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DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
MANUAL
PRCTICAS DE
LABORATORIO
DE BIOQUMICA
HERMINSUL DE JESS CANO CALLE
STELIA CAROLINA MNDEZ SNCHEZ
JENNIFFER CRUZ LAITN
ESCUELA DE QUMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
Cdigo: MFOQ-BQ.01
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PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA
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Contenido
Introduccin
Pg.
1. Espectroscopa y diluciones
13
3. Soluciones amortiguadoras II
20
26
31
40
48
58
64
10. Carbohidratos
XX
11. Extraccin
XX
12. Peroxidasa
XX
XX
14. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XX
15. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XX
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Introduccin
Este curso intenta introducir al estudiante a algunos de los procedimientos experimentales ms ampliamente
usados en bioqumica. Incluye anlisis de macromolculas como carbohidratos, lpidos, protenas y cidos
nucleicos; purificacin y caracterizacin de protenas, ensayos de enzimas y cintica enzimtica, aislamiento y
manipulacin de ADN y otros. El estudiante tambin se familiarizara con algunos de los equipos ms
frecuentemente usados en las prcticas de bioqumica.
Pocos artculos en la literatura estn escritos por un solo autor; la mayora tienen al menos dos autores y algunos
hasta ms de diez. Es as, que las prcticas sern llevadas a cabo en grupos de dos o tres estudiantes. Usted
puede escoger compaeros, o puede preguntar para que lo asignen a un grupo.
Antes de cada periodo de laboratorio, el estudiante necesita gastar algn tiempo leyendo la prctica, esta
lectura proveer informacin y entendimiento sobre los procedimientos a ser desarrollados. Si esto no se hace,
usted desperdiciara mucho tiempo de clase, y perjudicara a los dems estudiantes y al profesor. Tambin
encontrara difcil responder las preguntas de la prctica que deben ser entregadas cada da.
ASPECTOS FILOSOFICOS: La investigacin cientfica involucra una exploracin de lo desconocido. En
algunos casos, una pregunta tiene una respuesta correcta, la cual es conocida por el profesor e impartida a los
estudiantes. En investigacin, por otro lado, la respuesta correcta es raramente conocida de antemano y debe
siempre ser deducida de los resultados experimentales. Los investigadores deben por lo tanto acostumbrarse a
algn nivel de incertidumbre sobre la respuesta correcta a una pregunta experimental, y debe siempre
permanecer abierto a la evidencia experimental que contradice una hiptesis que ha surgido de experimentos
previos. Su trabajo como cientfico ser considerar sus datos, y tratar de interpretarlos. En este contexto,
respuestas equivocadas son respuestas que son contradichas por sus datos o que no producen una conclusin
lgica de los datos que usted ha recolectado. As, usted debe ser muy cuidadoso cuando reporte datos o
resultados de lo que usted hizo u observo, especialmente si usted observa algo inesperado. Fraude cientfico, en
la cual personas intencionalmente reportan datos falsos, es considerado muy en serio porque esto resulta en una
creencia difcil de sobreponer ya que es un estamento que entra en conflicto con la verdad. En algunas ocasiones
vemos en la literatura retractaciones, en la cual un cientfico publica un estamento de una informacin dada en
un articulo previo como el resultado de un artefacto y no como una reflexin de la respuesta correcta. Evitando
as la pena de publicar una retractacin y ser visto como una persona que no es cuidadosa en el desarrollo de
experimentos y en la interpretacin de resultados.
Otro asunto crtico es la apropiada citacin de las fuentes de informacin que usted usa para escritos cientficos.
Se debe siempre referenciar apropiadamente los autores de artculos y libros que usted consulta. Si usted no lo
hace, estar reclamando crdito por trabajo desarrollado por otros.
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1. ESPECTROSCOPA Y DILUCIONES
Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
1.1. Objetivos
Adquirir habilidades y competencias bsicas en el desempeo dentro de un laboratorio de bioqumica.
Determinacin cuantitativa de la concentracin de CuSO4 en una muestra problema mediante
espectroscopa de absorcin molecular UV-VIS.
Comprender y aplicar los conceptos de molaridad, normalidad, porcentajes de peso a peso y dilucin.
1.2. Conceptos relacionados
Absorbancia, ley de Lambert-Beer, dilucin, espectrofotometra.
1.3. Fundamento terico
1.3.1. Espectroscopa
Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solucin. La absorbancia es una
medida cuantitativa til y est relacionada con la concentracin a travs de la ley de Beer-Lambert, la cual
establece lo siguiente:
Donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda dada, es el coeficiente de extincin del
compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (Mcm)-1, c es la concentracin molar de la especie que
absorbe, y l es la longitud de paso de la celda que contiene la solucin donde se realiza la medicin y est dada
en cm. As, si el coeficiente de extincin es conocido, la absorbancia de la solucin puede ser usada para
calcular la concentracin de la especie en solucin (asumiendo que la nica especie que absorbe es el
compuesto de inters).
La explicacin anterior de por qu medimos la absorbancia no explica lo que significa la absorbancia en s. Otra
definicin ms precisa est dada por la expresin (2):
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( )
Donde I0 es la cantidad de luz que entra a la muestra, e I es la cantidad de luz que sale de la muestra. La
absorbancia es por lo tanto una medida de la porcin de luz que llega al detector. De lo cual se deduce que
cuando la absorbancia vale 1, solo el 10% de la luz alcanza el detector, y cuando es 2, solo el 1% de la luz
alcanza el detector.
Valores de absorbancia mayores de 2 no son confiables porque muy poca luz est alcanzando el detector para permitir
mediciones acertadas. Cuando se realizan las mediciones, si el valor de absorbancia es mayor de 2, se debe diluir la
muestra y realizar las mediciones nuevamente.
Un espectrofotmetro interpretar huellas presentes en las caras pticas de la cubeta, como tambin burbujas
de aire o presencia de slidos en la solucin, afectando los valores reales de la medicin. Antes de colocar la
cubeta se deben tener en cuenta estos aspectos.
Algunas cubetas estn diseadas para luz visible nicamente. Cuando el espectrofotmetro est en modo de
ultravioleta (340 nm o menos) asegrese que su cubeta no tiene gran absorbancia cuando solamente contiene
agua.
El trmino espectroscopia proviene de la palabra espectro que originalmente se refera a los mltiples
colores de luz que aparecan al analizar luz blanca a travs de un prisma. Implica por lo tanto, el uso de mltiples
longitudes de onda de luz.
