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Determinacin de protenas en hojas

de Citrus. il. Extraccin, fraccionamiento


y cuantificacin

POR

A. I . GARCA

y /. SANCHEZ-ROJAS

ABSTRACT
The extraction conditions for the chloroplastic and citoplasmic proteins of the Vema lemon tree leaves physiologically normis are estudiad, chosing disgregation methods and extractants.
For the citoplasmic proteins, tris-glycine-glucose (TGG) is selected
as extractant (eluent), being stablished the action of each one of their
components and the optimum pH. Likewise, it is tested that the adition
to the buffer solution of different protective substances relatives to
the formation of protein-quinone complex, do not improve the bioffer
quality.
The sedimentations conditions for chloroplasts are the foUowing:
6000 X g during 45 minutes using as the more appropiate extractein
(eluent) for the chloroplastic protein, the sodium dodecil sulphate at
a concentration of 0,5 %.
A fractionation of the citoplasmic proteins, using amonium sulphate
and trichloroacetic acid (TCA) is made. The chloroplastic proteins are
divided at the same time in soluble and insoluble.

200

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

INTRODUCCIN

Dentro de la gran importancia que desde cualquier punto de vista


tienen las protenas vegetales, las localizadas en las hojas de las plantas
superiores presentan un inters especial, pues en ellas se sintetizan la
mayor parte de las sustancias que integran el vegetal.
A pesar del inters que siempre ha suscitado el estudio de estas protenas, hasta hace relativamente poco tiempo los trabajos desarrollados
en este campo han sido relativamente escasos. A ello puede haber contribuido la baja concentracin en que se encuentran, factor este que
requiere tcnicas de extraccin exhaustivas y que eviten, en lo posible,
las desnaturalizaciones que tan frecuentemente se producen en este tipo
de compuestos.
Las protenas citoplsmicas, segn Byers (6), son las precipitables
de un extracto despus de separar la fraccin que contiene clorofilas y
su composicin depende del mtodo usado para separar el material cloroplstico. Esta definicin, aunque aceptable, es poco precisa, ya que
en la disgregacin del material y fraccionamiento proteico pueden producirse contaminaciones debido a la ruptura de ciertos orgnulos como
cloroplastos, mitocondrias, ncleos, etc. (33).
Para la extraccin de las protenas foliares hay que realizar una disgregacin del material vegetal en presencia de un extractante cuya misin es, al men'os tericamente, que las protenas pasen cuantitativamente al medio extractante con el menor deterioro posible. Los procedimientos ms utilizados son el de trituracin en mortero usando arena de mar como abrasivo (2, 37) y la homogeneizacin elctrica (37).
Los extractantes empleados son muy numerosos y dentro de ellos se
encuentra el tampn fosfato pH 7 (27), cloruro sdico (10), hidrxido
sdico (19), agua (1, 18), cido clorhdrico (10) y tampn tris-glicinaglucosa pH 8,5 (37).
Las protenas cloroplsticas se clasifican (36) en dos grupos: las solubles, integradas principalmente en la fraccin I (16), y las insolubles
o laminares, que estn unidas a la clorofila formando la estructura cloroplstica y que al parecer intervienen activamente en el proceso fotosinttico.
Para obtener los cloroplastos aislados, el proceso de disgregacin
del material vegetal no debe ser excesivamente enrgico para evitar la
fragmentacin mecnica de los mismos. Asimismo, es necesario utilizar
simultneamente determinadas sustancias que proporcionen un medio
isotnico al de los cloroplastos (12, 14).

Determinacin

de protenas en hojas de Citrus. II.

201

La sedimentacin cloroplstica es funcin del tiempo y de la fuerza


centrfuga a que se somete la suspensin y depende de la especie vegetal de que se trate, ya que el nmero y tamao de los cloroplastos
(12, 14, 20), es especfico de ellas.
La divisin inicial en protenas citoplsmicas y cloroplsticas, segn lo expuesto anteriormente, debe considerarse un tanto relativa,
pues la proporcin que se obtiene para ambas depende de la especie
vegetal de que se trate (6) y del procedimiento seguido para su extraccin (24). Por esta razn no es de extraar que en la bibliografa se
den frecuentemente porcentajes distintos segn el caso que se considere (9, 33, 34). El fraccionamiento de las protenas citoplsmicas se
puede realizar en funcin de su diferente solubilidad en disoluciones
de electrolitos. Uno de los ms empleados es el sulfato amnico, que
se utiliza en concentraciones variables, siendo las ms frecuentes las
del 40 y 60 % (8, 29, 30, 31). La eleccin de este rango se basa en la
posible existencia de fracciones proteicas de naturaleza relativamente
homognea (9). El resto de protenas que no precipitan con sulfato amnico del 60 % lo hacen con TCA del 10 %. Las protenas cloroplsticas
se suelen fraccionar en solubles, por accin de una disolucin hipotnica, e insolubles que se separan por la accin de detergentes (4, 7, 12,
13, 15, 20).
Cuando se utiliz en un trabajo anterior protena patrn, los mtodos que se mostraron ms adecuados en cuanto a sensibilidad y reproductibilidad fueron los de Folin-Lowry y absorcin en el ultravioleta
a 280 nm. Sin embargo, la aplicacin de stos a extractos sin purificar
no proporcionan resultados correctos a causa de diversos compuestos
que acompaan a las protenas (15, 26, 28, 32, 35). Las sustancias interferentes pueden proceder de los extractantes o de los compuestos celulares. De entre estos ltimos, los de naturaleza fenlica son los que presentan mayores dificultades debido a su fcil oxidacin a quinonas y
posterior formacin de complejos quinonas-protenas bastante estables (17). Por todo ello, la cuantificacin de protenas vegetales exige
una purificacin previa del extracto con el fin de eliminar lo ms posible las contaminaciones.
En este trabajo se estudian distintas formas de disgregacin del
material vegetal y extractantes para la determinacin cuantitativa de
protenas foliares, as como algunos procedimientos para eliminar interferencias. Asimismo, se efecta un fraccionamiento de protenas citoplsmicas y cloroplsticas y se concreta el mtodo ms idneo para
su determinacin cuantitativa.

