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FORTALEZA - CEAR
2006
FORTALEZA - CEAR
2006
G633e
CDD: 615.1
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assereuy UECE
Orientadora
______________________________________
Profa. Dra. Nylane Maria Nunes Alencar - UFC
______________________________________
Prof. Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias - UFC
lafacienses,
minha
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, que ao longo de todo o trabalho, deu-me condies para que prosseguisse apesar
de todas as adversidades.
Aos meus pais, Dalton Moreira Gomes e Maria Oscarina Magalhes Gomes, pelo apoio
incondicional no s nesse trabalho, mas em todos os projetos realizados ao longo de toda a
minha vida.
minha namorada Delany Roque de Queiroz que acompanhou praticamente toda minha
histria acadmica e, anseio eu, que me acompanhe pelo resto da vida. Obrigado pelo
estmulo nas horas de descrena, dos conselhos nas horas de desespero e pelo amor
imensurvel que temos um pelo outro.
Profa. Dra. Ana Maria Sampaio Assreuy, por ter me recebido em seu laboratrio, pela
orientao, pacincia e principalmente, pelo exemplo de carreira docente e esprito
cientfico.
Ao Prof. Wladimir Ronald Lobo Farias pelas palestras sobre os polissacardeos sulfatados e
o fornecimento dos mesmos para a realizao deste trabalho.
A Profa. Dra. Nylane Maria Nunes Alencar pela ateno dispensada nas vrias vezes que
cedeu seu laboratrio para execuo de alguns experimentos e por ter aceitado o convite de
compor esta banca.
Aos meus amigos Ana Vaneska Passos Meireles, Alana de Freitas Pires, Mrio Rogrio
Lima Mota, Rafaela Gomes Cardoso, Sabrina Rodrigues Fontenele pela amizade,
companheirismo, auxlio nos experimentos, pelo bom humor mesmo nas situaes mais
difceis sendo estas cientficas ou pessoais. Vocs sempre foram as melhores companhias
nos momentos mais importantes.
Michelle Soares Josino da Silva, pela companhia nas interminveis, por vezes famintas e
exaustivas, mas tambm hilrias horas de experimento para a concretizao desse trabalho.
RESUMO
Os polissacardeos sulfatados (PLS) constituem uma classe de carboidratos ricos em polinions, e
que apresentam uma diversidade de atividades biolgicas relevantes. As atividades mais estudadas so a
antitrombtica e a anticoagulante, tendo sido tambm demonstrada as atividades antiinflamatria tanto in
vitro quanto in vivo. Entretanto, a maioria das atividades destas molculas demonstradas na literatura se
refere aos PLS obtidos de algas pardas, sendo estas atividades pouco exploradas nos PLS obtidos de outros
grupos de algas. Alm disso, os estudos exploram pouco a atividade destas molculas in vivo e suas
propriedades pr-inflamatrias. Sendo assim o presente estudo investigou in vivo as atividades
antiinflamatria e pr-inflamatria dos PLS extrado das algas vermelhas Botryocladia occidentalis,
Solieria filiformes e Champia feldmannii, estudando com maiores detalhes a atividade pr-inflamatria
desta ltima, alm de suas propriedades antinociceptivas. Foram utilizados ratos Wistar machos e fmeas
(150-250g) nos estudos de inflamao e camundongos Swiss albinos (20-35g) nos estudos de nocicepo.
Na investigao da atividade antiinflamatria destas molculas, os animais foram injetados com os PLS por
via endovenosa na dose de 0,9 mg/Kg antes de receberem os estmulos inflamatrios carragenina, dextrana
ou zimosan. Os polissacardeos de B. occidentalis e S. filiformes, testados no edema da carragenina e
dextrana, no foram capazes de inibir a formao do edema destes, enquanto que os de C. feldmannii alm
de no inibir estes edemas no inibiu tambm aquele elicitado por zimosan. Na investigao da atividade
pr-inflamatria, os PLS foram injetados por via subcutnea intraplantar. Todos os PLS testados induziram
edema de pata, sendo o edema de C. feldmannii o mais pronunciado de todos. Durante as investigaes das
propriedades pr-inflamatrias dos polissacardeos sulfatados de C. feldmannii no houve uma
correspondncia nos estudos de dose-resposta sendo o edema destas molculas persistente por 24 horas aps
sua aplicao. Ainda nos estudos que atestam suas propriedades pr-inflamatrios, estes PLS tambm
induziram a migrao de neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos elevando tambm a permeabilidade
vascular nos tecidos das patas desses animais. Nas tentativas de modulao farmacolgica desta atividade os
animais receberam os PLS (0,9 mg/Kg, s.c.) ou 1 hora aps a injeo dexametasona - glicocorticide
(1mg/Kg, s.c.), indometacina - inibidor de prostaglandinas (5mg/Kg, s.c), L-NAME - inibidor da sntese de
xido ntrico (25mg/Kg; e.v), meclizina - anti-histamnico (40 mg/Kg, s.c) e pentoxifilina - inibidor de TNF
e IL1 (90mg/Kg, s.c.). Todos os mediadores inibiram o edema causado pelos PLS de C. feldmanni, exceto o
L-NAME, excluindo a participao de xido ntrico nos eventos inflamatrios desse edema. A atividade
antinociceptiva dos PLS de C. feldmannii foram investigadas atravs do teste de contores abdominais
conduzidas por cido actico. Essa substncia foi administrada nas doses (0,2; 1; 5 e 25 mg/Kg, s.c.) 30
minutos antes da injeo de cido actico 0,6%. A dose de 1 mg/kg foi a que apresentou a melhor inibio.
