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Karl Schosinsky, Eugenia Mara Quintana Guzmn, Clements Ruepert

Optimizacin de un mtodo para la deteccin de carbamatos y organofosforados en vegetales
Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana, vol. 43, nm. 1, marzo, 2009, pp. 11-20,
Federacin Bioqumica de la Provincia de Buenos Aires
Argentina
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=53516745003

Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana,

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Toxicologa

Optimizacin de un mtodo
para la deteccin de carbamatos
y organofosforados en vegetales
Optimization of a method for the detection of
organophosphates and carbamates in vegetables
Karl Schosinsky1, Eugenia Mara Quintana Guzmn2, Clements Ruepert3

1. PhD., Catedrtico, Departamento de Anlisis Clnicos, Facultad de Microbiologa,

Universidad de Costa Rica (UCR), Centro
de Investigacin en Enfermedades Tropicales (CIET), UCR y Universidad de Ciencias Mdicas (UCIMED).
2. Magister Scientiae, Profesora Asociada
Departamento de Anlisis Clnicos, Facultad de Microbiologa, UCR y CIET.
3. M.Sc., Investigador Instituto Regional de
Estudios en Sustancias Txicas (IRET),
Universidad Nacional.

Resumen
Debido al alto grado de contaminacin por plaguicidas de productos agrcolas y al alto costo que implica su deteccin se consider importante optimizar el mtodo de escrutinio de inhibicin de colinesterasas humanas en presencia de extractos vegetales. Se demostr que las suspensiones de glbulos
rojos y plasma son estables al menos por tres meses si se mantienen entre 4
y 8 C. El reactivo de color es estable por al menos dos aos y medio en refrigeracin y los sustratos de ambas colinesterasas son estables congelados
al menos por dos aos. La mezcla del extracto vegetal y los glbulos rojos o
plasma debe incubarse 90 minutos a 37 C para determinar los porcentajes
de inhibicin enzimtica. Se determin que los porcentajes de inhibicin superiores a 16% en la plasmtica y a 21% en la eritroctica indican presencia
de plaguicida en los vegetales. Este mtodo de screening optimizado para detectar la presencia de carbamatos y organofosforados tiene ventaja sobre otros
por su bajo costo, facilidad y rapidez de anlisis sin requerir de equipo costoso y poco verstil. Esta metodologa no cuantifica ni identifica el plaguicida presente pero permite diferenciar entre organofosforados y carbamatos si
el periodo de incubacin del vegetal con eritrocitos o plasma se prolonga por
24 horas a 20-25 C.
Palabras clave: colinesterasa plasmtica * colinesterasa eritroctica * plaguicida * vegetal * screening * organofosforados * carbamatos

Summary
Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana
Incorporada al Chemical Abstract Service.
Cdigo bibliogrfico: ABCLDL.
ISSN 0325-2957
ISSN 1851-6114 en lnea
ISSN 1852-396X (CD-ROM)

Optimization of the screening method of inhibition of human cholinesterases is considered important because of the high contamination rate of agricultural products with pesticides and its high detection cost. It has been
demonstrated that erythrocytes and plasma are stable at least for three
months at 4-8 C. The colour reaction reagent is stable for at least two and
a half years at 4-8 C and the substrate for both cholinesterases is stable
when frozen, at least for two years. The solution of vegetable extract and

12

Schosinsky K et al.

erythrocytes or plasma must be incubated 90 minutes at 37 C in order to determine the

percentages of enzymatic inhibition. It was established that inhibition percentages higher
than 16% for the plasmatic solution, and 21% for the erythrocytic solution mean that pesticide is present in vegetables. The advantages of this optimized screening method for the
detection of carbamates and organophosphates in vegetables are its low cost and its easy
and quick analysis without the need of expensive equipment. This method does not quantify or identify the pesticide, but rather it differentiates organophosphates from carbamates if
the incubation time of the vegetable extract with erythrocytes or plasma is maintained at 2025 C for 24 hours.
Key words: plasmatic cholinesterase * erythrocytic cholinesterase * pesticide * vegetable *
screening * organophosphates * carbamates

