DETERMINAREA ACTIVITII LIPAZEI

Lipaza (hidrolaza esterilor glicerinei, E. C. 3.1.1.3.) catalizeaz scindarea hidrolitic a

triacilglicerolilor cu formare de glicerol i acizi grai liberi, conform reaciei :
O

O
O

H2 C

H2 C

H2C

R1

R1

OH

OH

O
R2

+ 3H2O

HO

+
R2

H2C

R3

OH

OH

O
R3

L-glicerol

t riac ilglicerol

OH

ac izi g rasi

Lipazele se ntlnesc n diferite esuturi animale : ficat, pancreas, plmni, rinichi,

esutul adipos, snge etc.
i n regnul vegetal lipazele sunt larg rspndite, mai ales n semine, n special la
plantele oleaginoase. Lipazele s-au evideniat, de asemenea, n unele specii de
microorganisme.
Lipazele de diverse proveniene se deosebesc dup activitatea catalitic, pH-ul optim
de aciune, temperatura optim i alte proprieti.

II.6.1.1. DETERMINAREA ACTIVITII LIPAZEI VEGETALE

n plante exist lipaze care acioneaz la diferite valori de pH, deosebindu-se n acest
sens lipaze acide, neutre, i alcaline. n seminele plantelor oleaginoase exist mai ales lipaze
acide i alcaline.
Principiul metodei. Activitatea lipazei se determin dup creterea aciditii n
mediul de reacie n urma eliberrii acizilor grai din triacilgliceroli hidrolizai de enzim.
Acizii grai liberi, rezultai prin hidroliza triacilglicerolilor sub aciunea lipazei, se titreaz
direct cu soluie de hidroxid de sodiu :

O
R1

O
+ 3NaOH
OH

+ 3H 2O
R1

ONa

Substratul ideal pentru studiul aciunii lipazei dintr-un anumit organism viu ar fi
triacilglicerolii obinui chiar din acel organism. Dar se pot utiliza i ali triacilgliceroli cum ar
fi uleiul de floarea soarelui sau uleiul de msline.
Reactivi. 1) Ulei de floarea soarelui sau ulei de msline.
2) Soluie tampon acetat 0,5 M cu pH 4,7. Se obine prin amestecarea de volume
egale de soluie de acid acetic 1M i acetat de sodiu 1M cu 2 volume de ap bidistilat.
3) Soluie tampon borat 0,2 M cu pH 8,3. Se dizolv 6,184 g de acid boric n 400 ml
ap distilat. Se ajusteaz pH-ul soluiei de acid boric la 8,3 cu soluie de NaOH 1 N. Se
completeaz volumul soluiei de borat de sodiu la 500 ml cu ap distilat.
4) Soluie de NaOH 0,1N. Se dizolv 4,3 g NaOH n 1000 ml ap distilat, la balon
cotat. Factorul soluiei de NaOH se stabilete cu ajutorul acidului oxalic, n prezena
fenolftaleinei ca indicator.
5) Soluie alcoolic de timolftalein 1%. Se dizolv 1 g de timolftalein n 100 ml
alcool etilic 90%.
6) Alcool etilic 96% sau alcool metilic.
7) Eter etilic.
8) Toluen.
Mod de lucru. Seminele de plante se macin sau se tritureaz n mojar (cu
adugarea unei mici cantiti de sticl pisat). O cantitate de 2,5 g de semine uscate i
mcinate fin se mojareaz cu 1 ml ulei pur de floarea soarelui. Pentru determinarea activitii
lipazei acide n mojar se adaug 5 ml soluie tampon acetat 0,5 M cu pH 4,7 i se tritureaz

timp de 5 -10 minute coninutul mojarelor. n cazul determinrii activitii lipazei alcaline se
folosesc 5 ml soluie tampon borat 0,2 M cu pH 8,5. Se efectueaz cte dou probe.
La terminarea triturrii pasta din mojare se transfer n dou flacoane conice cu dop
rodat, cu capacitatea de 100 ml. Mojarele se spal cu 5 ml ap distilat care se adaug peste
coninutul din flacoane. Se introduc 5 picturi de toluen, se nchid flacoanele i se agit timp
de 3 - 5 minute pe un agitator automat. Apoi se introduc pentru 5 - 10 ore ntr-un termostat
la 30C.
Dup termostatare n fiecare flacon se toarn cte 50 ml amestec alcool etilic (metilic)
/ eter etilic (4:1) i se agit.
Se las s se depun reziduul insolubil apoi se titreaz cu soluie de NaOH 0,1N n
prezena ctorva picturi de timolftalein.
Paralel cu probele de cercetat se vor face 2 martori n care se introduc aceleai
cantiti de substane (2,5 g fin semine, 1 ml ulei pur, 5 ml soluie tampon, 5 ml ap
distilat i 5 picturi de toluen) dar nu se termostateaz ci se titreaz direct dup adugarea
amestecului alcool-eter.
Calculul rezultatelor. Activitatea lipazei se exprim n ml soluie de NaOH 0,1 N
necesari pentru neutralizarea acizilor grai eliberai sub aciunea lipazei din 100 g semine :

X=

(V - v) F 100
,
p

n care :
X - activitatea lipazei;
V - ml soluie de NaOH 0,1 N consumai pentru titrarea probei de cercetat ;
v - ml de soluie de NaOH 0,1 N consumai pentru titrarea martorului;
F - factorul soluiei de NaOH stabilit cu ajutorul acidului oxalic ;
p - greutatea materialului analizat n grame.