Reacii citochimice

Citochimia se bazeaz pe studiul microscopic al componenilor chimici celulari: nucleoproteine,

proteine, hidrai de carbon, lipide i enzime.
Coloraiile citochimice ofer informaii n legtur cu linia celular i diferenierea celulelor
hematopoietice i joac un rol important n evaluarea anomaliilor hematologice, n special n
diagnosticul diferenial i clasificarea bolilor maligne ale sngelui.
Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul c, o reacie pozitiv este ntotdeauna
valoroas, n timp ce reacia negativ este neconcludent. Pentru certitudine, n majoritate
cazurilor reaciile citochimice se practic cu un martor pozitiv al reaciei 1;2.

Reacii
citochimice

LAM
M1,M2

LAM M3

LAM M4

LAM
M5

LAM M6

LAM M7

LAL

MPO

++

- , +/-

PAS

- , +/-

-,+

- , +/-

-,+

- , + , ++

ANAE

-,+

++

- , +/-

- negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.

Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB i LAL necesit coroborarea datelor
de microscopie optic - morfologie i coloraii citochimice - cu imunofenotiparea, eventual datele de
microscopie electronic.

I. Mieloperoxidaza
Informaii generale
Reacia MPO este coloraia citochimic de elecie pentru recunoaterea celulelor granulocitare,
prezena sa reprezentnd singurul marker fr echivoc al diferenierii mieloide. Mieloperoxidaza
este o enzim localizat n granulaiile azurofile ale celulelor seriilor granulocitare i monocitare i
n granulaiile specifice ale eozinofilelor 4.
Principiul reaciei
Peroxidazele celulare descompun apa oxigenat i elibereaz oxigenul, care oxideaz benzidina
i genereaz un compus brun-auriu insolubil i stabil, localizat n citoplasma celulelor peroxidazopozitive1;3.
Recomandri pentru determinarea activitii peroxidazei
- diferenierea leucemiei acute mieloblastice (LAM) de cea limfoblastic (LAL);
- demonstrarea corpilor Auer;
- detectarea scderii activitii, la subiecii cu deficit de MPO congenital sau dobndit (n
mielodisplazii)1.
Pregtire pacient - jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mese) 3.
Specimen recoltat
a) snge capilar i/sau aspirat medular - frotiuri

b) se recomand recoltarea simultan de snge venos pentru hemogram 3.

Cauze de respingerea probei
- frotiuri nefixate n maxim 8 ore de la recoltare;
- frotiuri executate din snge recoltat pe EDTA 3.
Recipient de recoltare
a) se execut frotiuri de snge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogram 3.
Cantitate recoltat
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesar dup recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor s se fac n primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se
poate face n primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 pri + formol 40% 1 parte. Fixarea se
cronometreaz 30 secunde, dup care frotiurile se spal cu jet de ap de robinet. Frotiurile fixate
se pot colora imediat sau se pot pstra cteva zile la temperatura camerei, pn la colorare 3.
Stabilitate prob
- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30C;
- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metod - examinare microscopic3.
Interpretarea rezultatelor
Granulele de culoare galben-brun indic prezena activitii peroxidazelor celulare.
Reacia este intens n celulele seriei granulocitare. Martorul pozitiv al reaciei este reprezentat de
granulocitul matur - granule mari n citoplasm i peste nucleu. Este discutabil dac mieloblastul
normal este peroxidazo-pozitiv n microscopia optic. Reacia este pozitiv ncepnd de la stadiul
de promielocit; sunt prezente o multitudine de granule galben-brune n citoplasm, care uneori
mascheaz alte caracteristici citoplasmatice.
Pentru stabilirea diagnosticului de leucemie acut mieloblastic (LAM) cel puin 3% din blati
trebuie s fie peroxidazo-pozitivi. Mieloblatii prezint de obicei granulele mari, localizate i mai
reduse numeric dect promielocitele normale. Corpii Auer, rezultai din coalescena anormal a
granulaiilor azurofile, sunt intens peroxidazo-pozitivi.
Monocitele dau o reacie negativ sau slab pozitiv. Monoblatii din leucemia acut monocitar
(LAM-M5) sunt de obicei negativi, n timp ce monoblatii din leucemia acut mielomonocitar
(LAM-M4) pot fi slab pozitivi.
Limfocitele i eritrocitele nu au activitate MPO n nici un stadiu de maturare.
n concluzie, reactia pozitiv n blati indic leucemie mieloblastic sau mielomonocitar 1;4;5.
Limite i interferene
Obinerea unei reacii pozitive n blati are valoare diagnostic pentru leucemia acut
mieloblastic, n timp ce reacia negativ este neconcludent. Rezultatul trebuie coroborat cu alte
teste citochimice1.
II. Reacia acid periodic Schiff (PAS)
Informaii generale