Introduccin
Los plaguicidas han dado un gran aporte a la agricultura al incrementar el rendimiento agropecuario (1).
Son utilizados tanto en actividades agrcolas como pecuarias y de salud pblica. Son sustancias destinadas a
prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo a los vectores de enfermedades humanas o animales y a las especies no deseadas de plantas o animales que pueden causar perjuicio o interferir en la
produccin, elaboracin, transporte o comercializacin de alimentos (2)(3).
Se estima que actualmente el 85% de los plaguicidas empleados en el mundo se dedican al sector agropecuario (4-6). El uso indiscriminado de estas sustancias ha ocasionado contaminacin de aguas, suelo y
alimentos, teniendo una incidencia negativa sobre la vida silvestre y el hombre (7). La presencia de residuos
de plaguicidas en los alimentos que se derivan de su
uso durante las diversas fases de la produccin, almacenamiento, elaboracin, preparacin y comercializacin, ha despertado gran inters por sus repercusiones
en la salud y por ser un factor importante que interviene en las relaciones comerciales internacionales.
La intoxicacin por plaguicidas organofosforados y
carbamatos produce efectos residuales, sobre todo en
el Sistema Nervioso Central y en el Perifrico, as como en las funciones neuromusculares (8)(9). Se ha
documentado que ciertos plaguicidas estn asociados
con el desarrollo de cncer, esterilidad y malformaciones congnitas y se presentan con frecuencia intoxicaciones moderadas y severas (10). El contacto con el
plaguicida se da por aplicacin directa, arrastre por el
viento, por el agua o por tomarlo del suelo contaminado o de otras fuentes del ambiente (11).
Los organofosforados y carbamatos son los insecticidas y helminticidas de mayor importacin en Costa
Rica (12). La toxicidad que producen se asocia con la
inhibicin de la acetilcolinesterasa que es la enzima
responsable de la degradacin e interrupcin de la ac-

Acta Bioqum Cln Latinoam 2009; 43 (1): 11-20

tividad biolgica del neurotransmisor acetilcolina, cuya acumulacin altera el funcionamiento normal en la
transmisin de los impulsos nerviosos (13).
Los problemas causados por los plaguicidas en la salud humana y en el medio ambiente han preocupado
a las autoridades de Costa Rica por lo que se han incorporado en el Plan Nacional de Salud desde 1999.
La mayor incidencia de intoxicaciones por plaguicidas
en Costa Rica se da por Paracuat seguido de carbofuran, metomil, terbufos, fenamifos, glifosfato y propoxur, siendo los ltimos seis organofosforados o carbamatos (14). Costa Rica es el pas centroamericano que
ms agroqumicos utiliza calculndose que casi duplica la cantidad per cpita de producto consumido respecto del resto de la regin (15).
Los plaguicidas organofosforados y algunos carbamatos son inhibidores de la enzima humana colinesterasa, que cataliza la hidrlisis de steres de colina. Hay
dos tipos de colinesterasas, la srica o plasmtica y la
eritroctica; ambas enzimas son inhibidas, pero la actividad de la enzima plasmtica disminuye ms rpido
que la eritroctica, por lo que la determinacin de la
actividad plasmtica es un ndice muy sensible para
prevenir intoxicacin. La determinacin de la actividad de la enzima eritroctica es de importancia en los
sistemas de vigilancia para intoxicaciones crnicas ya
que permanece disminuida por ms tiempo que la
plasmtica (16).
Es de suma importancia determinar el grado de contaminacin por plaguicidas de los productos agrcolas
que se consumen, pues estos estn expuestos a contaminacin por fumigacin directa, contaminacin de los
suelos y aguas de riego, y por lo general son productos
que se consumen sin un lavado adecuado y sin coccin.
Sobre la base de la alta contaminacin por plaguicidas en vegetales que se obtuvo en una publicacin previa mediante la inhibicin de colinesterasas humanas
(17), se consider muy importante optimizar este mtodo. Adems, es sencillo y de bajo costo para la deteccin de la presencia y relativo grado de toxicidad del
plaguicida en los vegetales.

