Prctica 12

CARACTERIZACIN FENOTPICA DE MUTANTES RESISTENTES A

ALCOHOL ALLICO EN F. oxysporum
OBJETIVO
Se identificar fenotpicamente mutantes resistentes al alcohol allico previamente
aislados carentes de actividad de la enzima Adh1 en F. oxysporum f. sp.
lycopersici.

INTRODUCCIN
La alcohol deshidrogenasa (Adh) pertenece a la familia de las oxidoreductasas,
enzimas que han sido ampliamente estudiadas en diferentes organismos debido
su participacin en diversas rutas metablicas, realizando la oxido-reduccin de
alcoholes, aldehdos y cetonas, procesos esenciales tanto en procariotes como
eucariotes (Reid y Fewson, 1994). Entre los procesos fisiolgicos donde se ha
observado la participacin de la Adh se encuentra la fermentacin, realizada por
levaduras y bacterias anaerobias, produciendo etanol y el cofactor oxidado NAD +,
en donde la regeneracin del NAD+ es esencial para la produccin de energa y la
continuacin del ciclo metablico. La oxidacin de alcoholes por medio de la Adh,
resulta en la produccin de aldehdos o cetonas y el cofactor reducido NADH;
adicionalmente, esta enzima oxidativa puede estar involucrada en la utilizacin de
alcoholes como fuente de carbono y energa para el crecimiento (Reid y Fewson,
1994). En otros casos la Adh brinda proteccin a la presencia de estrs
anaerbico y contribuye a mantener el equilibrio redox intracelular, entre otros
(Bakker y col., 2000). Es comn que la produccin de la enzima se regule a travs
del desarrollo y/o de condiciones ambientales, existiendo en muchos casos
isoformas de las enzimas que difieren en sus propiedades bioqumicas y
fisiolgicas.
F. oxysporum f.sp. lycopersici es un hongo fitopatgeno que infecta a las plantas
de tomate por la raz, en donde existen diversas condiciones ambientales y
nutricionales tales como baja tensin de oxgeno, as como diferentes fuentes de
carbono y nitrgeno. Para sobrevivir, crecer e infectar a las plantas de tomate de
una manera eficiente, F. oxysporum necesita adaptar su metabolismo rpidamente
a dichos cambios ambientales, a travs de un sistema multirepiratorio. En dicho
sistema multirespiratorio, la actividad de alcohol deshidrogenasa (Adh) participa de
manera importante ya sea como enzima fermentativa (produciendo etanol y
regenerando NAD+, el cual es necesario para que la glucolisis contine en
condiciones de baja tensin de oxgeno predominantes en el ambiente donde
crecen las races) o bien como enzima oxidativa para consumir el etanol producido
por la plantas.
Previamente con el objetivo de conocer el papel fisiolgico de la Adh en el
metabolismo del etanol en F. oxysporum f. sp. lycopersici, y en la relacin de dicho

metabolismo con los procesos de crecimiento tanto en medio de cultivo como in

planta, se han aislado cepas mutantes espontneas resistentes a alcohol allico,
una de ellas denominada AC3. El racional para ello se basa en que la presencia
de enzima Adh activa convierte el alcohol allico en acrolena, un toxico potente
para las clulas (Bennetzen, 1982). As pues, los mutantes espontneos carentes
de la actividad enzimtica pueden ser aislados por su capacidad de sobrevivir a
concentraciones de alcohol allico que son toxicas para la cepa silvestre.
Durante la presente prctica se pretende corroborar el fenotipo de resistencia a
alcohol allico en la mutante AC3 de F. oxysporum o, para ello se obtendrn
conidias de la cepa silvestre y mutante AC3 y se sembrar en cajas con medio
PDA con alcohol allico.

DESARROLLO
Material
a. Micropipetas automaticas y puntas
b. Cultivos de F. oxysporum f. sp. lycopersici cepa 42 87 (silvestre Adh+)
c. Cultivos de F. oxysporum f. sp. lycopersici cepa AC3 (mutante Adh1-)
d. Embudos
e. Filtros
f. Centrifuga
g. Tubos
h. Agua estril
i. Mecheros
j. Etanol al 70 %
k. Placas con medio PDA
l. Placas con medio PDA + 0.6 % allico.
m. Asas de cultivo
n. Incubador
Procedimiento
Obtencin de conidias
1. Incubar a F. oxysporum f. sp. lycopersici en medio PDB 28 C / 150 rpm /3
das
2. Esterilizar el rea de trabajo (limpiar el rea de trabajo con etanol al 70 %)
3. Rotular el tubo con el nombre de la cepa, la fecha y el nmero del equipo
4. Filtrar el cultivo a travs de un filtro de tela para retirar el micelio
5. Centrifugar el filtrado a 5000 rpm durante 5 min
6. Desechar el sobrenadante
7. Lavar las esporas con agua destilada estril
8. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min
9. Desechar el sobrenadante
10. Lavar nuevamente con agua destilada estril
11. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min
12. Desechar el sobrenadante

13. Resuspender la pastilla en 10 mL de agua destilada estril.

Resistencia a Alcohol allico
1. Rotular las cajas con medio PDA y PDA 0.6 % allico con el nombre de la
cepa, la fecha y el nmero del equipo.
2. Flamear el asa en el mechero, esperar unos segundos a que se enfri.
3. Introducir el asa estril en el tubo con las cepas recin colectadas.
4. En la placa con medio se inocula los microorganismos tomando una muestra
asa cargada se hacen 3 o 4 estras; se quema el asa, se hacen 3 o 4 estras
perpendiculares a las anteriores, se quema el asa y se repite el procedimiento
hasta agotarla superficie de la placa.
5. Incubar por 3 das a 28 C .
RESULTADOS
OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
1. Cul es la diferencia entre un mutante espontaneo y uno inducido?
2. Cul es la frecuencia y la tasa de mutacin?
3. Cmo se relaciona la actividad de alcohol deshidrogenasa con la resistencia
a alcohol allico?

BIBLIOGRAFA

Reid, M. F. & Fewson, C. A. (1994). Molecular characterization of microbial

alcohol dehydrogenases. Crit Rev Microbiol 20, 13-56.
Bakker, B. M., Bro, C., Kotter, P., Luttik, M. A., van Dijken, J. P. & Pronk, J.
T. (2000). The mitochondrial alcohol dehydrogenase Adh3p is involved in a
redox shuttle in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol 182, 4730-4737.
Bennetzen, J.L., Hall, B.D., 1982. The primary structure of the
Saccharomycescerevisiae gene for alcohol dehydrogenase. J. Biol. Chem.
257, 30183025.