Universit de Constantine III

Facult de Mdecine PR Bensmail

Dpartement de Pharmacie
Laboratoire de Chimie Analytique
6me Anne

DEMARCHE METHODOLOGIQUE
EN ANALYSE PHARMACEUTIQUE
Constantine les 5 et 7 Mars 2013
Dr B.ACHOUR-BOUAKKAZ
I)
II)

INTRODUCTION
RAPPEL DES METHODES ANALYTIQUE
1) Mthodes danalyses chimiques
2) Mthodes danalyses instrumentales

III) CHOIX DUNE METHODE ANALYTIQUE

III1)

METHODES DIDENTIFICATION
a) Matire premire
b) Milieux biologiques

III2) METHODES DE DOSAGE

a) Matire premire
b) Formes pharmaceutiques (produit fini)
c) Milieux biologiques
1

I-INTRODUCTION
-La chimie analytique est une science fondamentale, elle regroupe les mthodes en analyse
chimique qualitative et quantitative.
Lanalyse chimique a fait preuve de beaucoup dinnovations, avec lautomatisation des
mthodes analytiques utilisant des instruments trs puissants et trs performants en
sensibilit et spcificit.
Pour conseiller la meilleure mthode afin de rsoudre le problme danalyse, il existe une
science appele chimiomtrie.
La chimiomtrie regroupe lensemble des mthodes dexploitation (statistiques) pour
rsoudre le problme pos en sappuyant sur loutil informatique.
Elle cherche a apport une rponse correcte par exploitation des rsultats afin de rduire
le nombre dessais pour les analyses longues et couteuses.
La chimie analytique englobe donc lanalyse chimique et la chimiomtrie.
En effet des mthodes danalyses fiables sont requises pour assurer la conformit avec la
rglementation nationale et internationale dans tous les domaines danalyse et celui du
domaine pharmaceutique.
Le laboratoire danalyse doit prendre les dispositions appropries pour sassurer quil est en
mesure de fournir les donnes de niveau de qualit requis par lutilisation de mthodes
valides en respectant les critres de validation.
-

Rptabilit

Reproductibilit

Spcificit

Linarit

Robustesse

Limite de dtection et de quantification

I)

Rappel des mthodes analytiques :

Mthodes chimiques danalyse

Mthodes instrumentales danalyse

1) Mthodes chimiques danalyse :
Elles sont caractrises par leur simplicit, leur rapidit de mise en uvre et un faible
cot du matriel. Elles sont dcrites dans la pharmacope et appliques aussi bien pour
les matires premires que pour les formes pharmaceutiques simples. On distingue :
2

Mthodes protomtriques

Mthodes doxydorductions

Mthodes complxomtriques

- Mthodes par prcipitations

- Mthodes de dosage par paires dions
Ces techniques manquent de spcificit et sont difficilement applicables aux mlanges
complexes sans extractions pralables des constituants doser. Mais elles ont toujours
leur place parmi les mthodes actuelles des diffrentes pharmacopes.
a) Protomtrie en milieu aqueux et non aqueux :
- Il sagit de ractions acide/base selon la dfinition de Bronsted mettant en jeux des
protons do le nom de protomtrie.
La protomtrie est une mthode bien adapte aux matires premires, et adaptable dans
certains cas au produit fini (forme pharmaceutique).
Elle reste actuellement une mthode de base pour le contrle de la matire premire dans
lindustrie pharmaceutique.
La mthode est dcrite dans la pharmacope franaise, dans la pharmacope europenne et
dans dautres pharmacopes.
On distingue deux grands types de protomtrie :
-

Protomtrie en milieu aqueux = sapplique essentiellement aux acides et bases

minraux (gnralement forts en milieux aqueux). Peu de molcules organiques
dintrt pharmaceutique peuvent tre doses par ces mthodes (acide/base
organiques faibles).
Le point de fin de titrage est dtermin soit par les indicateurs colors, soit par
potentiomtrie.

Protomtrie en milieux non aqueux = met en jeux des ractions acide/base dans des
solvants autres que leau. Elle sera mise en uvre quand :
le compos doser est insoluble dans leau
la force de lacide ou de la base est trop faible pour tre dos en milieu
aqueux.
Mlange de polyacides ou polybases
Elle ncessite un bon choix du solvant (solvants peu toxiques et peu chers)

Exemple : le benzne permet le dosage des bases organiques mais il est peu employ
cause de sa toxicit
b) La complxomtrie = est une des mthodes volumtriques les plus utilises, en
particulier pour le dosage des matires premires pharmaceutiques. Elle est
3

largement dcrite dans la pharmacope pour la dtermination du titre des sels de

mtaux bivalents ou trivalents soit par mthode directe, soit par retour.
-

En analyse qualitative elle est utilise pour :

Lidentification de ligands dans les essais limites des matires premires
(recherche dimpurets).
Comme ractions didentification dune matire premire

En analyse quantitative : la formation de complexes peut donner lieu de trs

nombreuses exploitations quantitatives.

dosages complxomtriques ou complxonomtriques utilisant E.D.TA, Na2

ou complexon III dans les mthodes volumtriques pour la dtermination des
sels de mtaux bivalents ou trivalents, soit par mthodes direct ou par
mthodes en retour.