Em suma, os PLS testados demonstram no possuir atividade antiinflamatria, enquanto que os PLS de C.
feldmannii apresentaram significativa atividade pr-inflamatria somada a sua potente atividade
antinociceptiva.
ABSTRACT
The sulfated polysaccharides (SPL) constitutes a class of carbohydrates rich in polyanions and that
presents a diversity of important biological activities. The antithrombotic and the anticoagulant activities are
the most studied. It was demonstrated by the sulfated polysaccharides (SPL) the anti-inflammatory activity
both in vitro and in vivo. However, the majority of the activities of these molecules demonstrated in
literature are related to SPL obtained from brown seaweed (Phaeophytas) being these activities little
exploited from the SPL obtained from other groups of seaweed.
Moreover, the studies little explore the activity of these molecules in vivo and its pro-inflammatory
properties. So, the present study has investigated the anti-inflammatory and pro-inflammatory activities of
the SPL extracted from the red algae Botryocladia occidentalis, Solieria filiformes and Champia feldmannii,
studing in more detail the pro-inflammatory activity of the latter besides its antinociceptives properties.
Wistar rats (150-250 g) were used on the pro and anti-inflammatory studies and male Swiss mice (20-35 g)
in the nociception studies.
In the investigation of anti-inflammatory activity of these molecules, the animals of each group
were injected by endovenous via (0.09 mg/kg) of their respectives SPL before they receive the
inflammatory stimuli carrageenan, dextran or zimosan. The polysaccharides of B. occidentalis and S.
filiformes, tested in the carrageenan oedema and dextran were not able to inhibit the formation of these
oedema, while the SPL of C. feldmannii than not inhibit these oedema also not inhibited that elicitated by
zimosan. In pro-inflammatory activit research the SPL were injected by subcutaneously intraplantar via. All
SPL tested induced paw oedema, being the oedema of C. feldmannii the sharpest of all.
During the investigation of pro-inflammatory properties of sulfated polysaccharides of C.
feldmannii there was no correlation in studies of dose-response being the oedema of these molecules
persistent for 24 hours after its application. Even the studies that prove their pro-inflammatory properties,
these SPL also led neutrophils migration of abdominal cavity of rats also raising the vascular permeability
in paw tissue of these animals.
In attempts of modulation of this activity the animals received the SPL (0.9 mg/kg, sc) or 1 hour
after the dexamethasone injection (1.0 mg/Kg, s.c.), indomethacin (5 mg/Kg, s.c.), L-NAME (25 mg/Kg;
e.v), meclyzine (40 mg/kg, s.c.), pentoxifylline (90 mg/Kg, s.c.). The results demonstrated that only LNAME failed to inhibit the paw oedema elicitated by C. feldmannii, indicating, however, the possibility to
have greater participation of cytokines and prostaglandins in the process. The nonciceptive activity of C.
felmanni SPL as antinociceptiva was confirmed when its administration was done of (0.2, 1, 5 and 25
mg/kg, s.c.) 30 minutes before the injection of acetic acid 0.6%. The dose of 1 mg/kg presented the best
inhibition. In short, the SPL testes demonstrated no posses anti-inflammatory activity, while the SPL of C.
feldmannii showed a significant pro-inflammatory activity in addition to its potent nonciceptive activity.
