ACTUALIZACIN

Revista de la Facultad de Medicina

Universidad Nacional de Colombia
1999 - Vol. 47 N2 Pgs. (89 - 97)

Las pruebas serolgicas en el diagnstico de la enfermedad infecciosa

Miguel A. Guzmn U_rreg~,MD_.Profesor Asociado. Departamento de Microbiologa. Maye Bernal Rivera Be. Profesora Asistente.
Departamento de Microbiologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia.

Las pruebas serolgicas basadas en la

reaccin antgeno anticuerpo constituyen una valiosa herramienta en el diagnstico y manejo de la enfermedad infecciosa. Su introduccin como ayudas
diagnsticas se inici a finales del siglo
pasado y tuvo uno de sus momentos estelares hacia 1905 cuando August Von
Wassermann O), adapt la fijacin de
complemento
desarrollada por Jules
Bordet (2,3) al diagnstico de la sfilis
(4), convirtindola en un procedimiento
clsico que hasta hace pocos aos constitua el pilar fundamental de laboratorio para el diagnstico de esta enfermedad, fue la famosa
reaccin
de
Wassermann.
De entonces a nuestros
das las pruebas serolgicas han recorrido un largo camino buscando la precisin del diagnstico de la enfermedad
infecciosa. Cientos de investigaciones
han contribuido al desarrollo y perfeccionamiento de estos procedimientos
procurando siempre conseguir que tengan una gran sensibilidad y una gran especificidad, cualidades muy difciles de
alcanzar. En los ltimos aos, se pretende adems, que los procedimientos sean
simples de realizar y que el resultado se
produzca rpidamente; la medicina contempornea parece estar llegando a esta
deseada meta.
CLASES DE PRUEBAS
SEROLGICAS
Desde el punto de vista de aquello que
investigan, se dividen en dos grandes
categoras, pruebas directas y pruebas
indirectas.

PRUEBAS DIRECTAS
Son aquellas que basadas en el principio de la reaccin antgeno anticuerpo
investigan la presencia del antgeno. En
el caso de la enfermedad infecciosa equivale a decir que investigan la presencia
del agente etiolgico o, uno de sus componentes.
PRUEBAS INDIRECTAS
Son aquellas que basadas en la reaccin
antgeno anticuerpo, investigan no ya, el
agente en s, sino la huella que dej ste
al pasar por su husped en trminos de
una respuesta inmune puesta en evidencia por el hallazgo de anticuerpos especficos contra el agente o alguno de sus
componentes y que, indirectamente permite suponer que el agente en cuestin
estuvo presente en el husped en algn
momento.
Las pruebas serolgicas de acuerdo con
el procedimiento que utilicen para evidenciar la reaccin antgeno anticuerpo
se dividen tambin en dos grandes grupos: primarias y secundarias.

PRUEBAS SECUNDARIAS
Son aquellas en las cuales la reaccin
antgeno-anticuerpo da lugar a una manifestacin visible lo cual- permite una
lectura visual macroscpica. Su realizacin usualmente es simple. Este tipo de
pruebas incluyen la precipitacin y la
aglutinacin.

PRUEBAS DE PRECIPITACIN
Las pruebas de precipitacin, cuya dinmica fue estudiada por Heildelberger
hacia 1.930 (5), constituyen una de las
pruebas secundarias ms verstiles. La
caracterstica fundamental de sta, es que
el antgeno est siempre en dilucin en
una solucin tampn la cual generalmente es solucin salina. Heildelberger (5)
encontr que el fundamento visible de
la reaccin antgeno-anticuerpo
ocurre
en las reacciones de precipitacin solamente cuando los dos componentes estn en proporciones ptimas y que este
fenmeno puede evidenciarse claramente en la llamada curva de precipitacin;
cuando se coloca una serie de capilares
con concentraciones
descendentes de
anticuerpos dirigidos contra una concentracin constante del antgeno homlogo en dilucin, se produce, luego de un
perodo de incubacin, el fenmeno visible y se puede determinar la presencia
de tres zonas claramente diferenciables:
en los tubos iniciales en donde la concentracin de anticuerpos predomina
sobre la concentracin de antgeno no
se observa ningn fenmeno visible, a
medida que la dilucin de los anticuerpos
progresa se llega a una zona en que la
concentracin de anticuerpo y antgeno
es ptima producindose una precipitacin franca, cuando la concentracin de
anticuerpos contina disminuyendo predomina, entonces, la concentracin de
antgeno y en esta zona tampoco hay ningn fenmeno visible. La primera zona
recibe el nombre de prozona, la segunda

89

GUZMN

M Y COL

en donde el fenmeno es visible se denomina zona de proporciones ptimas y

la tercera zona se llama postzona. La dinmica de las reacciones de precipitacin es siempre la misma. En el pasado
la reaccin de precipitacin fue adaptada como recurso diagnstico utilizando
sistemas de tubo capilar para observar
el fenmeno, ejemplo de esa aplicacin
fue la determinacin de la protena C
reactiva. La reaccin de VDRL y sus modificaciones son tpicas reacciones de
precipitacin (4).
Una modificacin al sistema de precipitacin en tubo consisti en colocar entre el suero que contena los anticuerpos
y la dilucin del antgeno una capa de
agarosa fundida que al solidificarse forma un tapn que separa los dos reactivos
los cuales difunden a travs de la agarosa
en forma tal que al encontrarse en proporciones ptimas forman un anillo de
precipitacin claramente visible en la
agarosa, sin embargo, tcnicamente este
tipo de reaccin era difcil y Oudin la
modific en el sentido de fundir la
agarosa mezclndole una determinada
cantidad de antisuero y colocndolo en
un tubo de ensayo para dejarla solidificar y luego colocar el antgeno en dilucin en la parte superior; esta modificacin permiti conocer que cuando el
antgeno es una mezcla de compuestos
antignicos al difundirse unidireccionalmente en la agarosa estos se difunden a mayor o menor velocidad segn
su peso molecular y reaccionan con su
anticuerpo homlogo formndose tantos
anillos de precipitacin cuantas fracciones antignicas existan lo cual puso de
manifiesto que la reaccin de precipitacin era una valiosa herramienta de anlisis inmunolgico.
Un gran desarrollo de esta idea lo constituy
el sistema
propuesto
por
uchterlony (6), de utilizar la agarosa
fundida en caja de Petri, colocar los
reactivos anticuerpo y antgeno en orificios equidistantes en forma tal que difundieran en la agarosa en una doble difusin y la zona de proporciones pti-