202

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

METERIAL Y MTODOS

El material utilizado son hojas de Citrus Limn, variedad Vema,


de 4 a 7 meses de edad procedentes de rboles fisiolgicamente normales.
DISGREGACIN DEL MATERIAL

Los procedimientos empleados fueron


a) Para la obtencin de las protenas
trituracin en mortero con arena de mar
vo, en presencia de extractantes.
b) Para las cloroplsticas, triutracin
trico con un extractante adecuado.

los siguientes:
citoplsmicas se efecta una
lavada al cido como abrasien un homogeneizador elc-

EXTRACTANTES

Como extractante para las protenas citoplsmicas se us el tampn


Tris 0,041 M-glicina 0,32 M-glucosa 0,67 M, pH = 8,5 (37). Tambin se
ensayaron los siguientes: Tampn fosfato, p H = 7 ; cloruro sdico al 1 %;
hidrxido sdico 0,2 %; pirofosfato sdico 0,01 M; agua; cido clorhdrico 0,1 % y cido actico 0,01 M.
Para el aislamiento de los cloroplastos se utiliz la disolucin isotnica: Sacarosa 0,5 M-trs 0,05 M-cloruro magnsico 1 mM-mercaptoetanol 4 mM, pH=7,8 (12).
FRACCIONAMIENTO

Para las protenas citoplsmicas se realiz en funcin de su distinta


solubilidad en disoluciones de sulfato amnico al 40 y 60 %. El resto
se precipit con TCA al 10 %. De esta forma se obtienen tres fracciones
proteicas.
De las protenas cloroplsticas, la fraccin soluble se separ a partir del botn cloroplstico, el cual se trata posteriormente con disolucin hipotnica: Tris 0,01 M-cloruro magnsico 1 mM-mercaptoetanol
4 mM, pH = 7,8. Para las insolubles, los cloroplastos y sus fragmentos
se tratan con dodecilsulfato sdico al 0,5 %.
Todos los productos utilizados fueron R. A.
La metodologa para la determinacin de protenas y sus fracciones
se realiza segn (24). Para las medidas espectro y colorimtricas se usa
un espectrofotmetro Hitachi Perkin-Elmer mod. 124.

Determinacin de protenas en hojas de Citrus. II.

203

RESULTADOS Y DISCUSIN
Para establecer las condiciones de extraccin de las protenas de
hojas de Citrus es necesario considerar distintos procedimientos segn
consideremos las protenas soluble (citoplmicas) o las obtenidas de
los cloroplastos.
El primer paso para la extraccin de las protenas citoplsmicas es
la disgracin del material. Las experiencias previas realizadas en este
sentido nos indican que en la homogeneizacin elctrica hay un aumento de la temperatura, que podra desnaturalizar parcialmente las
protenas y tambin una formacin de emulsiones que, al tener que
eliminarlas, conducen a un mayor nmero de manipulaciones. Por ello,
elegimos la trituracin en mortero con arena de mar como abrasivo,
al observar, adems, una mejor disgregacin del material vegetal.
El conocimiento de la relacin ptima peso hoja/volumen de extractante es indispensable para una extraccin cuantitativa. Para concretar esta relacin, se trituraron tres muestras de 1 g cada una con
50 mi de extractante (tampn fosfato, pH 7). Los homogeneizados se
filtraron lavando el residuo con volmenes iguales de extractante (50 mi).
Los resultados se representan en la figura 1.

/. de proleinas
extraidas
80

50

20

24

34

54

Fracciones de 50 mi
de t'xtractran\e

Fig. 1.Porcentaje de protenas en funcin del volumen de extractante utilizado.


Media de muestras por triplicado.