LISTA DE ABREVIATURAS
ADP =
Adenina difosfato
ANOVA =
Anlise de varincia
ASC =
ATP =
Adenosina trifosfato
C3a=
C3b=
C5a =
Cg =
Carragenina
COX-1 =
COX-2 =
COX-3 =
DL50 =
EDTA =
cido etilenodiamonotetractico
E.P.M =
e.v. =
Endovenosa
eNOS =
iNOS =
nNOS =
fMLP =
Peptdeo N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina
HDL =
HE =
Hematoxilina-Eosina
i.p. =
Intraperitoneal
Imunoglobulinas G
IgM =
Imunoglobulinas M
IL-1 =
Interleucina-1
IL-4=
Interleucina-4
IL-8 =
Interleucina-8
LDL =
LTB4 =
Leucotrieno B4
MBL =
NADP =
NADPH =
nNOS =
NO =
xido ntrico
NOS =
PAF =
PCAM-1 =
PLS =
Polissacardeo sulfatado
s.c. =
Subcutnea
TNF- =
VLDL =
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
34
FIGURA 2
34
FIGURA 3
34
FIGURA 4
43
FIGURA 5
FIGURA 6
FIGURA 7
43
45
FIGURA 8
FIGURA 9
49
FIGURA 10
47
51
53
FIGURA 11
FIGURA 12
FIGURA 13
61
FIGURA 16
59
FIGURA 15
57
FIGURA 14
55
63
65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Tabela 2
63
65
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUO
16
17
17
18
19
20
23
24
26
28
2 JUSTIFICATIVA
31
3 OBJETIVOS
32
3.1 GERAL
3.2 ESPECFICOS
32
32
4 MATERIAIS E MTODOS
33
4.1 ANIMAIS
33
4.2 COLETA DE ALGAS
33
4.3 ISOLAMENTO DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS
35
4.4 DROGAS E REAGENTES
37
4.5 CARACTERIZAO DAS ATIVIDADES BIOLGICAS DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS
EM EM MODELOS EXPERIMENTAIS DE INFLAMAO
38
4.5.1 Atividade pr-inflamatria no modelo do edema de pata
38
4.5.1.1 Envolvimento dos mediadores
38
4.5.1.2 Alteraes da permeabilidade
39
4.5.2 Atividade pr-inflamatria no modelo de peritonite induzida por C. feldmanni 39
4.5.3 Avaliao da atividade antiinflamatria
40
4.6 AVALIAO DOS EFEITOS DOS POLISSACARDEOS SULFATADOS NA NOCICEPO
40
41
41
5 RESULTADOS
42
DDDDEXTRANA
DDDDDEXTRANA
44
6 DISCUSSO
66
7 CONCLUSO
72
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
73
1 INTRODUO
17
18
1.3 Carboidratos
Os carboidratos so um grupo diverso de compostos contendo primariamente
tomos de carbono ligados a hidrognios e grupos hidroxila. Estas so as biomolculas
mais abundantes encontradas em fontes naturais, principalmente nos vegetais, que as
sintetizam num processo denominado fotossntese.
A palavra carboidrato designava, durante o sculo XIX, uma famlia de compostos
denominados hidratos de carbono representados pela frmula geral Cn(H2O)n. Com a
descoberta de novos compostos que no apresentavam as mesmas propriedades qumicas, o
significado do termo carboidrato foi modificado e ampliado. Atualmente inclui
poliidroxialdedos, lcoois cetnicos e cidos e seus derivados simples, assim como
polmeros contendo ligaes do tipo acetal (SZNAIDMAN, 1999).
Alguns carboidratos so relativamente pequenos com pesos moleculares menores
que 100 kDa. J outros so grandes macromolculas com pesos moleculares na ordem de
centenas de milhares de kDa. Perante tal diversidade, existem segundo o seu tamanho, trs
classes principais de carboidratos: monossacardeos, oligossacardeos e polissacardeos. Em
sua grande maioria, monossacardeos e oligossacardeos apresentam pequeno peso
molecular, so compostos cristalinos, solveis em gua e tm geralmente sabor doce, j os
polissacardeos, embora em geral tambm sejam solveis em gua, no apresentam sabor e
possuem alto peso molecular.
Monossacardeos so acares simples e consistem de uma unidade de
poliidroxialdedo ou cetona, que no pode ser hidrolisada a unidades menores em condies
razoavelmente suaves. O monossacardeo mais abundante na natureza a D-glucose, um
acar com seis tomos de carbono em sua molcula (LENINGHER et al., 2002).
Dissacardeos so formados pela ligao de unidades de monossacardeos (2 a 6)
unidas entre si por ligaes glicosdicas caractersticas. Ocorrem freqentemente na forma
de dissacardeos, com cadeias formadas por duas unidades de monossacardeos. Trs
importantes exemplos de oligossacardeos so os dissacardeos lactose (D-glucose + Dgalactose), maltose (D-glucose + D-glucose) e a sacarose, ou acar da cana, o qual
consiste de dois monossacardeos, D-glucose e D-frutose, (LENINGHER et al., 2002).