Los espectrofotmetros tienen entonces la habilidad de medir absorbancia a valores especficos de longitud de
onda. El mtodo usado ms comnmente involucra un monocromador que permite descomponer la luz
incidente en sus componentes con diferentes longitudes de onda y de esta forma escoger una longitud de onda a
la cual una muestra dada absorbe con mayor intensidad. La habilidad para medir la absorbancia a diferentes
longitudes de onda es muy til porque el coeficiente de extincin vara al variar la longitud de onda. Adems, el
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espectro de absorbancia puede variar dependiendo de la composicin qumica del compuesto y el ambiente
(solvente) alrededor de este.
La figura 2 muestra el espectro de absorbancia de una protena. Esta tiene un valor muy alto de absorbancia de
alrededor de 280 nm, y muy bajo a mayores longitudes de onda. Para esta protena, los nicos cromforos que
absorben a esta longitud de onda son los anillos aromticos de los aminocidos tirosina y triptfano. Como estas
protenas absorben en el ultravioleta, son incoloras. Sin embargo, hay otras protenas que absorban en la regin
visible como lo son la Hemoglobina que posee un grupo (Hemo) que absorbe fuertemente en esta regin.
El coeficiente de extincin de una molcula a una longitud de onda dada puede ser calculado utilizando la ley de
Beer-Lambert para medidas de absorbancia de soluciones de concentracin conocida.
1.3.2. Diluciones
Muchas soluciones usadas en bioqumica son preparadas por dilucin de una solucin estndar. Para esto se
necesita considerar la concentracin final deseada y el volumen requerido del material diluido, esto se puede
hacer utilizando la ecuacin (3).
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V1=?
C1= 1000 g/mL
V2=200 L
C2= 20 g/mL
( )
Esto quiere decir que se toman 4 L de la solucin inicial, se le adiciona 196 L de disolvente para obtener la
solucin final de concentracin conocida.
Otro factor importante es la nomenclatura para las diluciones la cual se muestra como una relacin. Por
ejemplo: Una relacin 1:2 quiere decir que a un volumen inicial se le agrega otro volumen de solvente para
lograr el volumen final. Una relacin 1:5 quiere decir que a un volumen inicial se le agregan 4 volmenes de
solvente. Otras veces la nomenclatura est dada en valores de X, por ejemplo una solucin 10X. Si se quiere
preparar de esta una dilucin 1X se necesitara una relacin 1:10 para prepararla. De la misma forma se pueden
preparar otras diluciones para realizar una curva de calibracin. En este experimento, se aprender cmo
preparar diluciones, cmo usar el espectrofotmetro y cmo interpretar los datos.
1.4. Materiales
Pipetas
Puntas para pipetas
1.5. Equipos
Espectrofotmetro UV-Vis
1.6. Sustancias
1.7. Procedimiento
1.7.1. Dilucin simple 1
Papel parafinado
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Colocar la longitud de onda a un valor de 700 nm y calibrar un blanco a cero con agua.
Preparar 3 mL de las siguientes diluciones de CuSO4 usando agua destilada: 1:2, 1:5, 1:10, 1:50, y 1:100.
Asumiendo que la solucin estndar de CuSO4 es 5X, preparar las siguientes diluciones: 0,5X, 1X, 2X.
Preparar las siguientes diluciones de CuSO4 usando dilucin en serie: 1:5, 1:25, 1:125, y 1:625.
Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para las soluciones o diluciones de
concentracin desconocida.
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Residuos acuosos
Una disolucin que contiene 4.48 ppm de KMnO4 presenta una transmitancia de 0.309 en un cubeta de
1.00 cm a 520 nm. Calcular la absortividad molar del KMnO4.
b) El complejo FeSCN+2, cuya longitud de onda de mxima absorcin es 580 mn, tiene una absortividad molar
de 7.00 X 103 L cm-1 mol-1. Calcular:
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1. La absorbancia a 580 nm de una disolucin del complejo 2.50 X 10 -5M,si se mide en una cubeta de
1.00 cm
2. La absorbancia de una disolucin del complejo cuya concentracin es el doble de la del apartado
anterior.
3. La trasmitancia de las disoluciones descritas en los apartados 1 y 2.
4. La absorbancia de una solucin cuya transmitancia es la mitad de la descita en el apartado 1.
c)
Mximo de absorcin,
nm
1.
Absortividad Molar
430 nm
600nm
HIn
430
8.04X103
1.23X103
In-
600
0.775X103
6.96X103
Calcular la absorbancia a 430 nm y a 600 nm de las disoluciones de indicador con las siguientes
concentraciones: 3,00 x 10-4 M; 2,00 X 10-4; 1,00 X 10-4 M; 0,500 X 10-4 M y 0,250 X 10-4 M.
2.
Referencias bibliogrficas
1)
2)
3)
Skoog D. A., West D. M. y Holler F.J., "Fundamentos de Qumica Analtica". Ed. Reverte.
Barcelona. 1997.
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Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
2.1. Objetivos
Determinar el pH de una solucin utilizando mtodos colorimtricos o
potenciomtricos.
Reconocer la capacidad tampn de aminocidos y protenas
Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de las soluciones tampn
de importancia biolgica.
2.2. Conceptos relacionados
Concepto de cido-base, ionizacin del agua, definicin de pH y pKa, ecuacin de
Henderson-Hassenbalch, capacidad tampn, valores de pKa de aminocidos.
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Varillas de agitacin
3 vasos de precipitados (50 o 100
mL)
2.5. Equipos
PHmtro
2.6. Sustancias
Soluciones tampn de pH 3,5,7,9 y
10
NaOH 0.1 M
cido ortofosfrico
Indicador universal
HCl O.1 M
cido brico
Fosfato
de
sodio
monobsico
(NaH2PO4)
Fosfato
de
sodio
dibsico
(Na2HPO4.7H2O)
2.7. Procedimiento
1.
Pesar 0.5 g de cido brico y disolver en un 100mL de agua destilada, adicionar 560 L de
cido ortofosfrico y 480 L de cido actico glacial, completar hasta 200 mL de agua
destilada. El pH de la solucin da alrededor de 1.9.
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A partir de esta solucin, a 25 mL de la solucin anterior adicionar NaOH 0.2 M, con ayuda
de una bureta, para obtener diferentes pHs. Realizar los clculos tericos del volumen de
NaOH para obtener soluciones a pH 3,5, 7,9 y 10. Comparar estos datos con los obtenidos
experimentalmente.