204

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

La consideracin de los datos nos indica que, si bien la primera


fraccin de 50 mi extrae la mayor parte de las protenas, slo se puede
considerar prcticamente total cuando se utilizan 200 mi de extractante.
La misin fundamental del extractante es disolver las protenas puestas en libertad al disgregar el material y preservarlas de las desnaturalizaciones. Todo ello considiciona la naturaleza de los compuestos
que forman parte del mismo.
Los extractantes utilizados son muy numerosos, experimentndose
los siguientes: Cloruro sdico, Hidrxido sdico, Pirofosfato sdico.
Agua, Acido clorhdrico. Acido actico, Tampn fosfato pH 7 y Trisglicina-glucosa pH 8,5. Las concentraciones proteicas obtenidas para
cada uno de ellos frente a muestras idnticas de hojas se muestran en
la tabla L
TABLA I

VALORES DE PROTENAS EN MG POR 100 G DE MATERIA SECA


PARA OCHO EXTRACTANTES DISTINTOS. MTODO DE FOLIN-LOWRY
Muestra

ClNa 1 %

NaOH 0,2 %

0,01 M

Tampn
fosfato pH 7

1
2
3
4

1718,5
1718,5
1729,4
1663,8

2911,6
2911,6
2845,9
2802,2

1992,1
1992,1
1937,5
2014,0

3240,0
3021,1
3021,1
3064,9

Media

2867,8

1983,9

3086,7

Muestra

1707,5
Tris 0,041 M
Glic 0,32 M
Gluc 0,67 M

1
2
3
4

4312,7
4268,9
4356,5
4203,2

Media

4285,3

CIH 0,1 %

Acido actico
0,01 M

1346,3
1291,6
1236,9
1360,2

131,3
131,3
207,9
153,2

131,3
180,6
153,2
153,2

1333,7

155,9

154,5

H2O

Los datos anteriores ponen de manifiesto, inicialmente, que el extractante ms cuantitativo es el formado por: Tris-0,041 M-Glicina-0,32;
MlGlucosa 0,67 M pH 8,5. Sin embargo, antes de aceptar este tampn
como el extractante ms apropiado para el material vegetal en estudio,
es necesario dilucidar las cuestiones siguientes: I."") Comprobar el pH
ptimo, 2.") Accin de los componentes en la extraccin, y 3.") Mejorar
su composicin para que cuali y cuantitativamente la extraccin sea
mxima y especfica.

Determinacin

de protenas en hajas de Citrus. II,

205

El rango de p H establecido p o r numerosos autores (3, 5, 11, 23) vara desde la neutralidad a valores bsicos n o excesivamente altos. P a r a
c o m p r o b a r su posible influencia se p r e p a r a r o n lampones Tris-glicinaglucosa a distintos p H : 7, 7,5, 8, 8,5 y 9.
Los resultados, resumidos en la tabla II, m u e s t r a n que la mxima
extraccin corresponde a u n a valor de p H igual a 8,5.
TABLA II

INFLUENCIA DEL pH DEL TAMPON TRIS-GLICINA-GLUCOSA EN LA EXTRACCIN DE PROTENAS EN HOJAS DE CITRUS. MEDIA DE MUESTRAS POR
TRIPLICADO. MTODO DE FOLIN-LOWRY
pH

Mg de proteina por
100 g de peso seco

7
7,5
8
8,5
9

4748,1
4899,8
5278,3
5314,5
5230,2

Porcentajes con
a la extraccin

respecto
mxima

89,35
92,20
9932
100,00
98,42

Para esclarecer la accin de los componentes del l a m p n


zaron extracciones en las mismas condiciones con disoluciones
Tris-glicina y Tris-glicina-glucosa, todas a p H 8,5. E n todos los
determinaron protenas totales y se realizaron los espectros en
violeta de los extractos dializados.

se realide Tris,
casos se
el ultra-

Los datos de la tabla I I I m u e s t r a n que el contenido proteico disminuye algo al utilizar Tris-glicina con respecto a los otros, pero las
diferencias n o son significativas p a r a sacar conclusiones acerca del
papel que desempean glicina y glucosa.

TABLA III

INFLUENCIA DE LOS COMPONENTES DEL TAMPON TRIS-GLICINA-GLUCOSA


EN LA EXTRACCIN DE PROTENAS EN HOJAS DE CITRUS. MG DE PROTENAS POR 100 G DE HOJA SECA. MTODO DE FOLIN-LOWRY
Extractante utilizado
Muestra

Tris

Tris-Glicina Tris-Glicina-Glucosa

1
2
3
4

4760,8
4760,8
4888,1
4837,1

4633,5
4582,5
4582,5
4606,2

4760,8
4760,8
4964,4
5015,3

Media

48117

4601,1

4875,3

206

A. L. Garca y J. Snchez-Rojas

Sin embargo, el anlisis espectrofotfomtrico de los extractos (figura2) muestra notables discrepancias. Segn fuentes bibliogrficas (14),
la formacin de complejos imioquinonas-protenas, modifican el espectro caracterstico de stas, de tal forma que el mximo a 270-280 nm se
convierte en infrexin.