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mas apareciera en forma de un precipitado lineal en el espacio entre el orificio

que contiene el antgeno y el orificio que
contiene el antisuero, esta reaccin conocida como doble inmunodifusin de
uchterlony gan gran aceptacin como
herramienta de anlisis inmunoqumico
y se adapt para diagnstico de algunas
entidades clnicas, siendo particular-mente til en el diagnstico serolgico de algunas entidades micticas sistmicas como
Histoplasmosis, Coccidioidomicosis
y
Paracoccidioido-micosis entre otras (7);
otra de las grandes aplicaciones de la
reaccin de precipitacin en agarosa lo
constituy la elegante reaccin desarrollada por Mancini,
Carbonara
y
Heremans (8) para cuantificacin de protenas plasmticas
conocida
como
inmunodifusin radial, estos autores demostraron que diluyendo un anticuerpo
homlogo en agarosa y colocndose en
un orificio hecho en la agarosa una mezcla de antgenos en donde est presente
aquella protena para la cual esta presente
el anticuerpo homlogo, la difusin se
hace en forma radial dando un franco
anillo de precipitacin alrededor del orificio, con la circunstancia, de que el dimetro de este anillo es directamente proporcional a la concentracin de la protena en estudio; el procedimiento gan
rpida aceptacin y es en la actualidad
ampliamente utilizado en todo el mundo para la cuantificacin de protenas
plasmticas tales como albmina, IgG,
IgA, IgM, C3, C5, ceruloplasmina,
inhibidor de Cl esterasa y haptoglobinas,
entre otras.
Un sistema de cuantificacin similar pero
combinando un procedimiento electrofortico fue el desarrollado por Laurell (9)
conocido como tcnica del "Rocket" por
la forma que la precipitacin asume en
el agar, simulando un cohete espacial.
La tcnica de Laurell utiliza una fina capa
de agarosa fundida mezclada con un
antisuero que contiene anticuerpos contra una determinada fraccin del suero
humano, esta capa de agarosa fundida
se coloca en una lmina de vidrio y esta

se dispone en una cmara electrofortica, en la parte central se hacen orificios en lnea para colocar los controles
de concentracin conocida de la protena en estudio y en los otros los sueros
humanos en los cuales se desea cuantificar la protena, se somete a separacin
electrofortica en forma que la protena
por su carga elctrica relativa migra hacia el nodo o, hacia el ctodo y en esta
migracin ira reaccionando con su anticuerpo homlogo dando una precipitacin en forma de cohete, al trmino del
tiempo de corrido se mide la distancia
entre el vrtice del cohete y el centro del
orificio correspondiente, esta distancia
es directamente proporcional a la concentracin de la protena en estudio.
Aunque esta tcnica es sumamente exacta, es muy dispendiosa y requiere una
cmara de electroforesis; por tales razones no tuvo mucha aceptacin como recurso diagnstico.
La combinacin
de electroforesis
e
inmunodifusin en agarosa permiti a
Williams y Grabar desarrollar el sistema
denominado inmunoelectroforesis como
una herramienta muy til para el estudio
de mezclas antignicas tal como ocurre
en el suero humano. El sistema desarrollado por Williams y Grabar (lO) consiste en realizar
un fraccionamiento
electrofortico de suero humano en una
capa de agarosa
colocada
en un
portaobjeto microscpico, colocando el
suero humano en un pequeo orificio
hecho en la capa de agarosa y que puede
contener entre 5-10 microlitros de suero
humano, la placa se coloca en cmara
electrofortica de manera que un extremo est en contacto con el nodo y el
otro extremo con el ctodo y se aplica
una corriente continua de 150 voltios por
20 minutos, las protenas plasmticas se
separan electroforticamente
segn su
carga elctrica relativa de modo que
aquella protena electronegativa marcha
al nodo y aquellas menos electronegativas marchan al ctodo; terminando el
tiempo de separacin electrofortica se
hace una pequea zanja frente al orifi-

LAS PRUEBAS

Rev Fac Med UN Col 1998 Vol. 47 N 2

SERLOGICAS

cio donde se coloc la muestra en forma

tal que la zanja tenga la longitud casi del
porta objeto, esta zanja se llena con un
antisuero antihumano, obtenido usualmente en cabra o en conejo y se deja
incubar por 18 horas para que ocurra la
doble difusin, por cada protena presente en el suero se producir un arco
de precipitacin muy definido, permitiendo un anlisis
de la mezcla
antignica; la aplicacin al diagnstico
clnico de esta tcnica es muy limitada
reducindose al estudio del mieloma
mltiple, y a unas pocas situaciones
neurolgicas
en que el estudio
inmunoelectrofortico
del LCR puede
arrojar alguna luz.
Una adaptacin de la inmunoelec-troforesis
es la llamada contra inmunoelectroforesis
(ClE) o electroforesis de contracorriente;
inicialmente introducida por Cullford
para estudios mdico legales, prontamente se vio que podra convenientemente aplicarse a estudio de situaciones
clnicas, particularmente a la investigacin de infecciones de sistema nervioso
central causadas por microorganismos
capsulados cuyo polisacrido capsular
hidro soluble pueda investigarse en el
LCR, constituyendo su presencia all,
prueba irrefutable de la etiologa del proceso infeccioso; procesos tales como
meningitis por Klebsiella pneumoniae,
Haemophilus
influenzae Serotipo b,
Streptococcus pneumoniae, Neisseria
meningitidis
serotipos
A y C,
Cryptococcus neoformans pueden ser
convenientemente diagnosticados. Bsicamente el procedimiento consiste en
colocar una capa de agarosa fundida en
un porta objeto, hacer dos orificios que
puedan contener 5-10 microlitros separados por una distancia no mayor de
5mm,colocar el porta objeto contactando
un extremo al nodo y un extremo al
ctodo, colocar el LCR que se supone
contiene el polisacrido en el orificio
cercano al ctodo as que al migrar el
polisacrido, que es electronegativo, 10
traer dirigindose hacia el nodo, el
suero antipolisacrido se coloca en el
orificio cerca al nodo para que los