Mtodo para deteccin de plaguicidas

Materiales y Mtodos
Se procesaron en un extractor de jugos 20 g del vegetal para obtener un extracto. Se us como control
de colinesterasa plasmtica, una mezcla de plasmas
humanos (plasma control) obtenida con EDTA a la
que se determin la actividad de colinesterasa plasmtica por un mtodo cintico comercial (Biotec Internacional S.A. San Jos, Costa Rica).
Como control de colinesterasa eritroctica, se utilizaron eritrocitos humanos (eritrocitos control) lavados tres veces con solucin salina isotnica y resuspendidos con un volumen semejante de esa solucin
salina al de los glbulos rojos empacados; se determin la actividad de colinesterasa eritroctica por un mtodo cintico comercial (Biotec Internacional S.A. San
Jos, Costa Rica).
La reaccin sobre la cual se bas la determinacin
de la actividad enzimtica de las colinesterasas (18)
fue la siguiente:
Sustrato + colinesterasa tiocolina + sal del cido
Tiocolina + ditionitrobenzoato (incoloro) tionitrobenzoato (amarillo) + disulfuro mixto
La formacin de tionitrobenzoato es directamente
proporcional a la actividad enzimtica.
Sustrato: propioniltiocolina para colinesterasa srica y acetiltiocolina para la eritroctica.
Sal del cido: propionato para colinesterasa plasmtica y acetato para la eritroctica.
Actividad de colinesterasa plasmtica en extractos
vegetales: se mezclaron 100 L de plasma control con
100 L del extracto del producto agrcola y se incub
a 37 C por 90 min. Se colocaron 10 L de esta mezcla
en 1,0 mL de reactivo de color (ditionitrobenzoato) y
50 L de sustrato y se obtuvo el dA/min a una longitud de onda de 450 nm estableciendo una fase estacionaria de 15 s y un tiempo de lectura de 30 s. Para calcular el porcentaje de inhibicin de la actividad
enzimtica se analiz un extracto vegetal libre de plaguicidas (control) utilizando la metodologa anterior,
cuya actividad correspondi al 100%. Para determinar
el porcentaje de inhibicin se multiplic el dA/minuto de la muestra por cien y se dividi por el dA/min
del extracto control y a este valor se le rest 100.
Actividad de colinesterasa eritroctica en extractos
vegetales: se mezclaron 100 L de eritrocitos control
con 100 L del extracto del producto agrcola y se incubaron 90 min a 37 C; se colocaron 5 L de esta
mezcla en 1 L de reactivo de color (ditionitrobenzoato), se agregaron 50 L de sustrato y se obtuvo el dA/
min a una longitud de onda de 460 nm estableciendo
una fase estacionaria de 15 s y un tiempo de lectura de
45 s. Para calcular el porcentaje de inhibicin de la actividad se utiliz como control un extracto vegetal li-