0.9

0.6

o;3

240

320 240
TRIS

TRIS-GLICINA

320 240
320 nm
TR15-GLICINA-GLUC0SA

Fig. 2.Espectros de absorcin en el ultravioleta (240 a 320 nm) de extractos vegetales segn los componentes del tampn utilizado.
El mnimo en la zona 260-250 nm aparece ms definido en orden
creciente para Tris, Tris-glicina, Tris-glicina-glucosa. Es presumible, pues,
que en el extracto con Tris la formacin de estos compuestos sea menor.
Para estudiar este proceso se aadi a los tres extractos una pequea cantidad de oxidante (H2O2), la misma en cada caso. En estas condiciones se debera favorecer el paso de polifenol a quinona y, por lo
tanto, la formacin de complejos. Figura 3.
La glicina y en mayor proporcin la glicina-glucosa, contrarrestan,
dentro de ciertos lmites de concentracin, la accin de oxidantes externos al sistema (H2O2, O2 del aire). Por lo tanto, consideramos que la
adicin de glicina y glucosa al tampn Tris, proporciona una accin
estabilizadora as como una proteccin frente a la formacin de complejos.
La formacin de complejos protena-quinina dificultan la determinacin de aqullas, pues interfieren en los procesos de extraccin y purificacin, resultando una prdida en la extraccin.

Determinacin de protenas en hojas de Citrus. II.

207

o 0 9

06

q3

240
TRIS

320
TRIS-GLICINA

2A0
320 nni
TRIS-GLICINA-GLUCOSA

Fig. 3.Espectros de absorcin en el ultravioleta (240 a 320 nm) de extractos vegetales segn los componentes del tampn utilizeido, previa adicin de H2O2.

Son abundantes las sustancias que se emplean para tratar de eliminar o minimizar esta accin complejante (21, 22, 25) pudindose clasificar en:
a) Productos con ms afinidad por las quinonas que las protenas,
como son las polivinilpirrolidona (PVP), polietilen glicol y resinas de
intercambio inico.
b) Sustancias que dificultan la formacin de quinonas o que reaccionen con ellas a medida que se originen. Entre ellas se encuentran
reductores como cido ascrbico, tiodiglicol y mercaptoetanol.
Para conocer el efecto que producen las sustancias del tipo considerado en el primer grupo, al adicionarlas al tampn TGG, se efectu
una experiencia en la que se determinaron las protenas extradas con
TGG al que se le aadieron cantidades crecientes de resina Dowex 1X8.
Los valores se exponen en la tabla IV.
Los resultados ponen de manifiesto que las resinas retienen las protenas en cantidad apreciable; si bien hay que hacer notar que los extractos, una vez dializados, presentan en el ultravioleta unos mximos
mucho ms definidos. En la figura 4 se refleja este heoho, llevando los
extractos a concentraciones tales que la absorcin a 275 nm fue en todos los casos la misma.

208

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

TABLA IV

EXTRACCIN DE PROTENAS FOLIARES DE CITRUS CON TAMPON TRISGLICINA-GLUCOSA Y DISTINTAS CONCENTRACIONES DE DOWEX 1 x-8.
MEDIA DE MUESTRAS POR TRIPLICADO
Muestra

Concentracin
^Dowex 1 X 8 g
por 100 mi tampn

Mg protena por
100 g peso seco

Porcentajes con respecto


a la extraccin mxima

1
0,5
0,25
0,1
O

3232,0
4020,5
4292,5
4480,5
4639,9

69.65
86,65
92,51
96,56
100,00

0,6

Q4

Q2

240
300 2A0
300 2A0
300 nm
Og resina /
0,5g resina/
1g resina /
1g hoja
Ig hoja
1g hoja

Fig. 4.Espectros de absorcin de extractos proteicos de igual concentracin obtenidos con tampn Tris-glicina-glucosa y distintas concentraciones de Etowx 1 x 8 .

Se deduce que, si bien la resina ejerce una funcin purificadera por


su capacidad de retener quinonas, este efecto se manifiesta tambin
para las protenas. Por tanto, su empleo queda circunscrito exclusivamente a experiencias cualitativas.
En cuanto a sustancias de naturaleza reductora se ensayaron cido
ascrbico, tiodiglicol y mercaptoetanol. Dichos productos se adicionaron a alcuotos del tampn original, hasta alcanzar en ste las concentraciones 0,1 %, 0,01 % y 0,01 M, respectivamente.
La adicin de estos compuestos reductores no producen diferencias
muy significativas, por lo que es de suponer que la accin protectora

209

Determinacin de protenas en hojas de Citrus. II.

de la glicina y glucosa sea, en nuestro caso, similar a la de las sustancias ensayadas.


Dado que en los vegetales se e n c u e n t r a n sustancias que absorben
a longitudes de onda similares a las protenas (fenoles, cidos nucleicos, etc.), y q u e pueden acompaarlas en los extractos, el expectro de
ste en el ultravioleta n o slo confirma la existencia de protenas, sino
que puede dar u n a idea del grado de pureza en que stas se encuentran.
E n la figura 5 se r e s u m e la experiencia destinada a la caracterizacin espectrofotomtrica de las protenas.
El m x i m o correspondiente a las protenas (275 n m ) a u m e n t a su
definicin en el orden: extracto b r u t o (2A), extracto dializado (2B), extracto precipitado, redisuelto y dializado (3), el cual es muy semejante
al de la albmina p a t r n (1) a u n q u e con u n a ligera absorcin a 330 n m ;
finalmente (4), el extracto vegetal b r u t o , al que se haba restado como
blanco u n o previamente desproteinizado y que corresponde exclusivamente a las protenas presentes.
Por ltimo, p a r a c o r r o b o r a r el m t o d o de extraccin de protenas
citoplsmicas, se realiz u n a experiencia de reproductibilidad. Se utilizaron diez muestras de pesos idnticos y los datos se obtuvieron por
triplicado, tabla V.

