Sunteți pe pagina 1din 29

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

EXPERTIZA FILIATIEI

Motive de solicitare a expertizei filiatiei Cauze civile: stabilirea filiatiei fata de mama, fata de tata (paternitate). Cauze penale: incest, viol.

Expertiza medico-legala a filiatiei parcurge mai multe etape de investigare succesive:

-serologica

-dactiloscopica

-antropologica

-profil ADN

Filiatia fata de tata: se solicita atunci cind se constata neconcordanta intre tatal biologic si cel juridic.

Tagada paternitatii (pentru copilul nascut in interiorul casatoriei): in termen

de 6 luni de la aflarea stirii: Actiune introdusa de tata impotriva copilului. Se pleacã de la urmãtoarele prezumtii legale de paternitate:

- copilul nãscut în cursul cãsãtoriei are ca tatã pe sotul legitim al mamei, si

- copilul nãscut la cel mult 300 de zile dupã desfacerea, anularea sau declararea

nulitãtii cãsãtoriei, are ca tatã pe fostul sot, dacã a fost conceput în timpul cãsãtoriei si dacã în acest interval de timp mama nu a contractat o nouã cãsãtorie.

Stabilirea paternitatii copilului nascut in afara casatoriei: in termen de 1 an de

la nasterea copilului. Actiune introdusa de mama in numele copilului impotriva tatalui. Un barbat poate fi exclus de la paternitate in 2 cazuri:

1. identificarea unei proteine la copil care lipseste atit de la mama cit si de la tatal in

cauza (ex. copilul A, parintii O).

2. stabilirea faptului ca lipsesc la copil genele ce ar fi trebuit sa fie prezente prin

transmisie de la tatal in cauza. Posibilitati:

2a.cind tatal e homozigot pentru o gena care nu apare la copil (ex. in sistemul Rh tatal CC si copilul cc) 2b.heterozigot pentru gene care nu sint prezente la copil (tata AB, copil O). Excluderile in baza 1 si 2a se numesc de prim ordin (directe) in timp ce acelea pe baza 2a de ordin secund (indirecte) si aceasta intrucit starea de homozigot nu este decelabila neechivoc ci este o presupunere. In mod uzual barbatul se exclude de la paternitate si nu i se confirma paternitatea.

Axiomatic daca o femeie este singura pe o insula cu 10 barbati din care 9 se exclud, cel de-al 10-lea va fi declarat tatal copilului ce se va naste chiar el daca nu este confirmat.

o Filiatia fata de mama: se solicita atunci cind copilul nu are certificat de

nastere (nerecunoscut/nedeclarat/neinregistrat de catre mama), cind a fost pierdut/abandonat sau schimbat/furat. Actiunea o introduce copilul in numele sau impotriva mamei.

Legile transmiterii ereditatii

Legile Bernstein:

-un antigen poate apare la copil NUMAI DACA este prezent la unul dintre parinti. -daca un individ este homozigot pentru un antigen (ex. AA) acesta TREBUIE sa apara la TOTI descendentii lui. Legile Lang:

- la progenii din prima generatie se manifestã NUMAI CARACTERUL DOMINANT (uniformitatea hibrizilor din prima generatie);

- în a doua generatie apar si caracterele parentale recesive, care au fost estompate de efectele genelor dominante în prima generatie. Legile Mendel:

Legea puritãtii gametilor (legea segregãrii caracterelor) se referã la un cuplu de gene, adicã la douã trãsãturi contrastante ale aceluiasi caracter (trãsãturi allelomorfe). Alelele unui cuplu de gene provenite de la parentali nu se amestecã la progeni. La parentali ele se gãsesc în relatii de alelism, dar la progeni se segregã. În acest fel este posibil ca alelele recesive sã aparã în dozã dublã la

198

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

progeni si astfel sã se manifeste fenotipic. Aceasta permite enuntarea urmãtoarelor principii de bazã:

MM

+ MM = MM 100%

MM

+ NN = MN 100%

MM

+ MN = MM 50% + MN 50%

MN

+ MN = MM 25% + MN 50% + NN 25%

Legea asortãrii (segregãrii independente a caracterelor) se referã la mai multe cupluri de gene. Conform acestei legi, transmiterea la progeni a trãsãturilor allelomorfe apartinând la douã sau mai multe caractere are loc pentru fiecare caracter în parte (independent unul de celãlalt). Astfel, progenul va primi douã alele pentru fiecare caracter, câte una de la fiecare parental. Mostenirea trãsãturilor se face în functie de hazard (de exemplu, se pot mosteni numai alele dominante sau numai alele recesive, sau numai o alelã dominantã si o alelã recesivã).

Clasificarea sistemelor serologice folosite in filiatie -Sisteme antigenice eritrocitare

Grupe de singe majore: ABOH, Rh, MNSs

Grupe de singe minore: Kidd-Cellano, Lutheran, Duffy, Lewis, etc.

-Sisteme enzimatice eritrocitare: creatinkinaza, fosfogluco-mutaza, esteraza D, fosfataza acida eritrocitara, glucozo 6 fosfat dehidrogenaza, adenilat kinaza, glutamat priuvat transaminaza, adenozindeaminaza, 6-fosfo gluconat dehidrogenza, pseudocolin- esteraza 1 , etc. -Sisteme ale unor proteine serice: haptoglobinele (2 globulina 2 cu 3 forme fenotipice I-I, 2-1, 2-2), grup specific component, hemoglobina, etc. -Sistemul HLA -Alte sisteme: secretor/nesecretor, gustator/negustator

-ADN

Expresia fenotipicã a unei gene se numeste marker genetic. Ea se exprimã sub

formã de calitãti biochimice, imunologice si morfologice. Calitãtile biochimice si imunologice sunt determinate de o singurã genã, pe când cele morfologice sunt poligenice, determinate de mai multe gene, situate pe loci diferiti. Orice sistem folosit in stabilirea filiatiei (marker genetic) trebuie sa aiba 3 caractere:

transmitere mendeliana

prezente de la nastere

stabilitate pe parcursul vietii

Sansele de excludere in sistemele serologice pot fi sistematizate astfel:

SISTEME

% sanse excludere (Boorman K. 1985)

% sanse excludere (KnightB. 1991)

Sisteme ale antigenelor eritrocitare

   

MNSs

32.1

32.1

Rh

28.0

28.0

Kidd

18.7

4.5

Duffy

18.3

4.8

ABO

17.6

17.6

Kell

4.5

3.3

Lutheran

3.7

3.3

Sisteme proteine serice

   

GSC

30.2

14.5

Hp (haptoglobina)

18.1

17.5

PLG (plasminogen)

16.3

-

TF (transferina)

15.4

-

Pi (1-antitripsina)

25.6

-

C3

-

14.2

Gm

-

6.5

1 Pseudocolinesteraza este prezenta in ser spre deosebire de colinesteraza adevarata care se afla in eritrocit si jonctiunile neuromusculare.

2 Haptoglobina are ca scop eliminarea din organism a pigmentilor de uzura hemoglobinici si a altor reziduuri.

199

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Sisteme enzimatice eritrocitare

   

PGM (fosfoglucomutaza)

31.1

14.5

EAP (fosfataza acida eritrocitara)

23.4

21.0

GLO (glioxilaza)

18.7

18.4

EsD (esteraza D)

9.7

9.0

ADA (adenozin deaminaza)

4.5

4.5

AK (adenilatkinaza)

3.7

4.5

GPT (glutamat priruvat transaminaza)

-

19.0

6-Fosfogluconatdehidrogenaza (6-GPD)

-

2.5

Subtotal 1

97.3

93.0

HLA

90

90

Subtotal 2

99.6

99.0

ADN

   

Total

99,9

99,9

Tabelul de mai sus semnifica faptul ca daca ar fi testati 100 de barbati ce nu sint tati ai copiilor in discutie la 97 dintre ei se poate face excluderea subtotal 1- (prin includerea sistemului HLA un estimat conservativ ofera o sansa de excludere de circa 99% -subtotal 2). Prin introducerea tipajului ADN se poate obtine o sansa de excludere de 99.9% -total-.

Transmiterea caracterelor de grup in sistemul ABO. Descoperit de Landsteiner in 1901 (antigenele A, B) la care in 1902 a adaugat descoperirea AB. Antigenele apar pe eritrocit incepind cu luna 4 de viata intrauterina dar titrul anticorpilor anti-A si anti-B stabil si elevat apare numai la 3-6 luni de la nastere. Caracterele ABO sint mostenite prin intermediul a 3 gene alelice 3 numite A,B si O. Gena O se considera “tacuta” (mutã) intrucit nu are antigen pe suprafata eritrocitului si nu existã antiser care sã o evidentieze; ea se manifestã fenotipic numai dacã se aflã în dozã dublã la ambii pãrinti;

Fiecare individ are in total 2 cromozomi ce poartea alele A,B sau O, cite un cromozom de la fiecare parinte. Rezulta fenotipic 4 grupe ABO, adica grupul A (fenotip A:

genotip AA-homozigot-, genotip AO-heterozigot-), grup B (fenotip B-BB, BO-), grup O (fenotip O: genotip OO -homozigot-), si grup AB (fenotip AB: genotip AB-heterozigot-).

Presupunind ca un parinte este grup A (genotip posibil AA, AO) si celalalt este grup B (genotip posibil BB, BO) exista 4 posibile

Fenotip

Genotip

A

AA

AO

B

BB

BO

O

OO

AB

AB

Fenotipurile ABO si genotipurile lor corespunzatoare

AA x BB

AB (obligatoriu)

AA x BO

AB, AO

AO

x BB

AB, BO

AO x BO

AB, A, BO, OO

PARINTI

 

COPII

Fenotip

Genotipuri

Genotipuri

Fenotipuri

A

x A

AA x AA

AA

 
 

AA x AO

AA si AO

A si O

AO x AO

AA, AO si OO

A

x B

AA x BB

AB

 
 

AA x BO

AB si AO

AO x BB

AB, BO

A, B, AB, O

AO x BO

AB, AO, BO, AB

A

x AB

AA x AB

AA, AB

A, B, AB

 

AO x AB

AA, AB, AO, BO

A

x O

AA x OO

AO

A, O

 

AO x OO

AO, OO

B

x B

BB x BB

BB

 
 

BB x BO

BB, BO

B, O

BO x BO

BB, BO, OO

B

x AB

BB x AB

AB, BB

A, B, AB

 

BO x AB

AB, BB, AO, BO

B

x O

BB x OO

BO

B, O

 

BO x OO

BO, OO

AB x AB

AB x AB

AA, AB, BB

A, B, AB

AB x O

AB x OO

AO x BO

A, B

O

x O

OO x OO

OO

O

combinatii genotipale AA x BB, AA x BO, AO x BB, AO x BO. Toate posibilitatile ce rezulta din amestecul grupelor ABO sint prezentate in tabelul de mai jos. Exista 10 combinatii fenotipice parentale ce determina din 21 de combinatii posibile genotipale; combinatia care genereaza toate optiunile este AO x BO.

Nu intotdeauna este posibila determinarea genotipurilor cuprinse in tabelul alaturat.

3 Alele, gene alelice= una, doua sau mai multe gene care determina caractere alternative si care sint localizate la acelasi locus pe cromozomi omologi.

200

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

O privire de ansamblu asupra posibilitatilor/ imposibilitatilor ce rezulta arata:

Ca o consecinta a legii 1 a lui Bernstein enuntata mai sus, copiii de grup AB nu pot proveni din doi parinti grup 0 si reciproc. Mai putem adauga faptul ca mama unui copil AB nu poate fi niciodatã de grup O si invers, iar grupa tatãlui nici nu se mai ia în discutie (situatie întâlnitã la schimburile de copii în maternitãti).

Parinti

copii posibili

grupuri imposibile

O

x O

O

A, B, AB

O

x A

O,

A

B,

AB

O

x B

O,

B

A,

AB

A

x A

O,

A

B,

AB

A

x B

O,

A,

B,

AB

-

B

x B

O,

B

A,

AB

O x AB

A,

B

O,

AB

A x AB

A,

B,

AB

O

B

x AB

A,

B,

AB

O

AB x AB

A,

B,

AB

O

in considerare subgrupele A,

(A 1 ,A 2 ,A 3 ,A x ,A end ,A m ,A el ), remarcam ca cele mai puternice sint A 1 si A 2 (A 1 detine intre 800.000-900.000 situri de fixare fata de A 2 160.000-440.000 sau A3 70.000-100.000, …, A el 100-400) la care A 1 dominant fata de A 2 , ambele codominante fatã de B, iar O recesiv fatã de toate trei, se mai adauga urmatoarele posibilitati:

Daca

luam

In total rezulta 21 posibile combinatii fenotipice. De exemplu din grupele A 1 x B poate rezulta:

Genotipuri

Fenotipuri posibile la copil

posibile

A 1 A 1 x BB

A 1 B

A 1 A 1 x BO

A 1 B,A 1

A 1 O x BB

A 1 B,B

A 1 O x BO

A 1 ,B,A 1 B,O

A 1 A 2 x BB

A 1 B, A 2 B

A 1 A 2 x BO

A 1 ,A 2 ,A 1 B,A 2 B

Grup (fenotip)

genotip

 

A 1 A 1

A 1

A 1 O

A 1 A 2

 

A 2 A 2

A 2

A 2 O

 

BB

B

BO

O

OO

A 1 B

A 1 B

A 2 B

A 2 B

Antigenul A 2 poate apare la un copil la care unul din pãrinti este fenotipic A 1 , dacã cuplurile parentale sunt genotipicE: fie A 1 A 2 x A 1 O, fie A 1 A 2 x A 1 A 2 , dar nu si dacã cuplul parental este A 1 A 1 x A 1 A 2 . În cazuri rare, gena H lipseste (genotip Hh) si desi substanta precursor exista nu se formeazã substante antigenice desi genele ABO sunt prezente. În schimb, aglutininele anti A, B, H sunt prezente. Aceastã particularitate corespunde fenotipului Bombay (Ch). Himerismul este o stare geneticã rar întâlnitã la gemenii la care, datorita unor posibile anastomoze vasculare, celulele deriva nu numai dintr-o singura linie zigotica distincta. Astfel ei pot primi un implant de maduva osoasa unul de la celalat si astfel sa prezinte un grup sanguin majoritar (ex. O in prorportie de 61%) si un alt grup sanguin minoritar (ex. A in proportie de 39%). Acest lucru este posibil si hemoliza in vivo nu apare datorita tolerantei imunitare pe care o manifesta organismul fata de antigenele dobindite inainte de nastere. Pina in 1985 se cunoasteau 32 de cazuri de himere. Problema cea mai complicata este sa se determine genotipul majoritar. Acest aspect poate fi realizat prin determinarea grupului in saliva daca este secretor. Astfel intr-un caz prezenta antigen H in saliva si antigen A in singe: genotipul majoritar era de grup O. Un alt aspect interesant este faptul ca himerele secretoare pot secreta doar antigenele de grup care sint parte ale constitutiei lor genetice. Determinarea grupelor de singe in petele vechi nu se poate efectua prin teste de aglutinare intrucit eritrocitele sint lizate, prin metoda inhibitiei rezultatele sint inconstante, incit metoda elutiei ramine cea mai buna. Dupa absorbtia anticorpului pe materialul de testat se produce elutia permitindu-se ca sa se obtina reactii pozitive la o cantitate de doar 0,5-1% eritrocite (1 singur fir de material de 2-5 mm lungime). Selectia speciala a antiserului folosit este insa esentiala. Activitatea antigenica in eritrocitele vechi scade imediat si se prelungeste citiva ani (maxim 14 ani dupa unele relatari). Petele uscate rapid pastreaza activitatea mai mult timp decit cele ce ramin mai mult timp umede (bacteriile prolifereaza in mediu umed ceea ce poate induce reactii fal pozitive sau negative). M si N sint mai labili decit A si B. Exista si o reactivitate incrucisata intre anti-N si M. Rh, Fy, K, S, s sint detectabili citeva luni.