n celulele sangvine reacia pozitiv este datorat n primul rnd prezenei de glicogen
citoplasmatic. Acumularea de glicogen se consider a fi un indicator al dereglrii metabolismului
acestuia.
Multe din celulele sangvine prezint o reacie PAS pozitiv n citoplasm. Intensitatea acestei
reacii i tipul de colorare variaz cu tipul celular 1.
Principiul reaciei
Reactivul Schiff este o soluie incolor obinut prin reducerea fucsinei bazice. Acidul periodic
oxideaz grupul glicol sau derivaii si. Rezultatul este producerea de aldehide care reacioneaz
cu reactivul Schiff pentru a produce o culoare purpurie 1;3.
Recomandri pentru determinarea PAS
- diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 i L2;
- diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidenierea eritroblatilor PAS-pozitivi;
- diferenierea celulelor Gaucher i a histiocitelor cu granule albastre ca marea de alte tipuri de
macrofage1.
Pregtire pacient - jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mese) 3.
Specimen recoltat
a) snge capilar i/sau aspirat medular - frotiuri
b) se recomand recoltarea simultan de snge venos pentru hemogram 3.
Cauze de respingerea probei
- frotiuri nefixate n maxim 8 ore de la recoltare;
- frotiuri executate din snge recoltat pe EDTA 3.
Recipient de recoltare
a) se execut frotiuri de snge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogram 3.
Cantitate recoltat
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesar dup recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor s se fac n primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se
poate face n primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 pri + formol 40% 1 parte. Fixarea se
cronometreaz 30 secunde, dup care frotiurile se spal cu jet de ap de robinet. Frotiurile fixate
se pot colora imediat sau se pot pstra cteva zile la temperatura camerei, pn la colorare 3.
Stabilitate prob
- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30C;
- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metod - examinare microscopic3.
Interpretarea rezultatelor
Glicogenul apare colorat n rou purpuriu, sub form de granule sau difuz.
Martorul pozitiv al reaciei este reprezentat de granulocitul matur.
Granulocitele conin glicogen sub form difuz ncepnd cu stadiul de promielocit unde apare roz
i crete pe msura maturaiei. Bazofilele sunt moderat-intens PAS pozitive, frecvent prezentnd
grmezi amorfe n jurul nucleului. n leucemia acut mieloblastic (LAM) pot exista mieloblati
care prezint granule roii, mici sau medii. n faza blastic a leucemiei granulocitare cronice (LGC)
blatii sunt frecvent PAS pozitivi, similar limfoblatilor din leucemia acut limfoblastic.
Promielocitele din leucemia acut promielocitar (LAM-M3), n special forma hipergranular, sunt
de obicei PAS pozitive.