anticuerpos que son relativamente poco

electronegativos migren hacia el ctodo
y reaccionen dando una lnea de precipitacin, la prueba se realiza en un tiempo
de lOa 20 minutos, puede hacerse en
sangre, orina o suero. Esta tcnica es altamente especfica pero poco sensible,
de suerte que si la prueba es positiva tiene un valor diagnstico incuestionable,
pero si es negativa no excluye el diagnstico, debindose utilizar otro procedimiento; las tcnicas de precipitacin
pueden ser ledas muy rpido y con un
alto grado de precisin por procedimientos de turbidimetria
utilizando
un
nefelmetro, existen casas comerciales
que producen reactivos de ptima calidad para la cuantificacin de protenas
plasmticas, apolipoprotenas, polisacridos, etc.; pero el costo de tales reactivos
y la necesidad de un Nefelmetro son
limitan tes frente a los otros procedimientos descritos.
PRUEBAS DE AGLUTINACIN
La reaccin de aglutinacin fue desarrollada hacia finales del siglo pasado por
Durham en esta reaccin el antgeno
siempre esta en suspensin (11), pues se
trata de partculas; para que la reaccin
de aglutinacin ocurra se requiere los siguientes componentes:
1- Antgeno en suspensin
2- Sistema buffer
3- Dilucin de anticuerpos
La reaccin puede utilizarse como prueba directa o indirecta El mecanismo de
esta reaccin es simple: si en un sistema
buffer, usualmente solucin salina buffer,
se coloca una apropiada dilucin de un
suero que contenga anticuerpos especficos contra determinados
grupos
antignicos del antgeno en suspensin,
las molculas de anticuerpos reaccionan
con los grupos antignicos de las partculas del antgeno y actan como puente
produciendo grumos fcilmente visibles.
Las tcnicas directas de aglutinacin son
ampliamente utilizadas en Bacteriologa
para la identificacin serolgica de los

microorganismos gnero y especie. utilizan sueros monoespecficos producidos comercialmente.

Las pruebas de
hemoclasificacin son tpicas pruebas de
aglutinacin directa.
Las tcnicas indirectas de aglutinacin
fueron introducidas como herramientas
diagnsticas para investigar la presencia
de anticuerpos dirigidos contra un determinado agente, el hallazgo de tales
anticuerpos, visualizado por una reaccin de aglutinacin, frente a una suspensin pura del microorganismo sospechoso de ser el agente causal del cuadro
clnico en estudio, confirma indirectamente que ese microorganismo estuvo
presente en el husped y estimul una
respuesta
inmune en trminos
de
anticuerpos circulantes; las tcnicas indirectas de aglutinacin han sido ampliamente utilizadas como recurso diagnstico en entidades
como las fiebres
entricas:
fiebre tifoidea
y fiebre
paratifoidea, tifus y brucelosis ; grupo
de reacciones de aglutinacin que se
conocen como prueba de los "Antgenos
Febriles" (12-13) ; este tipo de reacciones, adecuadamente estandarizadas, con
controles apropiados son de utilidad clnica, permiten hacer una cuantificacin
con base en la aglutinacin presente en
un suero diluido progresivamente, el inverso de la dilucin que presente franca
aglutinacin se llama "Titulo de aglutinacin"; para cada antgeno investigado
hay un ttulo de referencia por encima
del cual un resultado empieza a tener significacin clnica; como todas las pruebas de laboratorio estas aglutinaciones
tienen su utilidad y sus limitaciones las
cuales deben ser conocidas por quien las
usan como recurso diagnstico.
MODALIDADES DE
AGLUTINACIN
Las tcnicas de aglutinacin son muy
verstiles y se han podido modificar para
permitir la investigacin de anticuerpos
contra grupos antignicos que pueden
ser solubles y por tanto no daran una
manifestacin visible de aglutinacin ;

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GUZMN.

sin embargo, muchas de estas sustancias

son componentes
de los microorganismos que pueden adherirse por manipulacin qumica sobre partculas inertes, el reactivo as obtenido se suspende
en un sistema buffer el cual se puede
hacer reaccionar con un suero que contenga anticuerpos contra los grupos adheridos a la partcula inerte sirviendo de
puente entre las partculas y presentando el fenmeno visible de la aglutinacin.
Dos tipos de partculas han sido ampliamente utilizadas, los glbulos rojos humanos o de algunas especies animales y
partculas de ltex de un dimetro muy
regular 0.85 micras, a estas partculas se les
puede adherir protenas, polisacridos, cidos nucleicos y hormonas, produciendo
variados tipos de antgeno con fines diagnstico, como la partcula cumple un
papel de portador pasivo de los grupos
antignicos el tipo de aglutinacin, se
llama aglutinacin pasiva, si la partcula
usada es un glbulo rojo la reaccin recibe el nombre de hemoaglutinacin pasiva, si la partcula es ltex la reaccin
recibe el nombre de aglutinacin de ltex. Por la facilidad de su realizacin y
la interpretacin stas pruebas juegan un
destacado papel como recurso diagnostico, no solo de enfermedades infecciosas, sino en otras condiciones; ejemplo
de estas tcnicas son la investigacin de
factor reumatoideo, la cuantificacin de
anticuerpos antitiroglobulina, antimicrosomales, entre otros. Las pruebas de
aglutinacin han sido modificadas para
la investigacin
directa de antgenos
bacterianos, micticos, parasitarios y an
virales, cuyo hallazgo en un paciente tiene el mismo valor del aislamiento del
agente etiolgico, en este caso, la partcula inerte glbulo rojo o partcula de
ltex se recubre con un anticuerpo
monoespecfico que se adhiere por su
fraccin Fe sobre la superficie de la partcula dejando libres los grupos de combinacin especfica del anticuerpo en
forma tal, que el antgeno investigado
sirve de puente y el fenmeno visible es
una aglutinacin, este tipo de aglutinacin recibe el nombre de aglutinacin
pasiva reversa.