13

bre de plaguicida que se analiz igual que las muestras

de los vegetales y cuya actividad enzimtica corresponde al 100%. El porcentaje de inhibicin se obtuvo multiplicando el dA/min de la muestra por cien y se dividi por el dA/min del extracto control y a este valor se
le rest 100.
Cintica de la mezcla de reactivo de color con plasma o glbulos rojos en ausencia de sustrato a 24 y 30 C:
se determinaron las absorbancias de la reaccin de color por un periodo de 30 min a ambas temperaturas.
Estabilidad del sustrato: se estableci analizando
ambas colinesterasas cada tres meses por un periodo
de dos aos y tres meses mantenindolo a 24 C, 4 C
y 10 C.
Estabilidad del reactivo de color: se analiz tanto la
colinesterasa plasmtica como la eritroctica cada tres
meses manteniendo los reactivos a 24 C y 4 C por un
perodo de dos aos y seis meses.
Linealidad: se determin la linealidad aumentando
los volmenes de plasma o suspensin de eritrocitos a
volmenes constantes de extracto vegetal, obtenindose la ecuacin de regresin lineal y el coeficiente de
determinacin R2.
Imprecisin en una sola corrida: se realizaron 18
anlisis de una suspensin de glbulos rojos lavados y
21 de una muestra de plasma para determinar la actividad de las colinesterasas en una sola corrida. Utilizando la imprecisin del mtodo se obtuvo el lmite de
deteccin que a su vez corresponde al punto de corte
(cut off). Este lmite se estableci utilizando la siguiente ecuacin para determinar el porcentaje de inhibicin: promedio menos tres desviaciones estndar entre valor promedio por 100 menos 100.
Porcentajes de inhibicin con diferentes actividades enzimticas en presencia de una cantidad constante
de plaguicida: se incub a 37 C la mezcla de extracto vegetal- oxamil (carbamato) o metilparatin (organofosforado) con diferentes cantidades de glbulos rojos por
90 min ajustando a un volumen final constante con
agua destilada. Se determinaron los porcentajes de inhibicin de cada una de estas diluciones utilizando un
extracto vegetal libre de plaguicida como control en
cada una de las diluciones. Este mismo procedimiento
se realiz sustituyendo los glbulos rojos por plasma,
utilizando los plaguicidas oxamil y terbufos (organofosforado).
Tiempo mnimo de incubacin a 37 C de la mezcla
extracto vegetal-plaguicida-glbulos rojos o plasma: se
determinaron los porcentajes de inhibicin de colinesterasas plasmtica y eritroctica en presencia de oxamil
o terbufos cada 15 min por un perodo de dos horas.
Diferenciacin entre organofosforados y carbamatos: se obtuvieron los porcentajes de inhibicin a los
90 min, 24 y 48 horas de incubacin de extracto vegetal con oxamil y extracto vegetal con metilparatin
tanto para glbulos rojos como para plasma.

Acta Bioqum Cln Latinoam 2009; 43 (1): 11-20

14

Schosinsky K et al.

Porcentaje de inhibicin respecto al tiempo en diferentes vegetales: se obtuvieron los porcentajes de inhibicin a los 90 min y 24 horas de incubacin en extractos de apio, lechuga y culantro obtenidos
comercialmente utilizando ambas colinesterasas.
Comparacin con cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC): a extractos vegetales con diferentes organofosforados (malatin, metilparatin,
foratos, terbufos y clorpirifos) se les determin el
porcentaje de inhibicin enzimtica por ambas colinesterasas y se analiz cada uno de estos extractos
mediante HPLC.

La cintica de la mezcla de la reaccin de color-glbulos rojos en ausencia de sustrato a 30 C se observa

en la Figura 1. Las Figuras 2 y 3 muestran la linealidad
de la colinesterasa plasmtica y eritroctica, respectivamente. Las Figuras 4 y 5 exhiben los porcentajes de inhibicin de ambas colinesterasas en presencia de concentraciones constantes de oxamil y metilparatin u
oxamil y terbufos con diferentes actividades enzimticas. Las Figuras 6 y 7 muestran los porcentajes de inhibicin de colinesterasa plasmtica y eritroctica en presencia de oxamil o terbufos a diferentes tiempos de
incubacin, respectivamente.

Resultados

Discusin y Conclusiones

La imprecisin en una sola corrida para la colinesterasa plasmtica y para la eritroctica se muestra en la
Tabla I. En la Tabla II se observa el porcentaje de inhibicin de colinesterasas con respecto al tiempo de la
mezcla de oxamil o metilparatin con extracto vegetal.
La Tabla III presenta el porcentaje de inhibicin de
ambas colinesterasas con respecto al tiempo de incubacin de la mezcla extracto vegetal con eritrocitos o
plasma en diferentes productos agrcolas obtenidos
comercialmente. La Tabla IV muestra el estudio comparativo entre el porcentaje de inhibicin de las colinesterasas y la concentracin del plaguicida organofosforado del extracto vegetal por HPLC.