201

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Enzimele eritrocitare se denatureaza mai rapid decit antigenele eritrocitare (in citeva luni). Haptoglobinele, antigenele Gm si Km isi pastreaza activitatea citeva luni.

Sistemul secretor Grupele de singe ABO pot fi detectate nu numai pe suprafata eritrocitului ci si in alte

tesuturi cit si in secretii (ser, saliva, sucuri gastrice, chisturi ovariene, sperma, fluid amiotic

si mai putin in sudoare, urina, lacrimi, bila si lapte uman). Circa 76% din populatie este secretor pozitiva: acest contingent secreta in afara

secretiei antigenelor grupelor de singe ABO si unele substante specifice. S-a stabilit ca secretia substantelor specifice este controlata de catre o pereche de alele Se si se. Indivizii pot fi homozigoti SeSe, heterozigoti Sese si homozigoti sese. Cei care detin alela Se sint secretori. Aceste persoane secreta 2 substante distincte in secretiile amintite in afara antigenelor de grup ABO: un glicolipid alcool-solubil (prezent pe suprafata eritrocitului, in aproape toate celelalte tesuturi dar absent din secretii) si o glicoproteina hidrosolubila (aflata in toate secretiile). Astfel secretorii grupelor ABO au in saliva in afara de antigenele

A si B si antigenul H (secretate ca glicoproteine hidrosolubile in glandele mucoase).

Serurile care contin aglutinina anti H aglutineazã mai puternic hematiile de grup O, mai slab pe cele de grup A 2 , si cel mai slab pe cele ale grupelor A 1 si A 1 B;

De fapt substantele specifice pot fi detectate prin tehnici specifice si sensibile la toti oamenii: chiar si nesecretorii arata in urma tehnicilor de elutie reactii slab pozitive. Pentru determinarea grupelor de singe din alte fluide decit singele trebuie folosite in paralel tehnici de elutie si de inhibitie si numai in cazul rezultatului identic , rezultatul se poate considera corect. Nu trebuie uitat ca bacteriile tind sa se multiplice cu precadere in saliva si fluidul seminal cel putin comparativ cu singele (E.Coli poate fi cauza unui B fals pozitiv si mai putin a unui A fals pozitiv). La nesecretorii la care testele de inhibitie nu pot fi aplicate singurul test util este elutia dar in acest caz rezultatele trebuie interpretate cu retinere. Trebuie avut in vedere si posibilitatea amestecului se fluide biologice (singe si saliva, fluid seminal si vaginal). De exemplu tipajul unui grup A secretor pe haine la o femeie violata poate exonera un violator

O secretor (in acest caz A poate veni din transpiratie sau fluid vaginal).

Tipajul grupului pe tamponul de secretie dupa un contact sexual poate fi util daca se cunoaste grupul femeii si mai ales daca acesta este O (daca este AB nu se pot deduce informatii pertinente). Tipajul grupelor pe fragmente de muschi sau de alt tesut se face prin tehnici de inhibitie si elutie. Necesita curatirea tesutului in metilalcool si eter pentru a indeparta substantele grase. Nu trebuie uitata ca E.Coli poate crea reactii fals pozitive mai ales la B si mai putin la A, ceea ce poate sa apara mai ales la cadavre aflate in submersie. Tipajul grupelor de pe piele, unghii si par se poate realiza prin inhibitie elutie si aglutinare mixta. Circa 78% din populatia generala sint Lewis negativi (genotip le), 22% Lewis + (genotip Le). Genele Lele si Sese se segrega separat, incit numarul secretorilor este cam acelasi cu cel al celor Lewis - (cei care sint Le a + nu secreta substante A,B,H). Le b nu este produsa de o gena separata ci rezulta din interactiunea dintre Le a si

genele H. De fapt grupul Lewis nu este eritrocitar ci seric, iar daca in ser cantitatea de substante antigenice este foarte mare atunci o parte se fixeaza suplimentar si pe eritrocit. Grupul contine glicosfingolipide in plasma si secreta glicoproteine in saliva. Posibilele fenotipuri sint prezentate mai jos, corelat cu substantele ce se secreta in fiecare caz in saliva acestora.

Fenotip saliva

Continut saliva

Gene prezente

Le (a-b+): secretori

H,Le b ,putin Le a

H,Se,Le

Le (a+b-): nesecretori

Mult Le a , deloc Le b sau H, putin Le c

H,se,Le

Le(a-b-): homozigoti lele, secretori

H, deloc Le a sau Le b , putin Le c

H,Se,le

Le (a-b-): homozigoti lele, nesecretori

Deloc H, Le a si Le b , putin Le c

H,se,le

Exista si anticorpi Lewis anti-Le a si

anti-Le b care de obicei

apar impreuna si

aglutineaza eritrocitele, dar nu in asa masura incit sa determine hemoliza la nou nascuti.

202

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Sistemul Rh Descoperit in 1940 de catre Landsteiner si Wiener. Ei au imunizat porci de guinea si iepuri cu singe de la Maccacus Rhesus si au obtinut un antiser care aglutina nu numai eritrocitele de Maccacus ci si pe cele ale circa 80-85% din populatia umana a New York-ului. Astfel au realizat ca au descoperit un nou grup de singe. Antigenele Rh apar în prima lunã de viatã intrauterinã, independent de celelalte sisteme. Aglutininele naturale anti Rh apar numai prin izoimunizare (transfuzii cu sânge Rh pozitiv la persoane Rh negative sau la mame Rh negative imunizate prin sarcini de produsul de conceptie Rh pozitiv). Sistemul Rh are 3 perechi de gene alelice Cc, Dd, Ee pe cromozomul 1: pe locusul 1 sunt localizate alelele Dd, pe locusul 2 sunt localizate alelele Cc si pe locusul 3 alelele Ee. Astfel, pe cromozomul 1 se aflã câte un membru din fiecare pereche, un locus putând fi ocupat de una sau alta din cele douã alele pereche. Genotipul este format din cele douã grupuri de câte trei factori antigenici (mosteniti de la mamã si de la tatã), care se transmit în bloc.

Caracterele dupã care se transmit factorii Rh sunt:

- caracterul antitetic prin care se întelege cã lipsa unui factor impune prezenta

celuilalt factor din aceeasi pereche; prezenta unuia din factori nu exclude prezenta celuilalt

din aceeasi pereche (de exemplu Cc);

- caracterul alelomorf conform cãruia dacã un parental are ambii factori ai unei

perechi, la descedent se transmite totdeauna numai unul din ei;

- fiecare individ are obligatoriu cel putin un factor din fiecare pereche (deci acesti

factori se transmit egal de la fiecare parental).

Rezulta 8 posibile haplotipuri: Cde, cDE, cDe, CDE, Cde, cdE, CdE, cde, 18 posibile

fenotipuri si 36 de genotipuri (dintre care 10 sint negative: cde/cde/, Cde/cde, Cde/Cde, Cde/cdE, Cde/CdE, cdE/cde, cdE/cdE, cdE/CdE, CdE/cde, CdE/CdE). Toate variantele in care

Toti acestia cu

genotipuri negative pot induce aparitia de anticorpi anti.D daca sint stimulati cu antigen D si

trebuie sa primeasca singe Rh negativ sau din genotipul propriu. Persoanele Rh (D)+ pot fi homozigote (D/D) sau heterozigote (D/d), pe când persoanele Rh (d)- nu pot fi decât homozigote (d/d). Anticorpii anti-Rh pot distruge antigenele Rh (D).

apare alela D sint Rh pozitive Rh (D)+,; restul sint negative Rh (d)-

CDe cDE TATA CDe cde MAMA Sperma CDe cDE Ovul CDe cde (haplotip) Celulele CDe
CDe cDE
TATA
CDe cde
MAMA
Sperma
CDe
cDE
Ovul
CDe
cde
(haplotip)
Celulele
CDe CDe
CDe
cDE
CDe cde
DE cde
copiilor

Putem sintetiza prin urmatoarele:

- antigenul unui copil (ex. D) provine obligatoriu de la unul din pãrinti;

- din doi pãrinti Rh negativi rezultã obligatoriu un copil Rh negativ;

- din doi pãrinti heterozigoti rezultã copii heterozigoti;

- un copil heterozigot provine dintr-un pãrinte obligatoriu CDE, în caz contrar

învinuitul se exclude;

- dacã mama este decedatã, iar copilul în viatã este cc se exclude învinuitul CC;

- dacã mama si copilul sunt Rh +, tatãl nu are nici o sansã de excludere pe acest sistem deoarece poate fi DD sau Dd.

203

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Sistemul MnSs

Sistemul MN a fost identificat de Landsteiner si Levine (1927), fiind propriu omului prin cele douã gene alelomorfe si codominante MN. Antigenele apar în luna a doua de viatã intrauterinã, copiii în vârstã de 4-6 luni având acelasi titru ca si adultii. Anticorpii anti-M si antiN apar prin imunizare si sunt anticorpi de tip IgG complet. Grupul M apare in circa 28%, grupul N in 22% iar cel MN in 50%. Transmiterea se face dupã legile lui Mendel, adicã:

MM

+ MM = MM 100%

MM

+ NN = MN 100%

MM

+ MN = MM 50% + MN 50%

MN

+ MN = MM 25% + MN 50% + NN 25%

Nu s-au constatat decit extrem de rare si neimportante izoimunizari la antigenele M,N la nou nascut sau posttransfuzional. Ulterior, Walsh si Montgomery (1947) identificã sistemul Ss în care alela S este dominantã, iar alela s este recesivã. Locii MN si Ss ocupã pozitii adiacente pe cromozomul 4 si de aceea se transmit împreunã. Anticorpii Ss sunt numai de tip imun, apãrând consecutiv transfuziilor sau în urma sarcinilor. Ei sunt anticorpi de tip incomplet IgG. Exista genotipurile SS, Ss, si ss cu o frecventa de aparitie fenotipica de 11%, 44% si respectiv 45%. Spre deosebire de anti-M si anti-N, anti -S si anti-s fiind active la 37 0 C aglutineaza eritrocitele in proportie de 55% (anti-S) si 89% (anti-s) si sint responsabile atit de manifestari hemolitice posttransfuzionale cit si dupa nastere.

Anti-M

anti-N

anti-S

anti-s

fenotip

genotip

+

-

+

+

MSs

MSMs

+

-

+

-

MS

MSMS

+

-

-

+

Ms

MsMs

+

+

+

+

MNSs

MSNs, MsNS

+

+

+

-

MNS

MSNS

+

+

-

+

MNs

MsNs

-

+

+

+

NSs

NSNs

-

+

+

-

NS

NSNS

-

+

-

+

Ns

NsNs

Gentotipurile si fenotipurile sistemului MNSs

Putem sintetiza prin:

Ss

poliformism

Astfel,

existã gene complexe: MS, Ms,

Antigenele

prezintã

un

semnificativ

de

MN,

rasã.

NS,

Ns.

Sistemul

MNSs

este

considerat

ca

fiind

cel

mai

eficient în expertiza filiatiei.

- dacã ambii pãrinti sunt homozigoti de acelasi fel rezultã numai copii homozigoti de acelasi fel;

- dacã ambii pãrinti sunt heterozigoti, pentru învinuit nu existã nici o sansã de excludere;

- învinuitii MN nu au nici o sansã de excludere;

- antigenele M si N nu pot apare la un copil dacã nu existã la cel putin unul din

pãrinti;

- dacã un copil este NN (MM) iar pãrintii NN, MN se exclude tatãl MM (respectiv NN);

- mama MM (sau NN)

nu poate avea un copil NN (respectiv MM)

indiferent de

fenotipul tatãlui.

Alte sisteme eritrocitare Sistemul Kell-Cellano (Coombs et.al. 1940). Initial, s-a crezut cã este format numai din doi factori: Kell (în functie de care persoanele se diferentiazã în K+ si K-) si Cellano (k, în functie de care persoanele se diferentiazã în k+ si k-), cei doi factori fiind alelomorfi si antitetici. Antigenul K se transmite dominant si autosomal. Kell pozitiv cu genotipuri KK circa 0.2% si Kk circa 10% populatie si Kell negativ cu genotip kk in circa

90%.

Pe acelasi locus s-au evidentiat ulterior circa 20 alele care dirijeazã si sinteza altor factori apartinând aceluiasi sistem. Prin analogie cu sistemul Rh, în sistemul Kell-Cellano antigenul pare a fi sub controlul unor gene strâns linkate, factorul K fiind comparat ca putere antigenicã cu factorul D. În practica filiatiei se foloseste sistemul Kk, dar sistemul în sine nu este considerat suficient de selectiv.

204

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Sistemul Duffy (Cutbush & Chanarin 1950). Initial s-a descoperit antigenul Fy a (Duffy +) determint de alela Fy a la circa 65%. Anti-Fy s-au dovedit a putea induce reactii hemolitice letale. Ulterior s-a identificat si antigenul Fy b (alela Fy b ) al caror anticorpi nu induce reactii hemolitice cunoscute.