92

'.

M Y COL

Pruebas tales Como investigacin de

antgenos de hepatitis B, protena C
reactiva, polisacridos
bacterianos y
micticos en LCR, pruebas de embarazo, investigacin
de Streptococcus
pyogenes, tipificacin de grupos del gnero Streptococcus utilizan este tipo de
reacciones. Son herramientas sencillas,
rpidas, y en su mayora de una alta especificidad.
COAGLUTINACIN
La coaglutinacin es una modalidad de
la aglutinacin pasiva reserva en la cual
la partcula indicadora utilizada es una
cepa de Staphylococcus aureus, particularmente la cepa Cowan (14). Esta cepa
tiene dentro de los componentes de su
pared bacteriana una protena denominada protena A, la cual tiene la propiedad biolgica de unirse qumicamente a
la fraccin Fe de la molcula de IgG humana y de conejo de forma que el
Staphylococcus queda convertido en una
partcula recubierta de molculas especficas de anticuerpos contra aquellos
antgenos bacterianos, parasitarios o
micticos que se desean investigar. El
reactivo as obtenido es un reactivo de
gran especificidad, muy estable y muy
econmico, que puede ser utilizado comercialmente para diagnstico.
PRUEBAS PRIMARIAS
Son aquellas en las cuales la reaccin
antgeno anticuerpo no da lugar a ninguna manifestacin visible, requirindose, para evidenciar que la reaccin ha
ocurrido, procedimientos tcnicos complejos
y en ocasiones
equipos
sofisticados y costosos. Las pruebas primarias pueden ser directas o indirectas
y de gran sensibilidad y especificidad,
que las acercan al ideal de una prueba
diagnstica. Dentro de esta categora tenemos:
123456-

Fijacin de complemento
Inmunofluorescencia
Radioinmunoensayo
Pruebas Inmunoenzimticas
Inmunoelectrotransferencia
Inmunocromatografa

FUACIN

DE COMPLEMENTO

Esta tcnica fue desarrollanda por Bordet

(2) a principios de siglo y tiene como
fundamento la utilizacin de una cantidad precisa de complemento
srico,
usualmente obtenido del cur, el cual se
utiliza de manera total en presencia de
la reaccin de un antgeno con su anticuerpo homlogo. Bordet decidi introducir en la reaccin una segunda fase
utilizando un sistema indicador que permitiera determinar que el complemento
haba sido utilizado en la primera fase
de la reaccin indicando que evidentemente en la primera fase un anticuerpo
haba reaccionado con el antgeno, la
segunda fase o sistema indicador que
Bordet utiliz fue una suspensin de glbulos rojos de carnero sensibilizados con
un anticuerpo anti - glbulo rojo de carnero los cuales con el complemento producen la hemlisis del glbulo rojo dando un fenmeno claramente visible, en
esta forma, si en la primera fase de la
reaccin el complemento presente se utiliza, en la segunda fase no hay complemento y el fenmeno hemoltico no ocurre; a su tumo, si en la primera fase el
complemento no se utiliza porque no hay
reaccin antgeno anticuerpo el complemento queda libre y se utiliza en la segunda fase dando un fenmeno visible
de hemlisis. Esta reaccin por su exquisita sensibilidad y especificidad fue
rpidamente incorporada como recurso
diagnstico
por
August
Von
Wassermann (1), para el diagnstico de
la sfilis. De entonces a nuestros das la
tcnica ha sido perfectamente valorada
y estandarizada como prueba cuantitativa en el diagnstico de la infeccin viral,
parasitaria, bacteriana y mictica. Es una
tcnica dispendiosa, requiere una perfecta evaluacin de los reactivos utilizados
y este hecho hace que quede confinada
a los laboratorios de referencia para estudios muy especficos. A nivel de enfermedades infecciosas es muy til en el
diagnstico serolgico de la enfermedad
de Chagas (Reaccin de Guerrero Machado), en el diagnstico de micosis
sistmicas, como la histoplasmosis,

LAS PRUEBAS

SERLOGICAS

coccidioidomicosisy
paracoccidioidomicosis, entidades en las cuales permite hacer un diagnstico, controlar el
tratamiento y establecer un pronstico.
INMUNOFLUORESCENCIA
El desarrollo
de la tcnica
de
inmunofluorescencia
se debe a Albert
Coons de la Universidad de Harvard (15).
La posibilidad de marcar un anticuerpo con
una sustancia qumica para poder seguir
el curso de este anticuerpo y as poder
tambin poner de manifiesto un antgeno
fue un deseo largamente acariciado por
los investigadores; varios intentos se hicieron con distintos compuestos y colorantes ; en 1940 Coons utiliz un compuesto fluorescente,
la fluorescena,
compuesto que poda conjugarse qumicamente con los grupos NH2 de las molculas de anticuerpo sin afectar la especificidad del anticuerpo; este compuesto poda ser excitado
por la luz
ultravioleta presentando el fenmeno de
la fluorescencia, es decir que al ser excitado por la luz ultravioleta, estas radiaciones de onda muy corta activan los
electrones del compuesto fluorescente,
emitiendo una radiacin de onda ms
larga dentro del espectro visible, en esta
forma un anticuerpo marcado al fijarse
especficamente al antgeno, por ejemplo una bacteria, se ver fluorescente.
Desde su inicio se vislumbr la gran posibilidad de este procedimiento como
herramienta en investigacin y en diagnstico, posteriormente, se encontr que
un ismero de la fluorescena,
el
Isotiocianato (16), era superior como
marcador fluorescente, desde entonces
este fluorocromo se viene utilizando para
marcar los anticuerpos.
Las tcnicas de inmunofluorescencia
pueden aplicarse como tcnicas directas
para investigar la presencia de antgenos
virales, parasitarios,
bacterianos
o
micticos en muestras clnicas; tiene una
amplia aplicacin clnica en diagnstico de Rabia, infeccin por Cytomegalovirus, Herpes simplex 1 y 2, Epstein
Bar y virus Sincicial Respiratorio, entre