ESTABILIDAD ENZIMTICA A DIFERENTES

TEMPERATURAS DE ALMACENAMIENTO
En un estudio previo se evalu la estabilidad de las
colinesterasas plasmtica y eritroctica a temperatura
ambiente, 4 y 20 C, durante un perodo de tres meses (19). Se estableci que la colinesterasa plasmtica
es estable en refrigeracin y congelacin por al menos
tres meses. A temperatura ambiente la actividad de esta enzima disminuye significativamente (6% a 11%)
en una semana. La colinesterasa eritroctica es estable
nicamente en refrigeracin. El proceso de congelamiento y descongelamiento provoca disminucin importante en la actividad de esta enzima. En las mues-

Tabla I. Imprecisin en una sola corrida de la actividad de Colinesterasa Eritroctica y

Plasmtica

N
X (dA/min)
DE (dA/min)
3DE (dA/min)
X-3DE (dA/min)
CV (%)
Presencia plaguicida
4DE (dA/min)
X-4DE (dA/min)
Presencia plaguicida

Eritroctica

Plasmtica

18
0,07072
0,0037557
0,011267
0,05945
5,3
% inhibicin >16%
0,0150228
0,055697
% inhibicin >21%

21
0,1928
0,007557
0,02267
0,17013
3,9
% inhibicin >12%
0,30228
0,16257
% inhibicin >16%

N= nmero de muestras
X= valor promedio

DE= desviacin estndar

CV= coeficiente de variacin

Tabla II. Porcentaje de inhibicin con respecto al tiempo

Colinesterasa
plasmtica

Muestra

Extracto + oxamil
Extracto + metilparatin

Colinesterasa
eritroctica

90 min

24 horas

48 horas

90 min

24 horas

48 horas

63,5%
57%

54,9%
75,12%

29,9%
77,9%

37,8%
77%

10,16%
97%

14%
82,9%

Acta Bioqum Cln Latinoam 2009; 43 (1): 11-20

Mtodo para deteccin de plaguicidas

15

Tabla III. Porcentaje de inhibicin con respecto al tiempo en diferentes productos

agrcolas
Muestra

23 A
32 L
40 A
42 C
45 C
59 C
76 L
77 L
103 C
105 C
112 A

Colinesterasa
plasmtica

Colinesterasa
eritroctica

90 min

24 horas

13%
32%
15%
3%
3%
1%
40%
44%
17%
64%
27%

1%
87%
53%
8%
8%
3%
89%
94%
65%
87%
41%

90 min
46%
58%
20%
4%
9%
3%
57%
56%
42%
86%
48%

24 horas
25%
73%
30%
0%
0%
0%
70%
63%
59%
99%
20%

A = Apio
C = Culantro
L = Lechuga

Tabla IV. Estudio comparativo entre porcentajes de inhibicin enzimtica y concentraciones

de plaguicidas organofosforados obtenidas por HPLC

Plaguicida
Malatin
Metilparatin
Foratos
Terbufos
Clorpirifos
Control

Concentracin
g/g
31,4
2,9
66,0
3,5
1,3
0

tras conservadas por un da a 20 C, la actividad de la

enzima eritrocitaria disminuy entre un 9 y 20% al relacionarla con la basal y a temperatura ambiente disminuye considerablemente en siete das.
ESTABILIDAD DEL REACTIVO DE COLOR
EN PRESENCIA DE ENZIMA
Con el propsito de establecer el efecto que producen la colinesterasa plasmtica o eritroctica en el reactivo de color se determinaron los dA/min en ausencia
de sustrato. La Figura 1 muestra aumentos en las absorbancias al utilizar glbulos rojos. Cuando se determin
la cintica con glbulos rojos incubados a 30 C se observ que la absorbancia tiende a estabilizase a los 15
minutos, mientras que a temperatura ambiente la estabilizacin requiere mayor tiempo, por lo que se recomienda que al determinar la actividad de colinesterasa
eritroctica en los extractos vegetales se debe incubar la
mezcla de glbulos rojos y extracto con reactivo de color
a 30 C por al menos 15 minutos previa adicin de sustrato. Este proceso no es necesario cuando se utiliza sue-