5.365
de
fosfato
de
sodio
dibsico
(Na2HPO4.7H2O)
7.17g
B(mL)
23.5
pH
A(mL)
B(mL)
1.5
16
23
15
10
22,5
2,5
14
11
22
13
12
21.5
3.5
12
13
21
11
14
20.5
4.5
10
15
20
14
pH
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2.
19
18
18
20
17
22
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Pesar 0.05g de naranja de metilo, 0,15g de rojo de metilo, 0.30g de azul de bromotimol,
0.35g de fenolftalena y el 66% de alcohol etlico a un litro.
Escala estndar
Preparar una batera de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo de ensayo 1mL de las
soluciones preparadas en un rango de pH de 3-10. Adicionar 5 gotas de indicador universal
y 9 mL de agua destilada.
Experimentacin
Experimento 1: Determinacin del pH.
Tubo 1: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 2: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Tubo 3: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 4: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Determinar el pH de cada solucin y anotar los resultados en una tabla
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Recipiente rotulado
Residuos acuosos
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Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry.
Fifth edition. Cambridge University Press.
2.
3.
Nelson, D.L.,
Captulo 3 (2006).
4.
Observaciones Oveimar
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Tipo de prctica:
Duracin:
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Indicaciones de peligro:
4 horas
3.1. Objetivos
Explorar las caractersticas de los sistemas amortiguadores y la forma como
mantienen valores constantes de pH.
Determinar la Ka para un cido dbil o Kb para una base dbil.
Preparar una solucin amortiguadora de un pH determinado.
Predecir la magnitud del cambio de pH cuando se adiciona acido o base a una
solucin amortiguadora.
3.2. Conceptos relacionados
Soluciones tampn, equivalentes cido-base, equilibrio inico, producto inico del agua,
contante de disociacin del agua, capacidad amortiguadora.
3.3. Fundamento terico
Las soluciones amortiguadoras son crticas en los procesos biolgicos y en general los
seres vivos utilizan diferentes tipos de soluciones amortiguadoras para controlar el pH a la
cual se llevan a cabo las reacciones.
Una solucin amortiguadora es una sustancia que mantiene constante el pH despus de la
adicin de pequeas cantidades de cido o base. Un sistema de este tipo, consiste de un
cido o base dbil y su respectiva sal, por ejemplo el cido carbnico y el bicarbonato de
sodio son un sistema amortiguador.
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El cido etanoico y su anin CH3COO- reacciona con los iones H+ u OH- que puedan ser
agregados a la solucin. Cuando un cido se aade a esta solucin, el ion etanoato
reacciona formando cido etanoco, el cual no se disocia completamente en agua
(electrolito dbil) de acuerdo a la siguiente reaccin:
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Debido a que el ion etanoato no es una base lo suficientemente fuerte para aceptar iones
H+ del agua, el pH de la solucin no presenta cambios significativos.
Una solucin amortiguadora no puede actuar de forma eficiente si se adiciona cido o
base es adicionado al sistema. La cantidad de cido o base que se puede agregar a una
solucin amortiguadora antes de cambiar de forma significativa su pH de denomina
capacidad de amortiguacin o capacidad buffer.
Ejemplos de soluciones amortiguadoras importantes corresponden al sistema cido
carbnico anin bicarbonato, responsable de mantener el pH de la sangre dentro del
intervalo pequeo de variaciones, indispensable en los humanos.
3.4. Materiales
Esptula
Erlenmeyer de 250 mL
pH metro
Pipeta de 10 mL
Vaso de preciptado de 250 mL
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3.5. Sustancias
Cloruro de sodio (NaCl) 0,1 M
Hidrogenosulfato
de
sodio
(NaHSO4) 0,1 M
Acetato de sodio (CH3COONa)
0,1 M
cido actico (CH3COOH) 0,1 M
3.6. Procedimiento
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Recipiente rotulado
Residuos acuosos
(Buffer)
Publishing
Company,
Inc.
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Tipo de prctica:
Grupal (2 personas)
Duracin:
Indicaciones de peligro:
3 horas
Ninguna
4.1. Objetivos
Obtener la estructura primaria de protenas de bases de datos
Analizar la estructura secundaria y terciaria de protenas obtenidas en bases de datos.
Usar visualizadores de protenas.
4.2. Conceptos relacionados
Pptidos, estructura secundaria, protenas, -hlice y hoja .
4.3. Fundamento terico
Los pptidos (del griego , pepts, digerido) son un tipo de molculas formadas por la
unin de varios aminocidos mediante enlaces peptdicos.
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implica la prdida de una molcula de agua y la formacin de un enlace covalente CO-NH. Es,
en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir aadiendo aminocidos al pptido,
pero siempre en el extremo -COOH terminal.
Los pptidos, al igual que las protenas, estn presentes en la naturaleza y son responsables
por un gran nmero de funciones, muchas de las cuales todava no se conocen.
La unin de un bajo nmero de aminocidos da lugar a un pptido, y si el nmero es alto, a
una protena, aunque los lmites entre ambos no estn definidos. Orientativamente:
Oligopptido: de 2 a 9 aminocidos.
Polipptido: entre 10 y 100 aminocidos.
Protena: ms de 100 aminocidos.
Las protenas con una sola cadena polipeptdica se denominan protenas monomricas,
mientras que las compuestas de ms de una cadena polipeptdica se conocen como protenas
multimricas.
La estructura secundaria de las protenas es el plegamiento regular local entre residuos
aminoacdicos cercanos de la cadena polipeptdica. Se adopta gracias a la formacin de
enlaces de hidrgeno entre los grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos
involucrados en las uniones peptdicas de aminocidos cercanos en la cadena. Estos tambin
se los encuentra en forma de espiral aplana.
Hlice alfa: En esta estructura la cadena polipeptdica se desarrolla en espiral sobre s misma
debido a los giros producidos en torno al carbono beta de cada aminocido. Esta estructura
se mantiene gracias a los enlaces de hidrgeno intracatenarios formados entre el grupo el
grupo -C=O del aminocido "n" y el -NH del "n+4" (cuatro aminocidos ms adelante en la
cadena). Un ejemplo particular es la Hlice de colgeno: una variedad particular de la
estructura secundaria, caracterstica del colgeno, protena presente en tendones y tejido
conectivo.Existen otros tipos de hlices: Hlice 310 (puentes de hidrgeno entre los
aminocidos "n" y "n+3") y hlice (puentes de hidrgeno entre los aminocidos "n" y
"n+5"), pero son mucho menos usuales.