Rev FacMed UN Col 1999 Vol 47 N 2

otros. Las tcnicas de inmunofluorescencia tambin se utilizan en su modalidad indirecta, es decir, para investigar la presencia de anticuerpos contra determinado antgeno, esta tcnica, de gran
versatilidad y aplicacin al diagnstico
presupone contar con un anticuerpo marcado con fluorescena, anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana, este anticuerpo marcado recibe el
nombre de conjudago y puede unirse a
la inmunoglobulina
humana independientemente de la especificidad de esta.
Las tcnicas de inmunofluorescencia indirecta requieren que para su ejecucin
se cuente con el sustrato,
cuyos
anticuerpos especficos se desean investigar en un suero problema; esta tcnica
tiene una gran aplicacin en diagnstico, las tcnicas ms usadas son la investigacin de anticuerpos antinucleares,
anticuerpos anti-Toxoplasma, anticuerpos
anti- Treponema pallidum, anticuerpos
anti- VIH; estas tcnicas correctamente
estandarizadas constituyen valiosas herramientas de diagnstico. Infortunadamente
los reactivos son costosos y se requiere un
microscopio de fluorescencia que es un
equipo muy costoso por la combinacin
de filtros necesarios y por la fuente de
luz que es una lmpara de vapores de
mercurio (17). A pesar de estas limitaciones las pruebas de inmunofluorescencia tienen un lugar importante como prueba
diagnstica.
RADIOINMUNOENSAYO

tancia radiactiva que mostr mayor facilidad para marcar los anticuerpos fue
un istopo de Iodo, inicialmente, Iodo
131 y posteriormente Iodo 125. La tcnica fue introducida bsicamente como
una tcnica directa para la cuantificacin
particularmente de hormonas ya que su
especificidad y sensibilidad permita
cuantificar stos compuestos en concentraciones tan bajas del orden de los
picogramos: la endocrinologa gan con
este desarrollo una poderosa arma de
diagnstico. posteriormente se desarrollaron tcnicas de radioinmunoensayo
para investigacin
de marcadores
tumorales tales como alfafetoprotena,
antgeno carcinoembrinico,
antgeno
prosttico especfico. La aplicacin del
Radioinmunoensayo en el diagnstico de
la enfermedad infecciosa fue realmente
muy pobre, limitndose a la investigacin de anticuerpos contra el virus de la
Hepatitis y VIH entre otros.
La necesidad de utilizar istopos radioactivos constituy siempre una gran
limitante toda vez que se trataba de
reactivos muy costosos con una vida
media muy corta y adems la lectura requera necesariamente un contador de
radiaciones gamma. El advenimiento de
las tcnicas Inmunoenzimticas fue gradualmente limitando su radio de accin,
quedando en la actualidad reducido al
campo de la investigacin y apenas s,
algunas pruebas de diagnstico.

(RIA)

Un avance muy grande en las pruebas

primarias lo constituy el desarrollo del
Radioinmunoensayo hecho hacia 1958
por Yalow y Berson (19), desarrollo por
el cual se le otorg el premio Nobel de
Medicina; bsicamente este procedimiento basado en la exquisita especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo introdujo para rastrear la reaccin una
sustancia radioactiva que pudiera convenientemente combinarse qumicamente con la molcula de anticuerpo en forma tal que este pudiera ser fcilmente
rastreado por la radiacin emitida por el
marcador radioactivo utilizado. La sus-

PRUEBAS
INMUNOENZIM

TICAS

Las pruebas inmunoenzimticas fueron

desarrolladas hacia 1975 por Engvall y
Perlmann (19), quienes decidieron marcar los anticuerpos con una enzima, de
forma tal, que al usar el sustrato especfico de la enzima se pudiera determinar
la presencia del anticuerpo; varios tipos
de enzimas fueron utilizados siendo las
ms usadas, ureas a, fosfatasa alcalina y
peroxidasa. La prueba inicialmente conocida por la sigla ELISA por Enzyme
Linked Inmunosorbent Assay y ahora
simplemente
como EIA (Enzyme

93

GUZMN M Y COL
Irnmune Assay), mostr la posibilidad de
ser utilizada como tcnica directa para
investigar la presencia de antgenos particulares o como prueba indirecta para
investigar anticuerpos especficos. Muy
precozmente se vio que sta era una tcnica ideal por la posibilidad de utilizar
reactivos de gran estabilidad y vida til
larga, adems de estandarizar los sistemas en microprocedimientos de fcil lectura visual o fotocolorimtrica, con equipos sencillos. En la historia del desarrollo de las pruebas serolgicas ninguna
ha producido tan gran impacto como
estas pruebas inmunoenzimticas, ellas
introdujeron una revolucin en los recursos diagnsticos tanto de la enfermedad infecciosa como de las enfermedades autoinmunes, endocrinas y en la investigacin de marcadores tumorales.
Fueron rpidamente
estandarizadas
como procedimientos directos cualitativos y cuantitativos y como procedimientos indirectos cualitativos y cuantitativos.
En el campo de las enfermedades infecciosas uno de los grandes impactos ha sido el
diagnstico de la enfermedad viral; hasta
su aparicin, eran bien limitados los recursos que el clnico tena para comprobar el
diagnstico, a partir del desarrollo de las
tcnicas inrnunoenzimticas el panorama
cambi radicalmente permitiendo la investigacin
directa
de agentes
etiolgicos
tales como, rotavirus,
adenovirus, virus sincicial respiratorio,
componentes antignicos de virus de
hepatitis B. Las tcnicas indirectas abrieron toda una serie de posibilidades para
diagnstico de infecciones tales como
sarampin, rubeola, varicelazoster infeccin por Epstein Bar, cutomegalovirus,
herpes 1 y 2 Y VIHl y 2; el hecho de
poder investigar la respuesta inmune en
trminos de IgG e IgM convirti esta
tcnica en una poderosa herramienta
para definir la situacin de infeccin
aguda o infeccin pasada, definicin de la
mayor trascendencia en situaciones como
rubeola y embarazo y toxoplasmosis y embarazo. En el campo de la enfermedad parasitaria las pruebas inmunoenzimticas

94

han tenido tambin un gran

el diagnstico de entidades
toxoplasmosis, enfermedad
leishmaniasis,
amebiasis,
neurocisticercosis, toxocara

impacto en
tales como
de Chagas,
giardiasis,
canis.