Fenotip

genotip

rata aparitie

Fy (a+b-)

Fy a Fy a

17%

Fy (a+b+)

Fy a Fy b

49%

Fy(a-b+)

Fy b Fy b

34%

Ulterior s-a identificat si fenotipul Fy (a-b-), alela Fy foarte frecvent la negri si rar la albi. Astazi se stie ca exista 2 tipuri de Fy unul (Fy) comun pentru negrii (negrii africani 90%, negrii New-York-ezi 80% si sub 3% la

europeni) iar celalat Fy x la populatia albã. Fenotipul Fy (a-b-) mai apre si la yemenitii evrei in timp ce la japonezi. Coreeni si eschimosi se intilneste o mare frecventa a alelei Fy a . Fenotipul Fy (a-b-), caracteristic negrilor, prezintã alela Fyo, în locul alelei Fy a Fy b . Persoanele cu un astfel de fenotip nu formeazã anticorpi anti Duffy dupã transfuziile cu sânge având hematii Fy a sau Fy b . La populatia albã genotipul FyFy este foarte rar. Atunci când el este prezent apar anticorpi anti-Fy3 dupã transfuziile cu sânge continând hematii Fy a si Fy b . Aceasta constituie diferenta geneticã principala între cele douã populatii. Se pare cã frecventa mare a factorului Fy la negri s-ar datora expunerii in timp a generatiilor la malarie. În acest sens, s-

Fenotipurile si genotipurile Duffy

a arãtat cã antigenele Duffy sunt receptori pentru Plasmodium vivax, spre deosebire de hematiile Fy (a-b-). De asemenea s-au mai evidentiat antigenele Fy3, Fy4, Fy5, al cãror rol în paternitate nu a fost stabilit.

Sistemul Kidd (Allen, 1951). Antigenul este Jk a iar anticorpul anti-Jk a potential

hemolitic. Fenotipurile si genotipurile cunoscute sint:

Din analiza genetica rezulta ca genotipic Jk a poate fi atât homozigot cât si heterozigot, pe când Jk b este exclusiv homozigot.

Fenotip

genotip

rata aparitie

Jk (a+b-)

Jk a Jk a

26%

Jk (a+b+)

Jk a Jk b

50%

Jk (a-b+)

Jk b Jk b

24%

Sistemul Lutheran (Callender&Race, 1946). Gena acestui sistem este localizatã pe cromozomul 19, prezentând douã alele: Lu a si Lu b . Lu a se transmite dominant autosomal (Lutheran +).

Fenotip

genotip

rata aparitie

Lu (a+b+)

Lu a Lu b

8%

Lu (a+b-)

Lu a Lu a

0.2%

Lu (a-b+)

Lu b Lu b

92%

Fenotipurile si genotipurile în sistemul Lutheran:

Din analiza genetica rezulta ca genotipic Lu a poate fi atât homozigot cât si heterozigot, pe când Lu b

este exclusiv homozigot. Ca fenotipuri rare în acest sistem s-au mai descris Lu4, Lu5 Lu20,

precum si Lu (a- b-). Anticorpii anti Lu (a) sunt de tip naturali (evidentiabili în mediul salin) si de tip imun (evidentiabili prin testul antiglobulinic).

Grupele sanguine in determinarea diferentierilor de rasa

1.

Exista cel putin 4 forme de hemoglobine:

o

hemoglobina A (tipul normal al adultului alb)

o

F (tipul fetal)

o

S (10-15% din adultul negru)

o

C (3% din adultul negru)

Forma S este patologica (homozigotul SS preznta anemie falciforma). Caracteristica

S este recesiva fata de forma A incit nu este posibila diferentierea uzuala intre A si AS. Antigenele Kell se regasesc numai la albi, in tip ce antigenele Duffy la 90% din negrii vest africani. Animalele au propriile lor grupe de singe, diferite de cele ale omului.

2. Sistemul Duffy pentru rasa negroida (vezi mai sus) si alte populatii.

Imunizarea ca raspuns la antigenele grupelor de singe Cele mai antigenice sint considerate proteinele A,B, si Rh.

205

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Imunizarea Rh

In urma administrarii de singe:

O prima administrare a circa 500ml singe Rh pozitiv la o persoana Rh negativ induce cu probabilitate de 50% izoimunizare in urmatoarele 2-6 luni. Circa 1/3 dintre cei Rh negativi insa sint “rezistenti” (non-raspunzatori) si nu pot

forma anticorpi anti-D. Altii insa desi nu formeaza anticorpi detectabili au fost totusi imunizati, ceea ce se poate dovedi prin prezenta bolii hemolitice la noul lor nascut.

Prin sarcina:

Este o metoda naturala de izoimunizare care produce anticorpi anti-D evidentiabili la dfirsitul nasterii la circa 2% dintre mame in conditiile in care fatul Rh pozitiv singereaza pe timpul graviditatii. La circa 6 luni de la nastere procentul de detectie a anticorpilor creste la 7% dintre mame (explicatia consta in trecerea in circulatia materna a unor cantitati de singe fetal uzual circa 10ml- cu ocazia hemoragiilor transplacentare); cu cit singele fetal trece in cantitate mai mare cu atit raspunsul imunologic va fi mai intens (initial cu IgM si apoi cu IgG). Amniocentezaa, cezariana extragerea manuala a placentei cresc riscul aparitiei si concentratia anticorpilor anti-D cu ocazia celi de-a doua nasteri insa chiar mici cantitati de singe fetal pot initia un raspuns imunologic intens cu producerea bolii hemolitice a noului nascut.

In mod surprinzator atunci cind exista si incompatibilitate de grup sanguin intre mama Rh - si fatul Rh+, imunizarea Rh prin sarcina este mai putin apta de a se produce. Imunizarea ABO In sistemul ABO in contrast cu sistemul Rh, anticorpii anti-A si anti-B sint in mod uzual prezenti in ser in raport invers cu prezenta antigenului eritrocitar. Exista chiar o cantitate redusa de anticorpi omologi dezvoltati prin imunizare ca urmare a patrunderii in circulatie pe timpul vietii a antigenelor de grup sanguin A,B, H cu diferite ocazii (singele altor persoane, microorganisme, flora intestinala, particule de praf, etc.) incit o prima imunizare pare sa fie produsa cvasiconstant (raspuns cu IgM). Raspunsul in cazul administratii singelui incompatibil este cu dezvoltare de IgG incomplete incepind cu ziua 2-3 cu un maxim in ziua 10-14 si apoi cu un delin lent spre ziua 20. La aceasta se adauga detectia de hemolizine. Acestea din urma probeaza o imunizare de data recenta. Problema principala este diferentierea imunizarii naturale de imunizarea hemolitica, ceea ce se poate efectua cu eritrocite de porc ce prezinta antigene A-like numite Ap care se aglutineaza cu anti-A IgG hemolici si nu cu anti-A IgM naturali.

Sistemul limfocitar HLA În cadrul Complexului Major de Histocompatibilitate, sistemul HLA constituie cel mai cuprinzãtor sistem de antigene umane, mai ales cã acesta este prezent pe toate celulele nucleate, trombocite si chiar pe spermii. Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca antigene care determinã o reactie imunologicã la transplantul unui organ sau la transfuzia între douã organisme diferite din punct de vedere genetic. Genele MHC apartin familiei de gene imunoglobulinice, cu rol în recunoasterea atât a structurilor proprii cât si a celor strãine organismului. Proteinele codificate de ele au mare complexitate de atribute biologice, responsabilitatea lor în individualizarea geneticã a fiecãrei persoane fiind de importantã capitalã. Sistemul HLA este codificat de gene situate pe bratul scurt al cromozomului 6. Fiecare locus poate fi ocupat de mai multe alele. La nivelul acestui cromozom genele HLA- A, B, C si D au localizãri bine definite. Astfel: regiunea HLA - D situatã cãtre centromer codificã moleculele de clasa II-a si are trei loci denumiti DP, DQ si DR. Cãtre extremitatea telemericã sunt regiunile HLA-A, B si C, care codificã pentru moleculele de clasa I. Cele mai polimorfe sunt regiunile HLA-A si HLA-B cu 23 si respectiv 49 de haplotipuri. Un haplotip reprezintã un set de gene localizat pe un cromozom care au exprimare genotipicã unicã. Între HLA-D si HLA-B sunt situate genele care codificã pentru moleculele de clasa A III, adicã pentru cei doi, C II, C IV si factorul B al complementului. Transmiterea geneticã a antigenelor HLA urmeazã legile de transmitere mendeliene pe sistem codominant. Multitudinea de antigene situate pe fiecare locus si imensele posibilitãti de combinare ale acestora în haplotipuri explicã polimorfismul extrem al acestui sistem de antigene, neegalat de nici un alt sistem genetic uman.

206

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Pentru tipizarea serologicã a HLA se folosesc tehnici variate, cea mai utilizatã fiind metoda limfotoxicitãtii în prezenta complementului de iepure. Pentru stabilirea fiecãrui antigen sunt folosite mai multe seruri test. Studiul antigenelor HLA-A, B si C (clasa I) necesitã limfocite din sânge periferic, iar pentru evidentierea antigenelor HLA-DR, DP si DQ (clasa II) se folosesc doar limfocite B din sânge periferic. Pentru tiparea antigenelor HLA din clasa II-a se utilizeazã tehnici de biologie molecularã: RFLP, PCR, PCR-RFLP (ultima constând din asocierea metodelor amintite anterior, având la bazã caracterizarea polimorfismului de lungime al fragmentului de restrictie dupã amplificarea regiunii variabile).

Antigenele HLA sunt clar diferentiabile serologic unele de altele. Totusi, unele dintre ele prezintã asemãnãri datorate probabil unor structuri moleculare similare, fapt care poate duce la aparitia unor reactii încrucisate. De exemplu: o reactie încrucisatã destul de puternicã existã între antigenele HLA - A2 si A28, între A1, A3 si A11, între A9 si A10, precum si între subiectele din complexul A19 (A29, A30, A31, A32, A33).

În ceea ce priveste valoarea biologicã si clinicã a sistemului HLA, aceasta constã în special în transplantul de organe, de mãduvã osoasã în afectiunile hematologice, în problematica transfuziilor si în expertiza filiatiei. Astfel, sistemul HLA este cel mai important marker genetic. Pânã în prezent nu s-a identificat nici un alt sistem de markeri genetici care sã aibe un asemenea polimorfism într- un model genetic asa de bine definit. De asemenea, sistemul HLA este foarte util în studiile de geneticã umanã, studiile de evolutie si selectie a mecanismelor genetice, în caracterizarea populatiilor umane, în alcãtuirea hãrtilor cromozomiale, în studiul bolilor asociate si în studiul ereditãtii.

207

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

TESTELE ADN IN PRACTICA MEDICO-LEGALA

Motto:

“We used to say that our fate was in our stars. Now we know that, in large measure our fate is in our genes” James Watson genetician, Laureat al Premiului Nobel, co-descoperotor al structurii ADN

Toate conceptele clasice legate de identitatea biologica a indivizilor umani sunt în prezent revizuite şi abordate prin prisma noilor informaţii ştiinţifice aduse de genetica moleculara. Comunitatea medico-legala şi juridica nu părea pregatită în urma cu 10-15 ani să receptioneze şi, cu atât mai putin, sa utilizeze concepte noi de genetică moleculara, testele ADN fiind apanajul unor categorii restranse de specialisti. Problema schimbului de tehnologie si a principiilor de identificare a fost intens dezbatuta pe plan mondial in tot acest interval de timp, atat in mediile stiintifice medicale, cat si in cele juridice, nevoite deopotriva sa isi reconsidere o multitudinie din teoriile considerate “clasice”. Conservatorii stiintelor medico-legale au formulat critici severe referitoare la primele teste ADN, pe cand partizanii noilor tehnologii le-au aclamat si chiar le-au exagerat infailibilitatea. Prin 1990-1995, perioada in care multe servicii medico-legale din tarile avansate tehnologic se intrebau daca nu era cumva prematura sau hazardanta o schimbare a metodelor traditionale de identificare, testele ADN au servit doar la rezolvarea unor cazuri “problema”, pentru care metodele conventionale nu ofereau rezultate concludente. Pe masura validarii performantelor si robustetii sistemelor de markeri ADN, testele genetice au fost larg imbratisate de comunitatea stiintifica medico-legala din intreaga lume, tendinta care s-a accentuat mult in ultimii 5-6 ani, odata cu generalizarea metodologiilor PCR si a celor de detectie si secventiere automata. Ceea ce mulţi nu credeau cu putiinţă s-a realizat:

testele ADN au devenit într-un timp record instrumentul fără rival al investigatiilor medico- legale şi criminalistice. La toate acestea, a contribuit desigur intr-un mod decisiv si finalizarea in 2001 a proiectului Genomul Uman, care a generat o uimitoare cantitate de informatie stiintifica despre materialul ereditar al speciei noastre. In acest context, medicina legala moderna si-a definit in cadrul ei o noua disciplina - genetica medico-legala - axata in principal pe investigarea in scop de identificare a genotipurilor umane. Tehnologiile de analiza ADN in scop de identificare umana sunt in prezent acceptate fara exceptie in toate sistemele juridice din lume la rezolvarea unor cauze penale si civile.

Aplicatii in domeniul penal si militar

 

Aplicatii in domeniul civil

-

identificarea victimelor in omoruri si pruncucideri

-

cercetarea paternitatii

identificarea criminalilor dupa urmele lasate la locul faptei sau asupra victimelor

-

cercetarea maternitatii (schimburi accidentale de copii in maternitati, noi-nascuti abandonati sau pierduti, etc.)

-

- identificarea agresorilor sexuali

- rezolvarea cazurilor de imigratie (reintregirea familiilor )

- identificarea autorilor talhariilor si furturilor

- identificarea adoptiilor ilegale

trierea si excluderea suspectilor in diferite anchete politienesti

-

identificarea fetilor conceputi prin fertilizare in vitro sau a mamelor surogat

-

-

identificarea victimelor in accidente aviatice,

-

cercetarea unor relatii de inrudire biologica intre:

catastrofe naturale, acte de terorism, razboaie

bunici/unchi-nepoti, veri de grd.I-IV (pana la veri de grd. IV), etc.

elucidarea cauzelor unor accidente rutiere si aviatice pornind de la urmele biologice

-

stabilirea unor relatii de descendenta biologica in scopul aflarii adevarului istoric sau din interese politice

-

probabrea unor rapiri si sechestrari de persoane, a traficului ilegal de persoane si de organe umane

-

stabilirea unor relatii de inrudire la solicitarea societatilor de asigurare

-

-

probarea unor agresiuni fizice

incheierea unor polite de asigurare cu clauze de moarte violenta

-

Potentialul testelor ADN de a exclude suspectii intr-o ancheta politieneasca, mai ales in cazurile de viol sau omor, este un castig enorm daca il comparam cu performantele testelor conventionale serologice sau al amprentelor digitale.