Porcentaje de Inhibicin
Plasmtica
Eritroctica
39,2
25,2
58
32,3
17,4
0

32
48
25,4
23
11,2
0

ro o plasma debido a que no se observan variaciones de

absorbancia significativas con respecto al tiempo.
ESTABILIDAD DEL SUSTRATO
Se determin que la estabilidad del sustrato a 10 C
tanto para colinesterasa eritroctica como plasmtica es
de dos aos y tres meses. Analizando ambos reactivos
cada tres meses se observ que son estables durante este perodo de almacenamiento, ya que los coeficientes
de variacin fueron muy semejantes a los obtenidos en
una sola corrida. En refrigeracin (10 C) la estabilidad del sustrato se mantiene por dos semanas y a temperatura ambiente por tres das.
ESTABILIDAD DEL REACTIVO DE COLOR
A TRAVS DEL TIEMPO
La estabilidad del reactivo de color para ambas colinesterasas mantenido en refrigeracin (10 C) es de
al menos dos aos y medio, ya que los coeficientes de
variacin fueron muy semejantes a la imprecisin en

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16

Schosinsky K et al.

0,40

Absorbancia

0,39
0,38
0,37
0,36
0,35
0,34
0,33
0

10

15

20

25

30

Tiempo (min)
Figura 1. Cintica de la mezcla reactivo color-glbulos rojos en ausencia de sustrato a 30 C

una misma corrida. No se recomienda mantenerlo a

temperatura ambiente (24 C) ya que adquiere coloracin amarillenta despus de una semana de almacenamiento, debido a la reduccin del mismo.
LINEALIDAD
Al utilizar diferentes volmenes de plasma manteniendo constante el volumen total de reaccin se obtiene una respuesta lineal de 0,1 dA/min a 0,45 dA/min,
lo que permite analizar con alta confiabilidad muestras con valores extremos. La ecuacin de regresin lineal obtenida es y=0,0368x + 0,0502 con un coeficiente de determinacin R2=0,9574 (Fig. 2).
Un comportamiento semejante se observa al utilizar
diferentes volmenes de eritrocitos manteniendo constante el volumen total de reaccin, con una respuesta lineal de 0,015 dA/min y al menos hasta 0,06 dA/min.
La ecuacin de regresin lineal obtenida es
y = 0,0028x + 0,0012 con un coeficiente de determinacin R2 = 0,9821 (Fig. 3).

LMITE DE DETECCIN Y PUNTO DE CORTE

La Tabla I muestra las desviaciones estndar y coeficientes de variacin al practicar 18 anlisis de una muestra de glbulos rojos lavados y 21 anlisis de plasma para determinar la actividad de las colinesterasas en una
sola corrida. Con esta informacin se puede determinar
el lmite de deteccin que a su vez corresponde al punto
de corte (cut off). El porcentaje de inhibicin obtenido
por la imprecisin para la colinesterasa eritroctica fue de
16% considerando tres desviaciones estndar, lo que
significa que cualquier valor superior a este porcentaje
sugiere presencia de plaguicidas. Sin embargo, si se utiliza el promedio de los dA/minuto menos cuatro desviaciones estndar el punto de corte sera de 21%.
Con la colinesterasa plasmtica se obtiene un porcentaje de inhibicin del 12% para tres desviaciones
estndar, por lo que valores superiores a este porcentaje indicarn presencia de plaguicidas. Si se utiliza el
promedio menos cuatro desviaciones estndar, el punto de corte sera del 16%.