Como prueba de tan amplia aplicacin

clnica y tan universalmente empleadas
cientos de casas comerciales se han lanzado a la produccin de los reactivos en
estuches que contienen todo lo necesario para realizar las pruebas con un estricto control de calidad interno asegurando un grado de confiabilidad alto.
Las tcnicas inmunoenzimticas
han
sido adaptadas en mltiples procedimientos tales como tcnicas de captura,
tcnicas competitivas y tcnicas indirectas; cada casa comercial tiene sus protocolos que deben seguirse en forma rigurosa.
En el campo de las enfermedades infecciosas los procedimientos ms comunes
son la tcnica de captura para la investigacin de antgeno y la tcnica indirecta para investigacin de anticuerpos.

Tcnicas de Captura: Son utilizadas

para la investigacin
de un agente
etiolgico por ejemplo, si se desea saber
si un paciente tiene circulante el AgsHB
(antgeno de superficie del virus de la
Hepatitis B) el sistema trae entonces, una
placa de poliestireno con una serie de
pozos, cada pozo es en realidad un pequeo tubo de ensayo, en cada pozo se
ha colocado un anticuerpo monoclonal
especfico contra el AgsHB, este anticuerpo se adhiere muy intensamente por
su fraccin Fe al poliestireno dejando
libre los grupos de combinacin del anticuerpo, el suero del paciente que
presuntivamente contiene el AgsHB se
coloca, adecuadamente
diluido en el
pozo, y se incuba por un tiempo determinado, para permitir que el anticuerpo
"capture" el AgsHB, si realmente est
presente; luego de lavar intensamente
todo los componentes srico s son removidos, se coloca entonces un segundo
anticuerpo producido en otra especie
animal el cual viene marcado con la en-

zima, es el llamado conjugado, este anticuerpo es especfico contra AgsHB, por

tanto se unir a las partculas capturadas
en la primera reaccin, luego de un perodo de incubacin apropiado se lavan
los pozos para remover todo aquello que
no haya reaccionado; en el pozo no permanecer ms que el primer anticuerpo,
el AgsHB capturado y el conjugado adherido al AgsHB ; para poder saber que
ello es as, es la enzima que est marcando el conjugado quien revelar ese
hecho, para ello, ser necesario colocar
el substrato correspondiente, si suponemos que la enzima marcadora
es
peroxidasa el substrato es agua oxigenada, la cual al ser interactuada por la
pero xi das a producir una reaccin sobre un compuesto que se adiciona a la
reaccin dando un color cuya intensidad
se mide en un fotocolorimetro para obtener una lectura de la densidad ptica.
Las lecturas de los controles positivos y
negativos y los sueros problemas permitirn establecer un ndice de lectura para
establecer la positividad o negatividad
de la reaccin.

Tcnicas indirectas: Estas investigan

la presencia de anticuerpos IgG, IgM o
Ig A para un determinado antgeno sea
este un virus, parsito, bacteria u hongo; para ello, los sistemas traen las placas de poliestireno sensibilizadas con los
antgenos respectivos. Por ejemplo, si
deseamos investigar anticuerpos contra
el virus de la inrnunodeficiencia humana (VIH), para establecer un diagnstico de infeccin por VIH, el sistema comercial trae la placa de poliestireno en
cada uno de cuyos pozos tiene adheridos los componentes antignicos del
VIH; en los pozos respectivos se colocan los controles y los sueros en estudio
y despus de la incubacin apropiada,
se lavan intensamente.
Si el suero en
estudio contiene anticuerpos anti -VIH
estos se fijan especfica e intensamente
sobre el antgeno, luego se coloca el conjugado que es un anticuerpo antigamaglobulina humana obtenido usualmente
en cabra y adems marcado con una
enzima,
este anticuerpo
se une

LASPRUEBASSERLOGICAS
especficamente
con la Inmunoglobulina humana fija a su vez sobre el
antgeno, luego de los lavados, se agrega el sustrato y se revela el color por la
reaccin de la enzima sobre el sustrato.
La reaccin
se lee fotocolorimtricamente para determinar la densidad
ptica y establecer los ndices que determinarn la positividad o negatividad
de la reaccin.
Las distintas casas comerciales han desarrollado sistemas muy variados desde
equipos de lectura manuales, semi automatizados y automatizados simples, hasta equipos de la ms alta sofisticacin.
En materia de procedimientos inmunoenzimticos se podra decir que hay para
todos los gustos (20). Estas pruebas tambin han sido adaptadas en sistemas rpidos para investigacin
de Streptococcus pyogenes, AgsIHB, Anticuerpos
anti- VIH y pruebas de embarazo, entre
otras.

INMUNOELECfROTRASFERENCIA
En 1980 Southem (21), desarroll un
procedimiento para estudio de DNA,
para lo cual despus de someter a
hidrlisis selectiva el DNA proceda a
someter la muestra a una electroforesis
en gel de poliacrilarnida para separar la
fraccin de acuerdo a y peso molecular;
como los geles de acrilarnida son muy
frgiles y difciles de manipular consider posible transferir a un papel de nitrocelulosa todas aquellas bandas separadas en el gel de poliacrilamida y hacerlo mediante una electroforesis en la
cual el gel colocado cerca al ctodo y el
papel de nitrocelulosa cerca al nodo al
recibir la corriente continua permita que
cada banda que est presente en el gel
fuera transferida al papel, ocupando la
misma posicin, a la manera de lo que
en fotografa un negativo se transfiere a
un positivo; en esta forma el papel de
nitrocelulosa poda cortarse en pequeas tiras, cada una de las cuales contena exactamente el mismo patrn de distribucin de bandas del gel original. Este
procedimiento
fue considerado como