Dosages spectroscopiques : lorsquun complexe est fortement color, il peut

tre exploit dans un dosage colorimtrique Exemple dosage du Fer (Fe2+)
Les mthodes complexomtriques sont aussi prcises que la spectroscopie dabsorption
atomique S.A.A, mais beaucoup moins spcifique et sensible.
La complxomtrie est prfre parfois la S.A.A pour des raisons de simplicit et du
cot du matriel.
c) Mthodes doxydorduction = un grand nombre dapplications simples, prcises et
dont la mise en uvre est gnralement peu couteuse.
Les diffrentes techniques couramment utilises sont :
-

La manganimtrie utilisant le pouvoir oxydant du permanganate du potassium KMnO4.

Exemples dapplications :
Dosage des sels ferreux et sels ferriques
Dosage de leau oxygne
Dosage des sucres rducteurs (mthode de Bertrand) trs utilise en
bromatologie

La chromimtrie = utilisant le pouvoir oxydant du bichromate de potassium K2Cr2O7

cest une technique connue pour le dosage de lthanol (Mthode de Cordebard)

Lhalognomtrie : comprend lensemble des mthodes qui utilisent les proprits

oxydorductrices des principaux halognes (chlore, iode, brome, ) chloromtrie,
iodomtrie, bromomtrie
4

Periodimtrie. Comprend lensemble des mthodes de dosage utilisant les proprits

oxydantes du systme oxydorducteur I+7/ I+5

Ces techniques sont peu spcifiques, ce qui limite leur emploi au contrle des matires
premires. En effet dans le cas dun mlange de constituants (produit fini, milieu
biologique), il est prfrable dutiliser une mthode danalyse plus spcifique.
2) Mthodes instrumentales danalyse :
a) Mthodes chromatographiques : ce sont des mthodes de sparation,
didentification, et de dosage.
Principe gnral : il est bas sur la rpartition des substances du mlange analyser
entre deux phases, lune mobile et lautre stationnaire
La phase mobile peut tre :
-

liquide et on parle de chromatographie en phase liquide.

un gaz et on parle de chromatographie en phase gazeuse.

Un fluide supercritique et on parle de chromatographie en phase supercritique.

Couple des systmes de dtection trs puissants, la chromatographie est trs

utilise en analyse pharmaceutique :

-

Matires premires

Produits finis

Surtout le dosage des mdicaments dans les milieux biologique (sang et urine)

Les diffrentes techniques de chromatographie :

-

La chromatographie sur couche mince (C.C.M) ou appele aussi chromatographie

planaire. Utilisant des plaques sur laquelle est dpose la phase stationnaire en une
couche trs mince.
La rvlation ou la dtection des substances se fait sur la plaque, il sagit dune
chromatographie par dveloppement.
Chaque substance est caractrise par son facteur de retardement ou facteur de
rtention Rf mesur directement sur la plaque
Lidentification dune substance se fait en comparant son Rf avec le Rf dune
substance de rfrence (talon).
La C.C.M est trs utilise pour lidentification et la dtermination de la puret

la matire premire.( mthode pharmacope)

Utilise aussi pour la dtection des mdicaments dans les milieux biologiques
(toxicologie)
5

de

La chromatographie en phase gazeuse C.P.G :

Cest une mthode de sparation sur colonne, utilise pour les substances volatiles
ou volatilisables vhicules par un gaz inerte appel gaz vecteur.
Les applications de la C.P.G sont nombreuses. Dans le domaine pharmaceutique elle
est utilise en analyse qualitative et quantitative
En analyse qualitative : les grandeurs de rtention volume ou temps de
rtention sont caractristiques dune substance ; elles peuvent tre utilises
dans un but didentification.
- pour vrifier la puret de certaines matires premires.
-Sparation des mdicaments dune mme famille en toxicologie.
En analyse quantitative : lanalyse quantitative est base sur la mesure de la
surface du pic enregistr puisquelle est proportionnelle la quantit de
substance lue.
Du fait de sa sensibilit, la C.P.G a permet le dveloppement des dosages des
mdicaments surtout dans les milieux biologiques
Plusieurs types de dtecteurs peuvent tre utiliss, de sensibilit et spcificit variables.
On peut citer comme dtecteurs :

Lionisation de flamme (FID : flamme ionisation detector) le plus utilis

Le catharomtre

Capture dlectrons

Dtecteur thermoonique

Avec lutilisation des colonnes capillaires trs performantes, et le couplage avec

dautres mthodes danalyse comme :