Hoja plegada beta o -plegada: Cuando la cadena principal se estira al mximo que
permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuracin espacial denominada cadena
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beta. Algunas regiones de protenas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre s
estableciendo uniones mediante enlaces de hidrgeno intercatenarios. Todos los enlaces
peptdicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo as gran estabilidad a la
estructura. La forma en beta es una conformacin simple formada por dos o ms cadenas
polipeptdicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en
direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrgeno y
diversos arreglos entre los radicales libres de los aminocidos. Esta conformacin tiene una
estructura laminar y plegada, a la manera de un acorden.
Giros beta-: Secuencias de la cadena polipeptdica con estructura alfa o beta, a menudo
estn conectadas entre s por medio de los llamados giros beta. Son secuencias cortas, con
una conformacin caracterstica que impone un brusco giro de 180 grados a la cadena
principal de un polipptido.
(C)
4.5. Equipos
Computador con conexin a internet.
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4.6. Sustancias
No sern usadas sustancias en este
laboratorio
por
tratarse
de
una
prctica de bioinformtica.
4.7. Procedimiento
Existen muchas bases de datos en donde se pueden encontrar las secuencias en aminocidos
y cidos nucleicos de protenas.
Para esta prctica usted har uso de estas bases de datos y escoger 4 secuencias problema
(de 4 proteinas diferentes) a las cuales les deber realizar los anlisis descritos desde el tem b
al f.
a. Ingrese a la pgina de protein data bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
En esta pgina puede buscar protenas por palabras claves. Escoja 4 protenas
diferentes.
b. Descargue la secuencia de la protena en formato FASTA y en formato PDB.
c. Reporte el nmero de residuos de aminocidos, punto isoelctrico, el nmero de
hojas y de -hlices.
d. Descargue un visualizador de protenas, en internet se encuentran varios para esta
prctica
se
recomienda
uno
de
los
ms
sencillos
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Referencias bibliogrficas
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M. Principles of Biochemistry, Worth Publishers,
2 edicin, 1997.
2. D.Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial Mdica
Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid, 2007.
3.
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5.1. Objetivos
Comparar los mtodos de cuantificacin de protenas.
Determinar el rendimiento y pureza de una protena: Casena.
Apreciar el uso de las tcnicas espectrofotomtricas para la cuantificacin de material
biolgico.
5.2. Conceptos relacionados
Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva de calibracin, casena,
reactivo de Lowry.
5.3. Fundamento terico
Para el estudio de la estructura de una protena, de la actividad de una enzima o el contenido
protenico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentracin de las
protenas.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la
formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de formar
complejos.
Entre los mtodos que se basan en la formacin de complejos colorimtricos entre las
protenas y reactivos especficos se encuentran:
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Rango de
Ventajas
Aplicaciones
sensibilidad
(g)
Bradford
1-15
Limite bajo de
deteccin
Compatible con
agentes
Resultados rpidos
Muestras que
contienen agentes
reductores
reductores
Rapidez
Lowry
25-100 a
500nm
Biuret
Color estable
Mayormente usado
Preciso
2-30 a 660 nm
protenas de
1-2 a 750 nm
membrana
1000-10000
Muy especfico
Determinacin de
para protenas.
protenas en cereal.
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Mtodo de Bradford
Est basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante
con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de
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Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595465nm).
Mtodo de Lowry
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Mtodo de Biuret
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5.4. Materiales
15 Tubos de ensayo.
Micropipetas de 20-100 l y de
Agitador Vortex
100-1000 l
5.5. Equipos
Espectrofotmetro.
5.6. Sustancias
Reactivo de Bradford
Suero albumina srica bovina (BSA)
(10 mg/mL)
Agua destilada
Reactivo de Biuret
Reactivo de Lowry
NaCl al 1% (P/P)
NaOH 1N
5.7. Procedimiento
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Solucin *
3 ml NaCl al 0.9%,
0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl
0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl
0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl
1 ml BSA y 2 ml NaCl
0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl
0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl
0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl
0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl
0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl
Absorbancia
Protena
(mg)
Blanco
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Tipo de prctica:
Grupal (2 personas)
Duracin:
Indicaciones de peligro:
4 horas
No se presenta riesgos.
6.1. Objetivos
Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de protenas hidrosolubles en solucin
acuosa.
Separar protenas de una solucin acuosa de protenas hidrosolubles utilizando
precipitacin salina.
Cuantificar la concentracin de protenas en diferentes fracciones de leche entera
bovina.
6.2. Conceptos relacionados
Protena Casena, contenido proteico de la leche, hidrlisis enzimtica, desnaturalizacin de
protenas.
6.3. Fundamento terico
La casena (del latn caseus, "queso") es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena)
presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o
el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en
un complejo que se ha denominado caseingeno. La tabla 1 recoge el contenido de esta
protena en la leche de distintas especies de mamferos.
especie
humana
bovina
ovina
caprina
1,3-1,5
3,2-3,5
5,4-6,0
3,1-4,0
44,9
82,5
84,8
81,3
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Figura 1. Patrn de electroforesis que se obtienen con las protenas lcteas. Carril 1:
Marcador de peso molecular. Carril 2: Protenas procedentes de las especies humanas. Carril 3:
Protenas procedentes de la especie bovina. (Tomada de Farrell, et al.)
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Casena
s1
s2
12-15
3-4
9-11
2-4
Variantes genticas
ByC
A1 y A2
AyB
Masa molecular
Punto isoelctrico (pI)
Restos de aminocidos (n)
...
4,83 - 5,07
5,45 - 5,77
199
207
209
169
Por otra parte, cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el
disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura 2). Se llama desnaturalizacin
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Estado nativo
Estado desnaturalizado
Se
distinguen
y qumicos (detergentes,
la fuerza inica
el pH
la temperatura
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Papel de filtro
4 tubos de ensayo
Embudo Bchner
1 micropipeta de 100-1000 L
Vasos de precipitado
lateral
Bomba de vaco
6.5. Equipos
pHmtro
Centrfuga
Espectrofotmetro
6.6. Sustancias
Reactivo de Biuret.
100 mL Solucin de Sulfato de
amonio saturada.
100 mL de leche de cantina.
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6.7
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Procedimiento
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6.8.
6.9
Recipiente rotulado
Residuos acuosos
(Buffer)
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Referencias bibliogrficas
1. Jenness J. 1980. Composition and characteristics of goat milk: Review 1968-1979.
Journal of Dairy Science 63(10): 1605-1630.