19
20
(MULLOY et al., 1994). Os PLS encontrados na parede celular de algas marinhas pardas
(Phaeophyta)
possuem
como
carboidrato
mais
representativo
-L
fucose
(PANTANKAR et al., 1993), sendo portanto, classificados como fucanas. J nas algas
marinhas verdes (Chlorophyta) os PLS em maior quantidade so aqueles compostos por
unidades de D-manose e galactose, sendo assim classificados como arabino-galactanas
(PERCIVAL & MACDOWELL, 1967). As algas marinhas vermelhas (Rhodophyta), por
terem a galactose como seu monmero majoritrio, possuem polissacardios sulfatados
definidos como galactanas. Estas quando extradas de agarfitas e carragenfitas, so
classificadas como agaranas e carragenanas, respectivamente (ESTEVES et al., 2000).
Atravs de estudos estruturais detalhados foi definido um terceiro grupo de galactanas
denominado, hbridos-D/L (STORTZ & CEREZO, 2000) ou carrgar (CHOPIN et al.,
1999).
21
22
inibiu o vrus cerca de 100% em baixas concentraes de extrato (1,2% p/v) (SANTOS et
al., 1999).
Polissacardeos
sulfatados
tambm
apresentam
efeito
antinociceptivo
em
camundongos. Tal atividade foi demonstrada por Vieira e colaboradores (2004) para
polissacardeos totais extrados da alga Bryothamnion seaforthii, uma alga vermelha
comum no litoral do Cear. Estes polissacardeos administrados aos animais por via
intraperitoneal (i.p.) nas doses de 1 e 5 mg/Kg promoveram um significativo decrscimo no
nmero de contores abdominais induzidas por cido actico. No entanto, no modelo de
nocicepo causado por formalina, estes polissacardeos s foram eficazes em maior dose
(10 mg/Kg). J no modelo de placa quente, que avalia a atividade nociceptora central, a
dose de 5 mg/Kg; i.p., aumentou o tempo de reao ao estmulo trmico nos tempos 30, 60
e 90 min. de pr-tratamento. Administrados por via oral na dose de 10mg/Kg, este
carboidrato elevou o tempo de reao somente aos 60 e 90 min do pr-tratamento. Viana e
colaboradores (2004) tambm atestaram a eficcia dos polissacardeos sulfatados de uma
alga vermelha do mesmo gnero, Bryothamionion triquetrum. Estes, quando administrados
nas doses 1 e 5 mg/Kg por via intraperitoneal, tambm inibiram as contores abdominais
induzidas por cido actico em 71 e 79%, respectivamente.
Outra
propriedade
demonstrada
para
estas
molculas
sua
atividade
23
24
25
26
fragmento C3b gerado vai se combinar com a C3-convertase dando origem C5convertase. A clivagem de C5 pela C5-convertase inicia a via citoltica comum que culmina
com a polimerizao de C9 na membrana da clula-alvo, formando o complexo de ataque
membrana (MAC) que interfere na propriedade de permeabilidade seletiva da membrana,
permitindo a entrada de gua, ons e pequenas molculas para o citosol da clula-alvo,
distendendo a membrana alm de sua capacidade elstica e levando sua ruptura (RAWAL
& PANGBURN, 2001). Durante a ativao do complemento so gerados peptdeos com
atividade biolgica: o C3a e o C5a que tm atividade quimiottica e de anafilatoxina; o
C3b, que alm de funcionar como opsonina, facilitando a fagocitose de partculas por
fagcitos, tambm participa na composio da C3-convertase da via alternativa (C3bBb).
27
28
1.7 Nocicepo
A dor causada por leses ou doenas uma constante ao longo da histria da
humanidade e o incmodo gerado por esta levou o homem a buscar tratamentos para este
estado desde as primeiras civilizaes (CARVALHO, 1999).
A dor pode ser definida segundo Adams (1997) como um sinal precoce e fisiolgico
de morbidade, sendo a principal experincia sensorial, entre todas as outras, atravs da qual
o indivduo detecta a presena de doena em si prprio.
A nocicepo um mecanismo pelo qual o estmulo doloroso transmitido ao
sistema nervoso central. Essa transmisso envolve uma interao complexa com estruturas
perifricas ativadas pela estimulao trmica, mecnica ou qumica, e centrais da superfcie
da pele ao crtex cerebral central (FURST, 1999). As clulas responsveis pela captao
destes estmulos so chamadas de nociceptores e esto localizadas na pele, msculos,
vasos, fscia, juntas e vsceras (GRUBB, 1998, BENSSON, 1999). Esses nociceptores
apresentam terminaes de neurnios mielinizados (fibras A), mas principalmente
desmielinizadas (fibras C), que se caracterizam por no apresentar acomodao, e sim
29
30
31
2 JUSTIFICATIVA
A inflamao e a dor so de fundamental para uma resposta protetora do organismo
aos diversos tipos de agresses. Porm, a inflamao pode ser potencialmente lesiva aos
tecidos, alm de ser a maior causa de morbidade e mortalidade em diversas patologias
humanas. Portanto, os estudos delineados com o intuito de avaliar as molculas
participantes do processo inflamatrio e da dor e a caracterizao de novas substncias que
interfiram nestes so de extrema relevncia.