La spectromtrie de masse C.PG/Masse

La spectromtrie Infrarouge C.P.G/IR

A permet les identifications complexes.
La chromatographie en phase liquide = cest la plus ancienne des mthodes

chromatographiques. ( exprience de Mickael Tswest = sparation des pigments

colors par lther de ptrole utilis comme phase mobile sur une colonne remplie de
carbonate de calcium qui constitue la phase stationnaire) do le nom de
chromatographie : chroma du grec signifie couleur.
Avec lutilisation de phases stationnaires de fine granulomtrie diamtre des grains
environ 3um, et les pompes puissantes. La chromatographie liquide a chang de nom est
devenu :

Chromatographie liquide haute pression ou haute performance C.L.H.P

6

(en Franais), High performance liquid chromatography H.P.L.C (en Anglais)

Les systmes de sparation les plus courants qui sont mis en uvre sont :
Adsorption : la phase stationnaire est solide
Partage classique ou mode normale : utilisant une phase stationnaire liquide
polaire et une phase mobile apolaire.
Polarit de phase inverse ou reversed phase (R.P) : dans ce cas la phase
stationnaire liquide est apolaire et la phase mobile est polaire.
75% des sparations sont ralises en mode inverse utilisant des colonnes R.P contenant
des phases stationnaires greffes formes de longues chaines de carbone. EX : colonne
R.P C8 et R.P C18
Les dtecteurs utiliss en chromatographie liquide :
Spectrophotomtre UV/Visible = aprs les dtecteurs longueur donde fixe (254
ou 280 nm), lapparition sur le march de spectrophotomtres longueur donde
variable (de 190 700 nm) a considrablement tendu leur domaine dapplication ; ils
restent cependant des dtecteurs spcifiques dont la rponse dpend
essentiellement de labsorptivit du solut (application de la loi de Beer-Lambert)
Spectrofluorimtre = destin au dpart aux composs fluorescents, le champ
dapplication de ce dtecteur sest dvelopp grce aux ractions chimiques de
drivation pr ou post colonne laide de marqueurs fluorescents.
Dtecteur lectrochimique = ce type de dtection, qui ne sapplique quaux
substances oxydables ou rductibles sest extrmement popularis ces dernires
annes. On peut citer le dosage des catcholamines.
-La chromatographie en phase supercritique CPS : Complmentaire des
chromatographies en phase liquide et gazeuse:
La CPG exige la volatilit et la stabilit thermique des soluts;
LHPLC labsence de dtecteur aussi universel et sensible que le dtecteur
ionisation de flamme
Phase mobile(CO2):peu couteux, atoxique, ininflammable, bon pouvoir solvant, sans
odeur
-La chromatographie ionique : est lvolution moderne de la chromatographie par
change dions. Son principe est fond sur les proprits des rsines changeuses dions qui
permettent une fixation slective des anions ou des cations prsents dans une solution. La

chromatographie ionique est considre comme la mthode de rfrence en matire de

dosage des espces ionique.
Cette mthode sapplique aussi bien aux anions quaux cations conjugus des protolytes
forts mais elle est cependant, actuellement surtout utilise pour doser les anions minraux
difficiles dterminer par les autres procds chromatographiques :
Chlorures, nitrates, phosphates et sulfates en hydrologie par exemple.
b) Mthodes lectrochimiques :
Les mthodes lectrochimiques mettent en jeu des ractions lectrochimiques, c'est-dire des ractions o il existe un change dlectrons entre un conducteur ionique (la
solution) et un conducteur lectronique (une lectrode).
Les mthodes lectrochimiques sont utilises pour le contrle de la matire premire
(protomtrie en milieu aqueux et non aqueux) et dans les mesures prcises de pH.
La mesure du pH : paramtre trs important qui caractrise la puret dune
substance, une valeur anormale du pH est lindice de la prsence dune impuret.
On distingue :
les mthodes indicatrices =
-

Polarographie

Ampromtrie

Potentiomtrie

Coulomtrie
Les lectrodes slectives = elles permettent la mesure dune espce dans un mlange
sans prparation. La dtection peut tre ampromtrique ou potentiomtrique
c) Mthodes instrumentales spectrales : de nombreuses mthodes analytiques sont
fondes sur les interactions entre la matire et une radiation lectromagntique. Le
phnomne exploit en analyse datomes ou de molcules, est labsorption de la
radiation ou la restitution sous forme de lumire de lnergie absorbe.
Les mesures sont ralises aussi bien sur un liquide que sur un solide (spectromtrie
dabsorption ou dmission molculaire) ou sur une vapeur atomique produite dans une
flamme ou dans un four (spectromtrie dabsorption ou dmission atomique).
-Spectrophotomtrie UV/VISIBLE :