2. Lonnerdal B and Forsum E. 1985. Casein content of human milk. American Journal of
Clinical Nutrition 41(1): 113-120.
3. Ribadeau-Dumas B and Grappin R. 1989. Milk protein analysis. Le Lait 69(5): 357416.
4. Park YW, Jurez M, Ramos M y Haenlein GFW. 2007. Physico-chemical characteristics
of goat and sheep milk. Small Ruminant Research 68(1-2): 88113.
5. Willamson MB. 1944. The amino acid composition of human milk proteins. Journal of
Biological Chemistry 156(1): 47 - 52.
6. Farrell HM, Jimenez-Flores R, Bleck GT, Brown EM, Butler JE, Creamer LK, Hicks
CL, Hollar CM, Ng-Kwai-Hang KF y Swaisgood HE. 2004. Nomenclature of the
Proteins of Cows MilkSixth Revision. Journal of Dairy Science '87'(6): 1641-1674.
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Tipo de prctica:
Grupal (2 personas)
Duracin:
Indicaciones de peligro:
4 horas
No se presenta riesgos.
7.1. Objetivos
Conocer los principios de la tcnica de electroforesis.
Separacin de las protenas en acetato de celulosa.
7.2. Conceptos relacionados
Protenas, enzimas, electroforesis, acetato de celulosa, movilidad electrofortica, protenas
sricas.
7.3. Fundamento terico
La electroforesis consiste en la migracin de solutos inicos a travs de un medio por efecto
de un campo elctrico. El soluto, como es el caso de esta prctica, puede ser una
macromolcula como, por ejemplo, una protena.
En presencia de un campo elctrico, E, una partcula cargada con carga q en un medio
determinado alcanzar una velocidad estacionaria, v, que depende del balance entre la fuerza
que origina el campo elctrico, Eq, y el rozamiento viscoso, f v, donde f es el coeficiente de
rozamiento, es decir, en condiciones de migracin estacionaria Eq= fv. Se define la
movilidad electrofortica U como la velocidad por unidad de campo elctrico:
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cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio que sirve
de soporte.
Electroforesis en papel
La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolucin tampn,
bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a
separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes
separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia de
potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas
de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel.
La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga.
Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras sobre una
superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...).
El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en cromatografa
sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados.
La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras
que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente en funcin de su carga, la
cromatografa lo hace en base a una amplia gama de caractersticas (ejemplos, solubilidad en
la cromatografa de reparto, polaridad en la de adsorcin, carga en la de intercambio inico,
etc.).
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de sustancias de bajo
peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que se produce puede disminuirse
aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de
desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de alto voltaje. El revelador para
localizar las sustancias seria la Ninhidrina en el caso de pptidos y aminocidos.
Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son
qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las
sustancias a separar, una vez tenidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometra. Es
muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo.
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o PAGE-nativa
o SDS-PAGE
o Isoelectroenfoque
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Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o experimento,
se utilizara un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la
resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso
de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos
tampones diferentes.
La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por
tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til para calcular
el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao. El
isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de
molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos.
La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque (primera
dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el mejor
mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da.
Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo
para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo
difcil de cuantificar y automatizar.
La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1-10 m de
dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de campos
elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.
7.4. Materiales
Pipetas de 15 ml.
Vasos de precipitado.
Micropipeta de 251000 L.
Puntas desechables
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7.5. Equipos
Sistema de electroforesis.
Fotodensitmetro
Agitador orbital.
7.6. Sustancias
Agua destilada
Soluciones
amortiguadoras:
Tris
de
corrida:
Azul
de
Bromofenol 3 mg/mL
Colorantes.
Decolorantes
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Procedimiento
Colocar una solucin tampn en una cubeta, teniendo cuidado de igualar los
volmenes de los dos compartimentos del electrodo.
Las tiras de acetato de celulosa deben ser sumergidas en la solucin tampn durante
al menos 10 minutos y como mximo 24 horas. Con la ayuda de unas pinzas, eliminar
las tiras de acetato de celulosa de la solucin tampn.
Perforar una esquina de la tira de acetato de celulosa para indicar la polaridad.
En la parte opaca de la tira de celulosa, marcar un origen o una lnea de aplicacin de
las muestras con lpiz rojo, asegurndose de que el lado perforado esta hacia abajo y
hacia la derecha. Marque el origen cerca de 4 cm de la extremidad que se sumergir
en el compartimiento catdico.
Colocar las tiras bien estiradas rectas en el apoyo, de tal manera que cada extremidad
toque la solucin tampn. Observar que cada lado perforado deber permanecer en
el polo negativo (ctodo). Como se realizar una corrida en tampn alcalino, las
protenas debern estar cargadas negativamente y por tanto migrarn hacia el polo
positivo (nodo). Por conveniencia, el polo negativo es de color negro y el positivo de
color rojo.
Adicionar a cada muestra 2 L de marcador de corrida (azul de bromofenol).
Cerrar la cmara de electroforesis y conectar a una fuente de 200 V, dejando correr
la electroforesis por 45 a 60 minutos. La corriente aplicada deber ser de 1 a 1,5
mA/tira.
Despus de la corrida, desconectar la cmara de la fuente de poder.
Remover las tiras y realizar la coloracin con Azul de Coomassie.
Sumergir las tiras en la solucin colorante por 15 minutos, agitando lentamente en el
agitar orbital.
Lavar las tiras 3 veces con una solucin de actico al 5%.
Sumergir las tiras en la solucin decolorante, para remover el exceso de colorante. Se
deja slo el que ha sido fijado por las protenas.
Cuantificar por densitometra.
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La cuantificacin de las bandas de protena de suero o plasma puede ser realizada por
densitometra desde que la tira de acetato de celulosa sea debidamente transparente
como sigue:
Sumergir una tira por 30 segundos en metanol para completa deshidratacin. En
seguida, colocar la tira en una mezcla Glicerol: metanol: cido actico1:85:14 por un
minuto. Depositar la tira sobre una placa de vidrio. Secar en una estufa a 55C, para
ser usada en el densmetro.
Muestra
7.9
Recipiente rotulado
Residuos de soluciones
acuosas (Buffer)
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c
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de suero?.
Referencias bibliogrficas
1)
2)
3)
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Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
4 horas
No se presenta riesgos.