Rev FacMed UN Col 1999 Vol. 47 N 2

una poderosa herramienta de anlisis con
una gran potencialidad en su ampliacin al
diagnstico en el campo de infectologa. La
primera aplicacin masiva de esta tcnica
se introdujo para demostrar anticuerpos
contra el virus de la inmunodeficiencia humana VIH, siguiendo exactamente el desarrollo de Southem, el virus era sometido
a una digestin enzimtica, sus componentes separados electroforticamente
en un gel de poliacrilarnida, transferidos
a un papel de nitrocelulosa y cortado en
pequeas tiras, cada tira al ponerse a reaccionar con el suero de personas supuestamente infectadas con el VIH cuyo
suero contiene anticuerpos especficos
contra cada una de los componentes del
virus, reacciona especficamente, al lavarse las tiras, todos aquellos componentes sricos que no hayan reaccionado se
lavan, quedando solo los anticuerpos
especficos; para saber que ellos estn all
fijados se utiliza un anticuerpo antigamaglobulina humana marcada por una enzima, usualmente peroxidasa, luego de la
reaccin se coloca el substrato respectivo desarrollndose una banda ntida de
color por cada fraccin del virus, para la
cual el suero en estudio tenga anticuerpos.
Usualmente los componentes visualizados
son Glucoprotena 160- 120- 41 Y protena 66 - 55 - 31 - 24 - 17.
El CDC (Centro para el Control de enfermedades de USA) considera como
criterio para confirmar un diagnstico de
infeccin por VIH la presencia de las
bandas 160/120 o 41/24 Esta tcnica por
su alta especificidad y sensibilidad se
convirti en la prueba de referencia
confirmatoria de diagnstico de infeccin
por VIH y recibi el nombre de
"Westemblot" por similitud a la tcnica de
Southem, conocido como "Southemblot"
y no porque tuviera algo que ver con los
puntos cardinales (22). Tambin hay tcnicas "Eastemblot" y "Northemblot" En
sntesis el Westemblot es una prueba
inmuno-enzimtica sobre papel y de tipo
indirecto. Tcnicas similares se han desarrollado para el diagnstico indirecto
de otras infecciones virales, tales como
las paraparesia espstica tropical causa-

da por virus HTL V-1, bacterianas, como

fiebre tifoidea,
parasitarias
como
neurocisticercosis y micticas como la
paracoccidioidomicosis. Una de sus limitaciones es el alto costo de los reactivos comerciales.
~UNOCROMATOGRAFM
En los ltimos aos se han desarrollado
una serie de pruebas serolgicas rpidas
que combinan el principio de la separacin cromatogrfica con la reaccin especfica antgeno-anticuerpo, permitiendo visualizar la reaccin mediante la utilizacin de un marcador de oro coloidal
(23).
Estas reacciones se han estandarizado como
pruebas directas o indirectas y en algunas
ocasiones como pruebas semicuantitativas.
Las reacciones inmunocromatogrficas han
sido comercializadas
en sistemas
miniaturizados para ser utilizadas inclusive a nivel de consultorio mdico, la
lectura es visual macroscpica constituyendo ayudas diagnsticas simples.
La prueba ha sido ensamblada en una
placa plstica
del tamao
de un
portaobjeto, en su interior la placa tiene
hacia un extremo una pequea almohadilla y hacia el otro extremo una pequea tira de papel de celulosa que hace
contacto directo con la almohadilla; al
mirar la placa por su cara superior se
observa tres ventanas; la primera se abre
directamente sobre la almohadilla absorbente y es el sitio en donde se coloca la
muestra clnica, la segunda se abre sobre
una zona de la membrana cromatogrfica
y es el sitio donde se lee el resultado positivo o negativo de la prueba y la tercera
se abre sobre una zona de la membrana
cromatogrfica en donde se lee el control interno de la reaccin. Debido al
hecho que los reactivos colocados en la
zona de lectura de la prueba y en la zona
de lectura del control interno han sido
colocados en forma linear, la reaccin
se evidencia en una y otra ventana como
una banda intensamente rosada.
Estas tcnicas se han estandarizado para
investigacin de la hormona gonado-

95

GUZMN M Y COL
tropina corinica humana como prueba
de embarazo con una sensibilidad de 20
mUI/ml, para investigacin de antgeno
prosttico especfico con una sensibilidad de 5 ng/ml, para la investigacin de
AgsHB (Antgeno de superficie del Virus de Hepatitis B), para la investigacin
de la hormona Luteinizante LH como
prueba de ovulacin, como prueba para
identificacin de Streptococcus pyogenes
en nuestras clnicas o en cultivos y como
pruebas para drogas de abuso como cocana, morfina, herona, marihuana y
anfetamina.
Hay varios tipos de pruebas inmunocromatogrficas entre las cuales tenemos:
1- Prueba de Captura
2- Prueba de Bloqueo
3- Prueba indirecta
Prueba de Captura: En pruebas de tipo
directo la disposicin de los reactivos es
la siguiente: en la almohadilla viene absorbido un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antgeno que se desea investigar este anticuerpo adems viene
marcando con oro coloidal (23); en la
zona de la prueba, sobre la membrana
cromatogrfica, sta colocado en forma
lineal un anticuerpo policlonal contra el
antgeno que se desea investigar y en la
zona del control interno, sobre la membrana cromatogrfica, esta colocado en
forma lineal un anticuerpo obtenido en
conejo dirigido contra el anticuerpo
monoclonal.
Si suponemos que se desea investigar en
un paciente el AgsHB, se toma la sangre
del paciente, se obtiene el suero, con dispensador se colocan 4 a 5 gotas del suero y 4 a 5 gotas de un diluente (Buffer)
provisto dentro del estuche de reactivo;
estos sueros y diluente, se colocan en la
ventana de la muestra, rpidamente ellos
son absorbidos y aIJ encuentran el anticuerpo monoclonal anti-AgsHB, marcado con oro coloidal, si realmente hay
AgsHB este se une a los grupos de combinacin especfico
del anticuerpo
monoclonal y continan migrando hacia
la membrana cromatogrfica en la zona