Sendo assim, os dados da literatura que demonstram atividade anticomplemento (in
vitro) e antinociceptiva (in vivo) de fucanas sulfatadas, nos levaram a investigao in vivo
das propriedades antiinflamatria, prinflamatria e antinociceptiva de galactanas isoladas
das algas marinhas vermelhas Botyocladia occidentalis, Champia feldmannii e Solieria
filiformis. Esta investigao pode sugerir estas molculas como ferramentas importantes
para a compreenso do papel de polissacardeos sulfatados no processo inflamatrio e gerar
um possvel perfil teraputico dos PLS e uso destes na melhora do prognstico de vrias
doenas de cunho inflamatrio tais como asma, choque sptico e artrite reumatide. E por
fim, valorizar a flora marinha de nosso vasto litoral.
32
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Investigar o papel dos polissacardeos das algas vermelhas Brotyocladia
occidentalis, Champia feldmannii e Solieria filiformis na inflamao e na nocicepo e seus
respectivos mecanismos de ao.
3.2 Especficos
a) Anti-inflamatrios
Estudar o efeito dos PLS de Brotyocladia occidentalis, Champia feldmannii e
Solieria filiformis sobre o desenvolvimento de edema de pata induzido por estmulos
inflamatrios osmtico e no-osmtico.
b)Pr-inflamatrios
1. Estudar o efeito edematognico dos PLS de B. occidentalis, C. feldmannii e S filiformis;
2. Avaliar a habilidade dos PLS de C. feldmannii em induzir migrao de neutrfilos para a
cavidade peritoneal;
3. Investigar os mediadores inflamatrios envolvidos no efeito edematognico dos PLS de
C. feldmannii.
c)Nocicepo
Estudar o efeito antinociceptivo dos PLS de C. feldmannii.
d) Toxicidade
Avaliar a toxicidade aguda dos PLS de C. feldmannii.
33
4 MATRIAIS E MTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar (Rattus novergicus) machos e fmeas (150-250g) e
camundongos Swiss albinos, machos (25-35g), que foram fornecidos pelo Biotrio Central
do Campus do Pici da Universidade Federal do Cear. Estes animais receberam rao e
gua ad libitum, sob condies adequadas de luz e temperatura e foram manipulados de
acordo com os princpios estabelecidos pelo Comit de tica em Pesquisa-UECE para uso
destes animais de experimentao.
34
35
36
ALGA DESIDRATADA
Hidratao (tampo acetato de sdio 0,1 M pH 5.0 + EDTA
5mM + cistena 5mM + papana 30mg/mL / 60 por 24 h
Material digerido
Filtrado
Resduo (re-filtado)
16 mL de soluo 10% de
cloreto de cetilpiridnio 25C 24 h
Precipitado
Centrifugao 10.000 x g, 20 min, 5C
Sobrenadante
(descartado)
Resduo
Lavagem (0,05% cloreto de cetilpiridnio) e
dissoluo 172 mL NaCl 2 M e etanol absoluto
Homogenato
Etanol absoluto 24 h, 4 C
Precipitado
Centrifugao 10.000 x g, 20 min, 5 C
Resduo
Lavagem etanol 80% (2x) e etanol absoluto (1x)
37
38
O modelo do edema de pata foi utilizado no estudo das propriedades prinflamatrias dos polissacardeos sulfatados. No estudo destas propriedades a substncia
estudada, ou seja, os PLS so administrados nas patas de cada animal, sendo a evoluo do
edema acompanhado por pletismografia.
O edema obtido nesse estudo foi calculado como a diferena entre o volume das
patas em um determinado tempo aps o estmulo e antes do estmulo (tempo zero). As reas
sob as curvas (ASC) tambm foram calculadas usando o mtodo do trapzio (LANDUCCI
et al., 1995). Os resultados foram expressos em unidades arbitrrias e comparados queles
obtidos das patas dos animais injetados somente com os estmulos inflamatrios.
Nos experimentos realizados os polissacardeos sulfatados das diferentes algas
foram injetados por via subcutnea (s.c.) nas doses de 0,1; 0,3 ou 0,9 mg/Kg. Na maioria
dos experimentos o desenvolvimento do edema foi acompanhado aps a administrao dos
PLS nos tempos , 1, 2, 3, 4 h.
39
40
leuccitos foram realizadas conforme metodologia descrita por Souza & Ferreira, (1985).