-Son domaine spectral est compris entre 50 800nm

Zone comprise entre 50 200nm (UV lointain) ce domaine nest pas utilis en pratique car
lnergie est trop importante.
Zone comprise entre 200 400nm (UV proche). Lnergie reste leve, on observe soit
des transitions lectroniques, soit des ractions photochimiques.
Zone comprise entre 400 800nm (visible).
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La Spectrophotomtrie UV/VISIBLE

est utilise en analyse qualitative et quantitative

Application qualitative : identification dune matire premire par la dtermination

de labsorbance spcifique dune substance.
Elle nest pas parfaite comme mthode didentification
Application quantitative = dosage bas sur la loi de Beer- Lambert qui relie
labsorbance la concentration de la substance doser une longueur donde donn
Utilisation de la technique UV/VISIBLE comme dtecteur aprs sparation par
chromatographie liquide H.P.L.C

H.P.L.C/UV/Visible classique

H.P.L.C/UV/Visible barrettes de diodes H.P.L.C/D.AD qui est la plus utilise

actuellement en raison de sa puissance de dtection. Toutes les longueurs dondes de
200 800 nm peuvent tre analyses simultanment en quelques secondes.

Nouvelles applications de la spectroscopie UV/VISIBLE

-

Analyse multi composants

Spectromtrie drive
-Spectrophotomtrie Infrarouge :
On distingue habituellement trois rgions:

Linfrarouge lointain, allant approximativement de 420 20 cm-1

Linfrarouge moyen, allant approximativement de 4300 420 cm-1
Le proche infrarouge plus nergtique allant approximativement de 12800 4300 cm-1
La Spectrophotomtrie infrarouge est inscrite la pharmacope,
Les applications de linfrarouge sont quotidiennes dans les laboratoires de recherche qui
doivent identifier des substances organiques de synthse. Cest une mthode intressante
qui sajoute lUV, la R.M.N et la spectromtrie de masse.
En analyse qualitative elle permet lidentification des matires premires ou dun toxique
Elle est base sur la comparaison du spectre de la substance avec celui dcrit dans les
tables de spectre.
Les appareils rcents comportent en mmoires une bibliothque de spectre de produits les
plus courants et la comparaison entre la substance et le produit talon est ralise sur
cran cathodique.
De nouveaux dveloppements de la technologie dans le domaine de lindustrie
pharmaceutique permettent daugmenter considrablement le rle de linfrarouge pour
lidentification des matires premires.
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- Spectrophotomtrie dmission atomique S.E.A = photomtrie de flamme

S.A.A flamme
- Spectrophotomtrie dabsorption atomique S.A.A
S.A.A four
Ces mthodes sont bases sur lexploitation des spectres de raies mis par les atomes
ayant subi une excitation suffisamment nergtique pour obtenir une variation de lnergie
des lectrons et essentiellement de ceux qui se trouvent sur les couches les plus
extrieures (lectrons de valence).
La S.E.A, qui sintresse aux atomes ltat E1 sera utilise pour doser les alcalins dans
une flamme qui na pas besoin dtre trs nergique.
La S.A.A, qui concerne les atomes ltat E0, sera de porte plus gnrale. Elle permet
de doser tous les lments dont la radiation de rsonance > 180 nm
Ces mthodes intressent de nombreux domaines : lindustrie chimique pharmaceutique et
lagro-alimentaire ainsi que la biologie. Les dosages sont donc raliss dans diffrentes
matrices, ce qui ncessite une mise au point adapte chaque cas.
-La Spectrophotomtrie dmission plasma
Les plasmas sont des gaz plus ou moins ionis : G

G+ + e-

Ils sont crs et entretenus par apport dnergie un gaz dit plasmagne au moyen dun
gnrateur. Ce gaz est en gnral de largon. Les chantillons analyser sont introduits
dans le plasma par lintermdiaire dune torche (torche plasma) I.C.P (inductively coupled
plasma) et sont transforms en vapeur atomique ou ventuellement ionique et excits par
les constituants du plasma : G, G+, eLes tempratures atteintes dans le plasma sont leves : de lordre de 4500K 8000K
II)

Choix dune mthode analytique :

Le dosage et lidentification de toute molcule mdicamenteuse font appel des

procds analytiques trs divers dont le choix nest pas toujours facile. Il ya donc lieu
avant de mettre au point ou dadapter une technique analytique plus ou moins complexe et
onreuse en temps et en matriel, de bien positionner le problme rsoudre.
Sagit-il dun contrle pharmaceutique ?
-

Matire premire ou produit fini

Dun dosage de mdicament dans un milieu biologique (sang, urine etc)

En effet la mthode sera fonction de :

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1) De la composition du milieu (matrice)