Grupal (2 personas)
8.1. Objetivos
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La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro
tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la informacin gentica: por ejemplo, una
secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC. En los organismos vivos, el ADN se presenta como
una doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas conexiones
denominadas puentes de hidrgeno.
Componentes
Estructura de soporte: La estructura de soporte de una hebra de ADN est formada por unidades
alternas de grupos fosfato y azcar. El azcar en el ADN es una pentosa, concretamente, la
desoxirribosa.
cido fosfrico:
Su frmula qumica es H3PO4. Cada nucletido puede contener uno (monofosfato: AMP), dos
(difosfato: ADP) o tres (trifosfato: ATP) grupos de cido fosfrico, aunque como monmeros
constituyentes de los cidos nucleicos slo aparecen en forma de nuclesidos monofosfato.
Desoxirribosa
Es un monosacrido de 5 tomos de carbono (una pentosa) derivado de la ribosa, que forma parte de
la estructura de nucletidos del ADN. Su frmula es C5H10O4. Una de las principales diferencias entre
el ADN y el ARN es el azcar, pues en el ARN la 2-desoxirribosa del ADN es reemplazada por una
pentosa alternativa, la ribosa.25 Las molculas de azcar se unen entre s a travs de grupos fosfato,
que forman enlaces fosfodister entre los tomos de carbono tercero (3, tres prima) y quinto (5,
cinco prima) de dos anillos adyacentes de azcar. La formacin de enlaces asimtricos implica que
cada hebra de ADN tiene una direccin. En una doble hlice, la direccin de los nucletidos en una
hebra (3 5) es opuesta a la direccin en la otra hebra (5 3). Esta organizacin de las hebras de
ADN se denomina antiparalela; son cadenas paralelas, pero con direcciones opuestas. De la misma
manera, los extremos asimtricos de las hebras de ADN se denominan extremo 5 (cinco prima) y
extremo 3 (tres prima), respectivamente.
Bases nitrogenadas:
Las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias que se encuentran en el ADN son la adenina (A), la
citosina (C), la guanina (G) y la timina (T). Cada una de estas cuatro bases est unida al armazn de
azcar-fosfato a travs del azcar para formar el nucletido completo (base-azcar-fosfato). Las bases
son compuestos heterocclicos y aromticos con dos o ms tomos de nitrgeno, y, dentro de las
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bases mayoritarias, se clasifican en dos grupos: las bases pricas o purinas (adenina y guanina),
derivadas de la purina y formadas por dos anillos unidos entre s, y las bases pirimidnicas o bases
pirimdicas o pirimidinas (citosina y timina), derivadas de la pirimidina y con un solo anillo.En los cidos
nucleicos existe una quinta base pirimidnica, denominada uracilo (U), que normalmente ocupa el lugar
de la timina en el ARN y difiere de sta en que carece de un grupo metilo en su anillo. El uracilo no se
encuentra habitualmente en el ADN, slo aparece raramente como un producto residual de la
degradacin de la citosina por procesos de desaminacin oxidativa.
8.4. Materiales
Micropipetas automticas
Vaso de precipitado
Puntas desechables
Tubos de ensayo.
Algodn
Varilla de vidrio.
8.5. Sustancias
Agua desionizada
Difenilalanina
EDTA
Etanol al 95%
cido
(H2SO4)
sulfrico
concentrado
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Procedimiento
1. Descascarar una cebolla de tamao medio.
2
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10. Pipetear la solucin de uno de los tubos con una pipeta graduada de 0.2 mL y cronometrar el
tiempo de flujo de salida (dejar caer libremente el lquido por gravedad) de la solucin hasta
extraer 0.15 mL.
11. El otro tubo debe ser calentado en bao de Mara por 10 minutos. Despus del perodo de
calentamiento, proceder como en el tem 10, anotando el tiempo de flujo.
12. Enfriar esta solucin en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 10.
13. Interpretar los resultados.
8.7. Disposicin de los residuos
Tabla 1. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Todos sern descartados en el recipiente indicado
8.8
Recipiente rotulado
Residuos acuosos (Buffer)
Referencias bibliogrficas
1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA. Bioqumica:
aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega. Captulo 3
(2006).
3) Lewin, B. Genes VI. Oxford: Oxford University Press, 1997. Pg: 1260.
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Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
4 horas
No se presenta riesgos.
Grupal (2 personas)
9.1. Objetivos
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nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA
o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen
carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar
de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a
ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de
marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las
muestras de DNA problema.
En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las
bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se
visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.
El DNA problema que se va a analizar mediante electroforesis en gel de agarosa en esta prctica es
DNA plasmdico. Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y de pequeo
tamao (entre dos y varios cientos de kilobases) que se encuentran en muchas especies bacterianas.
Se caracterizan porque se replican de manera independiente del DNA cromosmico bacteriano,
tienen su propio origen de replicacin, y no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero
pueden contener genes que contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales, como los que
confieren resistencia a antibiticos. Una determinada clula bacteriana puede no tener ningn
plsmido o puede albergar un nmero variable de los mismos. Algunas clases de plsmidos poseen la
propiedad conocida como replicacin relajada, esto es, estn presentes en forma de muchas copias
por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin.
Se han desarrollado un gran nmero de mtodos para la purificacin de DNA plasmdico de bacterias
y todos ellos implican invariablemente tres pasos:
a) Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo
b) Recogida y lisis de las bacterias
c) Purificacin del DNA plasmdico
El mtodo utilizado para la obtencin de plsmido en esta prctica se denomina lisis alcalina y se basa
en la desnaturalizacin selectiva del DNA cromosmico mediante alcalinizacin con NaOH y adicin
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Matraces pequeos.
Micropipetas automticas
Puntas desechables
9.5. Equipos
Centrifuga eppendorf de sobremesa.
Microondas o placa calefactora.
Equipo de electroforesis (cmara de
electroforesis, soporte, peine, fuente de
alimentacin).
9.6. Sustancias
Agua desionizada
Glicina
Acrilamida 30%
Glicerol
Bisacrilamida 0.8%
2-Mercaptoetanol
Tetrametiletilendiamina (TEMED)
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Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10 y 20%.
Persulfato de amonio 10%
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Solucin Colorante.
Solucin Decolorante.
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9.7
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Procedimiento
1.70
Acrilamida/Bis-acrilamida
2.00
1.25
SDS al 20%
0.025
0.025
TEMED
0.010
20. Vierta el gel entre los vidrios y cubra con una capa de isopropanol al 60%, con el propsito de
hacer ms efectiva la polimerizacin.