Agresiuni sexuale. Ponderea identificarilor pentru agresorii sexuali este de departe cea

mai mare din totalul testelor ADN efectuate pentru diverse alte infractiuni in laboratoarele medico-legale 4 . In caz de viol testarea ADN permite identificarea cu

4 “Poate cea mai mare contributie a tehnologiei ADN in medicina legala a fost identificarea violatorilor”- Prof. J.J.Cassiman, seful Centrului de Genetica Umana a Universitatii din Leuven

208

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

certitudine a agresorului plecand de la celulele spermatice si vaginale existente pe un tampon vaginal. Profilul ADN al victimei se evidentiaza din celulele vaginale, in timp ce profilul agresorului se obtine prin analiza celulelor spermatice. Profilele obtinute sunt ulterior comparate cu profilele de referinta apartinand victimei si persoanelor aflate pe lista suspectilor.

Omor. In cazurile de omor testarea ADN se face pornind de la urmele biologice recoltate de la locul faptei sau de pe corpuri delicte: pete de sange, de saliva sau sperma, fire de par, microurme biologice de contact (celule epiteliale descuamate de pe tegumente la contactul cu diferite suprafete sau obiecte: maner usa, intrerupator lumina, instrumente, bani, etc.). Profilele ADN rezultate sunt comparate cu profilele de referinta obtinute de la suspecti in urma prelevarii unei probe biologice de referinta de de la acestia (sange sau saliva).

Accidente rutiere. In accidentele rutiere testele genetice pot servi la a demonstra implicarea unui vehicul intr-un accident rutier soldat cu victime umane atunci cand vehiculul implicat paraseste locul faptei. In aceste cazuri, profilele ADN evidentiate din urmele biologice recoltate de pe caroseria masinii sunt comparate cu profilul de referinta al victimei. Daca profilele corespund, atunci se poate stabili cu maxima certitutdine ca vehiculul respectiv a fost implicat intr-un accident.

Identificarea cadavrelor necunoscute. Este o problema ce survine frecvent in practica medico-legala. Pentru analiza genetica se folosesc atat tesuturi moi in diferite stadii de degradare, cat si tesut osos sau dentar. Amprenta genetica se poate efectua pe tesut osos sau dentar chiar si atunci cand au suferit o carbonizare partiala. Daca identitatea cadavrului este prezumata, solutia identificarii rezulta frecvent in urma cercetarii relatiei de inrudire biologica a persoanei a carei identitate este prezumata cu diferiti membri ai familiei.

Aplicatii in domeniul militar. Realizand performantele si importanta testelor ADN in identificarile de persoane, armatele SUA si statelor NATO au initiat incepand de la mijlocul anilor „90, programe ample de colectare de probe biologice pentru tipare ADN de la toti angajatii si militarii in termen, dupa modelul programului de colectare a amprentelor digitale initiat cu decenii in urma .

Cercetarea relatiilor de inrudire biologica. Reprezinta un domeniu in expansiune datorita dezvoltarii de tehnici performante de analiza genetica moleculara. In prezent, in Statele Unite aproximativ 250.000 de mii de cazuri de paternitate sunt rezolvate in

fiecare an cu ajutorul testelor ADN. Raportarile cumulate pentru Europa se situeaza cu aproximatie tot in jurul aceleiasi valori. Insa testele genetice efectuate in scopul stabilirii unui pedigree vizeaza in prezent si o multitudine de alte aspecte (vezi in tabel - aplicatii in domeniul civil). Autoritatile din statele vestice rezolva in prezent problemele legate de imigratie si de reintegrire a familiilor imigrantilor pornind exclusiv de la testele ADN.

*

Fiinta umana se dezvolta dintr-o celula ou, ce reuneste zestrea ereditara a celor doi parinti si reprezinta o configuratie genetica noua, unica si irepetabila, constanta in timp. Individualitatea umana este deci o individualitate genetica, desi omul in ansambul sau este produsul interactiunii permanente dintre ereditate si mediu. Titlul de unicat al fiecarui univers genetic uman nu este contrazis pâna în prezent decât de gemenii monozigoţi. Ideea realizării profilului genetic al unei persoane, s-a nascut din conceptele geneticii clasice exprimate rezumativ prin:

(1) unicitatea genetica a fiecarui individ. Fiecare persoana are o infatisare caracteristica, unica. Intrucat acesta infatisare, fenotip, reprezinta materializarea genotipului rezulta ca exista o importanta diversitate a materialului genetic uman. Acest lucru se intampla dearece anumite parti ale genomului uman sunt polimorfe, intelegandu-se prin aceasta ca pentru acele parti din genom exista mai multe variante structurale. Se va vedea ca in special regiunile extragenice poseda un polimorfism accentuat, facand obiectul predilect al analizei geneticienilor legisti. (2) identitatea structurala a ADN in toate celulele unui organism uman. Informatia genetica a fiecarui organism viu este continuta in interiorul fiecarei celule, in

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

molecula de ADN; ADN are in alcatuirea sa genele care codifica fiecare caracteristica a organismului; toate celulele dintr-un organism viu poseda aceeasi structura a ADN. (3) respectarea legilor mendeliene ale transmiterii caracterelor ereditare in succesiunea generatiilor. Pogenii mostenesc o serie de trasaturi comune cu ale genitorilor dupa legile bine cunoscutesi definite in genetica clasica.

Drumul cercetarii individualitatii umane a fost deschis la sfarsitul secolului XIX de amprentele papilare, insusiri fenotipice cu determinism multifactorial, poligenic si de mediu, urmate in timp, de antigenele specifice de grup, sangvine si tisulare, pentru a viza in prezent materialul genetic al speciei umane - molecula de ADN.

*

Scurt istoric Pornind de la terminologia deja consacrata de amprenta geneticasa ne amintim de ruda sa mai varstica, de acum centenara, amprenta digitala. In 1880 antropologul britanic Sir Francis Galton publica primele observatii referitoare la amprentele digitale ca mijloc fidel de identificare al unei persoane. Incepand cu 1902 amprentele digitale au fost utilizate sistematic in justitie si armata in tarile anglo-saxone. La vremea aparitiei lor, amprentele digitale au revolutionat arena justitiei. Dupa 1950, in laboratoarele medico-legale s-au testat de rutina markerii pentru grupele de sange ABO , polimorfismul proteic fiind astfel un factor de diferentiere genetica. Ulterior, alte grupe de sange, proteine serice, enzime eritrocitare si complexul major de histocompatibilitate HLA au fost serotipate

pentru a servi identificarea probelor biologice sau la cercetarea paternitatii. Primele observatii referitoare la polimorfismul moleculei de ADN au fost facute prin 1978 cu ocazia studiilor genei beta -globinei in siclemii. A fost insa meritul britanicului Alex Jeffreys sa descopere in 1985 ca in genom exista regiuni hipervariabile cu specificitate individuala . El cerceta gena mioglobinei umane cand a remarcat o serie de secvente repetitive intercalate intre secvente codante ale genei. Atunci cand aceste secvente repetitive erau hibridizate cu secvente complementare si marcate radioactiv se vizualiza un set complex de benzi, asemanator unui cod de bare. Imaginea descrisa de un astfel de set de benzi (secvente de ADN) s-a dovedit a fi unica, specifica fiecarui individ uman. Definirea termenului de profil ADN. Analiza ADN in scop de identificare este cunoscuta sub numele de tipare ADN, genotipare ADN, profil ADN sau test de identificare ADN. Desi foarte larg utilizat, termnul de amprenta genetica 1 nu defineste tocmai corect acest tip de analiza.

Profilul ADN se defineste ca fiind totalitatea acelor caracteristici structurale ale materialului genetic care permit identificarea unui individ.

Testele ADN utilizate in medicina legala isi au fundamentarea stiintifica in genetica clasica, biochimie si biologia moleculara. De aceea pentru a intelege ce reprezinta un test ADN consideram necesara trecerea in revista a catorva notiuni elementare despre structura si functiile ADN. ADN este macromolecula ce constituie suportul material al ereditatii, reprezentand cartea noastra de identitate biologica. Informatia genetica este stocata in ADN sub forma unui cod, a carui descifrare permite fiecarei celule dintr-un organism sa-si indeplineasca functiile. Cvasitotalitatea materialului genetic uman se gaseste localizat in nucleul celular si defineste ADN nuclear (ADNnc). Restul patrimoniului genetic al celulei este reprezentat de ADN mitochondrial (ADNmt), o mica molecula de ADN circular, localizata in mitocondrii si care poseda o organizare si un cod genetic diferit de cel al ADN nuclear. Structura ADN nuclear. ADN uman se prezinta sub forma unui filament a carui lungime atinge aproximativ 1m si intra in compozitia cromozomilor din nucleul fiecarei

1 Sintagma amprenta genetică”, a fost creata operându-se o analogie între multitudinea de benzi obtinute prin analiza de genotipare şi multitudinea desenelor liniare ce alcătuiesc o amprentă digitală. Desi sugestiva, analogia este forţată intrucat, cei doi termeni, amprenta digitală şi amprenta genetică nu au în comun decât capacitatea de a reflecta una dintre trăsăturile fundamentale ale fiinţelor vii, şi anume unicitatea lor biologică. Termenul de amprentă genetică s-a impus sub această formă în conştiinţa publicului, insa in prezent, in literatura medicală de specialitate şi în limbajulul juridic se foloseste aproape exclusiv termenul de profil ADN.

210

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

celule. Molecula de ADN este identica in proportie de 99,9% la toti indivizii din aceesi

specie. Din cele 3,5 bilioane de perechi de nucleotide ce alcatuiesc filementul de ADN, doar

3 milioane sunt diferite de la un individ la altul. Aceste mici variatii structurale confera

unicitate biologica fiecarui individ uman. Genomul fiecarei persoane este unic cu exceptia gemenilor monozigoti. Materialul genetic nuclear il mostenim in proportii perfect egale de la

parinti: 50% de la mama si 50% de la tata. De aceea cu ajutorul ADN putem demonstra legaturile de rudenie dintr-o familie.

Molecula de ADN are o structura dublu-elicoidala, fiind alcatuita din doua lanturi rulate unul in jurul celuilalt (“spirala vietii”). Structura ADN poate fi imaginata destul de plastic ca fiind o scara in spirala marginita de doua balustrade. Succesiunea treptelor acestei scari in spirala este data de cele 4 tipuri de nucleotide: A-adenina, G- guanina, T-timina sau C-citozina. Schematic structura unei secvente dintr-un lant de ADN poate fi reprezentata astfel:

A A C T G A T A G G T C T A G Informatia este determinata de secventa de litere

de-a lungul lantului de ADN, cu alte cuvinte este codificata. Este vorba de un cod format din

4 litere, extrem de performant, deoarece cu ajurotul sau se inmagazineaza o cantitate

uriasa de informatie, o adevarata arhiva genetica, transmisa din generatie in generatie cu o

precizie uimitoare. De exemplu, secventa ACGT reprezinta o informatie diferita fata de secventa AGTC, in acelasi mod in care cuvantul “STOP” are un inteles diferit fata de cuvantul “POST” sau “SPOT”, chiar daca aceste cuvinte contin aceleasi litere. Conexiunea intre bazele azotate este o conexiune specifica, bazata pe complementaritate stricta, in sensul ca adenina se leaga numai cu timina, iar guanina numai cu citozina.

se leaga numai cu timina, iar guanina numai cu citozina. A = T C  G

A = T

C G

Astfel, secventa de ADN complementara celei reprezentate mai sus va fi:

A A C T G A T A G G T C T A G

T T G A C T A T C C A G A T C

Din acest tip de imperechere specifica al catenelor de ADN rezulta un lucru de mare importanta practica pentru tehnicile de analiza moleculara cunoasterea unei secvente de pe un lant de ADN permite deducerea cu exactitate a secventei complementare, deoarece ori de cate ori se separa cele doua lanturi, ele se vor recombina tot de aceeasi maniera complementara. Replicarea este cea de-a doua proprietate fundamentala a moleculei de ADN de mare importanta practica pentru tehnicile de analiza moleculara in genetica judiciara. Cunoasterea proceselor de replicare a ADN a permis reproducerea lor in vitro prin reactia polimerizarii in lant (PCR - Polymerase Chain Reaction). Replicarea 5 este procesul prin care, in cursul diviziunii celulare, se sintetizeaza o noua molecula de ADN folosind ca matrita o molecula de ADN preexistenta. Molecula nou sintetizata este identica cu molecula de ADN- mama, copia sa fidela sau replica sa. Procesul de replicare incepe prin separarea celor doua filamente de ADN. Fiecare filament serveste drept matrita pentru copierea unui nou lant de polinucleotide. Replicarea este controlata de mai multe enzime, dintre care cea mai importanta este ADN-polimeraza.

5 Replicare=sinteza de tip auto-copiativ

211

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Aceasta enzima adauga in procesul de sinteza al noilor catene in jur de 1000 de nucleotide pe secunda. ADN nuclear are in structura sa:

gene - in numar de aproximativ 25000 6

secvente inrudite cu genele

material extragenic - reprezentat de o cantitate considerabila de secvente de

ADN repetitiv („junk DNA”). Proportia de ADN repetitiv reprezinta peste 90% din

genom.

Structura genomului uman 7

 

ADN genic (gene si secvente

ADN codant (genic) (< 10%)

G

inrudite cu genele)

 

E

(20-30%)

ADN necodant (> 90%) - introni, pseudogene etc.

N

O

   

M

Secvenţe unice sau cu un numar mic de repetitii (70-80%)

U

L

 
   

U

ADN extragenic

 

Repetiţii intercalte in genom (40% ) (Alu repetitiile)

M

(necodant)

Secvente

(7080%)

 

A

moderat

 

N

 

si inalt repetitive

Repetiţii grupate in tandemuri (60%) Macosateliti Minisateliti Microsateliti

(20-30%)

Proprietatile secventelor repetitive grupate in tandemuri

alterneaza cu secventele codante de tip unicat (genele)

ocupa in genom poziţii fixe denumite loci (locus la singular)

au o informativitate cu totul excepţională, in sensul ca structura lor permite discriminarea ADN provenit de la diferiţi indivizi. Diferenţele interindividuale din structura secventelor repetitive, denumite polimorfisme ADN prin numarul variabil al tandemurilor repetitive (Variable Number of Tandem Repeats -VNTR), confera acestor structuri calitatea de markeri ai regiunilor genomice în care îşi au sediul

variantele structurale ale unei secvente de tip repetitiv sunt desemnate alele, prin asimilare cu alelele genelor. Functia indeplinita de ADN repetitiv nu este in prezent elucidata, dar ceeea ce intereseaza este organizarea sa si faptul ca transmiterea acestui material genetic se face

asemeni genelor, cu respectarea legilor ereditatii Mendeliene. Astfel, in cursul diviziunii celulare mitotice, secventele de tandemuri repetitive:

segrega independent (se combina la intamplare)

se regasesc in succesiunea generatiilor pe cromozomi omologi, la nivelul unui locus

de tip repetitiv, descendentii vor prezenta doua variante (alele) ale secventei repetitive: una de provenienta materna (alela materna), cealalta de provenienta paterna (alela paterna). Tandemurile repetitive au lungimi si structuri variabile:

succesiuni de 1-5 nucleotide repetate de câteva zeci-sute de ori definesc microsateliţii (STR - short tandem repeats) succesiuni zeci de nucleotide repetate de sute sau mii de ori definesc minisateliţii (VNTR 8 ).

