESPECFICAS PARA MICRORGANISMOS PARTICULARES (p.ex. comparao

com sequncias de rRNA depositadas em bases de dados p.ex. Ribossomal

Database Project)
- RECURSO A SONDAS FILOGENTICAS (Ex. tcnica FISH)

SONDA DE CIDO NUCLEICO

Fragmento de cido nucleico, em cadeia simples, que pode ser marcado (labelled),
com Fsforo radioactivo ou com molcula fluorescente, e usado para hibridar
(emparelhar) com sequncia complementar de cido nucleico numa mistura
(p.ex. molculas de cidos nucleicos de uma populao mista de microrganismos
em amostra de alimento, ambiental ou clnica).
Permite deste modo identificar de forma especfica a presena de um
microrganismo especfico que contenha essa sequncia-diagnstico.

Fluorescent in situ Hybridization (FISH) na

deteco e identificao de microrganismos especficos
(NO requere que os microrganismos sejam cultivados em cultura pura)

+
Sonda filogentica
marcada com fluorocromo
16S rRNA procariotas
18S rRNA - eucariotas

Clulas
(amostra com
populao mista)

Ribossomas

Microscpio de
fluorescncia
Observao da fluorescncia
emitida pelas clulas
(emparelhamento entre
sonda e rRNA)

Exemplo uso de sondas filogenticas

para detectar a presena de bactrias especficas
em grnulo de lama activada tratamento biolgico de efluentes

Classificao de Procariotas
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology
Manual que contm descries de todas as espcies bacterianas identificadas.

1 Edio (1 volume em 1984)

- Classificao fentica
2 Edio (desde 2001)
- usa classificao filogentica

Domnio Bacteria
Metablica e morfologicamente diversos
Divididos em 23 filos (phyla)

Domnio Archaea
halobactrias

2 phyla
8 classes
12 ordens
metanognicos

termoflicos