21. Una vez polimerizado el gel de corrido lave con agua para retirar el isopropanol y porciones
de acrilamida sin polimerizar.
22. Seque con papel de filtro y agregue 3.165 mL de gel de concentracin de acuerdo a la tabla 2:
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1.86
Acrilamida/Bis-acrilamida
0.45
0.75
SDS al 10%
0.030
0.060
TEMED
0.010
23. Una vez terminada la polimerizacin saque el peine, limpie los pozos con papel de filtro.
24. Introduzca el montaje en la cmara de electroforesis y cubra con buffer de corrido. La
composicin de buffer de corrido se describe a continuacin en la tabla 3:
Tabla 3. Composicin y concentracin del buffer de separacin.
BUFFER DE CORRIDO
Tris base
0.3%
Glicina
1.44%
SDS
0.1%
25. Prepare las muestras mezclando 10L del extracto de protenas de inters con 10L de
buffer de carga, la composicin y el buffer de carga se muestra en la tabla 4.
Tabla 4. Composicin y concentracin del buffer de carga para muestras.
BUFFER DE CARGA PARA MUESTRAS
Tris-HCl 0.5 M
25%
Glicerol
20%
SDS al 10%
40%
2-Mercaptoetanol
10%
Azul de bromofenol
5%
26. Siembre en los pozos las muestras junto a 4 L de marcador de peso molecular
27. Aplique voltaje entre 80-110 V de acuerdo al frente de corrido.
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28. Terminado el corrido transfiea el gel a la solucin colorante de azul de Coomassie R250, deje
colorear 30 minutos. La composicin de la solucin colorante.
29. Para observar las bandas, deje el gel en solucin decolorante hasta que el gel decolore y se
observen las bandas.
30. Posteriormente, escanear el gel y comparar las bandas con el carril 1 que corresponde al
marcador de peso molecular.
9.8. Disposicin de los residuos
Tabla 6. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Recipiente rotulado
Residuos slidos
coloracin de DNA.
Referencias bibliogrficas
1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA.
Bioqumica: aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega.
Captulo 3 (2006).
3) Miller, MB. DNA technology in schools: a straightforward approach. Biotechnology
education,
v.
4,
1993.
Pgs:15-21.
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10. CARBOHIDRATOS
Tipo de prctica:
Duracin:
Grupal (2 personas)
4 horas
Indicaciones de peligro:
10.1. Objetivos
Diferenciar las sustancias que contienen carbohidratos simples por medio de
reacciones qumicas.
Demostrar que el almidn es un polisacrido compuesto por muchas molculas de
azcares sencillos (glucosa).
Identificar la presencia de azcares reductores mediante la reaccin de Fehling.
10.2. Conceptos relacionados
Carbohidrato, azcares reductores, almidn.
10.3. Fundamento terico
Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera. La mayora
pueden ser representados con la frmula general Cn(H2O)n, por lo que se les conoce cono
hidratos de carbono. Gran parte de sus funciones biolgicas dependen de su estructura
qumica tan particular y verstil. Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos
y su degradacin durante el proceso de digestin genera la energa necesaria para las
funciones vitales del organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomolculas,
dan origen a molculas ms complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte
celular y tisular, de comunicacin entre clulas, de reconocimiento o de sealizacin.
Qumicamente se definen como polihidroxialdehdos o polihidroxiacetonas cclicas o
sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los mismos. Un carbohidrato que no puede
ser hidrolizado en uno ms simple es llamado monosacrido. Los monosacridos ms
comunes son la glucosa, la fructosa, la galactosa y la manosa. Un carbohidrato que puede ser
hidrolizado en dos molculas de monosacridos es llamado disacrido. Los ms importantes
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1 baln aforado de 1 L
Micropipeta de 0.5-5 mL.
Esptula
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7 Baln aforado de 1000 mL
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1 placa de aglutinacin
10.5. Sustancias
Agua destilada
10.5.1. Prueba de Benedict
Reactivo de Benedict: 100 g de
Carbonato de sodio (Na2CO3)
anhdro, 173 g de Citrato de sodio,
17,3 g de Sulfato de cobre
pentahidratado (CuSO4.5H2O)
Soluciones de carbohidratos
mol/L
Solucin de almidn al 1%
0,1
10.6. Procedimiento
10.6.1. Prueba de Benedict
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Mezclar las tres soluciones cuando estn fras. Aforar a 1 L con agua destilada hervida.
Preparar una solucin 0.1 mol/L de cada uno de los siguientes carbohidratos glucosa,
galactosa, lactosa, xilosa, fructosa, sacarosa y una solucin al 1% de Almidn (La
disolucin del almidn se realiza en agua caliente).
Repetir el paso anterior en 6 tubos ms. Luego, a cada tubo, aadir 6 gotas de un las
soluciones de carbohidratos.
Colocar los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos. Observar cualquier
cambio de color durante el calentamiento.
Tomar los tubos y ponerlos en una gradilla y despus de un corto tiempo observar si
se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o verdoso.
Aadir una gota de glucosa a una depresin, una gota de fructosa a otra, etc. Observe
las depresiones inmediatamente y anote los resultados. Vuelva a observar las
depresiones y revise si existe algn cambio. Si se observa algn cambio luego de
incubar por ms tiempo las diferentes reacciones, en el informe se debe explicar a qu
se debe este cambio y qu implicaciones podra tener este resultado.
Agitar muy bien los tubos y notar la diferencia de color que se atribuye a la formacin
de un complejo entre el almidn y el yodo. Anotar el resultado.
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Colocar los tres tubos en un bao de agua caliente (70 C) con cuidado, por 10
minutos y observar cualquier cambio de color. Anotar el resultado.
Tubo
No.
Agua (mL)
Almidn al 1% (gotas)
Despus de que la hidrlisis del almidn se haya llevado a cabo por 15 minutos, saque
0,5 mL del almidn que se est hidrolizando en el bao mara y repita la prueba del
yodo cada 15 minutos. Contine la hidrlisis hasta obtener una prueba de yodo
negativa.
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Recipiente rotulado
Solucin acuosacolorantes
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v.
4,
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Tipo de prctica:
Duracin:
Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas)
4 horas
11.1. Objetivos
Extraer y caracterizar la lecitina y el colesterol de yema de huevo.
Determinar cualitativamente la presencia de colina, fosfatos y glicerol en un
hidrolizado de lecitina.
11.2. Conceptos relacionados
Lpidos, Lectinas, colina, fosfatos y glicerol.