6 Date publicate HUGO (Human Genome Organization) in 2004

7 adaptat după Brown T.A. – “Genetics – A Molecular Approach” (1992) Chapman & Hall, London, 280-310

8 VNTR este un termen care desemneaza intreaga clasa de compusi repetitivi, dar cel mai ades denumeste markerii incadrati in clasa minisatelitilor

212

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Microsatelitii sunt considerati in prezent “standardul de aur” in materie de identificare. Dintre miile de microsateliti din genomul uman, in practica medico-legala sunt utilizate doar sistemele STR unilocus (cu localizare unica in genom), formate din tetra- si pentarepetii si numar minim de artefacte genetice (microvariante). Analiza unui singur locus STR nu este suficienta pentru afirmarea apartenentei unei probe la o persoana sau alta. Analiza a 10-16 loci STR permite identificarea cu succes a provenientei unei probe ADN.

Caracterizarea ADN structurat in tandemuri repetitive 9

   

Lungimea

       

TIPUL

Numărul

unitatii

 

Nr. de

CARACTERISTICI

APLICATII

Tehnica de

REPETITIEI

de loci

repetitive

repetitii

analiza

(pb)

     
 

1 -2 per cromozom

 

Grupari de

Localizati in

Nu au

 

MACROSATELI

cateva mii

100-5000kb

centromer si

utilizare

Southern blot

   

lungime

telomere

medico-legala

TI

   
       

1-30kb

Polimorfism de tip

Valoare in

 

MINISATELITI

Mii per

9 -100

n

= 10-30

VNTRs

cercetarea

Southern blot

genom

 

unilocus

filiatiei

PCR

 

multilocus

   

1 6 (CA)n (ATG)n (GTAG)n

   

Valoare mare

 

MICROSATELI

Zeci

de

 

< 1kb

in identificare

TII

mii

per

n

= 10-60

Polimorfism de tip STRs

si cercetarea

filiatiei

PCR

 

genom

 

Avantajele genotiparii markerilor de tip STR constau in

necesarul redus de material genetic pentru analiza (de ordinul ng pana la pg), incluzand aici si ADN degradat sau izolat prin tehnici de purificare rapida

existenta unui numar limitat de variante alelice - markerii STR au o distributie de tip

discontinua a ordinului de marime, lucru ce permite identificarea lor fidela prin comparare cu etaloane de marime

rata inalta de succes a analizei datorat randamentului crescut al reactiei PCR pentru

secvente le scurte de AND (vezi detalii la metodele de analiza)

posibilitatea analizarii simultate a mai multor loci STR (combinatii de 3 pana la 20 de loci STR) prin reactii de amplificare multiplex si electroforeza multiplex

posibilitatea inregistrarii rezultatelor in format digital si alcatuirii de baze de date. Printre dezavantajele investigatiilor pe STR se numara:

riscul crescut al contaminarilor cu ADN uman, bacterian sau viral din mediu, in etapele de

pregatire a probelor de ADN, a reactiei de amplificare sau in etapa de analiza a produsilor de reactie incidenta inalta a evenimentelor mutationale (single-step sau double step mutation prin

mecanism de slippage) estimata in medie la 10 -4 - 10 -3 /per locus.

Minisatelitii, desi au deschis era investigatiilor de genetica judiciara, sunt in prezent considerati markeri de rezerva. Gratie potentialului lor discriminatoriu ridicat sunt inca utilizati in testele de paternitate sau la investigarea unor relatii de inrudire biologica complexe. Limitarile acestor sisteme de markeri tin cantitatea relativ mare de material genetic necesara pentru analiza (intre 5-250 ng de ADN/ per proba bilogica) incidenta mare a secventelor degenerate (constand in variatii interne ale unitatii repetitive) care nu permite o identificare foarte exacta a alelelor. Exemplul cel mai elocvent, citat in literatura desi nu apartine medicinii legale umane este cel al clonei Dolly, a carei identitate nu a putut fi dovedita prin genotiparea microsatelitilor, fiind necesara o investigatie suplimentara, de aceasta data efectuata exclusiv pe minisateliti, pentru a dovedi autenticitatea clonei si a infirma ipoteza coform careia clona ar fi derivat in urma unei contaminari accidentale cu o celula fetala de la oaia gestanta.

9 dupa Krawczak M., Schmidtke J. - “Origin and maintenance of DNA polymorphism” (1994) DNA Fingerprinting, BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, 1760 si Trent R.J.- “Forensic Medicine” (1993) Molecular Medicine An Introductory Text for Students, Churchill Livingstone, Logman Group, Edinburgh, 179-192

213

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Nomenclatura locilor ADN care fac obiectul testelor genetice medicale sau judiciare.

Locii sunt denumiti conform unei nomenclaturi specifice, standardizate la nivel international.

Alelele locilor de tip STR se denumesc dupa numarul de repetitii pe care le contin.

Pentru orice marker genetic: D semnifica acid dezoxiribonucleic, prima cifra dupa D - localizarea cromozomiala, litera urmatoare descrie complexitatea segmentului de ADN, iar ultima cifra indica un numar secvential, dat regiunii.

Exemplificarea

D

- DNA

nomenclaturii

1 - indica localizarea pe cromozomul 1

pentru markerul

S

- semnifica segment unic (Single)

D1S80

80 - numarul secvential al regiunii de pe cromozomul 1

Unii markeri imbraca si denumiri mai speciale, imprumutand denumirea genei in vecinatatea careia sunt localizati: HUMTHO1 (Human tyrosine hydrolase gene), HUMTPOX (Human tyroide peroxydase gene), HUMCSF1 PO (Human c-ims proto-oncogene for CSF1 receptor gene), etc. Inainte de a intra in practica curenta, sistemele de markeri ADN din genetica judiciara fac obiectul unor ample studii de validare care urmaresc: specificitatea lor de specie, rata artefactelor de analiza, modul de transmitere mendelian, legatura cu maladiile genetice, frecventa alelelor si rata mutatiilor reflectate in studiile populationale.

Markerii ADN genotipaţi curent în scop de identificare si localizările lor cromozomiale 10

Cromozom

Locus STR

Cromozom

Locus STR

1

F13B, D1S1171

13

D13S308, D13S317

2

TPOX, APOB, D2S1242, D2S1338

14

D14S306

3

D3S1349, D3S1352, D3S1358, D3S1359

15

FES/FPS, Penta E

4

FGA (FIBRA), FABP, GABARB15

16

D16S539, D16S537

5

CSF1PO, D5S373, D5S815, D5S818

17

D17S976

6

F13A1, ACTBP2 (SE33), D6S502

18

D18S51, D18S535, D18S849

7

D7S460, D7S809, D7S820, D7S1517

19

D19S253, D19S433

8

LIPOL (LPL), D8S306, D8S320, D8S1179

20

D20S85, D20S470

9

D9S52

21

D21S11, Penta D

10

D10S89

22

 

11

TH01 (TC11), APOAI1, D11S554

X

HPRTB, ARA, STRX1, DXYS156

12

Y

DYS19, DYS385, DYS389-I, DYS389- II DYS390, DYS391, DYS392, DYS393

Markeri utilizati in identificare sunt localizati exclusiv la nivelul ADN necodant astfel incat informaţiile genetice vehiculate cu privire la identitatea unei persoane sa nu poata fi puse in legatura cu evetuale maladii cu determinism genetic. Daca testele de identificare s- ar efectua la nivelul ADN codant, ele ar permite, in anumite circumstante, diagnosticarea neautorizata a indivizilor bolnavi, cu toate consecintele nefaste in plan etic si social ce decurg din aceasta.

Ereditatea extranucleara - ADN mitocondrial (ADNmt). Mitocondria este un organit celular esential pentru viata celulei, pentru ca aici se desfasoara procesele respiratorii de baza ce conduc la producerea de energie. Fiecare mitocondrie are pana la 10 molecule de ADNmt, iar celula umana contine intre 5000-10000 de mitocondrii. Prin urmare, ADNmt se regaseste in de sute sau mii de copii intr-o singura celula, comparativ cu ADN nuclear care este unic. Daca probele biologice contin ADN nuclear in cantitati extrem de mici sau extrem de degradat, sansele de a recupera ADNmt sunt destul de mari, ceea ce prezinta un real avantaj in identificarile medico-legale. ADNmt uman a fost complet studiat si se cunoaste secventa completa a moleculei. Exista mari diferente intre ADNmt al diferitelor specii de animale, ceea ce face acest material ereditar ideal pentru diferentierea speciilor.

10 dupa baza de date a National Institute of Science and technology (www.cstl.nist.gov/div831/strbase)

214

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

ADNmt nu contine secvente repetitive, insa are in structura sa o zona polimorfa numita zona D-loop. In identificarile de persoane sunt analizate prin tehnici de secventiere moleculara regiunile hipervariabile HV1 (Hypervariable 1) si HV2 apartinand zonei D-loop. Transmiterea materialului genetic mitocondrial nu se face dupa tipul legilor Mendeliene, ci preferential pe linie materna (erediatate de tip matern). Cercetarile arata ca in timpul fecundarii, dupa patrunderea in ovul, mitocondriile spermato- zoidului se dezintegreaza, ramanand in celula ou numai mitocondriile ovulului. Datorita faptului ca ADNmt al unei persoane este mostenit integral de la genitorul matern, se poate verifica descendenta biologica pe linie feminina a membrilor unei familii. Acest lucru este extrem de util in identificarile medico- legale, mai ales acolo unde una din verigile dintre generatii lipseste: de exemplu, in cazul in care ambii parintii sunt decedati, studiul

secventelor de ADNmt al nepotilor si bunicii materne permite stabilirea filiatiei lor biologice.

bunicii materne permite stabilirea filiatiei lor biologice. - Modul de transmitere al ADNmt are si dezavantaje

- Modul de transmitere al ADNmt are si dezavantaje legate de imposibilitatea distingerii intre descendentii pe linie materna ale aceleasi familii.

- Analiza ADNmt nu isi gaseste utilitatea nici pentru testele de paternitate.

ADN nuclear

ADN mitocondrial

Localizat in nucleul celulelor

Localizat in mitocondrie

Structura dublucatenara helicoidala

Structura dublucatenara circulara

Unicat in celula

Multiple molecule de ADNmt in fiecare mitocondrie, deci cateva sute-mii per celula

Nu formeaza cromozomi in cursul diviziunii

Formeaza in timpul diviziunii celulei cele 23 de perechi de cromozomi

Determina fenotipul individului

Codifica enzime si proteine implicate in metabolismul energetic al celulei

Mostenit exclusiv pe linie materna

Mostenit de la ambii parinti, in proportii perfect egale

Markeri ADNnc in genetica judiciara secventele repetitive - utilitate in identificarile de persoane si cercetarea relatiilor de inrudire pe linie paterna sau materna

Markeri ADNmt in genetica judiciara regiunile hipervariabile HV1, HV2 din zona D-loop - utilitate in identificarile de persoane unde analiza ADNnc esueaza si pentru cercetarea inrudirilor pe linie materna

Etapele unui test ADN.

O analiza ADN este un proces complex, insa indiferent de tehnica de lucru utilizata in labo- rator, exista cateva etape standard care se parcurg in mod obligatoriu:

1. Prelevarea si conservarea probelor biologice biulogice

2. Izolarea si purificarea ADN din probele biologice

3. Amplificarea fragmentelor de analizat prin PCR

4. Vizualizarea produsilor de reactie

5. Analizarea rezultatelor si inscrierea lor intr-o baza de date

1. Prelevarea si conservarea probelor biologice pentru analiza ADN:

215

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Molecula de

ADN

este

o

molecula

stabila,

mai

stabila

decat

multe alte proteine care fac de obicei

analizelor

laboratoarele

medico-legale.

in

obiectul

obicei analizelor laboratoarele medico-legale. in obiectul In tabel sunt prezentate conditiile de prelevare obligatorii

In tabel sunt prezentate conditiile de prelevare obligatorii in vederea testarii ADN.

Tipul de produs biologic prelevat

Volumul

Suportul pe care se face prelevarea

Conservarea**

Recomandari

sange prelevat de la persoane vii

1-5ml

EDTA*

refrigerare (4C) sau congelare ( -20C)

Congelarea impiedica degradarile autolitice

sange prelevat la autopsie

1-5ml

inutil

idem ca mai sus

Sangele va fi prelevat din cavitatile cordului sau vase (sinus venos longitudinal)

saliva

1- 3 esantioane (tampoane sterile)

-

mediu uscat

Prelevatele trebuie obligatoiu bine uscate nainte de a fi introduse in tuburile protectoare din plastic In caz contrar tuburile se congeleaza

prelevate vaginale sau din sfera genitala

3-5 esantioane

-

mediu uscat

Prelevatele trebuie obligatoiu bine uscate nainte de a fi introduse in tuburile protectoare din plastic In caz contrar tuburile se congeleaza

(tampoane sterile)

tesuturi:piele,

2 5 cm 2

! nu se adauga formol

refrigerare (4C) sau congelare ( -20C)

In cazul tesuturilor putrefiate - se preleva din mai multe tesuturi (activitatea ADN- azelor difera de la un tesut la altul)

muschi, viscere,

os, etc.