Dans une matire premire le principe actif est le constituant essentiel
Dans une forme pharmaceutique ou produit fini (comprim, suppositoire, ou
autres). Le ou les principes actifs coexistent avec des excipients et des
conservateurs.
Dans les milieux biologiques la matrice est plus complexe, dans ce cas le
principe actif doit tre spar dabord des protines est des autres
composs endogne, do la ncessit dun prtraitement de lchantillon
2) Des caractristiques des mthodes analytiques :
Certaines mthodes sont plus ou moins sensibles ou spcifiques
Ainsi les mthodes titrimtriques ou spectrophotomtriques seront utilisables
sur des milieux limpides en labsence dinterfrences importantes.
A linverse, les mthodes chromatographiques (mthodes sparatives) seront
utilisables lorsquil ya lieu de sparer le principe actif P.A des substances
endognes ou dautres molcules proprits voisines.
3) Des caractristiques de la molcule
Les caractres organoleptiques (aspect, couleur, odeur) de la molcule
permettront dans certains cas simples son identification.
Les caractres physicochimiques tels que le point de fusion, le pouvoir
rotatoire, les longueurs donde dabsorption UV ou IR peuvent aider
lidentification dune substance.
Le caractre acide /base, la volatilit, la solubilit, la stabilit, la polarit
permettent de mettre au point lextraction et le dosage de la molcule
Connatre les caractristiques pharmacocintiques de la molcule va nous
permettre de mettre au point son dosage dans liquides biologiques. En effet
selon les mdicaments, les concentrations dans le plasma, les urines, les tissus
sont trs variables.

III1) les mthodes didentification

a) Matire premire :
-

la premire srie doprations de contrle consiste vrifier

Lidentit de la matire premire rceptionne
Lexamen des caractres organoleptiques qui sont dfinis par la pharmacope
11

Ensuite en fonction de la matire premire il faudra choisir une ou plusieurs des

techniques suivantes bases sur la dtermination dune constante physique ou dune
proprit chimique tel que :
Le point de fusion = la temprature de fusion dune espce chimique est une
constante caractristique de chaque compos dont la dtermination permet
de vrifier labsence dimpurets
Le pouvoir rotatoire : cest la proprit que reprsente certaines substances
de dvier le plan de polarisation de la lumire polarise en utilisant un
polarimtre la pharmacope dfinit langle de rotation optique, le pouvoir
rotatoire spcifique dun liquide, dune substance ou dune solution. Le pouvoir
rotatoire est particulirement intressant pour lidentification des acides
amins, des sucres, des composs carbone asymtrique
Lindice de rfraction : mesur laide dun rfractomtre, il permet
lidentification des huiles et de nombreux liquides purs.
La densit relative : mesure grce un pycnomtre solide ou liquide.
Les indices chimiques : comme lindice dacide, de peroxyde.

Enfin, deux groupes de mthodes sont facilement ralisables pour lidentification dune
matire premire mais ncessitent un chantillon pur comme talon
Mthodes spectrales :
En UV/Visible = dtermination du maximum dabsorption qui doit
correspondre la longueur donde indiqu dans la monographie de la
pharmacope.
En IR on doit vrifier la superposition des bandes du spectre de la substance
analyser et dune substance de rfrence
LIR ne peut pas servir de critre de puret mais cest une mthode
didentification rapide et fiable
Mthodes chromatographiques :
La C.C.M est une mthode spcifique et trs sensible largement utilise pour
lidentification des molcules (comparaison des Rf substance et talon)

12

-A ct de ces techniques physiques didentification des matires premires, la

pharmacope dcrit des ractions didentit des ions et des groupements fonctionnels. Le
principal inconvnient rside en la prparation des nombreux ractifs ncessaires et en la
complexit de certaines ractions.
Il existe diffrents documents couramment utiliss pour connatre les caractres
Physico-chimiques dune matire premire, on peut citer :
-

Les pharmacopes franaises et europennes

Lindex Merck

Les fiches SFSTP (socit Franaise des sciences et techniques pharmaceutiques)

Les fiches techniques et les dossiers techniques fournis par les laboratoires
fabricants.

Critres de puret dune matire premire

Aprs lidentification de la matire premire, il est ncessaire de sassurer que
celle-ci nest pas contamine (rsidus de synthse en cas de purification
insuffisante, produit de dgradation en cas de mauvaise conservation).
Des mthodes plus ou moins spcifiques sont utilisables :
C.CM : un corps pur ne donne quune seule tche aprs rvlation. Cette
mthode trs facile mettre en uvre, permet la mise en vidence
dimpurets ou de produits de dgradation.
Spectrophotomtrie UV le coefficient dabsorbance spcifique est
caractristique de la substance dans un solvant dtermin. On se place la
longueur donde maximale dabsorption. Labsorption mesure doit tre
comprise entre deux limites dfinies par la monographie ou la fiche technique
de la matire premire.
Perte de masse par dessiccation : cet essai permet de connaitre le degr
dhydratation. Cest un critre important connaitre puisque la prsence
deau abaisse le titre de la matire premire. Elle peut tre dtermine par
diffrentes mthodes selon les indications de chaque monographie.
Essai limites des mtaux lourds : recherche des mtaux lourds en fonction
de chaque matire premire. Chaque monographie indiquera le procd
utiliser.