Grfica 3

Cjrfica 4

350

nm

Fig. 5.Espectros de absorcin en el ultravioleta de albmina patrn y de extractos


citoplsmicos de hojas de Citrus.
Grfica 1: Mbmina de buey (patrn).
Grfica 2: A) Extracto bruto. B) Extracto dializado.
Grfica 3: Protena precipitada con cido tricloroactico al 10%, redisuelta en
NaOH 0,2 y dializada.
Grfica 4: Extracto bruto frente a blanco previamente desproteinizado.

210

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

TABLA V

REPRODUCTIBILIDAiD DE LA EXTRACCIN DE PROTENAS CITOPLASMICAS


EN HOJAS DE CITRUS. ABS. A 500 nm
Media
E
Des. St
Lmites 5%
C.V.%

0,353
0,002
0,009
0,333-0,373
2,63

Los datos confirman que el m t o d o de extraccin es reproductible


dentro de unos lmites de e i r o r vlido.
La disgregacin del material vegetal con objeto de aislar los cloroplastos, requiere q u e el proceso de r u p t u r a celular no sea excesivamente
enrgico p a r a evitar, en lo posible, la fragmentacin mecnica de los
mismos y adems el empleo de determinados compuestos que proporcionen u n medio isotnico al de los cloroplastos.
La sedimentacin cloroplstica en funcin del tiempo y fuerza centrfuga depende de la especie vegetal de que se trate. Para concretar
estos extremos se t o m a r o n cinco grupos de dos alcuotos cada u n o de
u n a suspensin purificada de cloroplastos y se centrifug a distintos
tiempos a 2.000 y 6.000 x g. Los botones cloroplsticos se t r a t a r o n con
DSS y DCS al 0,5 % y en las disoluciones se determina la concentracin
proteica p o r el m t o d o de Folin-Lowry. Los resultados se representan
en la figura 6.
Los datos permiten aseverar que a 2.000 x g n o se llega a conseguir
la mxima sedimentacin, sin embargo, a 6.000 x g es suficiente u n tiempo de 45 minutos. El extractante ms apropiado es el DSS.
De forma anloga a las protenas citoplsmicas, las cloroplsticas
deben p r e s e n t a r u n espectro caracterstico a 270-280 n m . E n la figura 7
se r e s u m e la experiencia desarrollada p a r a la caracterizacin de las
protenas cloroplsticas.
El extracto b r u t o (2), en el que se encuentra solubilizado el complej o protena-clorofila-detergente, m u e s t r a grandes interferencias y en la
zona 270-280 n m u n a inexin. La purificacin del extracto con butanol
y ter de petrleo proporciona u n mximo bien definido a 275 n m (3),
a u n q u e existen sustancias n o proteicas e n t r e 288 y 700 n m . El espectro
que se obtiene al precipitar, lavar, redisolver y dializar las protenas (4),
presenta m a y o r semejanza con el de la albmina p a t r n (1), con u n
mximo claramente definido a 275 n m .
P a r a establecer la reproductibilidad se determinaron p o r el mtodo
de Folin-Lowry las protenas sobre dos alicuotos de diez m u e s t r a s . Los

Determinacin

de protenas en hojas de Citrus. II.

211

V. Protenas
extradas
6.000 g
2.000 g
80

60

40

20

15

30

45

60

90

120

Oodeciisullalo sdico
Desoxicolalo sdico

rienipo de
Ct-nlritujacin
en minutos

Fig. 6.Porcentajes de protenas cloroplsticas extradas en funcin de las condicdones de sedimentacin y del extractante utilizado.

Grfica 1

Critica 3

350

250

400

550

7t

250

400

550

Grfica 4

7C0

270

350

Fig. 7.Espectros de absorcin en el ultravioleta de albmina patrn y de extractos


cloroplstioos de hojas de Citrus.
Grfica 1: Albmina de buey (patrn).
Grfica 2: Botn cloroplstico + detergente.
Grfica 3: Botn cloroplstico + detergente tratado con butanol y posteriormente
con ter de petrleo.
Grfica 4: Protena precipitada con cido tricloroactico al 10%, redisuelta en
NaOH 0,2 N y dializada.