   

Par sau unghii

10-30 fire de par cu radacina cu tot

-

mediu uscat

-

Pete de sange sau sperma

cat mai multe posibil, cu diam. minim de 0,5cm

-

mediu uscat fiecare pata se pastreaza separat

-

* Se accepta si utilizarea altor anticoagulanti decat EDTA, cum ar fi heparina sau florura de sodiu (continuta in flacoanele pentru recoltarea alcoolemiei), insa aceastea interfereaza cu activitatea enzimelor din etapa PCR compromitnd analizar. EDTA are avantajul ca reduce procesele de degradare a ADN prin chelarea unor cationi necesari ADN-azelor. ** Ideal ar fi ca izolarea materialului genetic sa se faca imediat ce sunt primite probele. Daca intervalul de prelucrare depaseste 72h atunci esantionul se va congela la 20C. Congelarea impiedica degradarile autolitice. Probele pot fi depozitate deci la 4C cateva zile fara ca ADN sa sufere degradari mari; totusi cantitatea si caliatatea ADN scade cu timpul chiar la 4C, impunandu-se congelarea. Transportul probelor va fi facut in aceleasi conditii in care a avut loc conservarea acestora.

Degradarea ADN are loc sub actiunea:

- ADN-azelor - enzime proprii ale celulei

- factorilor din mediu ambiental: umiditate, caldura, lumina UV,contaminare bacteriana.

216

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

De aceea este indispensabil de a preleva si conserva corect probele biologice destinate analizelor genetice, in conditii de:

- refrigerare

- uscaciune

- protejate de lumina solara, radiatii UV, agenti chimici

Eforturile trebuie concentrate in aceasta directie, deoarece reprezinta prima garantie a unor analize de calitate. Neglijenta sau ignoranta in manipularea probelor sau la transport poate prejudicia intreaga testare, lucru critic uneori in activitatea de identificare medico- legala.

Testele se pot efectua tuturor probelor biologice ce contin celule nucleate:

sange

saliva

tesuturi (proaspete si arhivate)

sperma

os

pulpa dentara

fir de par cu bulb

urina.

lichid amniotic

2. Tehnici de izolare si purificare a ADN din probele biologice. Succesul unei testari depinde in buna masura de etapa de izolare, de aceea este important sa se obtina ADN:

- in cantitate cat mai mare

- cu greutate moleculara mare (echivaleaza cu integritatea moleculei de ADN)

- cat mai pur - liber de toate impuritatile de natura proteica, ionica sau polizaharidica. Tehnicile de izolare variaza in functie de tipul, cantitatea si calitatea probei biologice de analizat. Exista o mare varietate de procedee de izolare a ADN, unele destul de laborioase prin care se obtine ADN pur si altele denumite metode “quick and easy” prin care se obtine ADN de puritate medie, dar propriu analizei prin PCR. Mai nou, au aparut o multitudine de echipamente care pot realiza automat extratia ADN si care sunt destinate in special prelucrarilor esantioanelor biologice in centrele unde se organizeaza baze de date ADN medicale sau judiciare. Majoritatea laboratoarelor de genetica judiciara folosesc protocoale de izolare a ADN standard sau cat mai apropiate de cele standard, existand astfel posibilitatea confruntarii rezultatelor obtinute intre laboratoare.

3. Amplificarea fragmentelor de analizat prin PCR Testele ADN in scop de identificare a indivizilor umani fac apel in mod curent la tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Tehnicile de analiza RFLP 11 au fost practic abandonate la mijlocul anilor ‟90 motiv pentru care nu vor fi prezentate. Tendinta generala in domeniu este de a se renunta la tehnicile laborioase, consumatoare de timp si a se opta pentru procedee lucru automatizate. Tehnica PCR, una din cele mai performante unelte de lucru ale geneticii moleculare prezente, descoperita si dezvoltata la inceputul anilor 1980 de Kery Mullis si colegii sai de la Cetus Corporation, companie americana de biotehnologie. Pentru aceasta descoperire inventatorii au primit premiul Nobel in 1993. Gena umana a beta-globinei a fost printre primele secventiate prin tehnica PCR. Tehnica are la ora actuala un impact major in medicina in ce priveste diagnosticul bolilor genetice, infectioase, oncologie si medicina legala. Datorita tehnicilor PCR a fost posibila derularea si finalizarea cu succes a Proiectului Genomul Uman in numai 5 ani de zile. Exista la ora actuala peste 10000 de laboratoare in lume care utilizeaza diagnosticul PCR si numarul lor este in crestere.

11 a fost prima tehnica de laborator utilizata in identificarile de persoane descrisa in 1985 de A.Jeffreys pentru analiza locilor ADN polimorfi de tipul minisatelitilor VNTR multilocus

217

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Reactia de polimerizare in lant (prescurtat PCR) este o metoda de sintetizare in vitro a unei secvente specifice de ADN, proces ce se repeta ciclic de mai multe ori, avand ca rezultat final marirea exponentiala a cantitatii de material genetic. Reactia PCR a fost comparata cu un “xerox la nivel molecular”. Tehnica PCR a fost conceputa de asa maniera incat sa mimeze procesul natural de replicare al moleculei de ADN din timpul diviziunii celulare. In timpul replicarii, fiecare molecula de ADN se separa in doua lanturi prin desfacerea legaturilor de hidrogen dintre perechile de baze azotate complementare. Apoi, printr-un proces declansat si condus de o enzima ADN-polimeraza, are loc sintetizarea unui nou lant de ADN, complementar cu matrita ADN originala. Rezultatul il reprezinta o dublare a numarului de molecule de ADN. Ingredientele reactiei PCR:

(1) solutia cu ADN izolat (2) primeri sau amorse de reactie - fragmente de ADN cu lungimea de pana la 20 de nucleotide, sintetizate pe cale chimica si concepute astfel incat sa flancheze secventa ADN de interes (3) Taq-polimeraza - enzima cheie a reactiei, obtinuta din bacteria Thermus aquaticus (4) nucleotide - o mixtura continand cele 4 nucleotide A,G,T,C Echipamentul necesar pentru PCR: un termocycler - aparat prevazut cu un bloc termic programabil

Reactia PCR se desfasoara in cicluri de 1-3 minute fiecare. Ciclurile se repeta de cca 20-30 de ori. Un ciclu complet cuprinde trei etape principale:

1. denaturarea termica a ADN dublu-catenar: are ca scop producerea de ADN monocatenar prin ruperea legaturilor de hidrogen dintre catenele complementare. Denaturarea se realizeaza la peste 90C. Denaturarea termic este un proces reversibil permitand reasocierea ulterioara a catenelor cu formarea unui nou dublu helix. Este important de stiut ca dupa mai multe cicluri de denaturare-renaturare ADN-ul isi pastreaza

proprietatile biologice.

2. cuplarea primerilor (amorselor) de reactie pe monocatena de ADN: primerii se cupleaza flancand capetele secventei tinta de ADN monocatenar; cuplarea se face pe baza de complementaritate;

3. extensia (sau polimerizarea): de la nivelul situsurilor de cuplare a primerilor se initiaza

care va incorpora pe

sinteza noilor catene de ADN prin intermediul Taq-polimerazei

rand nucleotidele din mixul de reactie

Taq-polimerazei rand nucleotidele din mixul de reactie fiecare reactie, segment tinta monocatenar devine catenar.

fiecare

reactie,

segment

tinta

monocatenar

devine

catenar. Daca procesul

fiecare

ciclu

Dupa

de

de

ADN

dublu-

este

100%

eficient,

dupa

n

cicluri complete se

produc

2 n

copii

dupa

ADN

matrita.

De

exemplu, dupa 20

de

cicluri

de

reactie

ar

trebui

rezulta in mediul

de

reactie

circa

1.000.000

de

copii

ale

frag-

mentului de ADN amplificat.

218

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Prin tehnici PCR multiplex se poate realiza amplificarea simultana a unui numar mai mare de secvente tinta de ADN folosind o combinatie de 3 pana la 16-20 seturi de primeri. Tehnicile PCR multiplex sunt larg utilizate in laboratoarele de genetica moleculara deoarece permit cresterea randamentului de lucru si automatizarea proceselor de analiza.

Avantajele metodei PCR:

a) senzitivitatea - capacitatea reactiei de a multiplica cantitati de ADN de ordinul nanogramelor si picogramelor (pentru o amplificare de calitate este de regula sufficient materialul genetic provenit din 10-100 de celule); cum eficienta amplificarii este invers proportionala cu lungimea segmentului de amplificat, majoritatea reactiilor folosesc drept tinta segmente de ADN mai mici de 2kb. Amplificarea genica este usor si sigur de realizat pentru secvente din genom de mici dimensiuni de tipul markerilor STRs.

b) rapiditatea efectuarii analizelei PCR ( in medie 3 ore)

Dezavantajele PCR:

a) relativa usurinta cu care se poate produce contaminarea probelor de ADN cu material genetic provenit din alte surse (ADN apartinand persoanei care face recoltarea probelor biologice, produsi de amplificare rezultati din reactiile anterioare).

b) sinteza in vitro a ADN este un proces grefat de erori - rata erorilor asociate cu activitatea Taq-polimerazei este estimata la 0,25% (o lipsa de incorporare de circa 400 de baze in 30 de cicluri).

4. Vizualizarea si identificarea produsilor de reactie Vizualizarea produsilor de amplificare (ampliconilor) se poate face in mai multe moduri:

cea mai simpla metoda si la indemana oricarui laborator, este electroforeza in mediu de agaroza urmata de colorare cu ethidium bromide, o substanta care se intercaleaza intre bazele nucleotidice si devine fluorescenta in lumina UV; radiatia UV este absorbita de secventele de ADN si reflectata ca o fluorescenta violet-oranj; fragmentele de ADN devin vizibile sub forma unor benzi intens fluorescente; metoda este utila pentru identificarea fragmentelor de ADN de mari dimensiuni motiv pentru are in prezent aplicabilitate redusa in genetica judiciara.

are in prezent aplicabilitate redusa in genetica judiciara. Vizualizarea produsilor de amplificare in gel de agaroza

Vizualizarea produsilor de amplificare in gel de agaroza intr-un caz de paternitate pentru markeri de tip VNTR (D1S80, D17S5, APOB):

Linia 1- ladder (scara cu etaloane de marime moleculara); liniile 2,5,8 alelele materne; liniile 3,6,9 alelele copilului; liniile 3,7,10 alelele barbatului investigat in calitate de prezumptiv tata biologic. Pentru fiecare marker, se observa ca alelele copilului au cate un corespondent in profilul matern, respectiv in cel al barbatului testat. Concluzia formulata a fost de confirmare a paternitatii.

pentru discriminarea fina a secventelor de ADN de mici dimensiuni, specifice markerilor STRs, in genetica judiciara se utilizeaza tehnici de electroforeza capilara realizate cu ajutorul echipamentele de analiza automata - secventiatoare genetice echipate cu detectie fluoresccenta laser. Produsii de reactie marcati fluorescent sunt identificati cu mare precizie.

219

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ UMF “Carol Davila” Vizualizarea produsilor de amplificare cu ajutorul analizorului genetic

Vizualizarea produsilor de amplificare cu ajutorul analizorului genetic automat intr-un caz de paternitate pentru markeri de tip STR (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E). Alele sunt desemnate automat de catre echipamentul de analiza. Linia 1- alelele materne (M); linia 2 - alelele copilului (C); linia 3 - barbatului investigat in calitate de prezumptiv tata biologic (T). Pentru fiecare marker, se observa ca alelele copilului au cate un corespondent in in profilul matern, respectiv in cel al barbatului testat. Concluzia formulata a fost de confirmare a paternitatii.

in

identificările de persoane realizează de rutina diagnosticul molecular al sexului unei persoane prin asa-numitul “test al amelogeninei”. Testul urmareste punerea in evidenta a unor

secvenţe localizate în regiuni omologe pe cromozomii X si Y, în imediata vecinătate a genei amelogeninei - de unde şi denumirea generică de “test al amelogeninei”. Secventa specifica cromozomului X este de dimensiuni mai mici decat cea a cromozomului Y, motiv pentru diagnosticul de sex este foarte usor de pus (vezi schema de mai jos):

- pentru subiectii de sex feminin testul evidentiaza o singura banda (coresp. secventei de pe cr. X)

- pentru subiectii de sex masculin testul evidentiaza doua benzi (un semnal corep secventei de pe cr. X si unul corep secventei de pe cr. Y).

Testul

amelogeninei.

Testarile

ADN

utilizate

ADN ADN feminin masculin X  XY
ADN ADN feminin masculin X  XY

ADN

ADN

feminin

masculin

X

XY

Markerii ADN specifici cromozomului Y. Reprezinta un puternic instrument de lucru pentru investigaţiile criminale şi de filiatie. In întreaga lume, autorii vastei majoritati a actelor criminale sunt bărbaţi: dupa statisticile oficiale aceştia comit peste 99% din agresiunile sexuale şi circa 93% din omucideri. Orice urmă, lăsată la locul unei fapte de catre un infractor de sex masculin, devine astfel deosebit de informativă, dacă în contextul investigaţiei ADN aşa-zise “clasice”, se are in vedere şi analiza markerilor ADN specifici cromozomului Y. Analiza comparativă a profilelor ADN specifice cromozomilor Y poate servi si la stabilirea paternitatii descendentilor de sex masculin in cadrul investigatiilor de filiatie. Metodele “clasice” de investigare a cromozomului Y. Investigarea cromozomului Y a reprezentat o practică limitată in serviciile medico- legale şi criminalistice in ultimele decenii, servind exclusiv la punerea in evidenta a sexului autorului unei infracţiuni. Printr-o metodă simplă se poate detecta în celule (sangvine, ale

220

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

mucoasei bucale, spermatozoizi, etc.) expresia citologică a cromozomului Y. Astfel, celulele care conţin cromozom Y, dupa tratare cu quinacrina, prezintă în lumina fluorescentă un corpuscul intens luminos - corpusculul fluorescent Y. Numărul punctelor fluorescente detectate intr-o celulă este egal cu numărul cromozomilor Y (XY, XYY, etc.). Dupa ce în 1961, Sandberg şi colab. au descris sindromul 47,XYY, în numeroase colţuri ale lumii s-a

trecut la căutarea febrilă a “cromozomului crimei” . Sindromul 47,XYY a fost unul dintre cele mai controversate sindroame cromozomiale, deoarece efectul Y-ului suplimentar a fost legat la vremea respectivă de comportamentul criminal. Citogenetica parea să aducă în acea epocă o explicatie obiectivă a comportamentului sociopat. Entuziasmul celor care credeau în “Y-ul criminal” s-a stins însă repede atunci când studii ştiinţifice foarte ample au demonstrat fără de tăgadă că nu există nici o relaţie directă între constituţia “YY” şi comportamentul criminal. Dosarul “Y-ului criminogen” odata închis, s-a diminuat şi interesul legiştilor şi criminaliştilor pentru investigarea cromozomului Y. Caracteristicile cromozomului Y derivă din funcţia sa de determinant al dezvoltării sexuale masculine. Dacă Y-ul lipseşte sau este nefuncţional, genele feminizante intră spontan in acţiune în timpul dezvoltării embrio-fetale. În timp ce cromozomii autozomi şi cromozomul sexual X se gasesc perechi în genomul uman si participă perechi-perechi in procesele de recombinare din timpul diviziunii celulare, cromosomul Y este unic - nepereche (de tip haploid) si nu participa la aceste procese de schimb de material genetic. Consecinţa acestui tip de comportament din meioză, este că Y-ul se transmite integral de la tată la fiu, în succesiunea generaţiilor. Această modalitate de transmitere a cromozomul Y ar corespunde în societate trasmiterii şi moştenirii numelui de familie, de la tată la descendenţii săi de sex masculin. Polimorfismul cromozomului Y. Ca şi restul materialului genetic uman, cromozomul Y acumulează gradual o serie de modificări structurale numite mutaţii - mărturii ale trecerii timpului şi proceselor evolutive specifice tuturor organismelor vii. Polimorfismul ADN al cromozomului Y este produsul mutaţiilor care se acumulează în succesiunea generaţiilor.