0,6
0,5

dA/min

0,4
0,3
y = 0,0368 x + 0,0502

0,2

R = 0,9574
0,1
0
0

10

12

Plasma (L)
Figura 2. Linealidad de la colinesterasa plasmtica con diferentes volmenes de plasma

Acta Bioqum Cln Latinoam 2009; 43 (1): 11-20

14

Mtodo para deteccin de plaguicidas

17

0,0600

dA/min

0,0500
0,0400
0,0300
y = 0,0028x + 0,0012

0,0200

R = 0,9821

0,0100
0,0000
0

10

15

20

25

Glbulos rojos (L)

Figura 3. Linealidad de colinesterasa eritroctica con diferentes volmenes de glbulos rojos

Al utilizar el promedio de los dA/minuto menos

cuatro desviaciones estndar se aumentara la sensibilidad diagnstica disminuyndose los falsos positivos por
lo que disminuira la especificidad diagnstica aumentndose los falsos negativos. Queda a juicio del analista
elegir el punto de corte que considere conveniente.
Al determinar el efecto de la actividad enzimtica
plasmtica y eritroctica en los porcentajes de inhibicin manteniendo constante la concentracin de plaguicida, oxamil, metilparatin o terbufos, se observ
que la inhibicin es independiente de la actividad enzimtica (Figs. 4 y 5). Este comportamiento permite
utilizar controles de glbulos rojos y plasma con actividades diferentes sin necesidad de estandarizar los controles a una determinada actividad.
TIEMPOS DE INCUBACIN
Con el propsito de establecer el tiempo mnimo
que se debe incubar la mezcla glbulos rojos-extracto

vegetal o plasma-extracto vegetal se incubaron en presencia de oxamil a 37 C y a diferentes tiempos. La Figura 6 muestra que al aumentar el tiempo de incubacin los porcentajes de inhibicin aumentan con
respecto al tiempo, hasta que se estabilizan aproximadamente a los 45 min mantenindose constante an a
los 120 min. Utilizando este mismo procedimiento
con terbufos se observa un aumento en el porcentaje
de inhibicin hasta los 90 minutos (Fig. 7). Se recomienda incubar las mezclas extracto vegetal-glbulos
rojos o plasma a 37 C un mnimo de hora y media para obtener mayor sensibilidad, ya que los organofosforados requieren mayor tiempo de incubacin sin que
se modifique la inhibicin dada por carbamatos.
La Tabla II muestra porcentajes de inhibicin que
producen el oxamil o metilparatin a diferentes tiempos
de incubacin de la mezcla extracto vegetal-glbulos rojos o extracto vegetal-plasma. Es evidente que los porcentajes de inhibicin disminuyen a las 24 y 48 horas de

100
90

Inhibicin (%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

2000

4000

6000

8000

Actividad (UI/L)
Metilparatin
Oxamil

Figura 4. Porcentaje de inhibicin con concentraciones constantes de Oxamil y Metilparatin

con diferentes actividades de colinesterasa eritroctica.

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Schosinsky K et al.

100
90

Inhibicin (%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

1000

2000

3000

400

5000

6000

7000

8000

9000

10000

Actividad (UI/L)
Oxamil
Terbufos

Figura 5. Porcentajes de inhibicin con concentraciones constantes de terbufos y oxamil con diferentes
actividades de colinesterasa plasmtica

incubacin en presencia de oxamil para ambas colinesterasas. Por el contrario, en presencia de metilparatin
los porcentajes de inhibicin aumentan. Para diferenciar si es un organofosforado o un carbamato presente
en el vegetal, se deben determinar los porcentajes de inhibicin incubndose a 37 C por 90 minutos y a temperatura ambiente por 24 horas. Lo anterior se explica debido a que los carbamatos y organofosforados se unen al
sitio cataltico de la colinesterasa inhibiendo su actividad
sobre el sustrato. La inactivacin enzimtica con organofosforados puede durar varios das o inclusive producir
una inhibicin irreversible conocida como envejecimiento. Las enzimas inhibidas por carbamatos se hidrolizan rpidamente regenerando su actividad (20).