212

A. L. Garca.y J.

Snchez-Rojas

datos de inedia, Em, desviacin estndar, lmites al 5 % y coeficiente de


variabilidad se m u e s t r a n en la tabla VI.
TABLA VI

Media
E
Des. St
Lmites 5%
C.V. %

0,185
0,002
0,008
0,169-0,202
4,11

El coeficiente de variabilidad calculado es algo superior al de las


protenas citoplsmicas, no obstante, el valor se encuentra dentro de
lmites tolerables.
Los dos m t o d o s (Folin-Lowry y absorcin en el ultravioleta) considerados son vlidos p a r a protena p a t r n ; sin e m b a r g o , la gran cantidad de sustancias q u e a c o m p a a n a las protenas de extractos foliares
hace que stos n o proporcionen resultados correctos en la mayora de
los casos. P a r a establecer cul de los dos mtodos es el m s apropiado
para la cuantificacin, se realizan las siguientes experiencias:
a) Citoplsmicas.
Las protenas extradas se precipitan con TCA
al 10 % y despus se lava con ter etlico y redisuelve en hidrxido sdico 0,2 N. E n la disolucin las protenas se d e t e r m i n a n p o r a m b o s
mtodos. Los resultados se exponen en las tablas VII y V I I I .
Los resultados p e r m i t e n sealar que los valores obtenidos en la
determinacin p o r ultravioleta son m s elevados y presentan m s variaciones que los obtenidos p o r Folin-Lowry. Posiblemente, la causa que
motiva este hecho sea que las protenas conservan, a n u n i d a s a ellas,
compuestos que presentan u n a m a r c a d a absorcin a 280 n m .
TABLA VII

FOLIN-LOWRY.
VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO
Media
159
E
1,00
Des. St
2,00
Lmites 5%
155-163
C.V.%
1,26

PROTENAS CITOPLSMICAS. MTODO D E

TABLA VIII
MTODO ESPECTROROTOMETRICO A 280 nm.
VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO
Media
586
EM
8,63
Des. St
38,60
Lmites 5%
505-666
C.V.%
6,58

PROTENAS CITOPLSMICAS.

Determinacin

de protenas en hojas de Citrus. II.

213

P a r a c o m p r o b a r si esta interferencia se presenta exclusivamente en


la determinacin esjjectrofotomtrica, se t o m a r o n c u a t r o alcuotos del
m i s m o extracto y a dos de ellos se les aplic la metodologa de purificacin p o r precipitacin. La concentracin proteica obtenida p o r ambos mtodos d e m u e s t r a n que u n a m a y o r purificacin no afecta a los
valores dados p o r Folin-Lowry, mientras que los del ultravioleta sufren
notables descensos (tabla IX).
TABLA IX

PROTENAS CITOPLASMICAS CON DIFERENTES GRADOS DE PURIFICACIN,


CUANTIFICADAS POR FOLIN-LOWRY Y ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA.
VALORES EXPRESADOS EN ppm
Muestra
Folin-Lowry
Ultravioleta
1
1'
2
2'

160
160
159
161

162
158
. 160
158

595
610
269
264

b ) Cloroplsticas.
Las experiencias efectuadas con las protenas extradas del b o t n cloroplstico p o r accin del DSS, fueron similares a
las expuestas p a r a las citoplasmicas. Los resultados se exponen en las
tablas X, X I y X I I .
TABLA X

PROTENAS CLOROPLSTICAS. MTODO DE FOLIN-LOWRY.


VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO
Media
211
E
1,00
Des. St
3,00
Umites 5%
204-217
C.V.%
1,56
TABLA XI

PROTENAS CLOROPLSTICAS. MTODO ESPECTROFOTOMETRICO A 2S0 nm.


VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO
Media
980
E
12,18
iDes. St
53,11
Lmites 5%
869-1091
C.V.%
5,41
TABLA XII

PROTENAS CLOROPLSTICAS CON DISTINTOS GRADOS DE PURIFICACIN.


MTODOS DE FOLIN-LOWRY Y ABSORCIN A 280 nm.
VALORES EXPRESADOS EN ppm
Muestra
Folin-Lowry
Ultravioleta
1
1'
2
2'

217
217
214
210

217
214
217
206

971
968
725
720

214

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

Los datos anteriormente expuestos permiten deducir las mismas


consecuencias ya expresadas en el apartado anterior. Todo ello nos ha
inducido a adoptar como mtodo de cuantificacin de protenas en hojas de Citrus el de Folin-Lowry.
A partir del fraccionamiento inicial en protenas citoplsticas y cloroplsticas, se han intentado nuevos fraccionamientos en ambos grupos. El de las protenas citoplsmicas se ha realizado en funcin de su
diferente solubilidad en disoluciones de sulfato amnico cuyas concentraciones son del 40 y 60 % y TCA del 10 %.
Para estudiar la reproductibilidad se precipitaron diez volmenes
iguales de extracto citoplsmico con sulfato amnico al 40 %, determinndose el contenido proteico. Los resultados se muestran en la tabla XIIL
TABLA X I I I

REPRODUCTIBILIDAD DE LA FRACCIN PRECIPITADA CON SULFATO


AMNICO DEL 4 0 % . VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO.
ABSORCIN 500 n m
Media
E
Des. St
Lmites 5 %
C.V.%

