PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD

ANTIFUNGICA PARA LEVADURAS

POR DISCO DIFUSION
M44-A2, M44-S3 (2009)

Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON

Instituto Nacional de Salud del Nio
rerojasle@yahoo.com
2014

EVOLUCION TAXONOMICA DE LAS LEVADURAS

Fuente

Ao

Referencia

N
Gneros

Increment
o%

N
Especies

Increment
o%

Practical handbook of microbiology, 2008

Epidemiologa
Levaduras en IIH del torrente sanguneo
41.4%, comunicacin personal (INSN, 20062008)

Entre 1999 y 2000, casos de sepsis por

hongos se incrementa en 207% (USA)
Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus
spp

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

Normas CLSI
Incremento de IFI y de antifngicos
Pruebas de susceptibilidad antifngica
GANAN reconocimiento

Mtodos de referencia tanto macro y

microdilucin de CLSI
Levaduras, M27
P (1992); T (1995); A (1997); A2 (2002)

Mohos, M38
P (1998); A (2002)

P 2003
A 2004

Mtodo disco difusin

Solo para levaduras
Solo para Candida spp.
No abarca otros gneros de levaduras ni
dimrficos en su fase de levadura

Azoles y equinocandinas
Resultados, 20 a 24 h. de incubacin
Mueller-Hinton en lugar de RPMI
Disponibilidad
Bajo costo

Mtodo disco difusin

Punto de corte
Caspofungina
Fluconazol
voriconazol

Mtodo disco difusin

Parmetros de QC
Caspofungina
Fluconazol
Posaconazol
voriconazol

Seleccin de los antimicrobianos en

disco para pruebas de rutina y reporte
Pese a criterios interpretativos, no
recomendado en rutina:
Decisin tomada por mdico infectlogo,
comit de farmacia y teraputica, personal de
microbiologa clnica y el comit IIH.

Para minimizar confusin, emplear

nombres genricos.
Nmero de agentes testados, deben ser
limitados, an con pocos antifngicos.

Equipo y materiales
Incubadora a 35 C (2 C), con ambiente
aerbico.
Estndar de turbidez McFarland 0.5
Hisopos de algodn estriles
Solucin salina fisiolgica estril (8.5 g/L
NaCl; 0.85%).

Reactivos
Medio Agar Mueller-Hinton + Glucosa 2%
+ Azul de Metileno 0.5 g/mL (MHS)
Fcil disponibilidad
Aceptable reproducibilidad lote a lote
Suplemento
Glucosa 2%, apropiado crecimiento
Azul de metileno 0.5 g/mL, incrementa zona de
definicin

Puede ser suplementado ya sea pre o pos

produccin

Preparacin del medio de Mueller-Hinton agar suplementado

(1) y suplementacin de las placas de MHA (2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Reactivos
pH de MHS
7.2 7.4, T amb. despus de solidificado
Macerar medio para sumergir el electrodo
Dejar que una pequea cantidad de agar se
solidifique alrededor del electrodo en un recipiente
de vidrio
Usar electrodo de superficie calibrado

Humedad
Exceso en la superficie, secar en incubadora
o cabina de flujo laminar, tapa entreabierta
(10-30 min).

Reactivos
Almacenamiento de discos
Refrigerar los recipientes a 8 C o
congelacin a -14 C, hasta ser utilizados.

Preparacin del estndar de turbidez

Estndar de turbidez McFarland 0.5

PROCEDIMIENTO
Preparacin del inculo
Cepas subcultivadas, sobre AS ASD
(pureza y viabilidad). T 35 C (2 C)
Inculo preparado picando 5 colonias
distintas de aprox. 1 mm de , 24 h, 5 ml de
SSF estril
Agitar por 15 s y ajustar turbidez (1x106 a
5x106 cel/mL

Preparacin inculo levaduras

(M44-A2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%:

Gold Standar

Verificar pureza del aislamiento:

evita dolores de cabeza

bacterias

Chrom Agar: excelente alternativa

Coinfeccin

PROCEDIMIENTO
Inoculacin de las placas
Dentro de los 15 min despus de ajustar la
turbidez del inculo, embeber el hisopo en la
suspensin, rotar varias veces y presionar
firmemente contra la pared interna del tubo
evitando el nivel del fluido.
Agar MHS es inoculado por estriado uniforme
del hisopo en toda su superficie, dos o mas
veces, rotando la placa aprox. 60 cada vez,
finalmente el borde del agar.
Tapa entreabierta, 3-5 min., no mas de 15 min

PROCEDIMIENTO
Aplicacin de los discos
Los discos son dispensados sobre la
superficie de la placa inoculada, ligera presin,
aproximacin entre discos no menor de 24
mm de centro a centro
Invertir las placas e incubar dentro de los 15
min despus que los discos son aplicados

DISCOS DE
FLUCONAZOL

25 g

DISCOS DE
VORICONAZOL

1 g

PROCEDIMIENTO
Lectura de las placas e interpretacin
Examinar despus de 20-24 h de incubacin
Zonas de inhibicin uniformemente circulares y
desarrollo semiconfluente
Sobre fondo negro no reflejante, iluminado
Medir el dimetro de prominente reduccin de
crecimiento
Ignorar microcolonias en los bordes o grandes
colonias dentro de la zona de inhibicin.
Leer a las 48 h solo cuando insuficiente
desarrollo es observado a las 24 h

INTERPRETACION

M44-S3
2009

J Clin Microb; 2008, 46(6):1927-1929

CONTROL DE CALIDAD
Propsito (monitorear)
Precisin (repetitibilidad) y exactitud
Performance de reactivos
Performance de la persona que realiza la
prueba y lee los resultados

CONTROL DE CALIDAD
Utilizar cepas de referencia para el QC
Candida albicans ATCC 90028
Candida parapsilosis ATCC 22019
Candida tropicalis ATCC 750
Candida krusei ATCC 6258.

CONTROL DE CALIDAD
Almacenamiento de cepas para el QC
Minimizar posibilidad de mutacin
APD a -70 C
Cepas de trabajo, AS o ASD a 2-8 C,
subcultivadas cada semana, no mas de tres
semanas
Cepas congeladas o liofilizadas,
subcultivadas al menos dos veces antes de
su uso

CONTROL DE CALIDAD
Dimetros lmites del control de calidad
Diario, si es satisfactorio semanal