Neste procedimento, 20 L do fluido coletado de cada animal foi diludo em 380 L de
reagente de Turk e posteriormente usados para a contagem total de leuccitos em cmara de
Neubauer por microscopia ptica. A contagem diferencial (foi realizada atravs de
esfregaos corados pelo mtodo da hematoxilina/eosina (HE).
Foram contadas 100 clulas por cada lmina e calculada a percentagem de cada uma
delas. O nmero de neutrfilos, moncitos, linfcitos e eosinfilos foram estimados por L
do fluido peritoneal, calculando-se a percentagem obtida na contagem diferencial do
nmero total de leuccitos.
O teste de atividade dos PLS sobre a nocicepo teve como finalidade avaliar o
efeito dos PLS administrados por via endovenosa sobre a induo da dor, atravs de um
modelo de nocicepo qumica, o teste das contores abdominais induzidas por cido
actico (Teste de Writhing).
41
42
5 RESULTADOS
5.1 Efeito dos polissacardeos sulfatados de Botryocladia
occidentalis, Champia feldmannii e Solieria filiformis sobre o
edema de pata induzido por dextrana
43
1,0
A
Edema (mL)
0,8
0,6
#
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
150
*#
100
50
salina
44
5.2
Efeito
da
administrao
de
diferentes
doses
dos
45
1,2
1,0
Edema (mL)
#
0,8
0,6
"
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
250
B
ASC (unidades arbitrrias)
200
150
100
50
salina
0,1
0,3
0,9
Champia feldmannii mg/Kg
46
5.3
pata que atingiu um pico mximo na 3 hora (1,22 0,08 mL) de seu desenvolvimento,
decaindo depois desse. A administrao e.v. (0,9 mg/Kg) dos PLS de B. occidentalis, C.
feldmannii e S. filiformis 30 min. antes da administrao de Cg, no promoveram reduo
do edema em nenhum dos tempos analisados. Observou-se mais uma vez que o grupo prtratado com C. feldmannii apresentou potencializao do edema no tempo 60 min (92%)
(FIGURA 7).
Esses dados confirmam a ineficcia dos PLS utilizados em inibir o edema de pata
induzido pelos estmulos utilizados at agora. Porm, existe a possibilidade da varivel
tempo de pr-tratamento estar interferindo com os efeitos desses sobre o desenvolvimento
dos edemas avaliados. Portanto, no experimento seguinte foi realizado o pr-tratamento dos
animais com os PLS em diferentes tempos.
47
1,4
1,2
A
Edema (ml)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
250
*#
B
*
ASC (unidadesarbitrrias)
200
150
100
50
salina
Carragenina 2 mg/pata
48
49
salina (0.01ml/Kg)
Cg (2mg/pata)
C. feldmannii (concomitante)
C.feldmannii (10 min)
C. feldmannii (30 min)
1,4
1,2
A
1,0
Edema (ml)
*
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
Tempo(min)
250
200
*
*
150
100
50
salina
Carragenina
concomitante
10 minutos
30 minutos
50
51
salina (0,01mL/Kg)
Zimosan (1mg/Kg)
C. fedmannii (0,9mg/Kg)
1,4
1,2
#
Edema (ml)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
360
Tempo (min)
B
400
350
300
250
200
150
100
50
0
salina
C. feldmannii
Zimosan (1mg/pata)
52
53
0,8
Edema (mL)
0,6
*
*
0,4
*
*
*
*
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
125
100
75
*
50
*
25
salina
Figura 10- Os polissacardeos sulfatados das algas Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii e
Solieria filiformis induzem a formao de edema de pata. Os PLS foram administrados s.c. (0,9 mg/Kg) na
pata traseira direita de ratos. O grupo controle negativo recebeu salina (0,01 mL/Kg de peso corporal; s.c.) na
pata traseira esquerda. O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240 min
aps a injeo dos PLS expresso como a variao dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e o
tempo zero. (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas, utilizando-se o mtodo do
trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. (Painel
B). * p<0,05 comparado ao grupo salina.