0,391
0,002
0,007
0,377-0,405
1,69

A los lquidos separados de la precipitacin anterior se les aadi


sulfato amnimo hasta que la concentracin del mismo es de 60 %.
Las protenas precipitadas se determinaron por Folin. Los resultados
se dan en la tabla XIV.
TABLA

XIV

REPRODUCTIBILIDAD DE LA FRACCIN PRECIPITADA CON SULFATO


AMNICO DEL 6 0 % . VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO.
ABSORCIN 500 n m
Media
E
Des. St
Lmites 5 %
C.V.%

0,412
0,002
0,007
0,398-0,426
1,59

El extracto obtenido despus de separar las dos fracciones anteriores, se trata con TCA al 10 %. Los datos se muestran en la tabla XV.
Las tres fracciones obtenidas muestran una reproductibilidad buena,
pues los coeficientes de variabilidad se encuentran dentro de lmites
muy estrechos (1,50-1,70).

Determinacin

de protenas

en hojas de Citrus.

TABLA

II.

215

XV

REPRODUCTIBILIDAD DE LA FRACCIN PRECIPITADA CON ACIDO TRICLOROACEPTICO AL 10 %. VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO.
ABSORCIN 500 n m
Media

0,331
0,001
0,005
0,319-0,342
1,64

EM

Des. St
Lmites 5 %
C.V. %

Las protenas cloroplsticas se subdividen en solubles e insolubles.


Para concretar la reproductibilidad de esta fraccin se tomaron diez
volmenes iguales de una suspensin de cloroplastos y obtenidos los
botones correspondientes, se trataron con disolucin hipotnica, desarrollndose la reaccin de Folin. La tabla XVI recoge los resultados
obtenidos.
TABLA

XVI

REPRODUCTIBILIDAD DE LA FRACCIN CLOROPLASTICA SOLUBLE.


VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO. ABSORCIN 500 n m
Media
EM
Des. St
Lmites 5 %
C.V.%

0,270
0,002
0,006
0,257-0,283
2,24

Los fragmentos cloroplsticos separados en la experiencia anterior,


se trataron con DSS al 0,5 % para solubilizar las protenas laminares.
Los datos se detallan en la tabla XVII.
TABLA XVII

REPRODUCTIBILIDAD DE LA FRACCIN CLOROPLASTICA INSOLUBLE.


VALORES DE DIEZ MUESTRAS POR TRIPLICADO. ABSORCIN 500 n m
Media
EM
Des. St. ...
Lmites 5 % ...
C.V.%

0,219
0,002
0,006
0,206-0,232
2,83

Aunque en este caso los coeficientes de variabilidad son superiores


(2,24 y 2,83) a los obtenidos en el fraccionamiento de las protenas citoplsmicas, se mantienen dentro de valores correctos.

216

A. L. Garca y J.

Snchez-Rojas

BIBLIOGRAFA

1. BAUDET, J., y MossE, J., The extraction of proteins from flower with water,
Compt. Rend., 525. 2843 (1962).
2. BAULT, A., Evoluton des proteins solubles acides de la radicules dui pois pendant Jes premiiens jours de su croissance, C. R. Acad. Sci. (Pars), 276, 741 (1973).
3. BETSCHART, A., y KINSELLA, J . E . , Exitraotability and solubility cif leaf proteins,
J. Agr. Food Chem., 21, 60 (1973).
4. BORDIER, CL., Phase separation of integral membrane proteins in Tritn X-114
solution, J. Biol Chem., 256, 1604 (1981).
5. BRAY, W . J., y HuMPHRiES, C., Solvent fractionation of leaf juice t o prepare
green and wdthe protedn produots, J. Sci. Food. Agrie, 29, 839 (1978).
6. BYERS, M., The aminoacid composition of some leaf protein preparation, Leaf
Protein, pg. 95. Pirie, N. W., ed. Blacwell scientific publications Oxford and
Edinburgh (1971).
7. DAS, G . A , y HALES, B . J., Aotion of detergents and electrophoresis on spinach
ohiloroplasts imder high alkaline conditiones, Photochem. PhotobioL, 26, 421
(1977).
8. DAWSON, R., Companison of fractiomation of groundnut protens by t w o difereitit methods, Biochem., 41, 305 (1971).
9. DoBY, G., Nitrogenous compounds of plants, Plant biochem., 10, 393. Inters.
Publish (1965).
10. EVANS, R . J., y KERR, M . H . , Extraction and preoipitation of nitrogenous constituents of dry navy beans (Phas'eolus vulgairis), J. Agr. Food. Chem., 11, 26
(1963).
11. FESTENSTEIN, G . N . , Extraction of proteins from green leaves, 1. Sci. Food.
Agr., 12, 305 (1961).
12. GRIFFTHG, D . E., y LOZANO, J . A., Sntesis d e protenas por cloroplastos in vatro.
Feotores relacionados con el estado de ios dloiraplastos. Revista espaola de
Fisiologa, 26, 71 (1970).
13.