13

 Recherche dimpurets particulires : certaines impurets particulires

chaque matire premire peuvent tre recherches. Une impuret de
fabrication, de dgradation.
b) Mdicaments dans les liquides biologiques : dpistage toxicologique
Lidentification des mdicaments dans les liquides biologiques aprs intoxication aigu
est souvent complexe en effet la gamme des mdicaments identifier est vaste.
Les ractions didentification doivent tre spcifiques des mdicaments et non des
substances endognes. Les concentrations peuvent tre infrieures au seuil de dtection.
Dans la pratique le mdicament est recherch dans le liquide de lavage gastrique, le plasma
et les urines. Mais cest dans le liquide de lavage quil sera plus facile didentifier un
mdicament et ce dautant que le mdicament subit des biotransformations importantes.
Les mthodes utilises sont :
Identification par ractions colors: ces ractions sont spcifiques dun
groupement chimique, elles seffectuent directement sur le liquide de lavage
gastrique ou lurine.
Identification aprs sparation : cest la mthode la plus employe
Elle consiste identifier les mdicaments aprs sparation par
chromatographie sur couche mince C.C.M
Identification par les mthodes immunologiques : ces mthodes dveloppes
pour le dosage des mdicaments ont t appliques aux recherches
toxicologiques
Dans certains cas difficiles, on fait appel dautres mthodes comme la
spectromtrie de masse couple la C.P.G ou L H.P.L.C

III2 Les mthodes de dosage

On dfinit les critres analytiques fondamentaux des techniques de dosage dans les trois
milieux : matire premire, produit fini, milieux biologiques
Pour les matires premires : le point fondamental est la prcision : une puret doit
pouvoir tre dtermine 0,1% prs.
Pour les formes pharmaceutiques : le titre du P.A doit pouvoir tre assur 5%
selon la lgislation europenne en vigueur, sinon il conviendra de justifier un
dpassement de ces normes
Le point le plus important est la spcificit (interfrences des excipients) ainsi que la
sensibilit dans certains cas.
14

 Pour les milieux biologiques : les deux critres essentiels sont la sensibilit et la
spcificit, la prcision de la mthode tant acceptable jusqu 10% environ
a) Matire premire
1) Dosage des lments minraux
1,1) Cations
Les alcalins : Na, K, Li, Ce, Fr, Rb
Ce sont des mtaux qui, combins loxygne, forment des alcalis.
Leur potentiel dionisation relativement bas, permet de les doser facilement par
spectrophotomtrie dmission atomique (S.A.E) encore appele photomtrie de
flamme
Cest la mthode la plus simple et la plus spcifique (utilisation de la raie de
rsonance de llment doser).
Les alcalino-terreux : Ba, Mg, Ca, Sr, Rd
Leur potentiel dionisation plus lev que les alcalins ne permet pratiquement pas
dutiliser la S.A.E, cest pourquoi on utilise la spectrophotomtrie dabsorption
atomique (S.A.A) en raison de sa prcision et de sa spcificit.
On utilise aussi les mthodes complxomtriques qui sont aussi prcises que la
S.A.A, mais beaucoup moins spcifiques et sensibles.
La complxomtrie ncessite une bonne matrise de lapprciation du virage et le
contrle du PH en utilisant des solutions tampons.
Le dosage peut tre direct ou en retour.
Les mtaux de transition et certains non mtaux
Ils correspondent dans le domaine mdical aux oligolments et certains minraux
(mtaux lourds) Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Sn, Bi, Pb, leur dtermination se
fait slectivement par absorption atomique (S.A.A)
Il ne faut pas oublier que la S.A.A dose llment et non pas ltat dionisation
possible de llment (Fe2+ et Fe3+ ne peuvent tre distingus). Il faudra utiliser
dautres mthodes comme (polarographie, lectrode spcifique) pour obtenir une
information plus prcise sur ltat de valence.
Une autre alternative pour les lments de transition est la titrimtrie soit par
formation de chlate (complxomtrie), soit par oxydorduction chimique ou
lectrochimique.
1,2) Anions :
Dans les pharmacopes le dosage dun sel minral est soit le dosage du cation, soit le
dosage de lanion.
15

 les halognures (F-, Cl-, Br-, I-)

Pour le dosage de ces anions, on utilise comme techniques :

largentimtrie

-Argentimtrie directe : Cl- , Br- , I- ont des produits de solubilit suffisamment faible
sous forme de sels dargent pour tre doss par argentimtrie directe en utilisant le
nitrate dargent 0,1N comme ractif titrant et en utilisant une dtection potentiomtrique
en utilisant une lectrode dargent.
-Technique de Mohr en milieu neutre pour les chlorures Cl-Technique de Charpentier-Vohlard en milieu acide
Les mthodes de Charpentier- Vohlard et Mohr permettent de doser en principe
nimporte quel anion chlorure dans nimporte quel matire premire. La simplicit de la
mthode de Mohr en fait la mthode de choix alors quelle nest pas toujours utilisable
pour les formes pharmaceutiques (pH acide). Dans ce cas il faudra avoir recours la
technique de charpentier Volhard.