54
55
Salina (0,01mL/Kg)
C. feldmannii (0,1mg/Kg)
C. feldmannii (0,3mg/Kg)
C. feldmannii (0,9mg/kg)
0,6
edema (ml)
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
Tempo (min)
120
*
ASC (unidades arbitrrias)
100
* #
80
60
40
20
0
salina
0,1
0,3
0,9
C. feldmannii (mg/kg)
Figura 11- Os polissacardeos sulfatados da alga Champia feldmannii provocam edema de pata em ratos
em diferentes doses. Os PLS de C. feldmannii (0,1; 0,3 e 0,9 mg/Kg, contidos em 1 mL de salina estril)
foram injetados por via s.c. intraplantar. O grupo controle negativo recebeu injeo s.c. intraplantar i.p de
salina estril (0,01 mL/Kg). O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de 30, 60, 120, 180 e 240
min aps a injeo dos PLS e expresso como a variao dos volumes das patas (mL) entre os vrios tempos e
o tempo zero (Painel A). As reas sob as curvas (ASC) foram determinadas, utilizando-se o mtodo do
trapzio (Painel B). Cada ponto representa a mdia E.P.M. da variao de volume de pata de 6 ratos. (Painel
B) *p<0,05 comparado ao grupo salina e # p<0,05 em relao ao grupo C. feldmannii 0,9 mg/Kg.
56
57
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
salina
Champia feldmannii
58
sulfatados
da
alga
marinha
vermelha
59
salina (0,01ml/kg)
Champia feldmannii (0,9mg/Kg)
1,2
1,0
Edema (mL)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
6 7 8 9 10
Tempo (horas)
11 12 24 48
Figura 13- O polissacardeo sulfatado de Champia feldmannii provoca edema de pata nas primeiras 12
h aps sua administrao em ratos. Os animais receberam o PLS de C. feldmannii via subcutnea
intraplantar (0,9mg/kg de peso corporal). O controle negativo recebeu salina (0,01mL/kg de peso corporal;
s.c. intraplantar). O edema foi medido antes (tempo zero) e nos tempos de , 1 - 12, 24 e 48h aps a injeo
dos PLS ou salina e expresso como a variao dos volumes deslocados pelas patas (mL) entre os vrios
tempos e o tempo zero.
60
61
4500
4000
n de leuccitos
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
total
neutrfilos
salina
total
neutrfilos
Champia feldmannii
Figura 14- O polissacardeo sulfatado da alga Champia feldmannii provoca aumento da migrao de
neutrfilos para a cavidade peritoneal de ratos. Os PLS de C. feldmannii (0,9 mg/Kg, contidos em 1 mL de
salina estril) foram injetados em um grupo por via intraperitoneal. O grupo controle negativo recebeu injeo
i.p de salina estril (1 mL por cavidade). A coleta do fluido peritoneal seguido da contagem de clulas foi
realizado 60 min aps a injeo dos estmulos. Os resultados foram expressos como mdia E.P.M. do
nmero de neutrfilos/L. *p < 0,05 em relao aos seus respectivos controles negativo de migrao (salina).
62
63
1,0
Edema (mL)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
240
300
360
Tempo (min)
Figura 15- Meclizina, dexametasona, indometacina e pentoxifilina inibem o edema de pata induzido por
Champia feldmannii. A avaliao do edema foi feita por pletismografia antes da injeo do PLS (0,9 mg/kg,
s.c) e 30; 60; 120; 180 e 240 min aps sua administrao. Controle negativo: salina estril (0,01 mL/Kg, s.c)
apenas. Bloqueadores farmacolgicos: L- NAME (25mg/kg; e.v), indometacina (indo; 5mg/kg s.c), meclizina
(mecli; 30mg/Kg s.c.) e dexametasona (dexa; 1mg/kg s.c.), administrados 1h antes do PLS; e a pentoxifilina
(pentoxi; 90mg/kg, s.c.) e celecoxib (30 mg/Kg, s.c), 30 min antes do PLS. * p< 0,05 em relao a salina. #
p< 0,05 em relao a Champia feldmannii.
Grupos
% Inibio
0,00
Champia feldmannii
Meclizina
Dexametasona
~15
Indometacina
25
Pentoxifilina
29
L-NAME
Salina
64
65
35
25
20
*#
*#
15
*#
*
10
n de contores abdominais
30
5
0
0.2
25
(mg/kg)
Champia feldmannii
cido actico 0,6%
Figura 16- O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta efeito
antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em camundongos. O PLS foi injetado
em doses crescentes (0,2; 1; 5 e 25mg/kg; e.v.) 30 min antes do cido actico 0,6% (0,1ml/10g, i.p.). Aps 10
minutos foi realizada a contagem do nmero de contores abdominais durante 20 min. *p<0,05 em relao
ao grupo cido actico (controle positivo).# p<0,05 em relao ao grupo C. feldmannii 1 mg/Kg.
Grupo
mg/Kg; via de
Nmero de
% de inibio
administrao
de contores
-
Controle
cido actico
33 1,44
positivo
0,6%
(10)
16,5 1,19
50 7,2*
(10)
C. feldmannii
1 (mg/Kg, i.p.)
6,6 1,28
96,96 19,39*
(10)
C. feldmannii
5 (mg/Kg, i.p.)
16,16 1,92
51,03 11,88*
(10)
C. feldmannii
25 (mg/Kg, i.p.)