11.3. Fundamento terico
Se llama lpidos a un conjunto de molculas orgnicas, la mayora biomolculas, compuestas
principalmente por carbono e hidrgeno y en menor medida oxgeno, aunque tambin
pueden contener fsforo, azufre y nitrgeno. Tienen como caracterstica principal ser
insolubles en agua y solubles en disolventes orgnicos como el benceno.
Los lpidos forman un grupo de sustancias de estructura qumica muy heterognea, siendo la
clasificacin ms aceptada la siguiente:
Lpidos saponificables: Los lpidos saponificables son los lpidos que contienen cidos
grasos en su molcula y producen reacciones qumicas de saponificacin. A su vez los
lpidos saponificables se dividen en:
Lpidos simples: Son aquellos lpidos que slo contienen carbono, hidrgeno y oxgeno. Estos
lpidos simples se subdividen a su vez en: Acilglicridos o grasas (cuando los acilglicridos son
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slidos se les llama grasas y cuando son lquidos a temperatura ambiente se llaman aceites) y
Cridos o ceras.
Lpidos complejos: Son los lpidos que adems de contener en su molcula carbono, hidrgeno
y oxgeno, tambin contienen otros elementos como nitrgeno, fsforo, azufre u otra
biomolcula como un glcido. A los lpidos complejos tambin se les llama lpidos de
membrana pues son las principales molculas que forman las membranas celulares:
Fosfolpidos y Glicolpidos.
Lpidos insaponificables: Son los lpidos que no poseen cidos grasos en su estructura
y no producen reacciones de saponificacin. Entre los lpidos insaponificables
encontramos a: Terpenos, Esteroides y Prostaglandinas. En el esquema 1 se muestra la
clasificacin general de los lpidos.
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Funcin de reserva energtica: Los lpidos son la principal fuente de energa de los
animales ya que un gramo de grasa produce 9,4 kilocaloras en las reacciones
metablicas de oxidacin, mientras que las protenas y los glcidos slo producen 4,1
kilocaloras por gramo.
Funcin estructural: Los lpidos forman las bicapas lipdicas de las membranas
celulares. Adems recubren y proporcionan consistencia a los rganos y protegen
mecnicamente estructuras o son aislantes trmicos como el tejido adiposo.
El colesterol es una grasa presente en todas las clulas del organismo. Se presenta en altas
concentraciones en la mdula espinal, pncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en
el hgado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50% de las necesidades de
colesterol son sintetizadas en el hgado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de
origen animal presentes en la dieta.
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11.5. Sustancias
Mezcla etanol:ter 2:1
Mezcla Cloroformo:etanol 2:1
cido sulfrico concentrado
cido molbdico
cido ascrbico 1 mg/mL recin
preparado.
Anhdrido actico
Erlenmeyer
Varilla de vidrio.
Pipetas
Probeta de 25 mL
1 Tubo de ensayo
Papel de filtro
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11.6. Procedimiento
Evapore el filtrado en bao de Mara usando una manta de calentamiento. Pesar los
lpidos totales.
Reaccin de Salkowski
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Identificacin de fostatos
Tome 1 mL del filtrado y adicione 1 mL de cido molbdico, agite, deje 3 minutos en
reposo. Adicione 1 mL de solucin de cido ascrbico observe la formacin de un color
azul.
Deteccin de colina
Tome 1 mL de filtrado y caliente suavemente en un mechero o en un bao de agua
hirviendo. La trimetilamina liberada se caracteriza por un olor a pescado.
Identificacin de glicerol
Tome 2 mL de filtrado + 2 mL de agua de bromo. Calentar en vitrina para expulsar el
exceso de bromo. Tomar 0,4 mL de esta solucin + 0,1 mL de solucin de naftol al 5% en
etanol, agitar. Adicionar 40 gotas de cido sulfrico. Calentar 2 minutos en bao mara,
enfriar. Observar la aparicin de coloracin verde.
11.7. Disposicin de los residuos
Tabla 2. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.
Sustancia o Mezcla
Todos sern descartados en el recipiente indicado
Recipiente rotulado
Solucin acuosacolorantes
b)
lipoprotenas (VLDL, LDL, HDL)?. Son los mismos para todas las edades?
c)
d)
e)
humanos?
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Referencias bibliogrficas
4)
5)
6)
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12.
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Duracin:
Grupal (2 personas)
4 horas
Indicaciones de peligro:
12.1. Objetivos
Extraer en solucin la enzima peroxidasa y cuantificar su actividad a diferentes
diluciones.
Determinar el efecto de la temperatura en la actividad enzimtica de la peroxidasa.
12.2. Conceptos relacionados
Enzimas, peroxidasa, actividad enzimtica.
12.3. Fundamento terico
En Bioqumica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica que catalizan
reacciones qumicas, siempre que sea termodinmicamente posible (si bien no pueden hacer
que el proceso sea ms termodinmicamente favorable). En estas reacciones, las molculas
sobre las que acta la enzima en el comienzo del proceso son llamadas sustratos, y estas los
convierten en diferentes molculas, los productos.
Las propiedades de las enzimas se derivan de su estructura proteica, siendo la principal
propiedad su capacidad cataltica. La especificidad y estabilidad de las enzimas estn tambin
determinadas por su condicin de protenas. As tenemos:
Estabilidad
La capacidad cataltica de una enzima depende de la manutencin de su estructura nativa.
Dicha configuracin es la resultante de muchas fuerzas de interaccin. Los cambios
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Actividad
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5 tubos de ensayo
Tubos eppendorf
XXXXXXXXXXXXX
12.5. Sustancias
Solucin extractora: Buffer fosfato 60
mM, NaCl 0,1 M, pH 7,0
Buffer fosfato 10 mM pH 6,0
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12.6 Equipos
Centrifuga
12.7. Procedimiento
12.7.1. Solucin de peroxidasa
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Sacar 0,1 mL de esta solucin a los 0, 5, 10, 15, 30 minutos de incubacin y enfriarlos
inmediatamente en un vaso con hielo.
Realizar el experimento que se hizo anteriormente con esta dilucin para determinar
la actividad de la misma forma que lo anterior para cada valor de tiempo.
De los datos obtenidos comparar los valores de actividad para la enzima sin calentar y
al calentar la dilucin a cada tiempo.
Recipiente rotulado
Solucin acuosa
b)
c) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
d) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
e) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
f) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
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Referencias bibliogrficas
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