Dosage par lectrode spcifique : dans le cas des halognures on utilise tout
particulirement llectrode spcifique fluorure pour les prparations
pharmaceutiques et les milieux biologiques.

Mthodes complxomtriques : avec le nitrate de thorium pour le dosage des

fluorures FCest la mthode de choix pour le dosage des sels fluors : simple, rapide, spcifique

Mthodes doxydorduction = simple et prcise, mais comme toutes les techniques

doxydorduction, sa spcificit est trs mauvaise (interfrences des autres couples
dans le dosage).
1,3) Les anions complexes :

On dfinira les anions complexes par la combinaison de deux lments chargs

ngativement : SO42-, NO2-, NO3-, CN-, PO43Il est rare, en fait que ces anions soient doss lors du contrle dune matire premire.
On prfre dterminer le cation correspondant (sodium, potassium) dont le dosage est
souvent plus simple et plus prcis
2) Dosage des molcules organiques :
Les substances organiques peuvent tre dfinies comme des combinaisons molculaires
formes des atomes de C, H, N, S, O et ventuellement dautres lments. Il peut sagir
dacides, de bases, de molcules sans pK, de sels.

16

Pour doser une molcule organique en tant que matire premire, lanalyste doit
slectionner dans la molcule considre un groupement fonctionnel susceptible dtre mis
en jeu dans une mthode de dosage rapide, simple, trs prcise.
2,1) Acides
Lacidimtrie en milieux aqueux : les acides organiques suffisamment forts pour tre
doss directement ou en retour en milieu aqueux sont relativement peu nombreux en
pharmacie.
lacidimtrie en milieu non aqueux : lutilisation dun solvant non aqueux permettant
une meilleure dissolution du principe actif, Exemple Actone, thanol pralablement
neutraliss.
Dans ce cas le ractif titrant est une solution alcoolique ex : KOH alcoolique 0,5N
2,2) Bases
Dosage en milieu aqueux : rserv aux bases fortes
Dosage en milieu non aqueux : rserv aux bases faibles on peut citer comme
exemple la mthode classique de Pifer et Wollish dveloppe dans les annes
1950 ; sa simplicit, sa rapidit, sa trs grande prcision lon fait adopter de
faon universelle et elle figure dans de trs nombreuses pharmacopes.
Le principe de la mthode est le suivant : la basicit de la molcule doser est
exalte par dissolution dans lacide actique ; ce dernier par solvatation va librer un
ion actate qui va pouvoir tre dos par un acide fort comme HClO4 0,1N. Il sagit
dun dosage indirect.
2,3) Les molcules carbonyles : Aldhydes et ctones peuvent ragir de faon
quantitative avec lhydroxylamine
R C = O + H2NOH

R C = N - OH + H2O

Cest une technique volumtrique simple applicable de nombreux composs

carbonyls ne possdant pas dautres fonctions organiques caractristiques.
2,4) Les polyols simples : sucres, drivs du glycrol etc..
La mthode de choix cest la priodimtrie : elle est prcise, simple, reproductible,
elle figure dans de trs nombreuses monographies de la pharmacope.

Lorsque la priodimtrie nest pas utilisable, il reste deux solutions :

Soit exploiter le pouvoir rducteur dun aldose ou dun ctose (rduction de la liqueur
de Fehling)

Soit dterminer le titre par polarimtrie pour les sucres possdant un pouvoir
rotatoire spcifique.
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2,5) Les molcules oxydorductibles :

Manque de spcificit des techniques doxydorduction. Ce type de dosage est pratiqu
que sil nya pas dautres mthodes disponibles.
2,6) Molcules comportant des groupements fonctionnels basiques et acides.
Le meilleur exemple est lacide amin

Dosage de la fonction acide : cest la mthode de Sorensen par formoltitration

Dosage de la fonction basique : dosage en milieu non aqueux

2,7) Dosage des sels de molcules organiques :