96

de prueba encuentran fijados un anticuerpo policlonal contra AgsHB, el cual

captura el AgsHB que tiene pegado al
conjugado (anticuerpo monoclonal, marcado con oro coloidal) dando una lnea
aparente rosada, el conjugado que no
reacciona contina migrando hacia la
zona del control interno, en donde encuentra un anticuerpo, policlonal dirigido contra el anticuerpo monoclonal marcado dando una banda rosada indicando que el sistema funcion bien, la reaccin en este ejemplo es positiva: tendremos banda en la zona de la prueba y banda en la zona de control. En caso de que
la prueba sea negativa, el conjugado
migra sin ser capturado en la banda de
prueba y ser atrapado en la banda de
control, esta debe aparecer siempre, en
caso de no aparecer indica que el sistema no funcion porque el reactivo esta
alterado y deber hacerse una nueva
prueba.
Prueba de Bloqueo: Es la ms utilizada
para la investigacin de drogas de abuso.
En esta prueba, en la almohadilla se encuentra un anticuerpo monoclonal dirigido contra la droga que se investiga y que
tiene ya copados los sitios de combinacin
con dicha droga; adems, est marcado con
oro coloidal; al colocarse la muestra clnica en la ventana para la muestra si la droga
est presente pasa muy rpidamente a la
membrana cromatogrfica y llega a la zona
de la prueba en donde la membrana
cromatogrfica tiene fijos una banda de
anticuerpos monoclonales contra la droga
en cuestin, copando todos los grupos especficos de combinacin, el conjugado
que es una molcula ms pesada migra
ms lentamente, llega a la zona de la
prueba y encuentra que todos los grupos
de combinacin especfica del anticuerpo all fijado estn copados por la droga
capturada de la muestra clnica y pasa
derecho continuando hacia la zona de
control
en donde
la membrana
cromatogrfica
tiene una banda de
anticuerpos policlonales antigamaglobulina monoclonal conjugada reaccionando con ella dando una banda intensamente rosada indicando que el siste-

ma funcion bien. La prueba se llama

de bloqueo porque la droga presente en
la muestra clnica bloquea la reaccin
con la droga ligada al conjugado. La reaccin positiva no dar, entonces, ninguna banda en la zona de la prueba, slo
dar una banda en la ventana de control.
En el caso contrario, cuando en la muestra no hay la droga que se investiga, el
conjugado
es atrapado
por los
anticuerpos libres en la zona de la prueba dando una banda rosada de reaccin
las molculas no captadas continan
migrando siendo captadas en la zona de
control dando una banda ntida de reaccin, en este caso la presencia de banda
en la ventana de la prueba y la presencia
de banda en la ventana de control indican que la prueba es negativa.
Prueba
indirecta:
Las pruebas
inmunocromatogrficas
han sido tambin adaptadas para la investigacin de
anticuerpos especficos contra determinados antgenos microbianos y as poder establecer un diagnstico indirecto,
pruebas para VIH, Trypanosoma cruzi,
Dengue
y Brucella,
han sido ya
estandarizadas
y comercializadas.
En
este tipo de pruebas indirectas se tiene
en la almohadilla un suero monoclonal
especfico contra la IgG humana adems
conjugado con oro coloidal; en la zona
de la prueba estn fijos sobre la membrana cromatogrfica grupos antignicos
del microorganismo cuyos anticuerpos
especficos se desean investigar, en la
zona de control se encuentra una banda
de un anticuerpo policlonal dirigido contra el anticuerpo monoclonal conjugado.
Pongamos por ejemplo que deseamos investigar si el suero de un paciente tiene
anticuerpos contra el VIH, entonces, se
toma la muestra de sangre, se obtiene el
suero, 4 a 5 gotas de este se colocan en
la ventana de la muestra y luego se coloca una cantidad similar de buffer; en la
almohadilla el anticuerpo monoclonal
conjugado antigamaglobulina
humana
captura una apreciable cantidad de molculas de la IgG contenida en el suero,
este gran complejo migra a la membrana cromatogrfica y llegar a la zona

LASPRUEBASSERLOGICAS

donde se encuentra el antgeno y all los

anticuerpos especficos dirigidos contra
el VIH, si los hay, y que vienen captadas
en el conjugado reaccionarn dando una
banda de reaccin intensamente coloreada, el exceso de conjugando contina
migrando hacia la zona de control en
donde el suero policlonal anticonjugado
est fijo, reaccionando con el conjugando para dar una banda intensamente coloreada indicando que la prueba funcion bien y el reactivo esta bien.
En consecuencia si la prueba es positiva
tendremos 2 bandas, una en la ventana
de la prueba y otra en la ventana del control, si la prueba es negativa tendremos
una banda nica en la ventana de control, si la prueba es invlida la banda en
la ventana de control no aparece.

Rev Fac Med UN Col 1999 Vol. 47 N 2

CALIDAD DE LOS SUEROS

CONCLUSIN

Los sueros que deban ser sometidos a

estudios serolgicos deben ser obtenidos a partir de una muestra de sangre
tomada con todas las normas de asepsia y antisepsia en pacientes preferiblemente en ayunas. Unicamente los
sueros lmpidos, transparentes y no
hemolizados, deben ser utilizados para
la realizacin
de las pruebas
serolgicas. Para conservar los sueros
lo ideal es repartir las muestras en
alcuotas de 0.5 mi, identificar correctamente y congelar a 20QC, dejando
una alcuota a 42C para realizar las
pruebas.
Nunca se debe congelar y
descongelar y volver a congelar porque ese procedimiento
altera la
reactividad de los sueros.

Las pruebas serolgicas han tenido un

gran desarrollo en las ltimas dcadas,
constituyen poderosas herramientas de
diagnstico;
en el campo
de la
infectologa
son insustituibles.
Se
debe, sin embargo, tener en cuenta que
como todo procedimiento de laboratorio tienen una utilidad y una limitacin,
pueden dar resultados falsos positivos
o negativos y por tanto los resultados
deben ser valorados
dentro del contexto de una correlacin clnica.
Como la mayora de los procedimientos
serolgicos estn disponibles comercialmente, los protocolos de la realizacin
de las pruebas deben ceirse estrictamente a lo indicado por el productor.

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