10,75 1,03
67,42 9,58*
(10)
Tabela 02. O polissacardeo sulfatado da alga vermelha Champia feldmannii apresenta efeito
antinociceptivo no teste de contores abdominais (teste writhing) em camundongos. Valores
representam a mdia E.P.M. * p < 0,05 Student-Newman-Keus Method (comparado ao grupo controle).
( ) nmero de animais
66
6 DISCUSSO
Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que os polissacardeos
sulfatados das algas vermelhas Botryocladia occidentalis, Champia feldmannii e Solieria
filiformes, administrados por via endovenosa, no apresentaram efeitos antiinflamatrios no
modelo de edema de pata induzido pelos agentes edematognicos carragenina, dextrana ou
zimosan em ratos. Dentre os polissacardeos sulfatados testados no modelo de edema de
pata induzido por carragenina e dextrana, os PLS de C. feldmannii apresentaram uma
potencializao dos edemas testados. Alm disso, os polissacardeos da mesma alga
apresentaram atividade pr-inflamatria, estimulando o edema de pata assim como o
aumentando da permeabilidade vascular nas patas e a migrao de neutrfilos para a
cavidade peritoneal destes animais. Estes mesmos PLS de C. feldmannii tambm
apresentaram significativa atividade antinociceptiva, no modelo de contores abdominais
provocadas por cido actico.
O pr-tratamento endovenoso dos animais com os PLS de C. feldmannii em
diferentes doses antes da induo do edema por dextrana, alm de no inibirem o edema
causado por esta substncia causaram uma potencializao deste efeito entre 25 e 53%, na
2 e 4 hora, respectivamente, aps sua administrao, parecendo contribuir com a liberao
de mediadores ativos neste tipo de edema, at o ltimo tempo de acompanhamento do
mesmo.
A carragenina caracteriza-se por ser um agente edematognico que induz a
liberao temporal de diversos mediadores inflamatrios em duas fases, com grande
infiltrao leucocitria (LO et al., 1982). Na primeira fase libera histamina, bradicinina,
serotonina e NO formado pela nNOS e na fase tardia, prostanides e NO formado pela
iNOS (Al-SWAYEH et al., 2000; DIROSA et al., 1971; VINEGAR, et al., 1969). J a
dextrana induz um edema osmtico acelular, com efeito mximo j nos primeiros 30 min,
com participao exclusiva de mediadores como histamina, serotonina e bradicinina (LO et
al., 1982).
Com relao a carragenina o resultado negativo da ao dos PLS de C.
feldmannii como agentes antiinflamatrios se repetiu. Houve tambm neste caso uma sutil
potencializao (p< 0,05) do edema do agente inflamatrio, apesar do pr-tratamento dos
67
68
69
70
71
analgsico no apresenta efeito antiinflamatrio, podendo assim ser proposta, apesar dos
dados serem inconclusos, uma possvel ao destes PLS sobre o sistema nervoso central.
Diante disso, os resultados obtidos nesse trabalho mostram que os PLS da alga
vermelha Champia feldmannii possuem uma significativa atividade edematognica e
antinociceptiva. Estudos adicionais utilizando outra srie de ensaios farmacolgicos sero
necessrios para elucidar os mecanismos envolvidos nas aes destas substncias, pouco
estudadas in vivo. Os mesmos resultados sugerem que as molculas aqui avaliadas possam
ser utilizadas como ferramentas para no estudo de processos inflamatrios e de nocicepo
ou mesmo o uso destes polissacardeos sulfatados em situaes clnicas em que seja
necessria a ativao do sistema imunitrio.
72
7 CONCLUSO
Os polissacardeos sulfatados das algas vermelhas Botryocladia occidentalis,
Solieria filiformes e Champia feldmannii, quando injetados por via endovenosa, no
demonstraram atividade antiedematognica em modelo experimental de edema de pata em
ratos induzido por carragenina e dextrana. C. feldmannii tambm no apresentou efeito
sobre o edema induzido por zimosan. Os mesmos PLS injetadas por via subcutnea
intraplantar apresentaram efeito edematognico, sendo o edema elicitado pelos PLS de C.
feldmanni o mais intenso de todos.
Os PLS de C. feldmannii apresenta efeito edematognico comprovado por dois
parmetros, sendo que essa atividade edematognica, nos modelos experimentais de edema
de pata, parece ser mediada em maior parte por citocinas e prostaglandinas.
Os polissacardeos sulfatados de C. feldmannii, quando administrados por via
endovenosa, apresentam uma potente atividade antinociceptiva no modelo experimental de
contores abdominais induzidas por cido actico.
Os PLS administrados endovenosamente no apresentaram toxicidade aguda nas
doses utilizadas.
73
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