Beaucoup de mdicaments organiques sont salifis pour faciliter la dissolution du
principe actif en milieu aqueux
Dosage des sels de bases organiques : les principaux sels de bases utilises en
pharmacie sont :
Les chlorhydrates, les bromhydrates, les sulfates, les msylates
Le dosage se fait par protomtrie en milieu non aqueux
Dosage des sels dacides organiques : ex actate de Zinc, gluconate de sodium
dosage du cation correspondant par complxomtrie ou par absorption
atomique S.A.A pour cation ( bi ou trivalent), quand le cation est monovalent il
peut tre dos par photomtrie de flamme.
On peut aussi doser lanion par protomtrie en milieu actique par lacide
perchlorique 0,1N

3) Les formes pharmaceutiques : Dosage des minraux dans les mdicaments

1) Cations : les mthodes voques pour les matires premires (photomtrie de
flamme, absorption atomique, colorimtrie, oxydorductimtrie) sont
globalement applicables aux formes pharmaceutiques
1,1) Association minrales strictes, ex oligolments et certains soluts massifs
Le dosage se fait par :

Complxonomtrie : lorsque les circonstances le permettent (forte concentrations,

un seul cation doser) les techniques titrimtriques deviennent intressantes en
raison de leur simplicit et de leur faible cot.
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Dosage spectrophotomtrique : Formation de complexes colors

mission ou absorption atomique : lorsque lanalyste doit rsoudre le problme de

dosage multilments dans une prparation pharmaceutique, il se tournera vers une
mthode physique dmission (photomtrie de flamme) pour les alcalins et
dabsorption atomique (S.A.A) pour les autres lments.

Lmission atomique par plasma induit ICP = (inductive coupled plasma)

1,2) Association avec des molcules organiques = ces associations posent moins de
problmes quun mlange complexe strictement poly ionique.
2) Anions
Les mthodes volumtriques sont trs pratiques partir du moment o une seule
espce anionique est en cause.

Les lectrodes spcifiques : peuvent tre utiles (F-, CN-, SCN-, NO2-, NO3-) mais
ncessite un entretien trs rigoureux

Les mthodes doxydorduction sont dun emploi limit du fait de leur manque de
spcificit. Sont utilises dans les dosages classiques des soluts dhypochlorite
(Dakin, leau de javel)

La chromatographique ionique : tous les anions ainsi que les anions complexes peuvent
dans certaines conditions tre doss simultanment par cette mthode
La colonne utilise est une rsine changeuse danions
3) Dosage des molcules organiques

Cest le problme le plus couramment rencontr lors du contrle du produit fini, la grande
majorit des mdicaments relevant de la chimie organique.
Lanalyste est appel dvelopper une mthode parfaitement spcifique du produit
doser toutes les interfrences avec dautres principe actifs associs, excipients doivent
tre vites, ceci nest pas toujours ralisable et seules les mthodes chromatographiques
permettent datteindre ce but.
3,1) Les mdicaments acides = les techniques qui sont utilises sont :
La protomtrie ne peut tre utilise quen milieu neutre ou quand le PH nest
pas ajust pour une raison de stabilit des principes actifs.
Absorptiomtrie dans lUV.
La chromatographie en phase gazeuse (C.P.G)
La chromatographie en phase liquide (H.P.L.C)
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3,2) Les mdicaments basiques =

Ce groupe constitue la majorit des mdicaments (sous forme de base et de sel de base).
Les mdicaments basiques (et leur sels) peuvent tre titrs plus commodment par trois
groupes de mthodes :
Volumtrie en phase htrogne avec appariement de paire dions
Absorptiomtrie directe dans lUV
Mthode chromatographique : C.P.G ou plus souvent H.P.L.C
3,3) Les polyols (sucre)
Ils peuvent tre doss :
Par voies enzymatiques (glucose)
Par priodimtrie
Par H.P.L.C- rfractomtrie et polarimtrie
4) Liquide biologique
Le dosage des mdicaments dans les milieux biologiques est le plus complexe, puisquil
faut sparer le mdicament doser des substances endognes susceptibles dinterfrer et
ventuellement de mtabolites.
Les principaux facteurs prendre en compte sont bien sr la spcificit et la sensibilit
de la mthode.
Les mthodes utilises lheure actuelle pour le dosage des mdicaments sont de deux
types :
Mthodes immunologiques : immunoenzymologie et immunofluorescence
Mthodes chromatographiques : La C.C.M se prte difficilement des ractions de
quantification, mais possible par HPTLC (CCM haute performance) .
La C.P.G et lH.P.L.C sappliquent au dosage de trs nombreux mdicaments ainsi qu
leurs mtabolites. La slection entre C.P.G et H.P.L.C se fera en premier lieu en
fonction des caractristiques physicochimique de la molcule doser.

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BIBILIOGRAPHIE

1) Analyse pratique du mdicament

D. Pradeau

2) Chimie analytique et quilibres ionique

Jean-Louis Burgot

3) Mthodes de sparation (tome 2)

M. Hamon

4) Chimie des solutions

M.Hamon

(tome 1)

6me Edition

5) Pharmacope Europenne

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