n mod normal, un numr mic (mai puin de 15%) de limfocite mature pot fi PAS pozitive cu
urmtoarele aspecte :
1+ rare granule roii, mici sau medii;
2+ numar moderat granule roii, mici sau medii;
3+ inele de granule roii, grosolane sau grmezi de material amorf de culoare roie n
citoplasm sau acoperind nucleul.
n leucemia limfatic cronic (LLC) netratat i faza leucemic a limfoamelor, numrul de celule
limfoide pozitive este de obicei crescut n mod semnificativ, dar acest rezultat nu este concludent.
n leucemia acut limfoblastic (LAL) un numr variabil de limfoblati pot fi PAS pozitivi 1+,2+,3+.
Aspectul PAS pozitiv 3+ prezint specificitate nalt pentru limfoblatii leucemici. Limfoblatii sunt
caracterizai printr-o mare variabilitate a activitii glicogenice: sunt PAS pozitivi doar n ~ 50% din
cazurile de LAL-L1 i L2, n timp ce n LAL-L3 sunt constant negativi.
Creterea glicogenului n limfocitele patologice nu este specific leucemiei, ci se datoreaz
creterii activitii metabolice care are loc n cursul oricrui tip de proliferare limfoid 1.
Monocitele sunt negative sau slab pozitive(1+). Precursorii monocitelor n leucemia acut
monocitar (LAM-M5) sunt frecvent pozitivi i pot prezenta granule mari sau grmezi amorfe,
similar limfoblatilor leucemici, dar de obicei limitate la citoplasm. n leucemia acut
mielomonocitar (LAM-M4) blatii, cnd sunt PAS pozitivi, prezint un aspect fin granular.
Precursorii eritroizi normali sunt PAS negativi. Proeritroblatii i eritroblatii bazofili din
eritroleucemie (LAM-M6) pot prezenta un aspect granular, cu granule grosolane dispuse n jurul
nucleului. Un aspect difuz PAS pozitiv, poate fi prezent n eritroblatii maturi din LAM-M6 i
sindromul mielodisplazic (SMD).
Megacarioblatii, megacariocitele i plachetele sunt PAS pozitive. Megacarioblatii din LAM-M7
prezint un aspect difuz sau cu granule dispuse periferic 1;4;5.
Limite i interferene
Reacia PAS are valoare mic n diferenierea LAL de alte tipuri de LA cu diagnostic dificil i incert,
datorit heterogenitii limfoblatilor 1.
III. Esteraze nespecifice
Informaii generale
Esterazele sunt enzime care hidrolizeaz esteri alfatici i aromatici i sunt utile pentru a distinge
celulele seriei granulocitare de celulele seriei monocitare.
Naphthol AS-D cloracetat esteraza este prezent n celulele liniei granulocitare i se gsete n
cantitate mic sau este absent n monocite i precursorii monocitelor.
Esteraza nespecific este, aa cum i arat i numele, o enzim ubiquitar prezent n mai multe
tipuri de celule, printre care: monocite,celule T i megacariocite. Poate utiliza ca substraturi: alfanaftil acetat, alfa-naftil butirat, naftol AS- D acetat 4.
Principiul metodei
Ne vom referi la reacia alfa-naftil acetat esteraz (ANAE): alfa-naftil acetatul este hidrolizat de
esteraze n alfa-naftol, care n prezena unei sri de diazoniu formeaz un compus de culoare
rou-brun, insolubil n ap1;3.
Recomandri pentru determinarea esterazelor nespecifice
- diagnosticul LA monocitare tipurile M4 i M5 1.
Pregtire pacient - jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mese) 3.

Specimen recoltat
a) snge capilar i/sau aspirat medular - frotiuri
b) se recomand recoltarea simultan de snge venos pentru hemogram 3.
Cauze de respingerea probei
- frotiuri nefixate n maxim 8 ore de la recoltare;
- frotiuri executate din snge recoltat pe EDTA 3.
Recipient de recoltare
a) se execut frotiuri de snge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogram 3.
Cantitate recoltat
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesar dup recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor s se fac n primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se
poate face n primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 pri + formol 40% 1 parte. Fixarea se
cronometreaz 30 secunde, dup care frotiurile se spal cu jet de ap de robinet. Frotiurile fixate
se pot colora imediat sau se pot pstra cteva zile la temperatura camerei, pn la colorare 3.
Stabilitate prob
- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30C;
- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metod - examinare microscopic3.
Interpretarea rezultatelor
n monocite, activitatea enzimatic a ANAE se evideniaz prin apariia unui compus rou-brun, cu
aspect difuz, moderat sau intens colorat (tip M monocitar). n celulele T (inclusiv limfoblatii T) i
megacarioblati, aspectul este mai mult focal, n regiunea Golgi sau paranuclear. Aspectul colorrii
este util, ntr-o anumit msur, n diferenierea tipurilor de celule.
Etapa de inhibare cu NaF a fost adugat pentru a face esteraza nespecific mai specific.
Activitatea enzimei n celulele liniei monocitare este inhibat de NaF, n timp ce n restul celulelor
activitatea persist.
Alfa-naftil acetat esteraza este obinuit negativ n celulele de serie granulocitar. Celulele blastice
din LAM-M0, M1 i M2 sunt de obicei negative. n LAMM3 esteraza nespecific este pozitiv n
20-30% din cazuri, fiind mai slab ca intensitate dect n monocite; reacia este sensibil la
inhibare cu NaF n aproximativ 1/3-1/2 din cazurile pozitive.
Celulele blastice monocitare din LAM-M4 au activitate ANAE intens pozitiv, difuz (tip M) n
proporie de peste 20%, iar n cele din LAM-M5 n proporie de peste 80%, sensibil la NaF.
Megacarioblatii leucemici din LAM-M7 au pozitivitate focal distinct parial inhibat de NaF.
Eritroblatii din LAM-M6 au de obicei activitate ANAE pozitiv, neinhibat de NaF.
Celulele blastice din LAL sunt negative; foarte rar pot aprea celule ANAE slab pozitive cu aspect
granular, cu sensibilitate variabil la NaF 1;4.
IV. Fosfataza alcalin leucocitar (indice FAL)
Informaii generale i recomandri
Activitatea fosfatazei alcaline este prezent n citoplasma neutrofilelor, osteoblastelor, celulelor
endoteliului vascular i unor limfocite.