Los porcentajes de inhibicin obtenidos a los 90

min y a las 24 horas de incubacin de extractos vegetales (adquiridos en el comercio) con glbulos rojos
o plasma se muestran en la Tabla III. En trminos generales, se podra pensar que la mayora de los plaguicidas utilizados en estas muestras son organofosforados debido al aumento en el porcentaje de
inhibicin a las 24 horas, con excepcin de la 23 A que
disminuy con ambas enzimas. Las muestras 42 C,
45 C y 50 C que mostraron valores inferiores a los establecidos en el punto de corte a los 90 min no sobrepasaron los niveles superiores aceptados a las 24 horas por lo que se consideran no contaminadas por
plaguicidas.

90
80

Inhibicin (%)

70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

120

140

Tiempo (min)
Eritroctica
Plasmtica

Figura 6. Porcentaje de inhibicin de colinesterasa plasmtica y eritroctica en presencia

de oxamil con diferentes tiempos de incubacin

Acta Bioqum Cln Latinoam 2009; 43 (1): 11-20

Mtodo para deteccin de plaguicidas

19

80

Inhibicin (%)

70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

30

60

80

100

120

140

Tiempo (min)
Plasmtica
Eritroctica

Figura 7. Porcentaje de inhibicin de colinesterasa plasmtica y eritroctica en presencia de terbufos

a diferentes tiempos de incubacin.

COMPARACIN CON UN MTODO

DE REFERENCIA
La Tabla IV muestra los datos de las concentraciones de diferentes plaguicidas organofosforados analizadas por HPLC con los porcentajes de inhibicin para ambas colinesterasas. Se observa que, excepto para
clorpirifos, hubo inhibicin enzimtica superior al lmite de corte establecido para ambas colinesterasas, lo
que demuestra que los plaguicidas fueron detectados
por este mtodo. En el caso del clorpirifos con la colinesterasa eritroctica el porcentaje de inhibicin obtenido es menor al lmite de corte, mostrando tambin
menor sensibilidad que la plasmtica para este plaguicida. Este ltimo comportamiento se observa con malatin, forato y terbufos, pero con metilparatin la eritroctica es ms sensible que la srica.
Se recomienda que para detectar la presencia de
plaguicidas en vegetales utilizando la inhibicin de
las colinesterasas, tanto los glbulos rojos como el
reactivo de color deben mantenerse entre 4 C y 8 C
y el sustrato en congelacin y la mezcla extracto vegetal-eritrocitos o plasma debe incubarse hora y media
a 37 C para asegurarse que el plaguicida inhiba adecuadamente a las colinesterasas. En la determinacin
de la actividad de colinesterasa eritroctica debe
preincubarse a 30 C la mezcla reactivo de color-glbulos rojos por un periodo mnimo de 15 min. Para
la colinesterasa srica no se requiere este periodo de
preincubacin. Para establecer la cintica de reaccin es necesario realizar una fase estacionaria de 15
segundos para ambas colinesterasas y un tiempo de
lectura de 30 s para la plasmtica y de 45 s para la eritroctica.
Se concluye que este mtodo de screening optimizado para detectar la presencia de carbamatos y organo-

fosforados en vegetales tiene la ventaja, sobre otros

mtodos convencionales como cromatografa lquida
de alta resolucin y los inmunoenzimticos, de su bajo costo y rapidez de anlisis sin que se requiera de
equipo costoso y poco verstil. Sin embargo, esta metodologa no cuantifica ni identifica el plaguicida presente pero permite diferenciar entre organofosforados y carbamatos.
CORRESPONDENCIA
EUGENIA MARA QUINTANA GUZMN
Departamento de Anlisis Clnicos, Facultad de Microbiologa
Universidad de Costa Rica, SAN PEDRO, San Jos, Costa Rica
Correo electrnico: eugenia.quintana@ucr.ac.cr

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Aceptado para su publicacin el 12 de septiembre de 2008