- Polimorfismele de tip STR-Y sunt markeri de elecţie pentru investigaţiile judiciare şi cercetarea paternitaţii. Spre deosebire de markerii STR autozomali, microsateliţii STR-Y se caracterizează prin transmiterea lor după modelul uniparental, strict de la tata la fiu.

- Polimorfismele de tip SNP-Y (single nucleotide polimorfism) sunt utile studiilor populaţionale, de evolutionism genetic şi diagnosticului unor infertilitaţi masculine. Un profil cromozomial Y definit prin doar 4 microsateliţi are rezoluţie joasă, în schimb, un set de 9-11 markeri STR-Y poate discrimina peste 95% din indivizii de sex masculin dintr-o populaţie. Puterea discriminatorie a markerilor cromozomiali Y este desigur mult mai redusa în izolatele populaţionale. În mod ideal, analiza judiciară a unui profil cromozomial Y ar trebui să includă cât mai mulţi markeri, astfel încât discriminarea indivizilor să fie posibilă in procent de 100%. Discriminarea intre indivizii care au o filiaţie comună pe linie masculină (tata-fiu, nepot- bunic patern, fraţi, veri primari cu bunic patern comun, nepot-unchi patern, etc.) nu se poate realiza utilizand markerii specifici cromozomului Y. Aplicaţiile ale analizei markerilor ADN specifici cromozomului Y. Cromozomul Y uman serveşte în domeniul medicina legala la:

1. identificarea agresorilor sexuali bărbaţi - serveste in special ca test de screening al suspecţilor

2. identificarea celulelor epiteliale masculine în ejaculatele indivizilor vasectomizaţi;

3. investigarea agresiunilor homosexuale

4. cercetarea paternităţii pentru cazurile cu descendenţi de sex masculin

5. studii de genealogie şi antropologie.

Investigarea agresiunilor sexuale cu ajutorul markerilor specifici cromozomului Y. Markerii ADN specifici cromozomului Y au avantajul că aduc informaţii adiţionale în investigaţiile medico-legale în afara dovezii că un ADN de origine masculină este prezent într-o proba vaginala postcoitala. Analiza PCR a markerilor STR-Y poate genera intr-un timp record un profil cromozomial Y specific agresorului si aceasta deoarece analiza

221

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

nu necesită procedee de extracţie prin liză diferenţială 12 din probele postcoitale. Pentru

cazurile de agresiuni sexuale cu agresori multipli, analiza markerilor cromozomiali Y permite determinarea cu precizie a numarului minim de agresori sexuali bărbaţi după numarul de profile Y identificate. Investigaţiile pe cromozomul Y au o serie de limitări ce ţin în special de proprietaţile cromozomului Y, de aceea interpretarea rezultatelor testelor trebuie facută cu multă atenţie, tinând cont de modul de transmitere şi particulărităţile mutationale ale cromozomului Y. Interpretarea rezultatelor în cazul necorespondenţei a doua profile cromozomiale Y.Ca şi pentru alte sisteme de markeri ADN utilizati in identificarile de persoane, constatarea că o persoana prezintă un profil cromozomial Y diferit decât cel evidentiat la locul faptei, reprezintă un criteriu obiectiv de a exclude respectiva persoana de pe lista suspectilor. Pentru testele de paternitate, neconcordanţele detectate pe markerii Y sunt în favoarea unei concluzii de non-paternitate. În cazurile de paternitate unde se evidentiaza nu mai mult de 1- 2 neconcordate intre profile trebuie avută în vedere si problema mutaţiilor. Interpretarea rezultatelor în cazul corespondenţei a doua profile cromozomiale Y. Dacă un barbat prezintă profil cromozomial Y al criminalului, ce valoare are observaţia şi cum trebuie facută interpretarea cazului? Primele consideratii ce trebuiesc facute intr-o astfel de situatie privesc modul de transmitere al cromozomului Y profile

Y identice se regasesc si la fraţii suspectului, la tatăl acestuia, la fii, la unchii şi nepotii

paternali, la verii paternali, etc. Odata eliminati din cercul de suspecti acesti barbati

inruditi biologic, rămâne de evaluat doar frecvenţa cu care se regăseşte respectivul profil

Y într-o anumită populaţie. De aici şi problema care apare mereu: ce populaţie trebuie

să fie analizată pentru ca frecvenţa să fie estimată cu maximum de acurateţe? Pentru sistemele de markeri ADN autozomali, corespondenţa perfectă a două profile ADN este posibila doar pentru gemenii monozigoti - din punct de vedere teoretic, singurul individ care poate avea un profil identic cu al unui suspect este doar fratele geamăn, situatie rar intalnita. Pentru analiza ADN mitocondrial se cunoaste ca toţi descendenţii pe linie maternală prezintă secvenţe identice de ADNmt. Deducerea populaţiei de origine după genotipul Y. Compararea distribuţiei diferitelor varietati structurale cromozomilae Y în populaţiile umane a relevat existenţa unui grad înalt de specificitate populaţională. În anumite populaţii, indivizii de sex masculin pot aparţine unui singur haplogrup Y in proportie de pana la 90%. (studii raportate pe populatii amerindiene). În aceste cazuri, analiza cromozomului Y are desigur o informativitate scazută pentru identificare. Diversitatea scazută a haplogrupurilor Y rezultă din fluctuaţiile în numărul de fii pe care fiecare bărbat îi are într-o populaţie. Variaţia aceasta naturală poate fi exacerbată în anumite societaţi datorită constrângerilor de ordin cultural şi practitilor maritale. Populaţiile urbane în care investigatorii judiciari operează frecvent sunt amestecate şi intricate ca origine comparativ cu populaţiile pe care îşi raportează studiile genticienii antropologi. De aceea gradul înalt de specificitate al profilelor cromozomiale Y, face ca acest tip de analize să fie deosebit de tentant pentru anchetatori în încercarea lor de localiza haplotipul Y al unui suspect într-un anumit grup etnic. Este deja o certitudine faptul ca informaţiile furnizate de un profil Y pot orienta decisiv o investigaţie judiciară, cu conditia cunoasterii frecvenţelor profilelor cromozomiale Y in populatia respectiva. Dacă genotiparea cromozomului Y devine mai complexă şi bazele de date ADN-Y devin operaţionale în tot mai multe parţi ale lumii, pare probabil ca în viitorul apropiat, toţi infractorii bărbaţi să îşi aibă haplotipul Y înscris în ele. Geneticienii legişti apreciază că într-un viitor nu foarte îndepărtat, un profil cromozomial Y suficient de detaliat, va putea indica ofiţerilor de poliţie populaţia de origine şi poate chiar şi numele de familie al infractorului care a lasat o urmă biologică la locul unei fapte. Un astfel de scenariu, deocamdată la limita cu şiintifico-fantasticul, va pune pe gânduri pe mulţi dintre indivizii certaţi cu legea când va deveni realitate. Cea mai cuprinzatoare bază de date internationala cu profile cromozomiale Y este organizată de cercetătorii de la Universitatea Humbold din Berlin (www.yhrd.org). Baza de

12 procedee de laborator consumatoare de timp, laborioase, utilizate pentru evidentierea profilelor ADN autozomale specifice victimei si agresorului

222

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

date conţine peste 20.000 de haplotipuri Y european- caucaziene, fiind o referinţă importanta atat pentru interpretarea rezultatelor testarilor efectuate de rutina in laboratoarele de gtentica judiciara cat si pentru studiile de genetică populaţională intreprinse pe cromozomul Y. Introducerea din 2002-2004 a kiturilor comerciale omologate pentru markerii STR-Y

a permis evaluarea performantelor de lucru si a condus deja la elaborarea de standarde in

analiza ale markerilor STR-Y de catre comunitatea stiintifica internationala. Genotiparile pe cromozomul Y au intrat si în practica medico-legală şi criminalistica din România incepand cu 2003 odata cu efectuarea primului studiu populational largit pe markeri STR-Y si raportarea datelor catre baza de date europeana. Identificarile judiciare si cercetarea paternitatii cu ajutorul markerilor ADN specifici cromozomului Y sunt deja o realitate în multe servicii de genetică judiciară din lume, iar specialiştii din domeniu sunt in prezent unanim de acord că analiza polimorfismului cromozomului Y trebuie să intre în repertoriul de analize al tuturor laboratoarelor de genetică medico-legală şi criminalistică.

Bazele de date ADN. Analiza ADN este un mijloc de identificare comparativa extrem de eficient, iar odata analizata o proba biologica, rezultatul poate fi pastrat intr-o banca de date. Posibilitatea obtinerii de profile ADN cu ajutorul reactiilor PCR multiplex a fost un factor cheie in reducerea costurilor si accelerarea testarilor, conducand in final la creerea unor baze de date ADN. O banca de date nationala poate identifica cu usurinta in special pe infractorii care opereaza intr-un teritoriu national sau chiar international. Premisa de la care se proneste in alcatuirea unei baze de date este ca anumite tipuri

de infractori recidiveaza de regula comitand aceleasi tipuri de acte infractionale. Se preteaza

la stocare in banca de date acele tipuri de infractiuni in care infractorii lasa urme biologice in

urma comiterii unui act criminal: viol, omor, talharie, etc. Prima baza de date ADN cu markeri de tip STR din lume a fost lansata in aprilie 1995 in Marea Britanie. Pentru crearea acestei baze de date s-a utilizat profile alcatuite din 6 markeri STR analizati cu ajutorul unui multiplex PCR. Banca de date cuprindea in 2003 peste 2.000.000 profile, servind la depistarea a peste 200000 de corespondente, pretul de cost al unei operatiuni de inregistrare si comparare a unei probe fiind de 42 de lire. Baza de date apatine Home Office (echiv. Minist. de Interne), iar de administrarea ei se ocupa Forensic Science Servicies. In momentul de fata, aceasta baza de date, cea mai cuprinzatoare din lume. Pe rand, urmand initiativa britanicilor, si alte state europene si-au creat baze de date nationale: 1997 - Olanda, 1998- Austria, Germania, 1999 - Danemarca, Finlanda, 2000- 2001 Belgia, Franta, Norvegia, Suedia, Elvetia. Concomitent cu intorducerea acestor baze de date ADN, statele respective au adoptat si legislatia corespunzatoare implementarii unor astfel de obiective. Deschiderea granitelor in cadrul proceselor de integrare europeana a condus si la cresterea cotelor criminalitatii transfrontaliere, in special la proliferarea “cercurilor pedofile” in unele tari ale Comunitatii Europene. Ca urmare, presiunea este in crestere pentru crearea de baze de date nationale in toata Uniunea Europeana. Mai mult, in 2002, forurile de decizie unionare au decis sa finanteze in urmatorii 5 ani crearea unei Baze de Date ADN Pan-Europene, care sa permita schimbul de profile genetice intre tarile membre. In Statele Unite, toate cele 50 de state ale SUA au baze de date cu amprentele genetice ale celor condamnati dupa 1992-1994, ajutand la rezolvea unor cazuri dificile de omor, talharii, identificarea persoanelor disparute. Sistemul de inregistrare in US National DNA Databank cuprinde un set de 13 loci STR - CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51 si D21S11 - denumit CODIS-. Presiunea legata de alcatuirea unei baze de date a crescut in urma arestarii unui suspect, presupus criminal in serie in baza unui test ADN. Procurorul care a condus investigatiile a declarat presei ca unul dintre obsatacolele majore care a determinat intarzaierea arestarii acestui agresor sexual cu multiple condamnari la activ, a fost inexistenta unei baze de date ADN. Aceasta in conditiile in care la vremea respectiva planurile pentru organizarea unei baze de date existau, insa disputele pe marginea amendametului pentru conservarea probelor biologice tergiversau adoptarea legii. Si decizia germana de a crea o baza de date ADN pentru infractorii condamnati pentru crime, agresiuni sexuale, talharie si alte infractiuni grave a fost mult

223

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

intarzaiata de problemele legate de protectia informatiilor. Adoptarea legii in Germania s-a facut tot sub presiunea unei seriii de evenimente tragice, in care au fost descoperite cadavrele unor copii agresati sexual. Pentru fiecare tara exista legislatii care precizeaza tipurile de infractori ce pot fi inclusi in bazele nationale de date ADN, cate probe poate cuprinde o baza de date, metodologia de identificarea prin cautare in baza de date si in ce mod informatiile furnizate de o astfel de baza de date pot constitui probe in fata insatantei de judecata. Cele mai restrictive sisteme legislative in domeniu prevad includerea in bazele nationale de date numai a profilelor infractorilor condamnati pentru delicte sexuale si crime deosebit de grave. Alte sisteme legislative, permit alimentarea bazelor de date cu rezultatele obtinute la toate cazurile judiciare, si chiar cu rezultatele testarilor din bancile de sange, din centrele de counceling genetic si de screening al maladiilor genetice, rezultatele testelor de paternitate, etc. Motivul invocat pentru o astfel de politici extrem de permisive este cel al necesitatii efectuarii unor estimari probabilistice corecte avand ca reper esantioane populationale cat mai reprezentative numeric. Exista in prezent un consens general ca bazele de date ADN ajuta nemijlocit la accelerarea investigatiilor criminale si solutionarea crimelor grave si implicit la eliminarea supectilor inocenti. Crearea bancilor de date suscita insa inca vii discutii cu privire la drepturile persoanelor a caror ADN este pastrat in aceste baze, deoarece o analiza genetica poate in orice moment releva si alte date decat cele legate de identificare - date legate de codul genetic - atentand astfel grav la intimitatea biologica a unui individ uman. Politia britanica din Marea Britanie recunoaste ca baza de date serveste in prezent si unor studii stiintifice. In serviciul ADN al Forensic Science se testeaza de cativa ani o serie de markeri pentru determinarea culorii pielii, ochilor, parului si rasei unui individ. Identificarea rasei se poate deja realiza cu o marja de eroare de numai 2-3%. Geneticienii legisti sunt de parere ca testele ADN vor servi in viitor la reconstituirea unui adevarat portret fizic al criminalului pornind de la o pata de sange descoperita la locul unei crime Probabil va mai trece ceva timp pana ce acest scenariu de film va fi pus integral in practica, insa studiile asupra genelor care determina aspectul fetei unei persoane sunt demarate in multe laboratoare.