Determinarea activitii (indicelui) fosfatazei alcaline leucocitare este utilizat in :

- diferenierea leucemiei granulocitare cronice de alte boli mieloproliferative (n particular
metaplazie mieloid cu mielofibroz i policitemia vera) i de reactiile leucemoide (infecii,
neoplazii);
- diferentierea poliglobuliilor secundare de policitemia vera;
- parametru de prognostic n LGC, ce reflect diferitele faze de activitate ale bolii;
- diferenierea formelor stabile, benigne de hairy cell leukemia (HCL) cu FAL normal, de formele
active de boal, cu neutropenie sever i FAL mult crescut 1;3;6.
Principiul reaciei
Fosfataza alcalin leucocitar catalizeaz reacia de hidroliz a esterilor fosfai n mediu alcalin.1naftolul rezultat din 1-naftil-fosfat se cupleaz cu o sare de diazoniu, formnd precipitate brune, n
funcie de localizarea i activitatea fosfatazei alcaline n celule. Intensitatea i frecvena granulelor
se evalueaz prin examen microscopic1,3.
Pregtire pacient - jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mese) 3.
Specimen recoltat
a) snge capilar i/sau aspirat medular - frotiuri
b) se recomand recoltarea simultan de snge venos pentru hemogram 3.
Cauze de respingerea probei
- frotiuri nefixate n maxim 8 ore de la recoltare;
- frotiuri executate din snge recoltat pe EDTA 3.
Recipient de recoltare
a) se execut frotiuri de snge capilar direct pe lame de microscopie;
b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemogram 3.
Cantitate recoltat
a) 3-5 frotiuri;
b) 2 mL3.
Prelucrare necesar dup recoltare
Este preferabil ca fixarea frotiurilor s se fac n primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se
poate face n primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 pri + formol 40% 1 parte. Fixarea se
cronometreaz 30 secunde, dup care frotiurile se spal cu jet de ap de robinet. Frotiurile fixate
se pot colora imediat sau se pot pstra cteva zile la temperatura camerei, pn la colorare 3.
Stabilitate prob
- frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30C;
- frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei3.
Metod - examinare microscopic3.
Determinarea citochimic a fosfatazei alcaline este bazat pe formarea unui precipitat colorat brun,
a crui intensitate este subiectiv gradat de la 0 la 5:
-grad 0= fr pigment, granulaii absente
-grad 1= una-puine granulaii distincte
-grad 2= cteva granulaii localizate
-grad 3= granulaii difuz distribuite
-grad 4= precipitate intense compacte care acoper citoplasma celulelor, dnd aspect de pigment
continuu, nucleul celulelor fiind ns vizibil
-grad 5= numr maxim de granulaii, cu nucleul frecvent invizibil.
Scorul fosfatazei alcaline leucocitare ntr-un frotiu este dat de suma scorurilor de colorare a 100
granulocite neutrofile mature1;3.

Valori de referin3 - Scor FAL:10-100.

Interpretarea rezultatelor
Valori sczute:
- leucemie granulocitar cronic (tipic, FAL este foarte sczut sau absent);
- hemoglobinurie paroxistic nocturn;
- sindroame mielodisplazice6.
Valori crescute
- boli mieloproliferative, altele decat LGC (policitemia vera i unele cazuri de metaplazie mieloid
cu mielofibroz);
- LGC n remisiune (poate avea FAL normal sau chiar crescut);
- infectii;
- afectiuni inflamatorii;
- leucemie cu celule proase1,6.
Limite i interferene
Condiii fiziologice de stress: sarcin, efort fizic intens (cresc indicele FAL).
Condiii patologice: infeciile asociate LGC pot crete valoarea FAL.
Medicamente: terapia cu factori de cretere, contraceptive orale, preparatele cortizonice, litiu,
(determin creteri ale indicelui FAL).
Interferene analitice
Scderi : EDTA (activitatea enzimei scade rapid n timp) 6.
Observaie: Pentru a determina indicele FAL, trebuie s existe suficiente granulocite neutrofile
mature n formula leucocitar3.
Bibliografie
1.
2.
3.
4.

Dan Coli. Tratat de Medicin Intern-Hematologie, partea a II-a (sub redacia Radu Pun), ed 1999, 1014-1026.
Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.
Laborator Synevo. Referinele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2006. Ref Type: Catalog;
Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe's Clinical
Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.
5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996,
Workshop Manual, p 167-176.
6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe's Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.