HARRIS, . H . ; PRESTON, J . F . , y EISENSTAOT, J . M . , Aminoacid incorporation

and products of protein synthesis dn isolated chloroplasts of Euglena gracdlis,


Biochemistry, 12, 1227 (1973).
14. HARRMANN, F., y MEISTER, A., Separation a n d spectroscopical propertdes of
pigment-protein oomplexes inautirrbinum chloroplasts, Photosyntheica,
6, 177
(1972).

Determinacin

de protenas

en hojas de Citrus.

II.

217

15. HESS, H . H . ; LEES, M . B . , y Etew, J. E., A linear Lowry-Folin assay for both
water-soluble a n d dodecy siilfate solubilized proteins, Anal. Biochem., 85, 295
(1978).
16. KAWASHIMA, N . , y WILDMAN, S . G., Fracton I protein, Ann. Rev. Plant PhysoL,
21, 325 (1970).
17. KiNG, C. M., y KRIEK, E . , The differentiail reactivity of the oxidatioos paxducts
of oAmdnophenols towards protedn and nucleic acid, Biochitn. Biophys. Acta,
111, 147 (1975).
18. KLECAKOWSKA, D., Physicochemical characteristic ol leaf proteins, Bull. Acad.
Pal Sel. Ser. Sel. Biol, 17, 143 (1969).
19. KRISHNA, C . R., Compartive study of alkaOi a n d Swan's reagent in t h e extraction' of p r o t m i s from plant materiails, Prox. Symp. Proteins, 50 (1960).
20. LAGOUTTE, B., y DURANTON, J., Physicochemiical study of structurail proteins of
dhlorosplasts from Zea mays, Biochim. Biophys. Acta, 253, 232 (1971).
21. LooMis, W. D., y BATTAILE, J., Plant phenolic compounids a n d the isolation of
plant enzymes, Phytochemistry,
5, 423 (1965).
22. LoTTi, G., Lx) zinco nel metabolismo vegetale, Agrochimica, XVII, 141 (1973).
23.

24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.

33.
34.
35.
36.

37.

NAUDA, C H . ; KONDOS, A., y TERNOUTH, J., Improved technique for plamt pro-

teims extraction, J. Sci. Food. Agrie, 26, 1917 (1975).


PiRiE, N. W., Drying, preservatin, solvent extraction and separation into chloroplast and cytoplasmic fractions. Leaf protein, pg. 86. Pirie, N. W., ed., Blackwell Soi. Publications. Oxford and Bdinburgh (1971).
PLICH, H . , y MILLIKAN, D., Soluble protein conten a n d oxidatve enzyme activiity of the apple as influenoe by extractiong media tissue pireservation procedures, Fruit. Sci. Rep., 2, 1 (1975).
PoTTY, V. H., Determination of proteins in the presenoe of phenols a n d i>eotins.
Anal. Biochem., 29, 535 (1969).
PUSTAI, A., Extraction. of nitrogenoos and phosphorus containing materiaJs
from t h e s e e d s of kidney beans (Phascolus vuilgari's), Biochem. J., 94, 611 (1965).
REJ, R . , y RICHARDS, A., Interference by tris buffer in t h e estimation of protein by t h e Lowry prooedure. Anal. Biochem., 62, 240 (1974).
SARKAR, S . K . , y HOWARTH, R . E . , Soluble proteins of alfalfa (Medicago Sativa) herbage. Fractionation by ammoniun sulfate y gel, J. Agrie. Food. Chem.,
23, 626 (1975).
SAYANOVA, V. V., Comparative study of salt soluble proteins in t h e seeds of
some species of bean by gradient extraction in column, Rast. Belki, 9, 5 (1970).
SIMARD, C , y BOOLET, M . , Fractionation of proteins from soybean, fababeam,
a n d rapresed and alfalfa ileaf using "fractionated dissolution". Can. Inst. Food.
Sci. Technol. J., 11, 16 (1978).
SOLBCKA, M . ; ROSS, J . A., y MILLIKAK, D . F . , Evidenoe of substances interfering

with the Lx>wry test for protein in plant leaf tissue, Phytochemistry,
7, 1293
(1968).
STAHMNN, M . A., Plant proteins, Ann. Rev. Plant Physiol., 14, 137 (1963).
SuBBA RAU, B . H . ; MAHADEVIAH, S., y SINGH, N . , Nutritional estudies on whole
extract cxmgulated leaf protein a n d fractionated from Lceme (Medicago Sar
tiva), J. Sci. Food. Agr., 20, 355 (1%9).
TAN, K . K . , Assay of proteins by Lowry's method in samples containing 2
mercaptoethanOl, Anal. Biochem., 86, 327 (1978).
WILDMAN, S . G., The organization of grana containing chloroplasts in relation
to location of some enzymatic systems concemed with photosynthesis,
protein
synthesis and ribonucleic acid synthesis. Biochemistry of chloroplasts, vol. 11,
pg. 295. Goodwin, T. W., ed., Academic Pness, London and New York (1967).
WRIGLEY, C . S., y WEBSTER, H . L., The effects of stem ruist infeotion on the
soluble proteins of wheat leaves, Atist. J. Biol. Sci., 19, 895 (1966).