Legislatie. Laboratoarele acreditate sa efectueze teste ADN in scop de identificare sau de paternitate trebuie sa indeplineasca o serie de criterii prevazute in regulamente speciale interne sau internationale (se includ aici criterii de calitate, competente profesionale, etc.). Acreditarile pentru efectuarea testelor sunt date de agentii nationale sau internationale. Persoanele inscrise pe listele speciale ale expertilor judiciari primesc la randul lor acreditari dupa criterii prestabilite.

In loc de concluzii. Amprenta genetica si-a castigat un loc de marca intre mijloacele de proba, fiind considerata la ora actuala drept o adevarata “regina a probelor” sau “proba perfecta”. In mai putin de 15 ani de cand au patruns in arena justitiei, amprentele genetice au cunoscut o cariera meteorica. Justitia moderna este revolutionata si in acelasi timp bulversata de aceste aplicatii ale geneticii moleculare. Inainte de 1990-1992, analizele serologice ofereau magistratilor anumite indicatii asupra provenientei unei probe biologice. Testele ADN permit in prezent excluderea cu certitudine a unor suspecti, precum si indicarea cu o rata foarte inalta a probabilitatii celui culpabil. Bineinteles ca nici cea mai performanta analiza genetica nu va puta inlocui o ancheta judiciara, insa o poate face mai eficienta prin bogatia de informatii furnizate. Pe masura ce tehnologiile de identificare se imbunatatesc si sunt utilizate pe scara tot mai larga, se ridica foarte acut şi intrebari serioase despre libertatile civile si dreptul la intimitate ale persoanelor testate genetic. Avalanşa informatiilor şi succesiunea rapidă a tehnologiilor din domeniul identificărilor genetice pare sa nasca în prezent un nou tip decalaj, de această dată de tip subiectiv, prin incapacitatea specialiştilor legişti de a asimila şi a transpune în practica toate aceste noi achizitii.

224

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Scurta incursiune istorica a cercetarii filiatiei rezolvate prin analiza profilului ADN

Teste pentru emigranti Primul caz rezolvat de catre Jeffreys, considerat descoperitorul si pionierul aplicarii amprentelor genetice in justitie, a fost un caz de imigratie datand din 1985: un copil nascut in Marea Britanie paraseste tara pentru a trai o perioada de timp in Ghana alaturi de tatal sau. La intoarcerea in tara, autoritatile au pus la indoiala identitatea baiatului. S-au efectuat analize serologice care au indicat ca baiatul putea fi atat fiul cat si un posibil nepot al mamei sale. Coroborarea testelor ADN ale copilului, mamei sale si a unor rude paterne, tatal nefiind disponibil, a evidentiat ca maternitatea si paternitatea baiatului erau certe permitand repatrierea acestuia. In acelasi an, 1985, autoritatile britanice respingeau aproape jumatate din cele peste 12000 de cereri de rezidenta cu statut de emigrant ale sotiilor si copiilor unor emigranti din Pakistan si Bangladesh. (Jeffreys AJ,

Nature317/1985)

Cazul Collin Pitchfork - autor al unui dublu asasinat. În regiunea Midlands din Marea Britanie fusesera agresate sexual si omorâte, la un interval de trei ani, doua femei tinere, iar politia avea unele indicii ca autorul era un barbat tânar, localnic, cu vârsta cuprinsa între 17 si 34 de ani. Ca urmare, anchetatorii au luat decizia ca toti barbatii care se încadrau în aceste limite de vârsta sa fie chemati pentru a li se preleva sânge. Scopul declarat al actiunii a fost acela al efectuarii unui screening populational pentru depistarea unei maladii. Actiunea - denumita operatiunea "sângerarea"si-a demonstrat eficacitatea. Profilul genetic al unuia dintre donatori - Collin Pitchfork - s-a dovedit a fi identic cu profilul genetic obtinut prin analiza probei de sperma recoltata de pe corpul uneia dintre victime. Criminalul si-a marturisit ulterior faptele si a fost condamnat.

Averea unei victime Fosta prietena a unui barbat decedat intr-un accident de trafic a pretins ca era insarcinata cu victima, legislatia respectivului stat american declarand ca mostenitor de drept al averii celui disparut pe copilul ce urma a se naste. Dupa nasterea copilului, au fost recoltate probe biologice de la mama si, copil, iar o proba de ADN a barbatului decedat a fost conservata timp de 10 luni. Astfel compararea amprentelor genetice ale celor trei au evidentiat ca revendicarile mamei erau nefondate, barbatul decedat excluzandu-se de la paternitate. (Lifecodes corporation, 1986)

False acuze de incest O adolescenta este acuzata in 1986 de omorarea tatalui. Fata a motivat fapta prin aceea ca tatal a fost cel care a abuzat sexual de ea lasand-o insarcinata. Fata a pierdut sarcina, iar probele biologice provenind de la fetusul avortat, de la acuzata si de la decedatul tata au fost supuse tiparii ADN. S-a dovedit astfel ca tatal fetei nu era tatal biologic al fetusului avortat, instanta pronutandu-se ca acuzele de agresiune sexuala incestuoasa invocate in legitima aparare erau nefondate.(Lifecodes Corporation,1986 !

Cazul Mengele Dr. Josef Mengele, supranumit “ingerul morti”, a condus unele din cele mai oribile experimente cu fiinte umane in lagarele de concentrare naziste. In 1945,la terminarea razboiului, el fuge si se ascunde sub o identitate falsa in America de Sud. In 1979 decedeaza, cel mai probabil in urma unui atac de cord. La putin timp dupa aceasta autoritatile germane au deschis o ancheta oficiala pentru a certifica identitatea persoanei decedate si suspectate a fi fost dr. Mengele. Intrucat existau mai multe dubii cu privire la identificarea scheletului, s-a dispus efectuarea unui test ADN din respetivul material osos in 1992. Profilul obtinut din proba de os au fost comparata cu profilele sotiei lui Mengele,Irene si ale fiuui sau Rolf . Comparand profilele celor trei s-a dovedit astfel ca alele de origine paterna ale lui Rolf se potriveau cu cele evidentiate din ADN-ul osos al celui exhumat. Sansa ca subiectul analizat sa nu fi fost tatal lui Rolf a fost estimata ca fiind mai mica de 0,005%. Urmare a acestei analize autoritatile germane au inchis cazul Mengele considerandu-l definitiv rezolvat.

Primul “sex-scandal” prezidential din istoria Statelor Unite Acum doua sute de ani in urma Thomas Jeffreson (1743-1826), cel de-al treilea presedinte american a fost incriminat intr-un jurnal din Richmond (1802) ca avand o relatie extraconjugala cu sclava sa Sally Hemings, relatie din care ar fi rezultat mai multi copii ilegitimi. Intr-un proces intentat in 1804 de un tribunal din Massachusetts, Jeffreson a negat toate acuzatiile ce i s-au adus, care de fapt erau mai mult de ordin circumstantial, fara o sustinere cu probe obiective. Scandalul a fost declansat in perioada alegerilor electorale insa nu a avut efectul scontat, popularitatea lui Jeffreson nefiind afectata si castigand alegerile prezidentiale. Controversele pe seama acestei saga au alimentat o intreaga literaura pana in ziua de azi. Pentru un grup de geneticieni solutia a fost sa compare cromozomii Y ai unor descedenti pe linie masculina apartinand celor doua familii Jeffreson si Hemings. Se cunoaste ca cea mai mare parte a cromozomului Y trece intact de la tata la fiu, de aceea el poate servi ca studiu intr-o linie de descendenta masculina. Cercetatorii au analizat mai multe seturi de markei polimorfici ( in total 19) ai ADN apatinand cromozomului Y si au publicat rezultatele cercetarilor lor in revista Nature/nr.27/1998 . Haplotipul lui Jeffreson nu a prezentat nici un punct comun cu cel al lui Tom Woodson (n.1790), primul fiu al sclavei Sally Hemings, concluzia geneticienilor fiind ca presedintele nu a fost tatal biologic a acestui copil. In schimb ei au gasit o potrivire perfecta intre haplotipul Y-ului lui Jeffreson si cel al lui Eston Hemings (n.1808), cel de-al cincilea fiu al lui Sally, probabilitatea ca acesta portivire sa apara intr-o populatie fiind mai mica de1%. Interesant este ca nu acest copil a fost obiectul scandalului de presa declansat in 1802, ci primul nascut al lui Sally Hemings.

225

CURS DE MEDICINĂ LEGALĂ

UMF “Carol Davila”

Din punct de vedere politic, verdictul geneticienilor in cazul lui Thomas Jeffreson a fost speculat de media in noiembrie 1998 in timpul audierilor presedintelui William Jeffreson Clinton pentru a motiva intr-un fel relatia sa extraconjugala: dupa cum se stie si in acest caz testul ADN a servit ca proba obiectiva in sustinerea acuzatiilor procurorilor. Acest episod a servit la demolarea imaginii unui erou sacru al Americii, Thomas Jeffreson, reamintind lumii ca mai ales presedintii nu sunt dumnezei sau sfinti, ci oameni ca toti oamenii cu toate slabiciunile si imperfectiunile care caracterizeaza o fiinta umana.

In cautarea adevaratilor parinti sau identificarile ADN in slujba drepturilor omului.

O tragedie de proportii s-a produs in Argentina intre 1975-1983 in timpul regimului militar, conducand la

raportarea disparitiei a circa 15.000 de persoane. Aproximativ 200 de copii au fost nascuti in conditii de captivitate. Cei mai multi dintre genitorii acestor copii au murit in inchisori, iar copiii au fost adoptati si crescuti in famillii de militari. In unele cazuri s-a dovedit ca unii militari au fost implicati in uciderea parintilor biologici ai copiilor pe care ulterior i-au luat in ingrijire. Investigatiile intreprinse dupa caderea regimului militar de catre Comitetul pentru Persoane Disparute au scos la iveala in multe cazuri, existenta unor certificate de nastere false emise pentru copii unor familii de militari, desi respectivii negau implicarea lor si se pretindeau a fi parintii biologici ai acestor copii. In familiile de militari unde s-a sesizat ca fiind suspecta provenienta unui copil, autoritatile au intreprins eforturi pentru obtinerea de

probe biologice de la copii, familia “adoptiva” si de la presupusele rude ale copiilor, in special de la bunici. Proiectul a fost sustinut de American Association for the Advancement of Science care a efectuat testele de ADN genomic si mitocondrial. S-a urmarit studiul transmiterii unor alele pe parcursul a doua generatii si apoi s-a calculat probabilitatea stabilirii unor grade de rudenie intre persoanele vizate. Numai puterea de discriminare extrem de mare a testelor ADN a facut proiectul sa fie viabil, astfel incat in urma acestor eforturi 51 de copii au fost identificati si redati familiilor lor biologice.

Familia Romanovilor In 1991 guvernul sovietic a ordonat efectuarea de excavatii in orasul Ekaterinsburg cu scopul de a identifica groapa comuna in care au fost ingropati dupa executie in 1918 tarul Nicolae al II-lea si familia sa. Specialistii au identificat cu aceasta ocazie osemintele tarului , tarinei Alexandra si a trei dintre copii lor, impreuna cu cele ale unor servitori si ale medicului de familie. In 1992, probe de os au fost genotipate in Marea Britanie in laboratorul de la Forensic Science Service. Tiparea mai multor loci de tip STR a evidentiat relatia de rudenie intre cei cinci membri ai familiei tarului. Apoi s-a procedat si la tiparea ADN mitocondrial pentru a se confirma ca intr-adevar familia respectiva este a Romanovilor:

secventele de ADN mitocondrial ale tarinei Alexandra si celor trei fiice ale sale au fost comparate cu cele ale printului Philip, sotul reginei Elisabeta a II-a., dovedindu-se a fi identice. Bunica materna a printului consort a fost sora cu tarina Alexandra, deci teoretic la toti cei cercetati trebuia sa se regaseasca aceeasi structura a ADN mitocondrial mostenit pe linie materna, lucru care s-a dovedit si in practica. Analiza ADNmt extras din osemintele tarului a pus o serie de probleme cercetatorilor deoarece in urma secventierii ADNmt s-a evidentiat un profil heteroplasmc (prezenta a doua variante structurale in populatia de ADNmt la aceeasi persoanaca urmare a unor fenomene mutationale). Cum genomul mitocondrial se mosteneste exclusiv pe linie materna, in mod normal un singur tip de ADNmt se regaseste la o persoana. Analizele au fost repetate in mai multe laboratoare britanice si americane rezultatul fiind acelasi. Autoritatile ruse au autorizat exhumarea fratelui tarului, Marele Duce Gheorgij Romanov, decedat de tuberculoza in 1895, pentru a se permite cercetatorilor sa preleveze probe biologice. Rezultatul a fost ca genomul mitocondrial al fratelui tarului prezenta acelasi tip de anomalie ca si tarul Nicolae, anomalie ce a fost mostenita de la mama lor. Astfel a fost confirmata si identitatea osemintelor tarului.

A ramas neelucidata soarta altor doi copii ai familiei tarului: ducesa Anastasia si tariceviciul Alexei. In ce

priveste identitatea Anastasiei cea mai cunoscuta persoana care si-a revendicat aceasta identitate a fost Ana

Anderson decedata in 1984 in Charlottesville, Virginia

Analiza secventelor de ADNmt extras din probe de par ale

decedatei nu au evidentiat nici o potrivire cu cele ale tarinei Alexandra. Pretinsa printesa a fost dovedita de cercatatori ca fiind o impostoare. Misterul Anastasiei, fiica cea mai mica a tarului disparuta fara urma va continua

astfel sa inspire literatura si cinematografia pentru inca multi ani.

Site-uri educationale despre testele ADN medicale si medico-legale:

1. http://www.accessexcellence.org

2. http://www.fbi.gov/

4. http://www.vector.chsl.org/resources/aboutdnafingerprinting.html

5. http://www.promega.com/profiles/

226